CN105111315B

CN105111315B - MIP3α-Fc融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN105111315B
Application number: CN201510629420.0A
Authority: CN
Inventors: 郑少江; 郭峻莉; 翁志宏; 郑少萍; 张晓钿
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN105111315A

Abstract

本发明提供了一种MIP3α‑Fc融合蛋白，所述的融合蛋白为巨噬细胞炎性蛋白MIP3α和Fc的二聚体融合蛋白，所述的MIP3α与Fc之间通过免疫球蛋白的铰链区或柔性肽段连接。本发明提供了一种长效的MIP3α‑Fc融合蛋白。这种新型融合蛋白，在体内外都体现出良好的生物活性和稳定性，能够趋化未成熟的树突状细胞，瘤内注射MIP3α‑Fc融合蛋白能有效抑制肿瘤的生长，同时具有长效血浆半衰期。

Description

MIP3α-Fc融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及一种MIP3α-Fc融合蛋白及其编码核苷酸序列、以及该融合蛋白的制药用途，属于基因工程技术领域。

背景技术

树突状细胞（DC细胞）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞生成，在启动、调控、并维持免疫应答的过程中处于中心环节。近年来大量的研究表明，通过肿瘤相关抗原负载树突状细胞，回输或免疫接种于载瘤宿主，可诱发特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的抗肿瘤免疫反应。同时树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的树突状细胞多，相对应患者的预后也更好。因此，设法提供肿瘤浸润性树突状细胞的量，从而诱导针对肿瘤细胞的特异性免疫应答，是一种有效的治疗肿瘤的手段。

趋化因子是一类控制细胞向炎性部位迁移的细胞因子，通过与其相应受体的结合，调控免疫细胞分化、发育及定向迁移过程。巨噬细胞炎性蛋白MIP-3α（macrophageinflammatory protein-3α），又称趋化因子20（CCL20），属CC类趋化因子。MIP-3α是目前最强的趋化树突状细胞的趋化因子，其特异性受体CCR6高表达于未成熟的DC细胞（imDCs)。这种未成熟的DC细胞捕获抗原后转而表达CCR7，分化成为成熟的树突状细胞。利用MIP-3a的这一特性，Fushimi等人将编码MIP-3α的基因通过腺病毒转染至小鼠黑色素瘤等四种恶性肿瘤中，结果这四种组织中都检测到DC细胞的聚集，并且三种肿瘤生产受到明显抑制。王甲南等人在小鼠肝癌模型上瘤内注射MIP-3α蛋白，明显抑制了肝癌的生长。

然而，直接利用基因治疗疾病的，目前尚未有临床应用，这主要涉及安全性问题。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，如Fushimi等人利用的腺病毒。问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。此外，无论哪种技术方法，外源基因都应导入靶体细胞内染色体特定基因座位，否则可能会导致正常细胞的基因突变，而目前尚未有成熟的方法解决这一问题。因此使用重组蛋白来进行相关疾病的治疗是更为合理的方法。但普通重组的MIP-3α蛋白的体内半衰期非常短，需要大剂量频繁给药，这大大限制了其临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服普通重组MIP-3α蛋白体内半衰期短的不足之处，提供一种MIP3α-Fc融合蛋白及其用途。

本发明的MIP3α-Fc融合蛋白，所述的融合蛋白为巨噬细胞炎性蛋白MIP3α和Fc的二聚体融合蛋白，所述的MIP3α与Fc之间通过免疫球蛋白的铰链区或柔性肽段连接。

所述MIP3α选自人或小鼠MIP3α；所述的Fc选自人或小鼠的IgG、IgA、IgE、IgM及它们的亚型；所述Fc选自天然型或突变型免疫球蛋白Fc段。

所述的MIP3α为人MIP3α，其氨基酸序列如 SEQ ID.1所示，所述的Fc为人IgG1-Fc，含铰链区的的Fc的氨基酸序列如 SEQ ID.2所示，所述的融合蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，第70-71位氨基酸残基为连接肽段。

所述的MIP3α为小鼠MIP3α，其氨基酸序列如 SEQ ID.4所示，所述的Fc为小鼠IgG2a-Fc，含铰链区的Fc的氨基酸序列如 SEQ ID.5所示，所述的融合蛋白单链的氨基酸序列如 SEQ ID.6所示，第70-71位氨基酸残基为连接肽段。

本发明提供了编码融合蛋白的DNA分子，所述的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID.7所示。或如 SEQ ID.8所示。

本发明提供了含有DNA分子的重组载体，优选哺乳动物细胞表达载体，如pcDNA3.1（Invitrogen公司）。

本发明提供了含有重组载体的宿主细胞，优选哺乳动物表达细胞，更为具体地优选HEK293细胞、CHO细胞。

本发明提供了融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述的肿瘤为肝癌。

本发明提供了含有融合蛋白的药物组合物。

所述的药物组合物还包括一种或几种其他的诱导树突状细胞成熟的组分或其它抗肿瘤药物。

本发明提供了一种长效的MIP3α-Fc融合蛋白。这种新型融合蛋白，在体内外都体现出良好的生物活性和稳定性，能够趋化未成熟的树突状细胞，瘤内注射MIP3α-Fc融合蛋白能有效抑制肿瘤的生长，同时具有长效血浆半衰期。

附图说明

图1是含有编码MIP3α-Fc融合蛋白的核苷酸序列的重组载体结构图；

图2是人MIP3α-Fc融合蛋白重组表达质粒的PCR产物电泳图；

图3是小鼠MIP3α-Fc融合蛋白重组表达质粒的PCR产物电泳图；

图4是纯化后的人MIP3α-Fc融合蛋白的PCR产物电泳图；

图5是纯化后的小鼠MIP3α-Fc融合蛋白的PCR产物电泳图；

图6为MIP3α-Fc融合蛋白的血浆半衰期测定结果；

图7为MIP3α-Fc融合蛋白对树突状细胞的趋化作用图；

图8为MIP3α-Fc融合蛋白抑制肿瘤的生长曲线；

图9为MIP3α-Fc融合蛋白的结构图。

具体实施方式

实施例1 MIP3α-Fc融合蛋白重组表达质粒的构建

1、人MIP3α-Fc融合蛋白重组表达质粒的构建

以cDNA克隆（购自Origene公司）为模板扩增人MIP3α基因（GeneBank：NM_001130046.1），所用引物序列如下（包含Kozak序列、克隆位点、保护碱基）

上游引物: 5'-ATATCCTTAAGCGGCCGCCGCCACCATGTGCTGTACCAAG-3'

下游引物: 5'-ATATGGGATCCATGTTCTTGACTTTTTTACTG-3'

用50ul的PCR反应体系，其中20mM的引物各加1ul；10mM的dNTP加1ul；pfu DNA 聚合酶，2.5U/ul，加1ul。反应条件为95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 45秒，30个循环。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分析，与预期相符（320bp）。

将得到的PCR产物用凝胶回收后AfLII与BamHI限制性内切酶(购自Fermentas公司)酶切克隆至实验室保存的pcDNA3.1-Fc表达载体中。筛选获得的质粒经测序比对，与预期序列完全一致。结果如图2所示。

2、小鼠MIP3α-Fc融合蛋白重组表达质粒的构建

以cDNA克隆（购自Origene公司）为模板扩增小鼠MIP3α基因（GeneBank：NM_016960.2），所用引物序列如下（包含Kozak序列、克隆位点、保护碱基）

上游引物: 5'-ATATCCTTAAGCGGCCGCCACCATGGCCTGCGGTGGCAAGCG-3'

下游引物: 5'-ATATGGGATCCATCTTCTTGACTCTTAGGCTG-3'

用50ul的PCR反应体系，其中20mM的引物各加1ul；10mM的dNTP加1ul；pfu DNA 聚合酶，2.5U/ul，加1ul。反应条件为95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 45秒，30个循环。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分析，与预期相符（323bp）。

将得到的PCR产物用凝胶回收后AfLII与BamHI限制性内切酶(购自Fermentas公司)酶切克隆至实验室保存的pcDNA3.1-Fc表达载体中。筛选获得的质粒经测序比对，与预期序列完全一致。结果如图3所示。

实施例2 MIP3α-Fc融合蛋白表达和纯化

1、MIP3α-Fc融合蛋白在HEK293细胞中瞬时表达

将处于对数生长期的HEK293细胞用胰酶消化后稀释至6×10⁵/mL的密度，接种到15cm培养皿中，每个培养皿加20ml无血清培养基，培养约24小时左右进行转染。利用Lipofectamine 2000 转染试剂(Invitrogen 公司 ) 将重组质粒转染至HEK293细胞，所用质粒由无内毒素质粒抽提试剂盒提取（Sigma公司）。转染的细胞在5%的二氧化碳培养箱中培养5天后上清液。上清中的融合蛋白产量，用的酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定。

2. MIP3α-Fc融合蛋白在CHO细胞的稳定高表达

将处于对数生长期的CHO细胞稀释至4 x10⁶/ml后，加0.5ml至电击杯中，再加入无内毒素的表达质粒10ug，混合后用电穿孔仪电压800V，电容25uF电转，放至3.5cm 培养皿中无血清培养。培养两天后加入800ug/ml的新霉素杀灭阴性细胞，2周后采用有限稀释法进行96孔细胞培养板的细胞克隆培养，2周后通过ELISA检测挑取出高表达的单克隆细胞进行细胞的扩大培养，培养2周后冻存稳定高表达细胞株。同时取一部分细胞，在1L的滚瓶子中进行稳定高表达细胞株的无血清培养，培养一周后收集表达上清。

3. MIP3α-Fc融合蛋白的纯化

将收集的培养上清用Protein A亲合层析柱（购自GE公司）纯化。用1X PBS （PH=7.4）清洗和平衡纯化柱，上样速度2ml/min，过15倍柱体积。调节上样流速至1ml/min进行上样。上样结束后，用1 X PBS（PH=7.4) 清洗纯化柱，上样速度2ml/min，过15倍柱体积。进液端换上甘氨酸溶液（PH=2.5)，调节流速至1ml/min洗脱融合蛋白。向收集管中加入一定量的Tris8.0缓冲液将蛋白调至PH中性。最后融合蛋白透析至1 X PBS（PH=7.4)中。纯化好的MIP3α-Fc融合蛋白经SDS-PAGE检测（如图4、5所示），含有融合蛋白的重组载体结构如图1所示。融合蛋白的结构如图9所示。

实施例3 MIP3α-Fc融合蛋白的血浆半衰期测定

给4只10周龄大的C57BL/6小鼠尾静脉注射小鼠MIP3α-Fc融合蛋白，每只给药0.1毫克，在如下时间点交替眶后取血：30分钟，2小时，4小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时。血样用特异性ELISA检测小鼠MIP3α-Fc融合蛋白的浓度。结果显示MIP3α-Fc融合蛋白的半衰期长达30小时。结果如图6所示。

实施例4 MIP3α-Fc融合蛋白对树突状细胞的趋化作用

1）树突状细胞的获取

使用淋巴细胞分离液（GE公司）从健康人外周血中分离单个核细胞，用无血清免疫细胞培养基（Takara公司）将细胞密度调整到1x10⁶/ml接种至培养皿中。5%二氧化碳37℃静置培养2小时，晃动培养皿，吸去未贴壁细胞，加入无血清培养基、1000U/ml的GM-CSF、以及1000U/ml的IL-4继续培养，每两天换液一次，培养6天。

2）细胞迁移实验检测MIP3α-Fc融合蛋白对树突状细胞的趋化作用

使用Transwell小室进行细胞迁移实验。将上述树突状细胞消化后计数，并调整密度至5×10⁵/ml，取细胞悬液100µl加入Transwell上室，下室加入500µl含2ug/ml的MIP3α-Fc融合蛋白的无血清培养液，对照组下室为不加MIP3α-Fc融合蛋白的空白无血清培养基，将24孔板放置37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。用棉签擦去上室内的细胞，移去Transwells，倒置，风干，24孔板中加入500ul含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在染料中，37℃ 30min后取出，PBS清洗,照相（放大倍数200X）。结果显示，MIP3α-Fc融合蛋白对树突状细胞有很好的趋化作用。结果如图7所示。

实施例5 MIP3α-Fc融合蛋白抑制肿瘤的生长

1）C57BL/6小鼠皮下肝癌模型的建立

取对数生长期的肝癌细胞系Hepal-6细胞，用无菌的生理盐水重悬至5x10⁶/ml，取100ul对C57BL/6小鼠进行皮下接种。接种后观察肿瘤生长情况，成功建立肿瘤模型的开展后续实验。

2）瘤内注射MIP3α-Fc融合蛋白抑制肿瘤

接种Hepal-6细胞后的第10天，将成功建立皮下肝癌模型的小鼠，分为三组开展实验：瘤内注射小鼠MIP3α-Fc融合蛋白治疗组、瘤内注射无菌生理盐水的对照组、以及不做任何处理的空白对照组。对于瘤内注射小鼠MIP3α-Fc融合蛋白治疗组，单次给药小鼠MIP3α-Fc融合蛋白10ug，隔两天给药一次，体积100ul；对照组单次注射100ul生理盐水，时间与蛋白给药同步。每次给药前测量肿瘤的体积，并绘制肿瘤生长曲线。结果，瘤内注射MIP3α-Fc融合蛋白能够抑制肿瘤生长。结果如图8所示。

Application Project

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<120> Title : MIP3α-Fc融合蛋白及其用途

<130> AppFileReference : 海南医学院

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tgcggcgaat cagaagcaag caactttgac tgctgtcttg gatacacaga ccgtattctt 120

catcctaaat ttattgtggg cttcacacgg cagctggcca atgaaggctg tgacatcaat 180

gctatcatct ttcacacaaa gaaaaagttg tctgtgtgcg caaatccaaa acagacttgg 240

gtgaaatata ttgtgcgtct cctcagtaaa aaagtcaaga acatggatcc caaatctgct 300

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 360

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 900

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 960

ctctccctgt ctccgggtaa atga 984

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SequenceName : 8

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Claims

1.MIP3α-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为巨噬细胞炎性蛋白MIP3α和Fc的二聚体融合蛋白，所述的MIP3α与Fc之间通过免疫球蛋白的铰链区或柔性肽段连接；

所述的MIP3α为人MIP3α，其氨基酸序列如 SEQ ID NO：1所示，所述的Fc为人IgG1-Fc，含铰链区的Fc的氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示，所述的融合蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，第70-71位氨基酸残基为连接肽段；

或者，

所述的MIP3α为小鼠MIP3α，其氨基酸序列如 SEQ ID NO：4所示，所述的Fc为小鼠IgG2a-Fc，含铰链区的Fc的氨基酸序列如 SEQ ID NO：5所示，所述的融合蛋白单链的氨基酸序列如 SEQ ID NO：6所示，第70-71位氨基酸残基为连接肽段。

2.编码如权利要求1的融合蛋白单链的DNA分子，其特征在于，所述的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO：7所示。

3.编码如权利要求1的融合蛋白单链的DNA分子，其特征在于，所述的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO：8所示。

4.含有如权利要求2或3所述的融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。

5.含有如权利要求4所述重组载体的宿主细胞。

6.如权利要求1所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。

8.如权利要求1所述融合蛋白的药物组合物。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，还包括一种或几种其他的诱导树突状细胞成熟的组分或其它抗肿瘤药物。