CN102060916A - 肠毒素c2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用。所述的肠毒素C2超抗原突变蛋白SAM-1，SAM-2和SAM-3分别具有序列表SEQID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6中氨基酸序列；制备过程：以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的DNA片段为模板进行重叠PCR扩增，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增得到突变基因，将其克隆入表达载体pET-28a，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，构建成异源表达各肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌，经诱导后异源表达得各肠毒素C2超抗原突变蛋白。本发明突变蛋白在保持较高超抗原活性和肿瘤抑制活性的基础上，其催吐和致热活性较野生型肠毒素C2蛋白有显著的降低，具有较好的临床药用前景。
Description
技术领域
本发明涉及肠毒素C2超抗原突变蛋白，具体的说是一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用。
背景技术
超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对人体或其他哺乳动物T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。不像传统的抗原，超抗原不需要抗原递呈细胞的加工处理，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II(组织相容性复合物)分子和T细胞Vβ区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，所以致使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于的肿瘤治疗。
金黄色葡萄球菌肠毒素C2(肠毒素C2，Staphylococcal enterotoxinC2，SEC2)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，近年来受到人们的广泛关注。但是，由于肠毒素C2超抗原的作用必须依赖于与免疫系统中的MHC II分子相结合，这必然会导致其在人体中可能与来自正常组织或细胞的MHC II分子的结合，从而对正常细胞也产生一定的毒性作用；此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，因此在对人体会产生一定的毒素综合症(TSS)和食物中毒症状，并在临床上表现为呕吐、腹泻、以及致热等症状，因此限制了其临床应用和治疗可得效果。前期研究中，曾经改变了MHCII的结合能力，但发现随着毒性降低，其抑瘤活性也有显著降低，临床应用前景不大。
因此，一方面减少肠毒素C2作为细菌外毒素所带来的毒副作用，另一方面保留或增强其超抗原活性和肿瘤抑制能力，进而提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，本发明通过基因定点突变技术对SEC2中与毒性和超抗原活性相关的位点进行突变，从而达到降低毒性且保持抑瘤活性的目的，所构建的肠毒素C2超抗原突变蛋白具有极高的临床药用前景。
发明内容
本发明目的在于提供具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白，所述具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6中的氨基酸序列。
一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的编码基因，所述编码基因具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中碱基序列。
具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法：
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCCATT CTT TGT TG-3’扩增出SEC2全基因sec2；
在此基础上，以SEC2全基因sec2为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和R-Mutant：5’-TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3’；F-Mutant，5’-GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ATA T-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P1：5’-GGA ATAACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’；P2：5’-GGT TTC CTT CAG CTT TTGTTA TTC C-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-2突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-3突变基因；
将以上突变基因sam-1、sam-2、sam-3分别克隆入表达载体pET-28a，并转化大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，构建成基因工程菌，经诱导后在菌体内表达目的蛋白。并经蛋白分离纯化得到具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白纯品。
所述的诱导方法是通过以IPTG为诱导物进行诱导表达。所述的蛋白分离纯化方法为Ni亲和层析法，所用的介质为琼脂糖凝胶树脂。
具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中氨基酸序列的突变蛋白具有可作为抗肿瘤和免疫调节类的临床药物的应用前景。
本发明所具有如下优点：
1.本发明为人工构建的系列编码超抗原突变蛋白的核苷酸序列，获知其基因全序列的组成。
2.本发明利用基因工程技术，突变构建了一系列编码具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的核苷酸基因，并在大肠杆菌中表达，表达获得的一系列具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白经检验具有较好的超抗原活性和较高的肿瘤抑制活性。
3.本发明构建并获得的系列超抗原突变蛋白由于显著降低了其催吐、腹泻和致热毒性，并保持了较高的肿瘤抑制活性，因此更具有用于临床肿瘤治疗的前景。
4.本发明提供的制备大量减毒超抗原肠毒素C2突变蛋白的方法能使该系列蛋白达到高效表达及纯化，能满足工业化生产的需要。
附图说明
图1为本发明中各肠毒素C2突变蛋白基因的PCR产物核酸电泳图谱(其中M代表DL2000marker；1、2、3、4依次代表具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7中碱基序列的各突变基因的PCR产物sam-1、sam-2、sam-3和sec2m、)。
图2为本发明中各肠毒素C2突变蛋白纯品的电泳图谱(其中M代表蛋白marker；1、2、3依次代表具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6中氨基酸序列的各突变蛋白SAM-1、SAM-2和SAM-3；4代表由突变基因sec2m编码的突变蛋白SEC2M)。
图3为本发明中各肠毒素C2突变蛋白纯品的超抗原活性检测实验结果图(横坐标为剂量梯度，纵坐标为增值指数)。
图4为本发明中各肠毒素C2突变蛋白纯品的体外抑制Hepa1-6肿瘤细胞生长能力的检测结果图(其中纵坐标为抑瘤率；横坐标为各突变蛋白的剂量梯度)。
图5为本发明中各肠毒素C2突变蛋白纯品的小鼠体内抑制S180细胞生长能力的检测结果图(其中纵坐标为抑瘤率；横坐标为各突变蛋白的剂量梯度)。
图6为本发明中各肠毒素C2突变蛋白纯品的家兔致热活性检测结果图(其中纵坐标为温度上升值；横坐标为各突变蛋白的作用时间)。
图7为突变蛋白SAM-1的三维结构示意图；
图8为突变蛋白SAM-2的三维结构示意图；
图9为突变蛋白SAM-3的三维结构示意图。
具体实施方式
实施例1
具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5中碱基序列的具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白基因序列；具有序列表SEQ IDNO：7中碱基序列的sec2m突变基因序列；具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6氨基酸序列的具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白序列(参见序列表)：
具有序列表SEQ ID NO：1碱基序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白基因
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtttg atggaaaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg
251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 agctgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa
401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
451 aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501 aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag
551 gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg
601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta
651 caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc
701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：717碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：3碱基序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白基因：
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtttg atggaaaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg
251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 acatgaagga aacgcctttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa
401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
451 aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501 aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag
551 gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg
601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta
651 caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc
701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID NO.3的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：717碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：5碱基序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白基因：
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtttg atggaaaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg
251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 agctgaagga aacgcctttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa
401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
451 aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501 aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag
551 gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg
601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta
651 caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc
701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID NO.5的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：717碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：7碱基序列的sec2m突变基因：
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtttg atggaaaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg
251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa
401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
451 aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501 aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag
551 gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg
601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta
651 caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc
701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID NO.7的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：717碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白序列：
001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli
051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn
101 vgkvtggktc myggitkaeg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm
201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
SEQ ID NO.2的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：239个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：4氨基酸序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白序列：
001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli
051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn
101 vgkvtggktc myggitkheg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm
201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
SEQ ID NO.4的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：239个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO：6氨基酸序列的一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白序列：
001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli
051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn
101 vgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm
201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
SEQ ID NO.6的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：239个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
实施例2
具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法：
①金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取
接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养，取1.5ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA(基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。
②PCR引物设计及反应条件：
分别设计合成PCR引物序列如下：
sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’
sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’
F-Mutant，5’-GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAA TAT GAA ATA T-3’
R-Mutant：5’-TAT TTT CCA TCA AAC CAG TAA ACT CAC TTG-3’
P1：5’-GGA ATA ACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’
P2：5’-GGT TTC CTT CAG CTT TTG TTA TTC C-3’
P3：5’-GGA AAC GCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’
P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCT TC-3’
所有引物均由invitrogen生物技术公司合成。
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F和sec2-R扩增出SEC2全基因sec2；
在此基础上，以SEC2全基因sec2为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和R-Mutant：5’-TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3’；F-Mutant，5’-GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ATA T-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P1：5’-GGA ATAACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’；P2：5’-GGT TTC CTT CAG CTT TTGTTA TTC C-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-2突变基因；
以具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-3突变基因；
各基因片断的PCR反应体系均为：10×Pfu DNA聚合酶反应缓冲液10μl、dNTP 8uL、上下游引物各20pmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA 50ng、Pfu DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至100μl。
各基因片断的PCR反应条件均为：
第一阶段95℃，5分钟；
第二阶段94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，90秒；共30个循环；
第三阶段72℃，10分钟；
③各肠毒素C2突变蛋白基因的鉴定：各片断PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图1)，分别切下大小为717bp的基因片段，按博大泰克生物技术公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；
具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的表达
1)具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白表达载体的构建：以上sam-1，sam-2和sam-3的PCR回收产物分别经EcoRI、XhoI双酶切，再行胶回收，以T4 DNA连接酶分别连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28a-sam-1-SEQ ID NO：1、pET-28a-sam-2-SEQ IDNO：3、pET-28a-sam-3-SEQ ID NO：5，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley& Sons出版社1995年第三版P39-40)，筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列(DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。
2)具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的诱导表达和纯化：分别接种转化了各表达载体质粒的BL21(DE3)单菌落于含50
卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％(V/V)接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD600为0.5，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，30℃诱导表达4小时。
分别离心收集菌体，并将各收集的菌体重悬于1/5体积的平衡缓冲液(10mM Tirs-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH7.9)，分别采用Ni亲和层析柱对各目的产物进行纯化，即获得具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中氨基酸序列的具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白；
纯化时以0.5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲和层析柱；以含40mM咪唑的平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液(20mM Tirs-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH7.9)洗脱下目的产物，并对洗脱产物经透析法除盐浓缩。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小及纯度(参见图2，如图所示，大肠杆菌BL21(DE3)重组表达菌株经过IPTG诱导，并经Ni-亲和层析柱纯化后，获得了高纯度的突变蛋白，能够满足进一步的实验需要)。
同样方法利用sec2m基因制备SEC2M蛋白，作为突变前参照。
实施例3
超抗原活性检测
取SPF级纯系小鼠Balb/c，通过颈椎处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻压碎后过200目筛网。然后将过筛网后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min收集细胞沉淀，用5mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min离心5min。再以不含血清的1640培养基(购自Gibco公司)清洗细胞1-2次，最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液(购自Gibco公司)调节细胞浓度，以8×105cells/孔加到96孔板中。分别将经纯化的各突变蛋白以10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml的终浓度加入各孔。以BSA作为阴性对照，SEC2标准品作为阳性对照，每个浓度设3个复孔。培养72h后，加入25ul/孔的MTT液(购自Sigma公司)。继续培养4h，1500r/min离心5分钟后弃上清培养液，收集细胞，加入浓度为120ul/well的二甲基亚砜溶液(DMSO)，溶解15min后，通过酶标仪以测定波长570nm、参比波长630nm条件下测吸光值。最后以增殖指数(Proliferation Index，PI)表示增值能力，PI＝实验组吸光值/阴性对照组吸光值(参见图3，各突变蛋白在不同浓度范围均能够有效地刺激小鼠T细胞增殖)。
实施例4
SEC2突变蛋白的抗肿瘤活性检测
将小鼠肝癌细胞Hepa1-6传代培养后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10％FBS的1640培养基稀释成浓度为5×105cells/mL的单细胞悬液，然后以2.5×104cells/孔培养在96孔板。将按实施例3中方法分离获得的小鼠脾淋巴细胞以5×105cells/well加入到上述含有Hepa1-6细胞的96孔板中，使效靶比达到20∶1。然后将纯化的系列超抗原突变蛋白分别以10、100、1000、10000ng/mL的终浓度加入各孔。以BSA作为阴性对照，SEC2野生蛋白作为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔、空白对照孔及调零孔，每个浓度设3个复孔，按常规条件培养72h，加入20ul/well的MTT液。继续培养4h，1000r/min离心收集细胞，加入DMSO120ul/well，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。肿瘤抑制瘤计算公式如下：100-[(蛋白实验孔吸光值-淋巴细胞自然释放孔吸光值)/(肿瘤细胞对照孔吸光值-空白对照孔吸光值)]×100％(参见图4，各突变蛋白均对Hepa1-6细胞具有一定体外抑制能力)。
实施例5
SEC2突变蛋白的小鼠体内实体瘤抑制活性检测
6-8周龄的雌性BALB/C小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，购进后适应性饲养观察一天，排除体重差距大、质量不合格动物。实验第0天，各组小鼠腋下无菌接种由生理盐水稀释的S180肉瘤小鼠腹水液0.2ml(约合瘤细胞5×106个/ml)。接种后按体重随机分为9组，每组8只。在实验第1、4、7天，对所有实验动物尾静脉注射给药0.5ml/只，各组给药种类和剂量分别为：空白对照生理盐水组N.S、SEC2组5μg/只、SEC2组15μg/只、SAM-1组5μg/只、SAM-1组15μg/只、SAM-2组5μg/只、SAM-2组15μg/只、SAM-3组5μg/只、SAM-3组15μg/只。实验第10天将实验动物处死解剖剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。
抑瘤率＝(空白对照组瘤重-给药组瘤重)/空白对照组瘤重×100％
(参见图5，各突变蛋白均对BALB/C小鼠体内的S180实体瘤具有一定体内抑制能力，说明本发明中的突变蛋白有望进一步开发成为临床抗肿瘤药物和免疫调节药物。)
实施例6
SEC2突变蛋白的致热活性分析
以健康大白兔(体重约2.0-2.5kg)作为热源活性试验模型。试验前每只兔子体温连续保持稳定90分钟，且起始体温不超过38.6 to 39.5℃的个体方可用于进一步的试验。将纯化获得的各肠毒素C2突变蛋白分别经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，用无菌PBS溶液稀释至10μg/ml，以10μg/kg的剂量通过耳缘静脉进行注射。通过热源试验测定仪观察每组兔子直肠温度在4小时以内的变化情况，并计算温度变化差异(ΔTemperature)。以野生SEC2及无菌PBS缓冲液分别作为阳性和阴性对照，每组测试3只兔子。(参见图6，本发明中的突变蛋白的致热毒性较野生型和突变前下降明显，更具有临床药用应用前景。)
实施例7
SEC2突变蛋白的体内催吐活性分析
以健康幼猫(8-10周，约500g)作为催吐活性试验模型。将纯化获得的肠毒素突变蛋白分别经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，用无菌PBS溶液稀释至相同浓度，然后以每只猫2mg的剂量进行腹腔注射，连续观察6小时，并记录其出现的催吐及腹泻反应情况(参见表1)。如表1所示，本发明中突变蛋白的催吐活性和腹泻活性较野生型和突变前下降明显，更具有临床药用应用前景。
表1.幼猫腹腔注射不同SEC2突变体蛋白催吐活性比较
a催吐或腹泻猫数超过三只以平均值±标准方差，少于三只以单值表示；
b催吐或腹泻猫数超过三只以范围表示，少于三只以单个值表示。
实施例8
SEC2突变蛋白的分子三维结构分析。
经过Ni亲和层析纯化的系列SEC2突变蛋白纯品SAM-1、SAM-2和SAM-3，经分子排阻和离子交换法再次纯化并超滤浓缩(方法参考分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。在室温下通过悬滴法获得突变蛋白的晶体。以稀疏矩阵采样法确定结晶条件。最终的结晶条件如下：突变蛋白溶液(SAM-1：25mg/ml；SAM-2：25mg/ml；SAM-3：20mg/ml；)和等体积的母液(0.1M Tris-HCl(pH 7.4)，0.08M醋酸镁，26％(w/v)聚乙二醇6000)混合，约15-18天时出现晶体。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4R CCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView 4.0软件在Silicon Graphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。突变蛋白SAM-1的三维结构参见图7，突变蛋白SAM-2的三维结构参见图8、突变蛋白SAM-3的三维结构参见图9。
Claims (4)
1.肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于：其为减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述肠毒素C2超抗原突变蛋白的编码基因，其特征在于：所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6编码基因分别具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5中碱基序列。
3.一种权利要求1所述肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于：
1)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTATCC ATT CTT TGT TG-3’扩增出SEC2全基因sec2；
在此基础上，以SEC2全基因sec2为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和R-Mutant：5’-TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3’；F-Mutant，5’-GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ATA T-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m突变基因；
2)以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的DNA片段sec2m为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P1：5’-GGA ATA ACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’；P2：5’-GGT TTC CTT CAGCTT TTG TTA TTC C-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1突变基因；
3)以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的DNA片段sec2m为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AAC GCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCGTTT CCT TC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-2突变基因；
4)以具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列的DNA片段sam-1为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P3：5’-GGA AAC GCC TTT GAT AAT GGG AAC-3’；P4：5’-CCA TTA TCA AAG GCGTTT CCT TC-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列sam-3突变基因；
5)将以上突变基因sam-1、sam-2、sam-3分别克隆入表达载体pET-28a，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成异源表达各肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌，经诱导表达并纯化制得相应肠毒素C2超抗原突变蛋白。
4.一种权利要求1所述肠毒素C2超抗原突变蛋白的应用，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中氨基酸序列的具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白可作为抗肿瘤或免疫调节类的前体药物的活性成份。
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