CN110016082B - MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白及其核酸分子和应用 - Google Patents

MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白及其核酸分子和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供MIP3α‑FGFR1‑PD1/Fc融合蛋白及其核酸分子和应用，涉及抗肿瘤药物技术领域。本发明所述MIP3α‑FGFR1‑PD1/Fc融合蛋白，该融合蛋白由包含PD1、FGFR1和鼠源抗体Fc段的核酸分子编码得到。本发明所述MIP3α‑FGFR1‑PD1/Fc融合蛋白具有显著的肿瘤血管靶向作用，在肿瘤组织和或肿瘤新生血管中高浓度的富集，本发明所述融合蛋白含有PD1蛋白，与肿瘤微环境中的PDL1结合，通过竞争性结合来降低T细胞表面的PD1与肿瘤细胞表面配体PDL1、PDL2的结合进而阻断PD1信号通路的持续激活，从而充分发挥融合蛋白清除免疫抑制作用，提供高效的肿瘤免疫治疗作用。

Description

MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白及其核酸分子和应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子及其制备方法和应用。
背景技术
巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)是目前发现DC最重要的特异性趋化因子。CC趋化因子受体6(CCR6)是MIP3α的唯一受体。研究表明，MIP3α可以通过吸引表达CCR6的未成熟DC募集病原感染组织或肿瘤区域，使募集来的DC活化发挥抗原递呈作用。可见，如果设法让肿瘤组织中的MIP3α水平增加，就能够在肿瘤局部组织募集到大量DC，进而大大增强这些DC处理递呈抗原的能力。因此，为了使体内MIP3α趋化募集而来的DC能够更有效地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性，必须寻找新的有效策略。
目前常用DC加载肿瘤细胞抗原或多肽在体外培养、用肿瘤细胞总RNA转化或特异肿瘤抗原基因修饰DC等方法制备的DC疫苗已经在临床应用，但是这种“作坊”式的DC疫苗制备方法存在体外操作复杂、成本高、规范难等不足。
发明内容
为了提高MIP3α的靶向性和肿瘤抑制效果，本发明提供了一种MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，该融合蛋白具有极强的肿瘤细胞靶向性，对肿瘤细胞有显著地杀伤作用，相对于MIP3α单独使用抗肿瘤效果有显著提升。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有99％以上同源性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码上述技术方案所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子，所述核酸分子由PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因组成。
优选的，所述PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因，按照5’端到3’端的顺序依次为MIP3α、FGFR1、鼠源抗体Fc段和PD1。
优选的，核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与所述SEQID NO.1所示的核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种上述技术方案所述核酸分子的制备方法，包括以下步骤：
1)将引物1～引物84混合，以引物1～引物84互为模板和引物，进行第一轮PCR扩增，得到混合扩增产物；
所述引物1～引物84的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.86所示；
2)以混合扩增产物为模板，以引物1为上游引物、引物84为下游引物，进行第二轮PCR扩增，得到MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子。
优选的，所述第一轮PCR扩增采用的PCR扩增体系每50μL包括：33μL ddH2O、5μL 10×PCR Buffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、10μL各引物浓度为20mM的引物1～引物84的混合物和1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶；
所述第一轮PCR扩增采用的PCR反应程序为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环25次；72℃5min。
优选的，所述第二轮PCR扩增采用的PCR扩增体系每50μL包括：40μL ddH2O、5μL 10×PCR Buffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为20mM的引物1、0.5μL浓度为20mM的引物84、1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶和2μL混合扩增产物；
所述第二轮PCR扩增采用的PCR反应程序为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，循环30次；72℃5min。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述表达载体中包含前述技术方案所述的核酸分子。
本发明还提供了前述技术方案所述融合蛋白、前述技术方案所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子、前述技术方案所述方法制备的核酸分子或上述技术方案所述重组表达载体在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了一种特异性抗肿瘤药物，包括前述技术方案所述的核酸分子或前述技术方案所述的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，还包括药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
本发明提供了一种MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有99％以上同源性的氨基酸序列。本发明所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白由包含PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的核酸分子编码而成，利用FGFR1的天然靶向性使得MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白整体在肿瘤细胞或肿瘤新生血管部分集中，从而特异性地提高肿瘤部分的MIP3α浓度；同时，本发明所述融合蛋白中的PD1部分与T细胞表面的PD1竞争性结合肿瘤微环境中的配体PDL1/PDL2，进而阻断PD1信号通路的持续结合，清除肿瘤细胞的免疫清楚作用，提供高效的肿瘤免疫治疗作用；此外，鼠源抗体Fc段具有增强提呈能力的作用能够进一步辅助增强机体的免疫上述作用，协同PD1增强抗肿瘤作用。因而，本发明提供的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白具有特异性靶向、抗肿瘤效果更为强力和持效，PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段相互协同、相互促进使得该融合蛋白相比于单独的MIP3α的抗肿瘤作用有显著提高，达到抑制肿瘤生长、延长癌症患者生存时间的效果。
研究表明，本发明提供的融合蛋白(MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白)能够与抗体FGFR1、抗体MIP3a、抗体PD1、PDL1、PDL2特异性结合，在小鼠体内半衰期约为45h，可有效抑制乳腺癌等肿瘤的生长、缩小肿瘤体积、减少肿瘤质量，抑瘤率可达到77％以上。
附图说明
图1为pcDNA3.1(+)的结构示意图；
图2为本发明实施例1制备的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子电泳示意图；图中：Lane M:DNA分子量标准；Lane 1:核酸分子的扩增产物；
图3为实施例2中重组质粒PCR鉴定示意图；图中：Lane 1，2，4-6为阳性克隆；LaneM为DNAMarker；
图4为实施例2中重组质粒QC鉴定示意图；图中：Lane 1为阳性克隆，2为阳性克隆PCR鉴定，3为阳性克隆AflII/XbaI双酶切鉴定；Lane M：DNAMarker；
图5为实施例3中ELISA上清液的融合蛋白表达量；
图6为实施例3中SDS-PAGE检测结果；
图7为实施例3中SEC检测的检测结果；
图8为实施例4中融合蛋白与抗体FGFR1结合实验；图中：Lane 1为P2357(FT1803809)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2357(FT1803809)非还原；
图9为实施例4中融合蛋白与抗体MIP3a结合实验；图中：Lane 1为P2357(FT1803809)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2357(FT1803809)非还原；
图10为实施例4中融合蛋白与抗体PD1结合实验；图中：Lane 1为P2357(FT1803809)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2357(FT1803809)非还原；
图11为实施例4中ELISA法检测融合蛋白与抗体PD-L1结合实验的检测结果；
图12为实施例4中ELISA法检测融合蛋白与抗体PD-L1结合实验的曲线图；图中：Lane4：包被：M一抗，加P23572μg/孔，反应1h；
图13为实施例4中ELISA法检测融合蛋白与抗体PD-L2结合实验的检测结果；
图14为实施例4中ELISA法检测融合蛋白与抗体PD-L2结合实验的曲线图；图中：Lane9：包被：M一抗，加P23572μg/孔，反应1h；
图15为实施例6中MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白关于降低肿瘤体积的对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子，由PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因组成。所述核酸分子的片段长度在2577bp，该核酸分子编码的融合蛋白具有显著的肿瘤血管靶向性和抗肿瘤作用。
在本发明中，所述PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因，按照5’端到3’端的顺序优选的依次为MIP3α、FGFR1、鼠源抗体Fc段和PD1。
在本发明中，所述MIP3α的编码基因为任何能够编码MIP3α蛋白的核苷酸序列，优选的选择SEQ ID NO.87所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.87所示核苷酸具有99％以上同源性的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方式中，所述MIP3α的编码基因更优选为SEQ IDNO.87所示的核苷酸序列。所述与SEQ ID NO.87所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的PD1编码序列中获得，在此不再赘述。
在本发明中，所述FGFR1的编码基因为任何能够编码FGFR1蛋白的核苷酸序列，优选的选自SEQ ID NO.88所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.88所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。在本发明的一些实施例中，FGFR1的编码基因更优选为SEQ ID NO.88所示的核苷酸序列。所述与SEQ ID NO.88所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的FGFR1编码序列中获得，在此不再赘述。
在本发明中，所述PD1的编码基因为任何能够编码PD1蛋白的核苷酸序列，优选的选自SEQ ID NO.89所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.89所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列，在本发明的一些具体实施方式中PD1的编码基因更优选为SEQ ID NO.89所示的核苷酸序列。所述与SEQ ID NO.89所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的PD1编码序列中获得，在此不再赘述。
在本发明中，所述鼠源抗体Fc段的编码基因为任何能够编码得到鼠源抗体Fc段的核苷酸序列，优选的选自SEQ ID NO.4所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。在本发明的一些实施例中鼠源抗体Fc段的编码基因优选为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所述与SEQ ID NO.4所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的鼠源抗体Fc段的编码序列中获得，在此不再赘述。
在本发明中，所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.1所示，其中由5’端到3’端依次为：Leading(M-IL2)+mMIP3α(Ala28-Met97)+Linker(GGGS)3+mFGFR1(Arg22-Glu376)+Fc(Mouse IgG2a)+mPD1(Glu26-Met169)。
在本发明中，所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子包括的PD1(程序性细胞死亡蛋白1)编码序列表达的PD1蛋白能够与肿瘤细胞中高表达的配体PDL1、PDL2结合，与机体微环境中PD1竞争配体的结合，从而阻断PD1通路持续激活，达到清除免疫抑制的作用，激活正常的机体免疫系统杀伤肿瘤细胞；所述核酸分子包括的FGFR1(碱性成纤维细胞生长因子受体1)编码序列能够提供精准的肿瘤靶向作用，使得融合蛋白定向富集到肿瘤细胞部位，显著增加MIP3α在肿瘤部位的浓度，充分发挥MIP3α趋化募集DC的作用，诱导出更为强力和持久的特异性免疫反应；所述核酸分子包括的鼠源抗体Fc段的编码基因能够提供增强提呈能力的作用，以进一步增强机体免疫杀伤作用，协同PD1增强抗肿瘤效果。本发明构建的核酸分子为MIP3α增强了肿瘤靶向性，同时利用鼠源抗体Fc段和PD1降低免疫抑制并提高机体免疫杀伤能力，通过各部分的相互协同、相互促进，使得本发明所述核酸分子表达的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白具有显著的肿瘤细胞杀伤作用，与MIP3α单一蛋白相比，抗肿瘤作用有显著提升。以达到抑制肿瘤生长、延长癌症患者生存时间的效果。
本发明还提供了一种上述技术方案所述核酸分子的制备方法，包括以下步骤：
1)将引物1～引物84混合，以引物1～引物84互为模板和引物，进行第一轮PCR扩增，得到混合扩增产物；
所述引物1～引物84的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.86所示；
2)以混合扩增产物为模板，以引物1为上游引物、引物84为下游引物，进行第二轮PCR扩增，得到MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子。
在本发明中，所述引物1～引物84的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.86所示。
本发明优选的通过人工合成得到引物1～引物84，将得到的引物1～引物84等量混合得到引物混合物。在本发明中，所述引物混合物中，引物1～引物84的浓度独立地优选为20mM。本发明所述引物1～引物84在第一轮PCR扩增时互为引物，本发明通过overlapPCR方法设计得到引物1～引物84，设计上述84条引物的目的是合成MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸序列。
本发明以引物混合物为模板进行第一轮PCR扩增时：
所述第一轮PCR扩增采用的PCR扩增体系每50μL优选的包括：33μL ddH2O、5μL 10×PCR Buffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、10μL各引物浓度为20mM的引物1～引物84的混合物和1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶；
所述第一轮PCR扩增采用的PCR反应程序优选的为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环25次；72℃5min。
得到混合扩增产物后，本发明优选的以混合扩增产物为模板，以引物1为上游引物、引物84为下游引物，进行第二轮PCR扩增，得到MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子。
在本发明中，所述第二轮PCR扩增时：
所述第二轮PCR扩增采用的PCR扩增体系每50μL优选包括：40μL ddH2O、5μL 10×PCR Buffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为20mM的引物1、0.5μL浓度为20mM的引物84、1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶和2μL混合扩增产物；
所述第二轮PCR扩增采用的PCR反应程序优选为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，循环30次；72℃5min。
本发明还提供了一种上述技术方案所述核酸分子编码得到的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列具有99％以上同源性的氨基酸序列。本发明所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的理论分子量为91KDa，实际分子量约为130KDa。本发明所述融合蛋白能够与抗体FGFR1、抗体MIP3α、抗体PD-1、PD-L1以及PD-L2结合，即表明所述融合蛋白具有结合PD-L1、PD-L2配体的作用，并含有MIP3α。本发明所述融合蛋白在小鼠体内半衰期约为45h。试验表明，本发明所述的融合蛋白能够有效减少小鼠乳腺癌4T1小鼠移植瘤肿瘤体积和瘤重，对小鼠体重无显著改变，其抗肿瘤效果好，副作用较小。
本发明还提供了一种用于表达所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的重组表达载体，所述表达载体中包含前述技术方案所述核酸分子。本发明对如何制备重组表达载体无特殊限定，采用本领域已知方式即可。本发明所述重组表达载体优选为哺乳动物表达载体，在哺乳动物中表达有利于保持MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的生物活性。在本发明的具体实施例中，本发明以pcDNA3.1(+)为载体构建得到含有MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子的重组表达载体，所述pcDNA3.1(+)的图谱如图1所示。
本发明还提供了前述技术方案所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了前述技术方案所述制备方法得到的核酸分子在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了前述技术方案所述MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述重组表达载体在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。
本发明优选的，上述应用中所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌和肾细胞癌等。
本发明还提供了一种特异性抗肿瘤药物，包括前述技术方案所述的核酸分子和药学上可接受的辅料，或者包括前述技术方案所述的融合蛋白和药学上可接受的辅料。优选的，在所述特异性抗肿瘤药物中，MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的质量百分含量优选为1～99％，更优选为50～99％。
在本发明中，所述特异性抗肿瘤药物优选的为抗肿瘤疫苗，该抗肿瘤疫苗通过瘤内注射使体内局部肿瘤组织富集高浓度本发明所述的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，通过提高机体免疫和提高MIP3α抗肿瘤效果的协同作用，获得更为显著的抗肿瘤效果。
进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物中还包括药用辅料；所述药用辅料包括但不限于药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。其中，药用载体包括但不限于脂质体、醇质体、聚合物胶束、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米载体、介孔二氧化硅纳米粒等；所述稀释剂、佐剂和赋形剂等药物辅料具体的可以包括药用防腐剂、抗氧化剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂或等渗和吸收延缓剂等。
进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂；具体的，所述片剂包括但不限于糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含片等；所述溶液剂包括但不限于注射剂、口服液；所述胶囊剂包括但不限于硬胶囊剂、软胶囊剂等。具体的，当本发明需要将抗肿瘤药物制成特定剂型时，按照剂型选择适宜的药用辅料。
进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物的给药途径包括但不限于注射给药、口服给药、直肠给药等。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子的构建
1)以引物1～引物84等量混合，得到引物1～引物84各自浓度为20mM的引物混合物，引物混合物中的引物1～引物84互为引物和模板，按照以下条件进行第一轮PCR扩增，得到混合扩增产物。
所述第一轮PCR扩增采用的PCR扩增体系为50μL：33μL ddH2O、5μL 10×PCRBuffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、10μL各引物浓度为20mM的引物1～引物84的混合物和1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶；
所述第一轮PCR扩增采用的PCR反应程序为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环25次；72℃5min。
2)以混合扩增产物为模板，以引物1为上游引物、引物84为下游引物，按照下述条件进行第二轮PCR扩增，得到MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述第二轮PCR扩增时：
所述第二轮PCR扩增采用的PCR扩增体系每50μL优选的包括：40μL ddH2O、5μL 10×PCR Buffer、1μL各物质浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为20mM的引物1、0.5μL浓度为20mM的引物84、1μL浓度为2.5U/L的Pfu高保真DNA聚合酶和2μL混合扩增产物；
所述第二轮PCR扩增采用的PCR反应程序优选的为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，循环30次；72℃5min。
3)PCR产物的凝胶回收：
使用1.8％的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳分离，在紫外透射仪中用手术刀切下含有目的PCR产物的琼脂糖凝胶，然后用江苏省弗泰生物科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物(详细步骤见相关说明书)
详细实验步骤：
(1)在紫外透射仪里，用手术刀切下通过琼脂糖凝胶电泳方式分离开的、含有目的DNA的琼脂糖凝胶(切胶应尽量的小并避免切到其他条带)。切碎该凝胶，置入做好标记的2.0ml离心管中。
(2)用含该凝胶的离心管重量减去空白2.0ml离心管重量，得到凝胶重量。按每100mg折换为100μL的方式，确定凝胶体积。
(3)向含该凝胶的离心管中，加入3倍凝胶体积的Binding I溶液。
(4)50℃水浴，每2分钟进行一次颠倒混合，直至凝胶完全溶解。在此时间内进行吸附柱的柱平衡，方法如下：
向DNA Binding column B吸附柱(杭州莱枫)(该吸附柱已放置于2ml收集管中)中加入500μL平衡液，12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(5)将凝胶液转移至吸附柱中，室温放置2分钟。12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)向吸附柱中加入600μL已加好无水乙醇的漂洗液washing，12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)重复步骤(6)，在此时间内将洗脱用的超纯水50℃水浴预热。
(8)12000rpm离心2分钟，以彻底去除吸附柱中残余漂洗液。
(9)将吸附柱置于干净的已做好名称标记的1.5ml离心管中，向柱膜中央悬空滴加30～50μL预热好的超纯水，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟，丢弃吸附柱，回收完毕。
(10)使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
4)使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳对第二轮PCR扩增得到的目的产物进行检测，结果如图2所示。可以看出，第二轮PCR扩增得到约2577bp的特异性DNA片段，与理论值相符，表明本发明所述的制备方法能够成功获得MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子序列。
实施例2目标质粒的构建及筛选、鉴定
1)LB培养基制备
液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入950ml去离子水溶解后，用5mol/LNaOH调至pH 7.2，最后加水至1000ml，分装后10磅高压灭菌20min。
固体培养基：琼脂粉1.5g，溶于100ml LB液体培养基中，10磅高压灭菌20min。
2)目的基因片段和质粒的酶切
以AflII和XbaI对pcDNA3.1(+)进行双酶切，酶切反应体系为：pcDNA3.1(+)12μL、10buffer 2μL、AflII1μl、XbaI 1μL和ddH2O 4μL，共计20μL。
将上述体系置37℃水浴6h，然后65℃，15min灭活限制性内切酶。酶切产物用江苏省弗泰生物科技有限公司的凝胶回收试剂盒分别做凝胶回收纯化，10g/L琼脂糖电泳鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量。
3)质粒和目的基因片段的连接
将实施例1扩增得到的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的核酸分子和酶切后的pcDNA3.1(+)按如下反应体系进行连接反应：
目的片段6μl、pcDNA3.1(+)2μl、10ligase buffer 1μL和T4DNAligase(10U/L)1μL，共计10μL。连接反应体系置于4℃12h后，以65℃，15min灭活连接酶。
4)制备新鲜感受态细菌及转化
接种E coliDH5α单菌落于1.5ml LB培养基，37℃培养过夜250rpm；转种1ml过夜培养菌液于40ml LB，37℃培养至细菌密度OD 600为0.4，取1ml菌液至1.5ml离心管，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；加500μl 75mM CaCl2混匀，冰浴30min；4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；加100μl 75mM CaCl2重新混匀，此即为新鲜的感受态细菌。另取1.5ml离心管，加连接反应液5μl，再加50μl新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30min；42℃水浴100s，再冰浴2min；加600μLLB，37℃1h后，取100μl涂布于含100μg/mlAmp的LB平皿，37℃培养过夜。
5)重组质粒PCR鉴定
在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：
ddH2O 20.75μL
10×PCRbuffer 2.5μL
10mmol dNTPs 0.5μL
引物1(SEQ ID NO.3) 0.5μL
引物84(SEQ ID NO.87) 0.5μL
菌落模板少许
Taq DNA polymerase (12U/μl)0.25μL
总计 25μL
以上体系先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸150sec，30个循环，最后72℃延伸5min。所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测，结果如图3所示。
6)重组质粒QC鉴定
上述PCR产物阳性之克隆移入3mLLB液体培养基中，于37℃恒温振荡细菌摇床中250rpm培养12小时。小量抽取质粒后，按如下反应体系进行PCR反应：
PCR反应体系：
ddH2O 41μL
10×PCR Buffer 5μL
dNTP(2.5mM each) 1μL
引物1(20mM) 0.5μL
引物84(20mM) 0.5μL
Pfu高保真DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μL
阳性克隆质粒 1μL
共计 50μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸150s，循环30次；
上述PCR产物阳性之克隆小量抽取质粒后，按如下反应体系进行酶切反应：
质粒 16μl
10×buffer 2μl
AflII 1μl
XbaI 1μl
总计 20μL。
混匀，5000rpm稍离心后，37℃水浴2h后，65℃水浴灭活AflII、XbaI15min。用含终浓度为50μg/ml溴化乙锭(EB)的1.2％琼脂糖制胶，分别取DNAMarker、酶切产物后，100v电压电泳30min后观察，结果如图4所示。
实施例3融合蛋白生产实验
1、细胞传代
1.1培养液配置
根据不同细胞配置相应的培养液，加入一定量的FBS，血清浓度可视细胞状态和传代次数做相应调整。
1.2细胞的消化与传代
取出处于对数生长期的细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化，镜下可见细胞漂浮并分散后，加入适量含血清的培养基终止消化，细胞吹散后加入离心管中，1000rpm离心4min。弃上清，轻轻滑动离心管，使底部细胞沉淀飘起。加入适量体积的培养液吹打细胞使其分散均匀，将细胞悬浮液转入培养皿中，摇匀，置于CO2培养箱中培养。
2、细胞瞬时转染
2.1待转染细胞的准备
将正处于对数生长期细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化，镜下可见细胞漂浮并分散后，加入适量含血清的培养基终止消化，细胞吹散后加入离心管中，1000rpm离心4min。弃上清，轻轻滑动离心管，使底部细胞沉淀飘起。根据细胞计数结果，加入相应体积的含血清培养液，使细胞密度在2.5*105个/ml。将密度为2.5*105个/ml的细胞液加入到10cm培养皿中，每平皿10ml。将平皿放入37℃培养箱培养，当细胞贴壁90～95％时进行转染(培养16～20h)。
2.2转染试剂的准备
2.2.1将脂质体、DNA、培养液置于15～25℃环境中20分钟。
2.2.2取8μg实施例2制备得到的质粒DNA(MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的重组表达载体)加入到1ml培养液中，用涡旋混合仪震荡2-3秒混匀。
2.2.3按照最适比例(转染试剂：质粒DNA为5:2)向DNA溶解液中加入20μL转染试剂。
2.2.4漩涡震荡转染混合液2～3秒，使其充分混匀后15～25℃环境中孵育20分钟。
2.3细胞转染
用移液器轻柔吹打转染液(1ml)，将混匀后的转染液加入到10cm培养皿中，轻轻摇匀，37℃培养箱培养6小时后，弃去培养皿中的培养基，重新加入20mL新鲜培养基。
2.4上清收集
待培养皿中培养基变黄后(约48小时后)，取样检测蛋白表达量(见表1)。每隔24小时取10ml上清，补加10ml新鲜培养基，转染后第4-6天，每隔24小时取15ml上清，补加15ml新鲜培养基。取样10～12天后，结束上清收集。
MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的表达结果如图5所示，可以知晓该融合蛋白表达量约为2.5mg/L。
2.5细胞上清的离心
用500mL平底离心瓶7500rpm，4℃，离心15min，将上清倒出，收集上清，过滤。
3、上清上ProteinA柱与纯化
3.1上清过ProteinA柱前准备
3.1.1上清收集后及时离心，用0.22um滤膜过滤，根据蛋白等电点加入适量Tris8.0调pH至7.0-7.4，且上清pH值至少偏离蛋白等电点一个pH值，确保上清pH值远离蛋白等电点又在层析柱最佳结合目的蛋白的pH范围内。
3.1.2根据上清的培养方式选择纯化柱的类型，稳定转染上清选择GE预装柱。
3.1.3处理、平衡柱子：将软管的进液端插入1X PBS，用15倍柱体积PBS处理柱子。
3.2上清过ProteinA柱
3.2.1将软管的进液端插入装有细胞上清液的蓝盖瓶最底端，柱子的出液连接废液筒，在蓝盖瓶、软管，柱子及废液筒上做好对应标记。调节蠕动泵至合适的转速，过亲和层析柱。
3.2.2过柱结束前从柱子的出液口续取1ml液体，废液筒中取1ml废液做ELISA检测，废液中有一定量蛋白(0.5mg以上)仍需再过柱。
3.3洗脱
3.3.1上样结束后，用平衡液(一般为1X PBS)平衡柱子，洗掉一部分杂蛋白，直至洗脱液加入到蛋白测定液中不变蓝为止，平衡液的pH值偏离蛋白的等电点。
3.3.2进液端换上pH 3.4的柠檬酸洗脱液，先空走一段，排除管内气泡后再接上层析柱顶端接头。用蛋白测定液检查是否有蛋白流出，若测定液显蓝色，开始收集蛋白。蛋白收集管中加入一定量的Tris8.0缓冲液，调节蛋白pH至弱碱环境，但不接近蛋白等电点。当蛋白测定液不再变蓝后，结束收集。
3.4蛋白透析
3.4.1将洗脱下的目的蛋白放透析袋中，再放入含1xPBS缓冲液的烧杯中，烧杯置磁力搅拌器上，4℃透析，6小时后，换新的1x PBS再透析6小时。
3.4.2透析结束后，用无菌吸头吸取蛋白至离心管中，管子做好标记。取样检测SDS-PAGE(见表2)。
3.5洗脱后柱子处理
3.5.1用5倍柱体积甘氨酸溶液(pH2.5)洗脱其余蛋白，蛋白测定液不再变蓝后换5倍柱体积Tris溶液(pH8.0)冲洗柱子；
3.5.2用10倍柱体积的平衡液(1X PBS)平衡柱子，最后用5倍柱体积的20％ET封存层析柱。
SDS-PAGE检测结果如图6所示，可以看出，该融合蛋白的理论分子量为91KDa，实际分子量约为130KDa。
SEC检测结果如图7所示，其中样品“P2357”即表示本发明制备表达纯化得到的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白。可以看出，该融合蛋白的纯度在90％以上。
实施例4MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白结合实验：
1、与FGFR1抗体的结合性能
原理：通过Westernblot对其FGFR1进行定性
样品：MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白(编号：P2375)
批号：FT1803809
上样量：1.0μg
使用抗体：FGFR1polyclonal antibody(Host:Rabbit)HRP，GoatAnti-Rabbit IgG
结果如图8所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白能够与FGFR1抗体有结合。
2、与MIP3a抗体的结合性能
样品：MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白(编号：P2375)
原理：通过Westernblot对其片段MIP3a进行定性
批号：FT1803809
上样量：1.0μg
使用抗体：Ccl20polyclonal antibody(Host:Rabbit)HRP，GoatAnti-Rabbit IgG
结果如图9所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白能够与MIP3α抗体有结合。
3、与PD1抗体的结合性能
样品：MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白(编号：P2375)
原理：通过Westernblot对其片段PD-1进行定性
批号：FT1803809
上样量：1.0μg
使用抗体：PD1polyclonal antibody(Host:Rabbit)HRP，GoatAnti-Rabbit IgG
结果如图10所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白能够与PD1抗体有结合。
4、与PD1抗体的ELISA结合实验
样品：MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白(编号：P2375)
P069PD-L1(mouse):Fc(mouse)(rec.)/FT1204104
加样：P069生物素标记(起始浓度2.5μg/mL，1/4梯度稀释)
Lane4曲线图如图12所示，结果显示，所述融合蛋白与PD-L1有结合，ED50为70ng/ml。
5、与PD1抗体的ELISA结合实验
样品：MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白(编号：P2375)
P1400PD-L2(mouse):Fc(mouse)(rec.)/FT1503369
加样：P1400生物素标记(起始浓度2.5μg/mL，1/5梯度稀释)
Lane9曲线图如图12所示，结果显示，所述融合蛋白与PD-L1有结合，ED50为64ng/ml。
实施例5MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白的半衰期测定实验
动物实验方案：
给4只7周龄大的C57BL/6小鼠尾静脉注射小鼠CCL20MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，每只给药0.1mg(4只小鼠(m1，m2，m3，m4)是给药，另外一只(z1)为对照组)，采血时间为30min，9h，24h，48h，72h，96h。血样(血浆)用特异性ELISA检测小鼠MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白浓度(检测小鼠IgG2a的试剂盒)。结果显示MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白能在小鼠体内半衰期约为45h。
半衰期计算公式：c1为(m1-9h)，c2为(m1-24h)，t1为9h，t2为24h
斜率(b)＝(logc1-logc2)/(t1-t2)
＝(log1.121-log0.889)/(9h-24h)
＝-0.0067135901
消除率常数K＝-2.303*b＝0.0154613980
半衰期t1/2＝0.693/k≈45h
实施例6FGFR1-PD1-MIP-3a/Fc融合蛋白抗肿瘤作用观察
1、模型的制备
购买小鼠乳腺癌细胞株4T1并进行培养，将培养的小鼠乳腺癌细胞4T1的细胞液浓度调整至1×107个/mL，以每只0.1mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。
2、分组与给药
待肿瘤长至100mm3时将动物随机分为7组，每组5只。具体分组为：
(1)MIP3α-FGFR1-PD1/Fc组：将实施例3制备得到的MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
(2)FGFR1-Fc组：将实施例3制备得到的FGFR1-Fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
(3)MIP3α-Fc组：将实施例3制备得到的MIP3α-Fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
(4)PD1-Fc组：将实施例3制备得到的PD1-Fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
(5)FGFR1/MIP3α-Fc组：将实施例3制备得到的FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
(6)佐剂生理盐水组：等体积生理盐水与与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天给药一次，持续35天；
(7)生理盐水组：相同体积的生理盐水经瘤内注射，500ug/kg，100ul/20g，三天一次，持续35天；
使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。观察动物给药过程和给药后的变化(活动，外观，精神)，连给药30天后，随即处死小鼠，手术剥取瘤块称重。
3、观测指标
(1)肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长宽。
(2)根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：
RTV＝Vt/V0
其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
4、观测结果
如图15所示，MIP3α-FGFR1-PD1/Fc组、MIP3α-FGFR1/Fc组、FGFR1-Fc组、MIP3α-Fc组、PD1-Fc组与生理盐水组或佐剂生理盐水组相比，肿瘤体积均有显著降低，并且随着给药的延长肿瘤体积不会显著增加，即Fc融合蛋白MIP3α-FGFR1-PD1/Fc组、MIP3α-FGFR1/Fc组、FGFR1-Fc组、MIP3α-Fc组、PD1-Fc组融合蛋白均具有一定的抑制肿瘤生长的作用。
还可以看出，MIP3α-FGFR1-PD1/Fc组与MIP3α-FGFR1/Fc组、FGFR1-Fc组、MIP3α-Fc组、PD1-Fc组相比，肿瘤体积更小，并且均存在显著差异。这表明本发明提供的Fc融合蛋白MIP3α-FGFR1-PD1/Fc相对于MIP3α-FGFR1/Fc组、FGFR1-Fc组、MIP3α-Fc组、PD1-Fc组融合蛋白具有更为显著的抑制肿瘤生长、降低肿瘤体积的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南医学院第一附属医院
<120> MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白及其核酸分子和应用
<160> 89
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttaagcggc cgctaatcac tcctcacagt gacctcaagt cctgcaggca tgtacagcat 60
gcagctcgca tcctgtgtca cattgacact tgtgctcctt gtcaacagaa gcttcgcaag 120
caactacgac tgttgcctct cgtacataca gacgcctctt ccttccagag ctattgtggg 180
tttcacaaga cagatggccg atgaagcttg tgacattaat gctatcatct ttcacacgaa 240
gaaaagaaaa tctgtgtgcg ctgatccaaa gcagaactgg gtgaaaaggg ctgtgaacct 300
cctcagccta agagtcaaga agatgggtgg aggttcgggt ggaggttcag gtggaggttc 360
taggccagcc ccaaccttgc ctgaacaagc tcagccctgg ggagtccctg tggaagtgga 420
gtctctcctg gtccaccctg gcgacctgct acagcttcgc tgtcggcttc gcgatgatgt 480
gcagagcatc aactggctgc gggatggggt gcagctggtg gagagcaacc gtacccgcat 540
cacaggggag gaggtggagg tgcgggactc catccccgct gactctggcc tctacgcttg 600
cgtgaccagc agcccctctg gcagcgatac cacctacttc tccgtcaatg tctcagatgc 660
actcccatcc tcggaagatg atgacgacga cgatgactcc tcctcggagg agaaagagac 720
ggacaacacc aaaccaaacc gtaggcctgt agctccctac tggacatccc cagagaaaat 780
ggagaagaaa ctgcatgcgg tgcccgctgc caagacggtg aagttcaagt gcccgtcgag 840
tgggacaccc aaccccactc tgcgctggtt gaaaaatggc aaagagttta agcctgacca 900
ccgaattgga ggctacaagg ttcgctatgc cacctggagc atcataatgg attctgtggt 960
gccttctgac aagggcaact acacctgcat cgtggagaat gagtatggga gcatcaacca 1020
cacctaccag cttgacgtcg tggaacgatc tccgcaccga cccatccttc aggcagggct 1080
gcctgccaac aagacagtgg ccctgggcag caatgtggag ttcatgtgta aggtgtacag 1140
cgatccgcag cctcacattc agtggctgaa gcacatcgag gtgaacggga gtaagatcgg 1200
gccagacaac ttgccgtatg tccagatcct gaagactgct ggagttaata ccaccgacaa 1260
ggaaatggag gtgcttcatc tacggaatgt ctcctttgag gatgcggggg agtatacgtg 1320
cttggcgggt aactctatcg gactctccca tcactctgca tggttgaccg ttctggaagc 1380
cctggaagag agaccagctg tgatgacctc accgctctac ctggaggatc ccagagggcc 1440
cacaatcaag ccctgtcctc catgcaaatg cccagcacct aacctcttgg gtggaccatc 1500
cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg atctccctga gccccatagt 1560
cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagat gtccagatca gctggtttgt 1620
gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat agagaggatt acaacagtac 1680
tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac tggatgagtg gcaaggagtt 1740
caaatgcaag gtcaacaaca aagacctccc agcgcccatc gagagaacca tctcaaaacc 1800
caaagggtca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct ccaccagaag aagagatgac 1860
taagaaacag gtcactctga cctgcatggt cacagacttc atgcctgaag acatttacgt 1920
ggagtggacc aacaacggga aaacagagct aaactacaag aacactgaac cagtcctgga 1980
ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctgagagtg gaaaagaaga actgggtgga 2040
aagaaatagc tactcctgtt cagtggtcca cgagggtctg cacaatcacc acacgactaa 2100
gagcttctcc cggactccgg gtaaagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt 2160
ctacccagcc tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc 2220
caactggtcg gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga 2280
aaaacaggcc gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat 2340
catacagctg cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga 2400
cagtggcatc tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag 2460
ccctggagca gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag 2520
cccctcgccc aaaccagaag gccggtttca aggcatgtga gtctaga 2567
<210> 2
<211> 814
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ser Asn Tyr Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Ile Gln Thr Pro Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Ala Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Met Ala Asp Glu Ala Cys
20 25 30
Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Arg Lys Ser Val Cys
35 40 45
Ala Asp Pro Lys Gln Asn Trp Val Lys Arg Ala Val Asn Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Arg Val Lys Lys Met Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Arg Pro Ala Pro Thr Leu Pro Glu Gln Ala Gln Pro Trp Gly
85 90 95
Val Pro Val Glu Val Glu Ser Leu Leu Val His Pro Gly Asp Leu Leu
100 105 110
Gln Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val Gln Ser Ile Asn Trp Leu
115 120 125
Arg Asp Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Asn Arg Thr Arg Ile Thr Gly
130 135 140
Glu Glu Val Glu Val Arg Asp Ser Ile Pro Ala Asp Ser Gly Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Cys Val Thr Ser Ser Pro Ser Gly Ser Asp Thr Thr Tyr Phe Ser
165 170 175
Val Asn Val Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp
180 185 190
Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr Lys Pro Asn
195 200 205
Arg Arg Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys
210 215 220
Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro
225 230 235 240
Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys
245 250 255
Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala
260 265 270
Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn
275 280 285
Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr
290 295 300
Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe
325 330 335
Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys
340 345 350
His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr
355 360 365
Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Met
370 375 380
Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr
385 390 395 400
Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp
405 410 415
Leu Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg Pro Ala Val Met Thr Ser
420 425 430
Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val
485 490 495
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
500 505 510
Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala
515 520 525
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys
530 535 540
Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
545 550 555 560
Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
565 570 575
Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val
580 585 590
Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly
595 600 605
Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp
625 630 635 640
Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His
645 650 655
Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Glu Val
660 665 670
Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr
675 680 685
Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp
690 695 700
Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln
705 710 715 720
Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln
725 730 735
Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His
740 745 750
Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys
755 760 765
Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly
770 775 780
Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr
785 790 795 800
Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met
805 810
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatccttaa gcggccgcta atcactcctc acagtgacct caagtcct 48
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatgcgagc tgcatgctgt acatgcctgc aggacttgag gtcactgtga 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcatgcagct cgcatcctgt gtcacattga cacttgtgct ccttgtcaac 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaacagtcg tagttgcttg cgaagcttct gttgacaagg agcacaagtg 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagcaacta cgactgttgc ctctcgtaca tacagacgcc tcttccttcc 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccatctgtct tgtgaaaccc acaatagctc tggaaggaag aggcgtctgt 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtttcac aagacagatg gccgatgaag cttgtgacat taatgctatc 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gattttcttt tcttcgtgtg aaagatgata gcattaatgt cacaagcttc 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctttcacac gaagaaaaga aaatctgtgt gcgctgatcc aaagcagaac 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggctgaggag gttcacagcc cttttcaccc agttctgctt tggatcagcg 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgtgaacct cctcagccta agagtcaaga agatgggtgg aggttcgggt 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttggggctgg cctagaacct ccacctgaac ctccacccga acctccaccc 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gttctaggcc agccccaacc ttgcctgaac aagctcagcc ctggggagtc 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agggtggacc aggagagact ccacttccac agggactccc cagggctgag 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctctcctgg tccaccctgg cgacctgcta cagcttcgct gtcggcttcg 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcccgcagcc agttgatgct ctgcacatca tcgcgaagcc gacagcgaag 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcaactggc tgcgggatgg ggtgcagctg gtggagagca accgtacccg 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtcccgcac ctccacctcc tcccctgtga tgcgggtacg gttgctctcc 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtggaggtgc gggactccat ccccgctgac tctggcctct acgcttgcgt 50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtaggtggta tcgctgccag aggggctgct ggtcacgcaa gcgtagaggc 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcagcgata ccacctactt ctccgtcaat gtctcagatg cactcccatc 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtcatcgt cgtcgtcatc atcttccgag gatgggagtg catctgagac 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gatgacgacg acgatgactc ctcctcggag gagaaagaga cggacaacac 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agggagctac aggcctacgg tttggtttgg tgttgtccgt ctctttctcc 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtaggcctgt agctccctac tggacatccc cagagaaaat ggagaagaaa 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgtcttggca gcgggcaccg catgcagttt cttctccatt ttctctgggg 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cccgctgcca agacggtgaa gttcaagtgc ccgtcgagtg ggacacccaa 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctttgccatt tttcaaccag cgcagagtgg ggttgggtgt cccactcgac 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gctggttgaa aaatggcaaa gagtttaagc ctgaccaccg aattggaggc 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atgatgctcc aggtggcata gcgaaccttg tagcctccaa ttcggtggtc 50
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgccacctgg agcatcataa tggattctgt ggtgccttct gacaagggca 50
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cccatactca ttctccacga tgcaggtgta gttgcccttg tcagaaggca 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atcgtggaga atgagtatgg gagcatcaac cacacctacc agcttgacgt 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaggatgggt cggtgcggag atcgttccac gacgtcaagc tggtaggtgt 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgcaccgacc catccttcag gcagggctgc ctgccaacaa gacagtggcc 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
accttacaca tgaactccac attgctgccc agggccactg tcttgttggc 50
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgtggagttc atgtgtaagg tgtacagcga tccgcagcct cacattcagt 50
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttactcccg ttcacctcga tgtgcttcag ccactgaatg tgaggctgcg 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cgaggtgaac gggagtaaga tcgggccaga caacttgccg tatgtccaga 50
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cggtggtatt aactccagca gtcttcagga tctggacata cggcaagttg 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ctgctggagt taataccacc gacaaggaaa tggaggtgct tcatctacgg 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tatactcccc cgcatcctca aaggagacat tccgtagatg aagcacctcc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gaggatgcgg gggagtatac gtgcttggcg ggtaactcta tcggactctc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cagaacggtc aaccatgcag agtgatggga gagtccgata gagttacccg 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tgcatggttg accgttctgg aagccctgga agagagacca gctgtgatga 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tctgggatcc tccaggtaga gcggtgaggt catcacagct ggtctctctt 50
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tctacctgga ggatcccaga gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tggtccaccc aagaggttag gtgctgggca tttgcatgga ggacagggct 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg 50
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tatggggctc agggagatca tgagtacatc cttgatcttt ggagggaaga 50
<210> 53
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg 50
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cacaaaccag ctgatctgga catctgggtc atcctcgctc acatccacca 50
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccagatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtactgttgt aatcctctct atgggtttgt gtctgagctg tgtgtacttc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatagagag gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aactccttgc cactcatcca gtcctggtgc tggatgggga gggcactgac 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggttttgaga tggttctctc gatgggcgct gggaggtctt tgttgttgac 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgagagaac catctcaaaa cccaaagggt cagtaagagc tccacaggta 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atctcttctt ctggtggagg caagacatat acctgtggag ctcttactga 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cctccaccag aagaagagat gactaagaaa caggtcactc tgacctgcat 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtaaatgtct tcaggcatga agtctgtgac catgcaggtc agagtgacct 50
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<212> DNA
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acttcatgcc tgaagacatt tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca 50
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<212> DNA
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gactggttca gtgttcttgt agtttagctc tgttttcccg ttgttggtcc 50
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<211> 50
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ctacaagaac actgaaccag tcctggactc tgatggttct tacttcatgt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcttttcc actctcagct tgctgtacat gaagtaagaa ccatcagagt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat agctactcct 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtgcagacc ctcgtggacc actgaacagg agtagctatt tctttccacc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc tcccggactc 50
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<211> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ctccagggcc cattggggac ctctttaccc ggagtccggg agaagctctt 50
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<400> 73
cccaatgggc cctggaggtc cctcaccttc tacccagcct ggctcacagt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctgcaggtga aggtggcatt tgctccctct gacactgtga gccaggctgg 50
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<211> 50
<212> DNA
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<400> 75
gccaccttca cctgcagctt gtccaactgg tcggaggatc ttatgctgaa 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tctggttgct gggactcagg cggttccagt tcagcataag atcctccgac 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tgagtcccag caaccagact gaaaaacagg ccgccttctg taatggtttg 50
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ctggaagcgg gcatcctgga cgggttggct caaaccatta cagaaggcgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
acacacggcg caatgacagt ggcatctacc tctgtggggc catctccctg 50
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tccagggctc tcctcgattt ttgccttggg gtgcagggag atggccccac 50
<210> 83
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcgaggagag ccctggagca gagctcgtgg taacagagag aatcctggag 50
<210> 84
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gcgaggggct gggatatctt gttgaggtct ccaggattct ctctgttacc 50
<210> 85
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
atatcccagc ccctcgccca aaccagaagg ccggtttcaa ggcatgtgag 50
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agagttctag actcacatgc cttgaaaccg 30
<210> 87
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
atggcctgcg gtggcaagcg tctgctcttc cttgctttgg catgggtact gctggctcac 60
ctctgcagcc aggcagaagc agcaagcaac tacgactgtt gcctctcgta catacagacg 120
cctcttcctt ccagagctat tgtgggtttc acaagacaga tggccgatga agcttgtgac 180
attaatgcta tcatctttca cacgaagaaa agaaaatctg tgtgcgctga tccaaagcag 240
aactgggtga aaagggctgt gaacctcctc agcctaagag tcaagaagat gtaa 294
<210> 88
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
atgtggggct ggaagtgcct cctcttctgg gctgtgctgg tcacagccac tctctgcact 60
gccaggccag ccccaacctt gcctgaacaa gctcagccct ggggagtccc tgtggaagtg 120
gagtctctcc tggtccaccc tggcgacctg ctacagcttc gctgtcggct tcgcgatgat 180
gtgcagagca tcaactggct gcgggatggg gtgcagctgg tggagagcaa ccgtacccgc 240
atcacagggg aggaggtgga ggtgcgggac tccatccccg ctgactctgg cctctacgct 300
tgcgtgacca gcagcccctc tggcagcgat accacctact tctccgtcaa tgtctcagat 360
gcactcccat cctcggaaga tgatgacgac gacgatgact cctcctcgga ggagaaagag 420
acggacaaca ccaaaccaaa ccgtaggcct gtagctccct actggacatc cccagagaaa 480
atggagaaga aactgcatgc ggtgcccgct gccaagacgg tgaagttcaa gtgcccgtcg 540
agtgggacac ccaaccccac tctgcgctgg ttgaaaaatg gcaaagagtt taagcctgac 600
caccgaattg gaggctacaa ggttcgctat gccacctgga gcatcataat ggattctgtg 660
gtgccttctg acaagggcaa ctacacctgc atcgtggaga atgagtatgg gagcatcaac 720
cacacctacc agcttgacgt cgtggaacga tctccgcacc gacccatcct tcaggcaggg 780
ctgcctgcca acaagacagt ggccctgggc agcaatgtgg agttcatgtg taaggtgtac 840
agcgatccgc agcctcacat tcagtggctg aagcacatcg aggtgaacgg gagtaagatc 900
gggccagaca acttgccgta tgtccagatc ctgaagactg ctggagttaa taccaccgac 960
aaggaaatgg aggtgcttca tctacggaat gtctcctttg aggatgcggg ggagtatacg 1020
tgcttggcgg gtaactctat cggactctcc catcactctg catggttgac cgttctggaa 1080
gccctggaag agagaccagc tgtgatgacc tcaccgctct acctggagat cattatctac 1140
tgcaccgggg ccttcctgat ctcctgcatg ttgggctctg tcatcatcta taagatgaag 1200
agcggcacca agaagagcga cttccatagc cagatggctg tgcacaagct ggccaagagc 1260
atccctctgc gcagacaggt aacagtgtca gctgactcca gtgcatccat gaactctggg 1320
gttctcctgg ttcggccctc acggctctcc tccagcggga cccccatgct ggctggagtc 1380
tccgaatatg agctccctga ggatccccgc tgggagctgc cacgagacag actggtctta 1440
ggcaaaccac ttggcgaggg ctgcttcggg caggtggtgt tggctgaggc catcgggctg 1500
gataaggaca aacccaaccg tgtgaccaaa gtggccgtga agatgttgaa gtccgacgca 1560
acggagaagg acctgtcgga tctgatctcg gagatggaga tgatgaaaat gattgggaag 1620
cacaagaata tcatcaacct tctgggagcg tgcacacagg atggtcctct ttatgtcatt 1680
gtggagtacg cctccaaagg caatctccgg gagtatctac aggcccggag gcctcctggg 1740
ctggagtact gctataaccc cagccacaac cccgaggaac agctgtcttc caaagatctg 1800
gtatcctgtg cctatcaggt ggctcggggc atggagtatc ttgcctctaa gaagtgtata 1860
caccgagacc tggctgctag gaacgtcctg gtgaccgagg ataacgtaat gaagatcgca 1920
gactttggct tagctcgaga cattcatcat atcgactact acaagaaaac caccaacggc 1980
cggctgcctg tgaagtggat ggcccctgag gcgttgtttg accggatcta cacacaccag 2040
agcgatgtgt ggtcttttgg agtgctcttg tgggagatct tcactctggg tggctcccca 2100
taccccggtg tgcctgtgga ggaacttttc aagctgctga aggagggtca tcgaatggac 2160
aagcccagta actgtaccaa tgagctgtac atgatgatgc gggactgctg gcatgcagtg 2220
ccctctcaga gacctacgtt caagcagttg gtggaagacc tggaccgcat tgtggccttg 2280
acctccaacc aggagtatct ggacctgtcc ataccgctgg accagtactc acccagcttt 2340
cccgacacac ggagctccac ctgctcctca ggggaggact ctgtcttctc tcatgagccg 2400
ttacctgagg agccctgtct gcctcgacac cccacccagc ttgccaacag tggactcaaa 2460
cggcgctga 2469
<210> 89
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300
cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420
gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480
aaaccagaag gccggtttca aggcatggtc attggtatca tgagtgccct agtgggtatc 540
cctgtattgc tgctgctggc ctgggcccta gctgtcttct gctcaacaag tatgtcagag 600
gccagaggag ctggaagcaa ggacgacact ctgaaggagg agccttcagc agcacctgtc 660
cctagtgtgg cctatgagga gctggacttc cagggacgag agaagacacc agagctccct 720
accgcctgtg tgcacacaga atatgccacc attgtcttca ctgaagggct gggtgcctcg 780
gccatgggac gtaggggctc agctgatggc ctgcagggtc ctcggcctcc aagacatgag 840
gatggacatt gttcttggcc tctttga 867

Claims (1)

1.一种特异性抗乳腺癌肿瘤药物，其特征在于，包括MIP3α-FGFR1-PD1/Fc融合蛋白，还包括药学上可接受的辅料；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
编码所述融合蛋白的核酸分子由PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因组成；
所述PD1、FGFR1、MIP3α和鼠源抗体Fc段的编码基因，按照5’端到3’端的顺序依次为MIP3α、FGFR1、鼠源抗体Fc段和PD1；
所述融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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