WO2006051805A1 - インターフェロンα変異蛋白質とその用途 - Google Patents

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WO2006051805A1
WO2006051805A1 PCT/JP2005/020514 JP2005020514W WO2006051805A1 WO 2006051805 A1 WO2006051805 A1 WO 2006051805A1 JP 2005020514 W JP2005020514 W JP 2005020514W WO 2006051805 A1 WO2006051805 A1 WO 2006051805A1
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residue
ifn
amino acid
mutant
mutant protein
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PCT/JP2005/020514
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French (fr)
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Tadanori Mayumi
Yasuo Tsutsumi
Shinsaku Nakagawa
Madoka Taniai
Kakuji Torigoe
Masashi Kurimoto
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel interferon mutant protein, and more particularly to a human interferon mutant subtype 8 mutant protein and a susceptibility disease agent comprising the same.
  • IFN a human interferon ⁇ subtype ⁇ 8
  • IFN a 8 human interferon ⁇ subtype ⁇ 8
  • Subtypes a 2a and a 2b hereinafter also referred to as “IFN a 2a” and “IFN a 2b”, respectively
  • IFN a 2a subtype ⁇ 8
  • IFN a 2b subtypes of IFN a It has been reported.
  • IFN 8 is more than other subtypes of IFN It exhibits extremely high antiviral activity, and in addition, Yanai Y, Horie S, Yamamoto K, Yamauchi H, Ikegami H ), Kurimoto M, Kitamura T, G According to Journal of Interferon & Cytokine Research, 21st, No. 12, 1, 129 to 1, 136, 2001, IFN ct 8 is It exhibits superior antitumor activity against kidney cancer than other IFN ct subtypes.
  • an object of the present invention is to provide a sensitive disease agent comprising an IFN a mutant protein, which is superior in antiviral action and antitumor activity as compared with conventional IFN ⁇ , as an active ingredient. It is.
  • the 145th arginine residue in the amino acid sequence of IFN a 8 shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 in the sequence listing is an isoleucine residue or leucine residue.
  • an IFN a variant protein in which the 146th alanine residue is converted to a asparagine residue or a serine residue and the 149th methionine residue is converted to a tyrosine residue is converted into a wild-type IFN a 8 It was found that the activity was significantly higher than that.
  • the lysine-mutated mutant protein produced by converting one or more lysine residues in the amino acid sequence of the above IFN ⁇ -mutated protein to other amino acid residues binds to a water-soluble polymer.
  • the bioactive complex is combined with a conventional water-soluble polymer, it has been found to have extremely high activity compared to the IFN a preparation, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the amino acid sequence of human interferon subtype 8 shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 in the sequence listing, and the 145th arginine residue is replaced with a leucine residue.
  • a mutant protein comprising an amino acid sequence in which an isoleucine residue or a palin residue, a 146th alanine residue is converted to a wasparagine residue or a serine residue, and a 149th methionine residue is converted to a tyrosine residue
  • the said subject is solved by providing the sensitive disease agent which comprises it as an active ingredient.
  • the IFN a muteins used in the present invention are wild-type IFN a 8, ie, IFN ⁇ 8a (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), IFN ct 8b (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) and IFN a 8c.
  • IFN ct mutant protein used in the present invention can be obtained by a conventional genetic engineering technique.
  • the protein is expressed by a phage display method, etc., and screening is performed using a combination of an antibody against IFN, a banning method using a receptor protein, an enzyme immunization method, a bioassay method, etc., so that it is more active than IFN a 8.
  • An enhanced IFN a variant protein can be obtained.
  • the phage display method is an extremely useful means because it can comprehensively screen for mutant protein candidates.
  • IFN a mutant protein used in the present invention Pierre one error 'defense (Piehler, J) (THE. Di Yananore. O blanking. Bio Logica Honoré. Chemistry, (Th e journal of Biological Che mistry), ⁇ 275 ⁇ , No. 51, pages 40425 to 40433, 2000), etc., in the amino acid sequence of IFN a 8, which is said to be involved in binding to IFN a receptor type 2, ie, , 30, 33, 145, 146, 149 and 150 amino acid residues are converted into random amino acid residues, and a comprehensive mutant is prepared by the above-mentioned genetic engineering technique to produce a suitable mutant protein.
  • the 145th arginine residue is an isoleucine residue, leucine residue or valine residue
  • the 146th alanine residue is an asparagine residue or a serine residue
  • 149th methionine residue The those that have been converted into tyrosine residues.
  • the IFNa mutant protein in which the amino acid residues at positions 145, 146, and 149 are converted as described above has markedly improved IFNa activity and is advantageously used as the IFNa mutant protein of the present invention.
  • IFN preparations are inferior in the body, it may be advantageous to administer a biologically active complex bound with a water-soluble polymer to a living body.
  • IFNs may have binding positions that, when bound to water-soluble polymers, can impair their activity due to steric hindrance. Therefore, the water-soluble polymer of IFN Mutant proteins whose binding positions are limited to positions that do not impair the activity are advantageously used in the present invention.
  • the binding position of the protein with the water-soluble polymer is selected from the N-terminal or lysine residue.
  • lysine-converted mutant protein in which one or more lysine residues have been converted to other amino acid residues
  • lysine-converted mutant protein has an appropriate binding. It is possible to limit the bonding position with the water-soluble polymer at the position.
  • lysine residues are present at the 31st, 46th, 50th, 71th, 122th, 134th, 135th, 160th, 163rd and 165th positions, and these positions are randomly selected.
  • a lysine conversion mutant protein suitable for binding to a water-soluble polymer by substituting an amino acid residue and screening the lysine conversion mutant protein retaining the activity by the above-described genetic engineering technique. it can.
  • the present inventors convert all lysine residues of the IFNa mutant protein of the present invention to other amino acid residues, the binding efficiency with the water-soluble polymer is extremely reduced. Therefore, it is desirable to preserve at least one lysine residue, and the lysine residue to be preserved is one of the 31st and 134th lysine residues. The knowledge that this is preferable is obtained.
  • the lysine conversion mutant protein of the present invention in which any of the 31st and 134th lysine residues is preserved and all other lysine residues are converted to other amino acid residues.
  • the lysine-converted mutant protein thus produced is advantageously used in the present invention in which the activity does not disappear even when bound to a water-soluble polymer.
  • any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 9 (corresponding to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10 to 15 in the sequence listing) is used, respectively. Including. These are shown in Table 1.
  • MUT1 is the 145th arginine residue as a leucine residue, the 146th alanine residue as a asparagine residue, and the 149th methionine residue as tyrosine.
  • MUT2 is a mutant protein converted to a residue.
  • 145th arginine residue is an isoleucine residue and 146th alanine residue is a serine residue.
  • MUT3 has the 145th arginine residue as the leucine residue, the 146th alanine residue as the serine residue, and the 149th methione residue.
  • MUT4 is a mutant protein in which the 145th arginine residue is the valine residue, and the 46th arginine residue is the mutated amino acid IJ of wild type IFN a 8b. This is a mutated protein in which alanine residues are converted to wasparagine residues and the 149th methionine residue is converted to a thiocin residue.
  • MUT2K31 is a lysine conversion mutant protein in which all lysine residues except the 31st lysine residue are converted to other amino acids in the amino acid sequence of “MUT2”.
  • this is a lysine conversion mutant protein in which all lysine residues other than the 134th lysine residue have been converted to other amino acids.
  • the IFNa mutant protein of the present invention is obtained by amplifying the DNA thus obtained by PCR reaction, if necessary, and then introducing it into a host such as E. coli via a plasmid vector or the like for transformation.
  • a desired amount can be obtained by selecting a clone producing the target protein from the transformant and culturing it.
  • the culture can be collected, for example, by dialysis, salting out, filtration, concentration, and centrifugation.
  • General methods for protein purification such as fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, gel electrophoresis, and isoelectric focusing should be applied.
  • the specific activity of the IFN-mutated protein used in the present invention is usually 2.5 X 10 8 IUZmg protein or more, preferably when applying the bioassay method using the FL cell-sindbis virus system, preferably 3 ⁇ 10 8 IU / mg protein or more, more preferably 3.5 ⁇ 10 8 IU / mg protein or more.
  • the bio-assay method using LS 174T cells derived from human colon cancer and vesicular stomatitis virus (VSV) can detect IFN-8 and its mutant proteins with high sensitivity, and the IFNa mutation of the present invention.
  • an IFNa mutant protein When the specific activity of an IFNa mutant protein is calculated by this method, it is usually 5 ⁇ 10 8 IUZmg protein or more, preferably 1 ⁇ 10 9 IU / mg protein or more, More preferably, it is 6 ⁇ 10 9 IU / mg protein or more.
  • the water-soluble polymer that is artificially bound to the IFNa mutant protein of the present invention is preferably a non-protein that is substantially water-soluble and is harmless to the living body and difficult to become an antigen.
  • synthetic polymers such as homopolymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, and polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and vinyl alcohol, propylene glycol, and derivatives thereof are used.
  • natural polymers such as erucinan, dextran, hydroxyethyl cellulose, punoleran, and methylcellulose.
  • polyethylene glycol homopolymers, Copolymers of cole with other water-soluble polymers and their derivatives are preferred.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer is usually adjusted to an average molecular weight in the range of 500 to 200,000 daltons, preferably 1,000 to 80,000 daltons. If the molecular weight is uneven, Prior to the protein binding reaction, fractionation is carried out by a general-purpose method such as fractional precipitation or gel filtration chromatography. Although depending on the type of water-soluble polymer and the final use of the IFN a mutant protein, if the molecular weight of the water-soluble polymer is below the above range, it becomes difficult to improve the pharmacokinetics. The physiological activity of the complex may decrease too much and lose its action as a pharmaceutical product.
  • the bond formed between the protein moiety and the water-soluble polymer is preferably an amide bond method that forms a stable covalent bond.
  • the ratio of the protein and the water-soluble polymer at the start of the reaction is 1: 0.1 to 1: 100, preferably 1: 0.5 to 1 in molar ratio. : 50, most preferably increasing or decreasing in the range of 1: 1 to 1:10. In general, if it is below this range, the efficiency of the binding reaction will decrease. Conversely, if it exceeds this range, the binding reaction will be too early, and it will be difficult to control the number of molecules of the water-soluble polymer that binds to the protein. In any case, the efficiency of the reaction and the purification after the reaction is lowered, and it is usually desirable to adjust in the above range.
  • the temperature, pH, and reaction time during the reaction are set so that the IFNa mutant protein is inactivated or difficult to decompose, and unwanted side reactions are minimized.
  • pH 0.1 to 12 preferably pH 5 to 10, 0.1 to 50 hours, preferably so that the reaction is completed within 10 hours.
  • the bioactive complex thus obtained can be purified by the same method as that for purifying IFNa mutant protein.
  • concentration, salting out, centrifugation, freezing can be performed. It is made liquid or solid by a method such as drying.
  • the number of water-soluble polymers to be bound to the IFN-mutated protein is usually 1 molecule or more, preferably 1 to 2 molecules, more preferably 1 minute per molecule of IFN-mutated protein. A child.
  • the specific activity when the IFN mutant protein of the present invention is used as a physiologically active complex is 3 X 10 6 IU / mg protein or more, preferably 1 X when measured in the FL cell-Sindbis virus system. 10 7 IU / mg protein or more, more preferably 2 ⁇ 10 7 IU / mg protein or more.
  • the specific activity measured by the LS I 74T cell ZVSV system derived from human colon cancer is Usually, it is 2 ⁇ 10 7 IU / mg protein or more, preferably 4 ⁇ 10 7 IU / mg protein or more.
  • the IFN a mutant protein of the present invention or a physiologically active complex in which it is bound to a water-soluble polymer is extremely useful as a sensitive disease agent for treating or preventing a sensitive disease.
  • the term “susceptible disease” as used in the present invention means the ability to administer the sensitive disease agent of the present invention alone or all of the diseases that can be treated or prevented by administration together with other drugs.
  • colon cancer rectal cancer, stomach cancer, kidney cancer, thyroid cancer, tongue cancer, bladder cancer, choriocarcinoma, liver cancer, uterine cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, malignant melanoma, neuroblastoma, ovarian tumor, Testicular tumor, osteosarcoma, spleen cancer, adrenal gland, goiter, brain tumor, malignant melanoma, solid tumors such as mycosis fungoides, blood system tumors such as leukemia, lymphoma, and also hepatitis B, hepatitis C Virus diseases such as AIDS and SARS, bacterial infections such as Chlamydia, immune diseases such as allergies and rheumatism.
  • the sensitive disease agent of the present invention has a wide variety of uses, for example, as an antitumor agent, an antiviral agent, an anti-infective agent, an immunodisease agent, etc., for treating and preventing such a disease.
  • the sensitive disease agent of the present invention is administered as a sensitive disease agent of the present invention as a single dose according to the administration route.
  • the sensitive disease agent of the present invention includes a so-called drug in a dosage unit form.
  • the drug in the dosage unit form refers to the sensitive disease agent of the present invention, for example, at a single dose or Meaning a drug in a physically separate unitary form suitable for dosing, comprising an amount corresponding to an integral multiple (up to 4 times) or a divisor (up to 1Z40).
  • examples of such drugs in the dosage unit form include capsules, granules, pills, suppositories, powders, and tablets. , Injections, poultices and the like.
  • the sensitive disease agent of the present invention comprises the IFNa mutant protein of the present invention and / or a physiologically active complex in which a water-soluble polymer is bound to them as an active ingredient. It can also be used in combination with a wild type IFN containing IFN-8. Further, for example, it does not preclude blending appropriate preparations commonly used for drugs such as excipients, ointment bases, solubilizers, flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, and emulsifiers.
  • skin disinfectant for skin, wound protection agent, anti-inflammatory agent, etc. vitamin A agent, vitamin B agent, vitamin C simultaneous lj, vitamin D agent, vitamin Vitamin preparations such as E-form lj, vitamin K preparations, calcium preparations, inorganic preparations, saccharide preparations, organic acid preparations, protein amino acid preparations, organ preparations and other cell tonics such as chlorophyll preparations and pigment preparations, Chemotherapy such as alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotic preparations, antitumor drugs such as antitumor plant component preparations, allergy drugs such as antihistamines, antituberculosis drugs, synthetic antibacterial drugs, and anti-winoles drugs
  • vitamins A agent, vitamin B agent, vitamin C simultaneous lj, vitamin D agent vitamin Vitamin preparations such as E-form lj, vitamin K preparations, calcium preparations, inorganic preparations, saccharide preparations, organic acid preparations, protein amino acid preparations, organ preparations and other cell tonics such as chlorophyll
  • the sensitive disease agent of the present invention may be used as an immunological adjuvant, for example, actinomycin D, acegraton, ifosfamide, ubenimetas, etoposide, enocitabine, aclarubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, irinotecan hydrochloride, epilubicin hydrochloride, gemcitabine hydrochloride, hydrochloric acid Daunorubicin, doxorubicin hydrochloride, nitrogen mustard N-oxide, dimustine hydrochloride, pirarubicin hydrochloride, fuadzol hydrochloride hydrate, bleomycin, brocarbazine hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, carbocon, carboplatin, carmofur, tamoxifen taenate , Toremifene taenoate, krestin, medroxicetate oral guestron
  • the IFNa mutant protein of the present invention when allowed to function also as an immune promoter, a synergistically high antitumor effect that cannot be easily achieved with only one of them can be obtained.
  • the combined use can reduce the dose of the antitumor drug, and as a result, has the benefit of significantly reducing the side effects caused by the antitumor drug.
  • the sensitive disease agent of the present invention exerts an effect on the treatment and prevention of susceptibility diseases, whether applied by the oral route or parenteral route.
  • a preparation comprising the IF N mutant protein of the present invention is prepared from 0.01 to 1,000 ⁇ g / kg body weight Z day, preferably 0.1 to 100 ⁇ g / body weight / day, divided into multiple doses as needed from 1 to 7 times / week Force applied by the oral route over a week to 1 year, or by parenteral routes such as intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal, rectal, intraperitoneal.
  • the physiologically active complex produced by binding the IFN a mutant protein of the present invention to a water-soluble polymer is stable, hardly decomposed by proteases in blood, etc., and has a wild residence time in the IFN Depending on the route of administration significantly longer than a 8, it can reach 10 times or more, so when applied by the same route for the same sensitive disease, the dose can be significantly reduced. It has the benefit of minimizing side effects caused by cytotoxicity to normal cells.
  • Amino acid residues of IFN 8b IJ (Oji IJ table [J No. 2]), amino acid residues 30, 33, 145, 14 6, 149 and 150 are other amino acids.
  • chromosomal DNA was collected from a human lymphoblast-derived cell line BALL_1 (JCRB0071: Japanese 'collection'ob'research-bioresources), and this was used as a cocoon and sequenced in the sequence listing.
  • This restriction enzyme is transferred to a plasmid vector (trade name “pET_3a”, sold by EMD Biosciences (USA)) having a T7 promoter region, a T7 terminator region, an ampicillin resistance gene region, and a ColEl ′ Ori region. It was introduced into the site.
  • pET_3a trade name “pET_3a”, sold by EMD Biosciences (USA)
  • pET_3a plasmid vector having a T7 promoter region, a T7 terminator region, an ampicillin resistance gene region, and a ColEl ′ Ori region. It was introduced into the site.
  • the DNA region encoding IFN ⁇ 8 was analyzed by a conventional DNA sequencer, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing was decoded, and the DNA was found to be DNA encoding IFN-8b.
  • SEQ ID NO: 19 (primer for converting the codons of amino acids 30 and 33 to NNS) and SEQ ID NO: 20 (codons of amino acids 145, 146, 149 and 150 are converted to NNS) PCR is performed according to a conventional method, and the obtained PCR product is converted into a saddle shape to add SEQ ID NO: 21 (primer for adding a restriction enzyme Ncol cleavage site to the 5 'end) and sequence.
  • a conventional force S-lay PCR was performed using No. 22 (a primer for adding a restriction enzyme Notl cleavage site to the 3 ′ end).
  • helper phage M13K07 Invitrogene Co., Ltd. (Tokyo, Japan) was added at 1 x 10 9 pfu per ml of medium, cultured at 37 ° C for 1 hour with shaking, and centrifuged. After separation, the precipitate was collected, suspended in 2% medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 6 hours.
  • the phage protein bound to IF NAR2 was eluted with 0.1 M hydrochloric acid aqueous solution, collected in a separate container, and neutralized by adding half of 1 M Tris (pH 8.0) of the hydrochloric acid solution.
  • the collected phages are infected with E. coli TG-1, and the E. coli is cultured in 2% medium containing 2% (w / v) gnolecose and 100 ⁇ g / ml ampicillin, and then the helper phage is used in the same manner as in Experiment 1-1.
  • Ml 3K07 was added to release the phage from the cells.
  • DNA encoding the 12 types of mutant proteins in Table 2 was used as a primer with the oligonucleotides of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 as primers.
  • DNA specific to the primer sequence was amplified by PCR, and then digested with restriction enzymes Ndel and BamHI. This is transferred to a plasmid vector (trade name “pET-3a”, sold by EMD Biosciences (USA)) having a T7 promoter region, a T7 terminator region, an ampicillin resistance gene region, and a ColEl ′ Ori region. It was introduced into the restriction enzyme site.
  • This plasmid was introduced into Escherichia coli BL21DE3 strain to obtain wild-type IFN a 8 or Escherichia coli for production of each mutant protein.
  • each cell line with RPMI1640 medium containing 10 (v / v)% urine fetal serum at a concentration of 8 X 10 3 to 2 X 10 5 cells / ml.
  • each of the above 4 mutants was serially diluted and added in the range of 40 pg to 10 / g / ml, and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere for 72 to 120 hours.
  • Cell Count Kit-8 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)) according to conventional methods, and to suppress the growth to half from the measured data.
  • the concentration (IC) required for the calculation was calculated.
  • IC concentration
  • mutant proteins No. 1, 2, 3 and 4 were found to exhibit stronger growth inhibitory activity against a wider variety of cell lines than wild type IFN 8. .
  • mutant proteins No. 1, 2, 3 and 4 have a higher cytostatic activity against all cell lines. Power, ivy.
  • the obtained Escherichia coli was suspended in 2YT medium containing 2% (wZv) gnoleose, cultured at 37 ° C for 1 hour with shaking, and then 2% (w / v) dalcose and 100 / ig / ml ampicillin were added.
  • the LB plate was plated and cultured for 16 hours. All E. coli colonies that appeared on the plate were collected, suspended in 2YT medium containing 2% (w / v) glucose and 100 ⁇ g / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C with shaking. At 0.5, add helper phage M13K07 and incubate at 37 ° C for 1 hour with shaking.
  • Collect cells by centrifugation and culture medium contains 50 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml ampicillin.
  • phages were produced by shaking culture at 37 ° C for 7 hours to obtain a phage library.
  • these were screened by a vanning method using a polyethylene immunotube to which a fusion protein (SEQ ID NO: 24 in the sequence listing) of IFNAR2 and the Fc region of human immunoglobulin G was bound.
  • the lysine conversion mutant protein “MUT2K31” (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) in which only the 31st lysine residue was not converted to another amino acid residue, and only the 134th lysine residue was another amino acid residue.
  • a lysine-mutated mutant protein “MUT2K134” (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) that was not converted to ⁇ was obtained.
  • the amino acid sequence of the IFN hypermutated protein “MUT2” SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing
  • the lysine-mutated mutant proteins “MUT2K31” and “MUT2K134” of the IFN a mutant protein have antiviral activity and cellularity compared to the original mutant protein “MUT2”. Although the growth inhibitory activity was decreased, the antiviral activity and cell growth inhibitory activity were higher than those of wild-type IFN a 8.
  • Polyethylene glycol having a molecular weight of 20 kDa was bound to the lysine-converted mutant protein obtained by the method of Experiment 2-2 or the wild type IFN a 8 obtained in Experiment 13. Specifically, the wild-type IFN ⁇ 8, IFN ⁇ mutant protein ⁇ MUT2K31 '' or ⁇ MUT2K134 '' is dissolved in a borate buffer solution (pH 9.0) to a concentration of 0.1 to 5 mg / ml, and then dissolved in water. Polyethylene glycol (m-PEG-SPA) activated with monomethoxy N succinimidyl propionate as a polymer is added in a molar ratio of 3 to 8 times the protein, and 2 hours at 7 ° C.
  • m-PEG-SPA polyethylene glycol
  • the bioactive complex prepared by binding polyethylene dialicol to “MUT2K31” or “MUT2K134” is significantly more than the commercially available IFN a 2a formulation bound to polyethylene glycol. It had high antiviral activity and cytostatic activity.
  • IFN a mutant proteins “MUT1,” “MUT2,” “MUT3,” or “MUT4” obtained in Experiment 1-3 were tested on 8-week-old male mice (body weight 20-25 g).
  • the lysine-mutated mutant protein MUT2K31 or IFN a mutant protein MUT2 obtained in step 2 Either MUT2K134 or a bioactive complex in which one molecule of polyethylene glycol is bound to MUT2K31 or MUT2K134 obtained in Experiment 3-1, is administered by injection via the transdermal, oral or peritoneal route.
  • IFN ct mutant protein “MUT1,” “MUT2,” “MUT3,” or “MUT4” obtained in Experiment 1-3 was added to 100 ml of physiological saline containing 1% (w / v) purified gelatin as a stabilizer.
  • This product is useful as a dry injection for treating or preventing sensitive diseases including malignant tumors, viral diseases, bacterial infections and immune diseases.
  • the obtained MUT2K31 or MUT2K134 is mixed with an appropriate amount of any of the bioactive complexes in which one molecule of polyethylene glycol is bound, adjusted to pH 7.2, and bioactive per lg.
  • a paste containing about 5 zg of the composite was obtained.
  • This product excellent in spreadability and stability is useful as an ointment for treating or preventing susceptible diseases including malignant tumors, viral diseases, bacterial infections and immune diseases.
  • Anhydrous crystalline ⁇ -maltose powder (registered trademark “Fine Tose”, Hayashibara Shoji Co., Ltd.
  • the product with excellent ingestion and stability is useful as a tablet for treating or preventing sensitive diseases including malignant tumors, viral diseases, bacterial infections and immune diseases.
  • the IFN a mutant protein of the present invention has significantly higher activity than conventional IFN ⁇ preparations, and when combined with a water-soluble polymer to form a bioactive complex, It is excellent and maintains a high concentration state in blood for a long time even when administered by injection. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a sensitive disease agent superior in anti-winore activity and anti-tumor activity to conventional sensitive disease agents containing IFN as an active ingredient. In the field, for example, it has a wide variety of uses as an antitumor agent, an antiviral disease agent, an anti-infective agent, an immune disease agent and the like.

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Abstract

　抗ウイルス作用及び抗腫瘍作用がより高い、インターフェロンα変異蛋白質、及び、それを有効成分とする感受性疾患剤を提供することを課題とし、配列表における配列番号１乃至３のいずれかに示されるヒトインターフェロンαのサブタイプα８のアミノ酸配列において、１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基、イソロイシン残基又はバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基又はセリン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基がチロシン残基に変換されたアミノ酸配列を含んでなる変異蛋白質、及び、それを有効成分とする感受性疾患剤を提供することによって前記課題を解決する。

Description

明 細 書
インターフェロン a変異蛋白質とその用途
技術分野
[0001] この発明は新規なインターフェロンひ変異蛋白質に関するものであり、とりわけ、ヒト インターフェロンひサブタイプひ 8の変異蛋白質、及び、それを含んでなる感受性疾 患剤に関するものである。
背景技術
[0002] 近年、ヒトのインターフェロン α (以下、「IFN a」と称することもある）のサブタイプ α 8 (以下、単に「IFN a 8」と称することもある。）は、医薬品として認可されているサブタ ィプ a 2aおよび a 2b (以下、それぞれ、「IFN a 2a」及び「IFN a 2b」と称することも ある）などの他のサブタイプの IFN aよりも優れた活性を有するとレ、う報告がなされて いる。例えば、フォスタ ~ ·ジ一'アーノレ（Foster GR)、ロドリグエス 'ォー（Rodrigue s 〇）、ゴーゼ.エフ（Ghouze F)、シュルテーフローリンデ.ィー（Schulte— Frohli nde E)、テスタ'ディー（Testa D)、リアォ'ェム 'ジエイ（Liao MJ)、スターク'ジ 一'アール（Stark GR)、リードビーター 'エル（Leadbeater L)、トーマス'ェイチ' シー（Thomas HC)、ジャーナル ·ォブ ·インターフェロン ·アンド'サイト力イン'リサ ~チ (Journal of Interferon & Cytokine Research^ 丄6 弟 12亏、 102 7乃至 1033頁、 1996年によれば、 IFNひ 8は他のサブタイプの IFNひよりも、極め て高い抗ウィルス活性を示し、さらに、ャナイ'ワイ（Yanai Y)、ホリエ'エス（Horie S)、ャマモト .ケィ（Yamamoto K)、ヤマウチ .ェイチ（Yamauchi H)、ィケガミ . エイチ (Ikegami H)、タリモト'ェム (Kurimoto M)、キタムラ ·ティー (Kitamura T)、ジャーナル'ォブ 'インターフェロン 'アンド 'サイト力イン'リサーチ (Journal of Interferon & Cytokine Research)、第 21卷、第 12号、 1 , 129乃至 1， 136頁 、 2001年によれば、 IFN ct 8は他の IFN ctサブタイプよりも、腎臓癌に対して優れた 抗腫瘍活性を示す。
[0003] しかしながら、これらの報告は、 IFN a 8が、他のサブタイプの IFN aよりも活性が優 れていることを示しているものの、インビトロの実験系でのみの結果に基づくものであ り、 IFN a 8と他のサブタイプの IFN aとの活性における差はさほど顕著でない。よつ て、従来の IFN a製剤や IFN a 8よりもさらに高レ、活性を有する IFN a変異蛋白質を 取得できれば、 IFN aの用途拡大が期待できる。
発明の開示
[0004] 斯かる状況に鑑み、この発明は、従来の IFN αよりも抗ウィルス作用及び抗腫瘍作 用に優れる IFN a変異蛋白質を有効成分とする感受性疾患剤を提供することを課題 とするものである。
[0005] 本発明者が鋭意研究したところ、配列表における配列番号 1乃至 3のいずれかに示 される IFN a 8のアミノ酸配列のうち、 145番目のアルギニン残基をイソロイシン残基 、ロイシン残基又はパリン残基に、 146番目のァラニン残基をァスパラギン残基又は セリン残基に、及び、 149番目のメチォニン残基をチロシン残基に変換した IFN a変 異蛋白質は、野性型の IFN a 8よりも顕著に活性が高いことを見い出した。また、上 記の IFN α変異蛋白質のアミノ酸配列における 1又は 2以上のリジン残基を他のアミ ノ酸残基に変換して作製されたリジン変換変異蛋白質は、水溶性高分子とを結合し て生理活性複合体とした場合、従来の水溶性の高分子と結合してレ、る IFN a製剤と 比較して、極めて高い活性を有していることを見い出し、本発明を完成するにいたつ た。
[0006] すなわち、この発明は、配列表における配列番号 1乃至 3のいずれかに示されるヒト インターフェロンひのサブタイプひ 8のアミノ酸配列にぉレ、て、 145番目のアルギニン 残基をロイシン残基、イソロイシン残基又はパリン残基に、 146番目のァラニン残基を ァスパラギン残基又はセリン残基に、及び、 149番目のメチォニン残基がチロシン残 基に変換されたアミノ酸配列を含んでなる変異蛋白質、及びそれを有効成分として 含んでなる感受性疾患剤を提供することによって前記課題を解決するものである。 発明を実施するための最良の形態
[0007] この発明で用いられる IFN a変異蛋白質は、野性型の IFN a 8、すなわち、 IFN α 8a (配列表における配列番号 1 )、 IFN ct 8b (配列表における配列番号 2)及び IFN a 8c (配列表における配列番号 3)のうちのいずれかのアミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に変換して、 IFNひ活性を増強させた IF N et変異蛋白質である。本発明に用いられる IFN ct変異蛋白質は、常法の遺伝子 工学の手法により得ることができる。例えば、 IFN a 8のアミノ酸配列において目的の アミノ酸残基をランダムなアミノ酸残基に変換するために、 IFN a 8のアミノ酸配列を コードする DNA中の該当するアミノ酸コドンに、 NNS配列を適用し、常法のオリゴ D NA合成技術、 PCR技術、 DNAライゲーシヨン技術などを駆使して、 目的のアミノ酸 残基がランダムなアミノ酸残基に変換された変異蛋白質を発現したライブラリーを得 る。次に、ファージディスプレー法などにより蛋白質を発現させ、 IFNひに対する抗体 、受容体蛋白質を用いるバニング法、酵素免疫法、バイオアツセィ法などを組み合わ せてスクリーニングすることによって、 IFN a 8よりもさらに活性が増強された IFN a変 異蛋白質を得ることができる。 IFNひ変異蛋白質の選別に当たっては、ファージディ スプレー法は網羅的に変異蛋白質の候補をスクリーニングできるので、極めて有用 な手段である。
[0008] 本発明で用いられる IFN a変異蛋白質は、ピエ一ラー 'ジエイ（Piehler, J) (ザ.ジ ヤーナノレ.ォブ.バイオロジカノレ.ケミストリー、 （The journal of Biological Che mistry) , ^275^,第 51号、 40425乃至 40433頁、 2000年）等の報告に基づき、 IFN a 8のアミノ酸配列の中で、 IFN a受容体タイプ 2との結合に関与するといわれ るアミノ酸残基、すなわち、 30、 33、 145、 146、 149及び 150番目のアミノ酸残基を ランダムなアミノ酸残基に変換し、上述の遺伝子工学的な手法により、網羅的に変異 体を作製して好適な変異蛋白質をスクリーニングした結果、上記のアミノ酸残基のう ち、 145番目のアルギニン残基をイソロイシン残基、ロイシン残基あるいはバリン残基 に、 146番目のァラニン残基をァスパラギン残基又はセリン残基に、及び 149番目の メチォニン残基をチロシン残基に変換されたものである。 145、 146及び 149番目の アミノ酸残基を上記のごとく変換した IFN a変異蛋白質は、 IFN a活性が著しく向上 しており、本発明の IFN a変異蛋白質として有利に用いられる。
[0009] 一方、既述のとおり、 IFNひ製剤は体内での安定性に劣るため、水溶性高分子を 結合した生理活性複合体にして、生体に投与するのが有利な場合がある。しかしな がら、 IFNひは、水溶性高分子と結合した場合、立体障害などにより活性を損ねてし まう結合位置を有する可能性がある。そこで、 IFNひ変異蛋白質の水溶性高分子の 結合位置を、活性を損ねない位置に限定した変異蛋白質が、本発明において有利 に用いられる。具体的に説明すると、水溶性高分子を蛋白質の遊離アミノ基に結合 するという手法を採用する場合、蛋白質における水溶性の高分子との結合位置は、 N末端あるいはリジン残基のうちから選択される。そこで、 1又は 2以上のリジン残基を 他のアミノ酸残基に変換した変異蛋白質 (以後、本明細書ではこのような変異体を「リ ジン変換変異蛋白質」と呼ぶ。）は、適切な結合位置に水溶性の高分子との結合位 置を限定することが可能である。本発明の IFNひ変異蛋白質の場合、 31、 46、 50、 71、 122、 134、 135、 160、 163及び 165番目の位置にリジン残基を有しており、こ れらの位置をランダムなアミノ酸残基に置換し、上述の遺伝子工学的な手法により、 活性を保持したリジン変換変異蛋白質をスクリーニングすることにより、水溶性の高分 子との結合に適したリジン変換変異蛋白質を得ることができる。本発明者等は、本発 明の IFN a変異蛋白質のすべてのリジン残基を他のアミノ酸残基に変換した場合、 水溶性の高分子との結合効率が極めて低下するため、リジン変換変異蛋白質にお いては、少なくとも一つのリジン残基を保存しておくのが望ましいこと、及び、その保 存すべきリジン残基としては、 31及び 134番目のリジン残基のいずれ力 1つであるの が好ましいという知見を得た。したがって、本発明におけるリジン変換変異蛋白質に おいては、 31及び 134番目のリジン残基のいずれかを保存し、それ以外リジン残基 の全てが他のアミノ酸残基に変換されたリジン変換変異蛋白質を作製するのが好ま しぐこのように作製されたリジン変換変異蛋白質は、水溶性高分子と結合しても活性 が消失することなぐ本発明において有利に用いられる。例えば、本発明で用いられ る IFN a変異蛋白質としては、配列表における配列番号 4乃至 9のアミノ酸配列（そ れぞれ、配列表における配列番号 10乃至 15の塩基配列に対応）のいずれかを含ん でなるもの挙げられる。これらを表 1に示す。『MUT1』は、野性型 IFNひ 8bのァミノ 酸配列において、 145番目のアルギニン残基をロイシン残基に、 146番目のァラニン 残基をァスパラギン残基に、及び、 149番目のメチォニン残基をチロシン残基に変換 された変異蛋白質であり、『MUT2』は、野性型 IFNひ 8bのアミノ酸配列において、 1 45番目のアルギニン残基をイソロイシン残基に、 146番目のァラニン残基をセリン残 基に、及び、 149番目のメチォニン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質で あり、『MUT3』は、野性型 IFN a 8bのアミノ酸配列において、 145番目のアルギニ ン残基をロイシン残基に、 146番目のァラニン残基をセリン残基に、及び、 149番目 のメチォェン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質であり、『MUT4』は、野 性型 IFN a 8bのアミノ酸配歹 IJにおレ、て 145番目のアルギニン残基をバリン残基に、 1 46番目のァラニン残基をァスパラギン残基に、及び、 149番目のメチォニン残基をチ 口シン残基に変換された変異蛋白質である。また、『MUT2K31』は、『MUT2』のァ ミノ酸配列において、 31番目のリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸に 変換されたリジン変換変異蛋白質であり、『MUT2K134』は、『MUT2』のアミノ酸 配列において、 134番目のリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸に変換 されたリジン変換変異蛋白質である。
表 1
Figure imgf000006_0001
この発明の IFN a変異蛋白質は、斯くして得られた DNAを、必要に応じて、 PCR 反応によって増幅した後、プラスミドベクターなどを介して大腸菌などの宿主へ導入 して形質転換し、得られる形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを選 別し、それを培養することによって所望量を得ることができる。形質転換体の培養物 から蛋白質を採取するには、培養物へ、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離 、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト グラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動 、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよぐ必 要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて用いられる。本発明で用いられる IF Nひ変異蛋白質の比活性としては、常法の、 FL細胞一シンドビスウィルス系によるバ ィォアツセィ法を適用した場合、通常、 2. 5 X 108IUZmg蛋白質以上、好ましくは 3 X 108IU/mg蛋白質以上、さらに好ましくは 3. 5 X 108IU/mg蛋白質以上である 。また、ヒト結腸癌由来の LS 174T細胞と水疱性口内炎ウィルス (VSV)を用いたバ ィォアツセィ法は、 IFNひ 8やその変異蛋白質を高感度で検出することができ、本発 明の IFN a変異蛋白質の活性の評価に有利であり、この方法により IFN a変異蛋白 質の比活性を算出した場合、通常、 5 X 108IUZmg蛋白質以上、好ましくは、 1 X 1 09IU/mg蛋白質以上、さらに好ましくは 6 X 109IU/mg蛋白質以上である。
この発明の IFN a変異蛋白質と人為的に結合せしめる水溶性の高分子としては、 実質的に水溶性であって、とりわけ、生体にとって無害かつ抗原となり難い非蛋白質 性のものが好ましい。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコ ール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリ コールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘 導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシェチルセルロース、 プノレラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃つ た調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、ポリエチレンダリ コールと他の水溶性の高分子との共重合体及びそれらの誘導体が好ましレ、。なお、 水溶性の高分子の分子量は、平均分子量として、通常、 500乃至 200, 000ダルトン 、好ましくは、 1 , 000乃至 80， 000ダルトンの範囲で加減し、分子量が不均一である 場合には、蛋白質への結合反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグ ラフィーなどの汎用の方法によって分画する。水溶性の高分子の種類や IFN a変異 蛋白質の最終用途にもよるけれども、水溶性の高分子の分子量が上記範囲を下回る と体内動態を改善し難くなり、逆に、上記範囲を上回ると、複合体の生理活性が低下 しすぎて、医薬品としての作用を消失することがある。 [0013] IFN a変異蛋白質に斯かる水溶性の高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基 へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた水溶 性の高分子を当該蛋白質に反応させる力 \あるいは、遊離のァミノ基へ特異的に反 応する官能基を有する多官能基試薬により、当該蛋白質と水溶性の高分子とを架橋 すればよい。反応方法としては、国際特許公開 WO95Z13090号明細書に記載さ れている方法に準じて行うことができる。また、斯界において汎用される方法、例えば 、特開昭 62— 289522号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法など を用いてもよレ、。蛋白質部分と水溶性の高分子との間に形成される結合は、安定な 共有結合が形成されるアミド結合法によるものが好ましい。
[0014] 反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質と水溶性の高分子との割 合は、モル比で 1 : 0. 1乃至 1 : 100、好ましくは、 1 : 0. 5乃至 1 : 50、最も好ましくは、 1： 1乃至 1： 10の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると結合反応効率が低 下し、反対に、この範囲を上回ると結合反応が早すぎて、蛋白質に結合する水溶性 の高分子の分子数の制御が困難になる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効 率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の 温度、 pH及び反応時間は、 IFN a変異蛋白質が失活したり分解し難ぐかつ、望ま しくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を 0乃至 100°C 、好ましくは、 4乃至 40°C、 pHを 0. 1乃至 12、好ましくは、 pH5乃至 10とし、 0. 1乃 至 50時間、好ましくは、 10時間以内に反応が完結するように設定する。斯くして得ら れた生理活性複合体は、 IFN a変異蛋白質を精製する場合と同様の方法によって 精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結 乾燥などの方法により液状又は固状とする。
[0015] また、 IFNひ変異蛋白質に結合させる水溶性の高分子の分子数は、 1分子の IFN ひ変異蛋白質に、通常、 1分子以上、好ましくは 1乃至 2分子、より好ましいのは 1分 子である。また、本発明の IFNひ変異蛋白質を生理活性複合体とした時の比活性は 、 FL細胞—シンドビスウィルス系で測定した場合、 3 X 106IU/mg蛋白質以上、好 ましくは 1 X 107IU/mg蛋白質以上、さらに好ましくは 2 X 107IU/mg蛋白質以上 である。また、ヒト結腸癌由来の LS I 74T細胞 ZVSV系で測定した場合の比活性は 、通常、 2 X 107IU/mg蛋白質以上、好ましくは、 4 X 107IU/mg蛋白質以上であ る。
[0016] この発明の IFN a変異蛋白質又はそれと水溶性の高分子とが結合した生理活性 複合体は、感受性疾患を治療又は予防するための感受性疾患剤として極めて有用 である。この発明でいう感受性疾患とは、この発明の感受性疾患剤を単独で投与す る力 \あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療又は予防し得る疾患全 般を意味し、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎癌、甲状腺癌 、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽 細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、瞎臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性 黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、さらには 、 B型肝炎、 C型肝炎、 AIDS, SARSなどのウィルス性疾患、クラミジァなどの細菌 感染症、アレルギー、リューマチなどの免疫疾患などが挙げられる。したがって、この 発明の感受性疾患剤は、斯かる疾患を治療'予防するための、例えば、抗腫瘍剤、 抗ウィルス剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様な用途を有することとな る。
[0017] 適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明の感受性疾 患剤は、投与経路に応じて、 1回当たりの用量として、本発明の感受性疾患剤を 0. 2 5ng/kg体重以上、好ましくは、 2. 5ng乃至 400 /i g/kg体重を投与し、用途に応 じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤 、丸剤、眼軟膏剤、 口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シ ロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、 軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナ一デ剤、流エキス剤 、ローション剤などの形態のものに調製することができる。
[0018] この発明の感受性疾患剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし 、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明の感受性疾患剤を、例えば、 1回当たりの 用量又はその整数倍 (4倍まで)若しくは約数（ 1Z40まで）に相当する量を含んでな り、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投 薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤 、注射剤、パップ剤などが挙げられる。
[0019] この発明の感受性疾患剤は、有効成分として、本発明の IFN a変異蛋白質及び/ 又はそれらに水溶性の高分子を結合させた生理活性複合体を含んでなるものである 。また、 IFNひ 8を含む野性型の IFNひと組み合わせて用いることもできる。また、例 えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一 般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を 逸脱しない範囲で、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用 薬、ビタミン A剤、ビタミン B剤、ビタミン C斉 lj、ビタミン D剤、ビタミン E斉 lj、ビタミン K剤 などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製 剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、 アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤など の抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイ ノレス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤な どの薬剤を 1又は複数配合してもよい。
[0020] さらに、この発明の感受性疾患剤は、免疫助成剤として、例えば、ァクチノマイシン D、ァセグラトン、ィホスフアミド、ウベニメタス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラル ビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸ェピルビシン、塩酸ゲムシタビン、 塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジエンマスタードー N—ォキシ ド、塩酸二ムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸フアドゾール水和物、塩酸ブレオマイシ ン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモ フール、タエン酸タモキシフェン、タエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプ 口ゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンォ クホスフアート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカ ノレバジン、チォテパ、テガフール、テガフーノレ'ゥラシル、テガフーノレ'ギメスタット 'ォ タスタツトカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノ スタチン、ネダプラチン、バタリタキセル、ビカノレタミド、ピシバニール、ヒドロキシカル バミド、ブスルファン、フルォロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナト リウム、マイトマイシン C、ミトブリニトーノレ、メトトレキセート、メルカプトプリン、 6 _メノレ カプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫 酸ビンブラスチン、硫酸ぺプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬と組み合わせて 用いることができる。このように、この発明の IFN a変異蛋白質を免疫助成剤としても 機能させるときには、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い抗 腫瘍効果が得られる。しかも、斯カ 併用は、抗腫瘍薬の用量を低減でき、その結果 として、抗腫瘍薬による副作用を著明に軽減し得る実益がある。
[0021] この発明の感受性疾患剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受 性疾患の治療'予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども 、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、この発明の IF Nひ変異蛋白質を含んでなる製剤を、 0. 01乃至 1， 000 μ g/kg体重 Z日、好まし くは、 0. 1乃至 100 μ g/体重/日の投与量で、必要に応じて、複数回に分けて 1乃 至 7回/週の頻度で 1週間乃至 1年間に亙って経口経路で適用する力 \あるいは、 皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により適 用する。この発明の IFN a変異蛋白質を水溶性高分子と結合して作製した生理活性 複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難ぐしかも、 生体における滞留時間が野性型の IFN a 8より有意に長ぐ投与経路によっては 10 倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合 、投与量を有意に少なくすることができ、その結果として、正常細胞に対する細胞障 害性などに起因する副作用を最小限とする実益がある。
[0022] 以下、この発明の実施の形態につき、実験に基づいて説明する。
[0023] 実験 l : IFN a変異蛋白質の取得
実験 1― 1：ファージライブラリーの作製
IFNひ 8bのアミノ酸酉己歹 IJ (酉己歹 IJ表における酉己歹 [J番号 2)におレヽて、 30、 33、 145、 14 6、 149及び 150番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変換し、 IFNひ活性が上 昇した IFNひ変異蛋白質の取得を試みた。すなわち、常法にしたがって、ヒトリンパ 芽球由来株化細胞 BALL_ 1 (JCRB0071 :ジャパニーズ 'コレクション'ォブ'リサ一 チ-バイオリソーシス）から染色体 DNAを採取し、これを錡型として、配列表における 配列番号 16 (制限酵素 Ndel切断部位、開始コドン、及び IFNひ 8の 5'末端付近の 塩基配列を有する）及び配列番号 17 (制限酵素 BamHI切断部位、終止コドン、 IFN a 8の 3'末端付近の塩基配列を有する）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーと して、常法の PCR法により、プライマー配列に特異的な DNAを増幅した後、制限酵 素 Ndel及び BamHIにより消化した。これを、 T7プロモーター領域、 T7ターミネータ 一領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及び ColEl ' Ori領域を有するプラスミドベクタ 一（商品名『pET_ 3a』、 EMDバイオサイエンス社販売（米国））へ、その上記制限酵 素部位に導入した。 IFN α 8をコードする DNA領域を常法の DNAシーケンサーに より解析したところ、配列表の配列番号 18の塩基配列が解読され、 IFNひ 8bをコー ドする DNAであることが判明した。これを錡型にして、配列番号 19 (30及び 33番目 のアミノ酸のコドンを NNSに変換するためのプライマー）と配列番号 20 ( 145、 146、 149及び 150番目のアミノ酸のコドンを NNSに変換するためのプライマー）により常 法にしたがい PCRを行レ、、さらに、得られた PCR産物を铸型にして配列番号 21 (5' 末端側に制限酵素 Ncol切断部位を付加するためのプライマー）及び配列番号 22 ( 3'末端側に制限酵素 Notl切断部位を付加するためのプライマー）により常法にした 力 Sレヽ PCRを行なった。これにより、 IFN a 8のアミノ酸酉己歹 IJにおレヽて、 30、 33、 145、 146、 149及び 150番目のアミノ酸残基のコドンがランダムなコドンに変換した配列表 における配列番号 23で表される DNAを得た。この DNAを制限酵素 Ncol及び Notl で消化し、あらかじめ制限酵素 Ncol及び Notlで消化したファージミドベクター pCA NTAB 5E (アマシャムバイオサイエンス株式会社販売 (東京、 日本)）に、常法によ りライゲーシヨン反応により組み込んだ。これを常法のエレクト口ポーレーシヨン法にて 導入した大腸菌 TG— 1を 2% (w/v)グルコース及び 100 μ g/mlアンピシリンを含 む 2YT培地中で培養し、吸収波長 600nmでの吸光度が 0. 5以上になった時点で、 ヘルパーファージ M13K07 (インビトロジヱン株式会社販売（東京、 日本））を培地 1 ml当たり 1 X 109pfuカ卩え、 37°Cで 1時間振盪培養した後、遠心分離して沈澱部を採 取し、 50 μ g/mlのカナマイシン及び 100 μ g/mlアンピシリンを含む 2ΥΤ培地で 懸濁し、 37°Cで 6時間振盪培養した。遠心分離によりファージを含む上清を採取し、 常法のポリエチレングリコール沈澱法によりファージを回収し、ファージライブラリーと した。 [0024] 実験 1 2 : IFN α受容体タイプ 2 (IFNAR2)を用いたバニング法によるファージクロ ーンの選択
IFNAR2ァィソフォーム3 (SWISS— PLOT No. P48551)の細胞外ドメインとヒ ト免疫グロブリン Gの Fc領域との融合蛋白質 (配列表における配列番号 24)を、常法 により培養動物細胞を用いた一過性発現系により調製し、あらかじめ抗 Fc抗体を壁 面に付着させたポリスチレン製ィムノチューブ（商品名『マキシソープ』、ナルジェヌン ク株式会社販売 (東京、 日本)）に固定化した。このチューブに実験 1 _ 1で得たファ ージを適量添カ卩し、 4°Cで 2時間静置した後、 0. 05% (vZv)ツイーン 20を含むリン 酸緩衝生理食塩水で洗浄し、さらに、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。この後、 IF NAR2に結合したファージ蛋白質を 0. 1M塩酸水溶液により溶出させ、別の容器に 採取した後、塩酸溶液の半分量の 1Mトリス (pH8. 0)をカ卩えて中性とした。採取した ファージを大腸菌 TG—1に感染させ、その大腸菌を 2% (w/v)グノレコース及び 100 μ g/mlアンピシリンを含む 2ΥΤ培地中で培養した後、実験 1—1と同様にしてヘル パーファージ Ml 3K07を添加して、菌体からファージを放出させた。このバニング操 作を 2回繰り返して得られたファージクローンを、大腸菌 TG— 1に感染させ、 2% (w /v)グルコース及び 100 μ g/mlアンピシリンを含む 2ΥΤプレートに播き、 37°Cで 1 0時間培養した後、コロニーを採取することにより単離し、常法にしたがい菌内のファ ージ由来のプラスミドを採取し、常法の DNAシーケンス法により塩基配列を解読した 。その結果、表 2に示す 12種の変異体を選別した。
[0025] 表 2
アミノ酸番号
備考
30 33 145 146 149 150
IFN a 8 し R R A M R 野生型 変異体 No. 1 一 一 し N Y - MUT1 変異体 No. 2 一 一 I S Y 一 MUT2 変異体 No. 3 一 一 し S Y 一 MUT3
一 - V N Y 一 MUT4 変異体 No. 5 一 一 V S Y K
変異体 No. 6 - - し S H - 変異体 No. 7 - 一 一 一 S - 変異体 No. 8 一 - V N Y K
変異体 No. 9 一 - 1 N Y - 変異体 No. 1 0 V 一 1 N Y - 変異体 No. 1 1 一 - 一 一 Q 一
変異体 No. 1 2 A 一 1 N Y - 実験 1一 3 :変異蛋白質の製造
表 2の 12種類の変異蛋白質をコードする DNAを、実験 1—1の方法に準じて、配 列番号 16及び配列番号 17で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに 用いて、常法の PCR法により、プライマー配列に特異的な DNAを増幅した後、制限 酵素 Ndel及び BamHIにより消化した。これを、 T7プロモーター領域、 T7ターミネ一 ター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及び ColEl ' Ori領域を有するプラスミドべク ター（商品名『pET— 3a』、 EMDバイオサイエンス社販売（米国））へ、その上記制限 酵素部位に導入した。これを、このプラスミドを大腸菌 BL21DE3株へ導入し、野性 型 IFN a 8又は各変異蛋白質の産生用の大腸菌を得た。これを常法により、 T プロ ス培地で培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、 TES緩衝液（20 mMトリス塩酸、 10mMエチレンジァミン 4酢酸及び 0· 5M塩化ナトリウム、 ρΗ8· 0) にて 2回洗浄後、 0. 2mgZmlリゾチームを含む TES緩衝液（ρΗ8. 0)に加え、常法 にしたがい超音波処理し、遠心分離し、 IFNひ 8を含む残さを回収した。これを 1 % ( w/v)トリトンエックス— 100を含む TES緩衝液に加え、攪拌後に遠心分離して上清 を除く操作を 3回行レ、、得られた沈澱物を 8Mグァニジン塩酸塩及び 50mMジチォス レイトールを含む、 50mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 0)に加え、遮光下で室温で 16時 間攪拌し、遠心分離して、上清を回収した。これに 100倍量の 1Mトリス、 0. 9 (w/v ) %塩化ナトリウム、 0· 4ML—アルギニン塩酸塩、 2· 5mM還元型ダルタチオン、 0. 5mM酸化型ダルタチオン、 0. 05 (w/v) %ツイーン 20に少量ずっ徐々に攪拌しつ つ加えた後、 4°Cで 16時間静置した。これを 4倍量の 0. l (w/v) %ゥシ血清アルブ ミンを含むリン酸食塩緩衝液 (pH7. 2)に加え、 pHを 6. 5乃至 7. 5に調整した後、 常法にしたがって、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（商品名『ボロス DEAE』、 パーセプティブバイオシステムズ社販売（米国） )により IFN a活性を有するフラクショ ンを採取した。これをさらに、ゲル濾過クロマトグラフィー（商品名『Superdex75』、ァ マシャムバイオサイエンス株式会社販売 (東京、 日本））により IFN α活性を有するフ ラタシヨンを採取し、野性型 IFN a 8及び各変異蛋白質を得た。
[0027] 実験 1一 4 :抗ウィルス活性
実験 1 3で得られた野性型 IFN a 8及び 12種の変異蛋白質の抗ウィルス活性を 測定した。抗ウィルス活性は、標準物質としてヒト IFN a国際標準品を用い、かつ、 F L細胞及びシンドビスウイ/レスを用いる常法のアツセィ系、又は、前記 FL細胞でのバ ィオアッセィ法に準じたヒト結腸癌由来 LS174T細胞 (東北大学加齢医学研究所 T KG0406)及び VSVを用いるバイオアツセィの 2通りの方法で、それぞれについての 比活性を測定した。なお、コントロールとして、組換え型 IFN a 2製剤（商品名『イント ロン A』、シヱリング.ブラウ株式会社販売（大阪、 日本））及びコンセンサス IFN a製剤 (商品名『アドパフェロン』、ァステラス製薬株式会社販売 (東京、 日本)）を用いた。ま た、各アツセィ値から、野性型 IFN a 8の活性を 100とした相対値を算出した。その結 果を表 3に示す。
[0028] 表 3 抗ウィルス活性による比活性 (IU/mg)
Fし LS174T
IFNひ 8
2.5 108 (100%) 5.5 X 108 (100%)
(野性型）
組換え型 IFN 2
1.9 X 1 08 (76%) 8.8 X 1 07 (16%) 製剤
コンセンサス IFN
Of製剤 4.7 X 108 (188%) 4.0 X 108 (73%) 変異体 No. 1 2.9 X 108 (1 16%) 3.1 X 109 (564%) 変異体 No. 2 4.2 X 108 (168%) 4.8 X 109 (873%) 変異体 No. 3 3.9 X 108 (156%) 6.6 X 109 (1200%) 変異体 No. 4 3.3 X 108 (132¾) 4.1 X 109 (745%) 変異体 No. 5 4.4 X 108 (176%) 1.6 X 109 (291%) 変異体 No. 6 3.0 X 108 (120%) 9.5 X 108 (173%) 変異体 No. 7 5.0 108 (200%) 9.0 X 108 (164%) 変異体 No. 8 1.8 108 (72%) 7.5 X 108 (136%) 変異体 No. 9 1 .0 108 (40%) 4.4 X 108 (80%) 変異体 No. 10 2.9 X 108 (1 16%) 3.5 X 108 (64%) 変異体 No. 1 1 1.7 X 108 (68%) 1.5 X 108 (27%) 変異体 No. 12 2.4 X 108 (96%) 1.1 X 108 (20%) 表 3に示すとおり、変異体 No. 1乃至 7の変異蛋白質は、 FL/シンドビス系及び L S 174T/VSV系のバイオアツセィにおいて、野性型 IFN a 8よりも抗ウィルス活性が 高 特に、 LS 174T/VSV系のバイオアツセィにおいて顕著であり、約 2乃至 12倍 の活性を有していた。
[0030] 実験 1 5 :細胞増殖抑制活性
上記の変異蛋白質のうち、変異体 No. 1、 2、 3又は 4の変異蛋白質について、ァメ リカン'タイプ ·カルチャー 'コレクション（ATCC)、ジャパニーズ'コレクシヨン'ォブ ·リ サーチ.バイオリソーシス (jCRB)、ジャーマン 'コレクション.ォブ 'ミクロオルガニズム ズ 'アンド ·セル ·カルチャーズ (DSMZ)又は東北大学加齢医学研究所 (IDAC)力、ら 入手した、ヒト B細胞由来 Daudi細胞 (ATCC CCL— 213)、ヒト慢性骨髄白血病由 来 U937細胞 iCRB JCRB9021 )、ヒト T細胞由 ¾Jurkat細胞（ATCC TIB - 15 2)、ヒト肝癌由来 PLC/PRFZ5細胞 (JCRB 】〇1 80406)、ヒト結腸癌由来1^ 17 4T細胞（IDAC TKG0406)、ヒト肺癌由来 EBC—1細胞 iCRB JCRB0820)、ヒ ト胃癌由来 MKN 1細胞 (JCRB JCRB0252)、ヒト腎癌由来 ACHN細胞（ATCC CRL161 1)、 VMRC— RCW細胞 (JCRB JCRB0813)、 A498糸田胞（DSMZ A CC55)又は Caki— 1細胞（ATCC HTB46)、又はヒト膀胱癌由来 HT1 197細胞（ ATCC CRL— 1473)のいずれかに対する細胞増殖抑制活性を求めた。 10 (v/v ) %ゥシ胎児血清を含む RPMI1640培地に、 8 X 103乃至 2 X 105個/ mlの濃度で 各細胞株を播種し、これに、実験 1 4におけるウィルス感染阻止活性値を指標にし て、 40pg乃至 10 / g/mlの範囲で、上記変異体 4種をそれぞれ段階希釈して加え 、 37°C、 5%炭酸ガス雰囲気下で 72乃至 120時間培養した。これらを常法に従い、『 セルカウンティングキット— 8』 (和光純薬工業株式会社販売 (大阪、 日本)）を用いて 生細胞数を計測し、その計測データから、増殖を半分にまで抑制するために必要な 濃度 (IC )を算出した。また、コントロールとして、実験 1—4と同様に、実験 1—3で
50
得た野性型 IFN a 8、又は、市販の IFN a 2製剤又はコンセンサス IFN a製剤を用 いた。結果を表 4に示す。
[0031] 表 4
Figure imgf000018_0001
表中、「一」は測定を行なってレ、なレ、ことを示す。
[0032] 表 4に示すとおり、変異体 No. 1、 2、 3及び 4の変異蛋白質は、野性型 IFNひ 8より も、多岐の細胞株に対して強い増殖抑制活性を示すことが判明した。また、組換え型 IFNひ 2製剤及びコンセンサス IFNひ製剤と比較しても、変異体 No. 1、 2, 3及び 4 の変異蛋白質は、いずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制活性が高力、つた。これら の結果は、明らかに、変異体 No. 1、 2、 3及び 4の変異蛋白質が、野性型 IFN " 8や 従来の IFN a製剤よりも優れた生物活性を有してレ、ることを示してレ、る。
[0033] 実験 2： IFN a変異蛋白質のリジン変換変異蛋白質の作製
実験 2— 1：ファージライブラリーの作製
水溶性高分子との結合位置を限定するために、 IFN a変異蛋白質のリジン残基を 他のアミノ酸に置換した、リジン変換変異蛋白質の作製を試みた。すなわち、実験 1 2により得られた変異体 No. 2 (『MUT2』）の変異蛋白質をコードする DNA (配列 番号 11 )を铸型にして、配列表における配列番号 25 (46、 50及び 71番目のリジン 残基をランダムなアミノ酸残基に変換するためのプライマー）と配列番号 26 (122、 1 34及び 135番目のリジン残基をランダムなアミノ酸配列に変換するためのプライマー )の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせにより PCRを行なレヽ 、増幅された DNAを錡型にして、さらに、配列表における配列番号 27 (31番目のリ ジン残基をランダムなアミノ酸残基に変換するためのプライマー）と配列番号 28 (160 、 163及び 165番目のリジン残基をランダムなアミノ酸配列に変換するためのプライ マー）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせにより PCRを行 なった。上記の操作により、 IFNひ変異蛋白質『MUT2』の 10箇所のリジン残基がラ ンダムなアミノ酸残基のコドン (NNS)に変換された配列表における配列番号 29の塩 基配列の DNAを得た。この DNAを、常法にしたがい、ファージミドベクター pCANT AB 5Eに組み込んで、ファージライブラリーを作製し、さらに、常法のエレクト口ポー レーシヨン法により、大腸菌 TG—1に導入した。得られた大腸菌を 2% (wZv)グノレコ ースを含む 2YT培地に懸濁し、 37°Cで 1時間振盪培養した後、 2% (w/v)ダルコ一 ス及び 100 /i g/mlアンピシリンを含む LBプレートに播き、 16時間培養した。プレー トに出現したすべての大腸菌コロニーを採取し、 2% (w/v)グルコース及び 100 β g /mlアンピシリンを含む 2YT培地に懸濁し、 37°Cで振盪培養を行った後、濁度が 0 . 5の時点で、ヘルパーファージ M13K07を加え、 37°Cで 1時間振盪培養した後、 遠心分離により菌体を集め、培地を 50 μ g/mlカナマイシン及び 100 μ g/mlアン ピシリンを含む 2YT培地に交換した後、 37°Cで 7時間振盪培養してファージを産生 させ、ファージライブラリーを得た。これらを、実験 1—2と同様にして、 IFNAR2とヒト 免疫グロブリン Gの Fc領域との融合蛋白質 (配列表における配列番号 24)を結合さ せたポリエチレン製ィムノチューブを用いるバニング法でスクリーニングした結果、 31 番目のリジン残基のみが他のアミノ酸残基に変換されなかったリジン変換変異蛋白 質『MUT2K31』（配列表における配列番号 8)、及び、 134番目のリジン残基のみが 他のアミノ酸残基に変換されなかったリジン変換変異蛋白質『MUT2K134』（配列 表における配列番号 9)が得られた。これらは、 IFNひ変異蛋白質『MUT2』（配列表 における配列番号 5)のアミノ酸配列において、 31及び 134番目のリジン残基のいず れかと、それらリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸残基に変換されたリ ジン変換変異蛋白質である。
[0034] 実験 2— 2 :リジン変換変異体の製造
上記で得られた 2種のリジン変換変異蛋白質は、実験 1 3の方法にしたがって、 大腸菌により発現させた。ただし、錡型として『MUT2K31』をコードする DNA (配列 表における配列番号 14)又は『MUT2K134』をコードする DNA (配列表における 配列番号 15)を、プライマーとして配列表における配列番号 16と配列番号 30の塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列表における配列番号 16と配列番号 31の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
[0035] 実験 2— 3 :抗ウィルス活性
得られたリジン変換変異蛋白質の抗ウィルス活性を実験 1—4と同様にして測定し た。なお、対照として、野性型 IFN a 8又は実験 1 - 3で作製した IFN a変異蛋白質『 MUT2』を用レ、、その相対活性を算出した。その結果を表 5に示す。
[0036] 表 5
Figure imgf000020_0001
[0037] さらに、実験 1 5に準じて、 U937細胞、 Jurkat細胞、 PLC/PRF/5細胞、 EB C—1細胞、 MKN1細胞、 ACHN細胞、 VMRC—RCW細胞、 A498細胞、 Caki— 1細胞、又は HT1 197に対する細胞増殖抑制活性測定し、実験 1 5と同様にして、 IC を求めた。その結果を表 6に示す。
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[0038] 表 6
Figure imgf000021_0001
[0039] 表 5及び表 6に示すとおり、 IFN a変異蛋白質のリジン変換変異蛋白質である『M UT2K31』と『MUT2K134』は、もとの変異蛋白質『MUT2』と比べると、抗ウィルス 活性及び細胞増殖抑制活性が減少するものの、野性型 IFN a 8と比べて、高い抗ゥ ィルス活性及び細胞増殖抑制活性を保持していた。
[0040] 実験 3：リジン変換変異蛋白質と水溶性高分子との生理活性複合体
実験 3— 1：生理活性複合体の製造
実験 2— 2の方法で得られたリジン変換変異蛋白質又は実験 1 3で得られた野性 型 IFN a 8に、分子量 20kDaのポリエチレングリコールを結合させた。すなわち、野 性型 IFN α 8、 IFN α変異蛋白質『MUT2K31』又は『MUT2K134』をホウ酸緩衝 溶液 (pH9. 0)に濃度 0. 1乃至 5mg/mlになるように溶解した後、水溶性の高分子 としてモノメトキシ N サクシンィミジルプロピオネートにより活性化させたポリエチレン グリコール（m— PEG— SPA)、をモル比で蛋白質の 3乃至 8倍になるように加え、 7 °Cで 2時間反応させた。次いで、反応混合物へ ε アミノカプロン酸をモル比で水溶 性の高分子の 10倍量加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物を陰ィ オン交換クロマトカラム（商品名『Resource Q』、アマシャムバイオサイエンス株式会 社販売（東京、 日本））により HPLC分画して蛋白質に結合していないポリエチレング リコールを除去した。さらにゲル濾過クロマトカラム（商品名『Superdex200』、アマシ ャムバイオサイエンス株式会社販売（東京、 日本)）を用いて HPLCにより分画し、 1 分子の IFN α 8又は IFN a変異体に 1分子のポリエチレングリコールが結合してなる 生理活性複合体を採取した。 [0041] 実験 3— 2 :熱安定性
実験 3— 1で得た生理活性複合体をそれぞれ、 5 (v/v) %ゥシ胎児血清を含む M EM培地で 10, 000IU/mlの濃度に調製し、下記表 7に示す温度で 30分間加熱処 理を行った。遠心分離後、培地上清を回収し、それらを FL細胞及びシンドビスウィル スを用いたアツセィ系に供し、残存する抗ウィルス活性を測定し、加熱前の抗ウィル ス活性に対する百分率 (残存活性率）を下記数式 1により求めた。結果を表 7に示す
[0042] 数式 1
残存活性率(％) =
(加熱後のウィルス感染阻止活性/加熱前のウィルス感染阻止活性） X 100
[0043] 表 7
Figure imgf000022_0001
[0044] 表 7に示すとおり、ポリエチレングリコールと結合した『MUT2K31』又は『MUT2K 134』は、 60°Cで処理した後にも 69%又は 84。/0の活性を保持しており、ポリエチレン グリコールと結合した野性型 IFN α 8よりも安定性に優れることが判明した。
[0045] 実験 3— 3：リジン変換変異蛋白質と水溶性高分子との生理活性複合体の生物作用 実験 1一 4に準じて抗ウィルス活性を、実験 1一 5に準じて細胞増殖抑制活性を調 ベた。対照として IFNひ 2aに 40kDaのポリエチレングリコールが結合している市販の IFNひ製剤（商品名『ぺガシス』、中外製薬株式会社販売 (東京、 日本)）を用いた。 抗ウィルス活性の結果を表 8に、細胞増殖抑制活性の結果を表 9に示す。
[0046] 表 8 抗ウィルス活性による比活性（IU/mg)
Fし LS 1 74T
組換え型 IFN or 2a
2.86 X 106 (100%) 9.01 X 105 (100%) -PEG( 40kDa)
MUT2K31
1.72 107 (601 %) 2.00 X 107 (2220%) -PEG(20kDa)
MUT2K1 34
2.79 X 107 (976%) 4.73 X 107 (5250%) -PEG(20kDa)
[0047] 表 9
Figure imgf000023_0001
[0048] 表 8及び表 9に示すとおり、『MUT2K31』又は『MUT2K134』にポリエチレンダリ コールを結合して作製した生理活性複合体は、市販のポリエチレングリコールを結合 した IFN a 2a製剤よりも、著しく高い抗ウィルス活性及び細胞増殖抑制活性を有して いた。
[0049] 実験 4 :急性毒性
常法にしたがって、 8週齢の雄性マウス（体重 20乃至 25g)に、実験 1—3で得られ た IFN a変異蛋白質『MUT1』、『MUT2』、『MUT3』又は『MUT4』、実験 2— 2で 得られた IFN a変異蛋白質『MUT2』のリジン変換変異蛋白質『MUT2K31』又は『 MUT2K134』、又は、実験 3— 1で得られた『MUT2K31』又は『MUT2K134』に 1分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを、経 皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、生理活性複合体の LD は、いずれの
50
投与経路においても lmgZkg体重以上であった。このことは、この発明の生理活性 複合体がヒトへの投与を前提とする医薬品として、又は医薬品に配合して用いること が安全であることを物語っている。
[0050] 以下、実施例で本発明の詳細を説明する。
実施例 1
[0051] ぐ液剤 >
安定剤として 1 % (wZv)人血清アルブミンを含む生理食塩水に、実験 1—3で得ら れた IFNひ変異蛋白質『MUT1』、『MUT2』、『MUT3』又は『MUT4』、実験 2 _ 2 で得られた IFN α変異蛋白質『MUT2』のリジン変換変異蛋白質『MUT2K31』又 は『MUT2K134』、又は、実験 3—1で得られた『MUT2K31』又は『MUT2K134 』に 1分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを 1 mg/mlになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
[0052] 本品は、悪性腫瘍、ウィルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感 受性疾患を治療又は予防するための注射剤、点眼剤又は点鼻剤として有用である。 実施例 2
[0053] <乾燥注射剤 >
安定剤として l % (w/v)精製ゼラチンを含む生理食塩水 100mlに、実験 1—3で 得られた IFN ct変異蛋白質『MUT1』、『MUT2』、『MUT3』又は『MUT4』、実験 2 _ 2で得られた IFN a変異蛋白質『MUT2』のリジン変換変異蛋白質『MUT2K31』 又は『MUT2K134』、又は、実験 3—1で得られた『MUT2K31』又は『MUT2K13 4』に 1分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを l OOmg溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に lmlずつ分 注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。
[0054] 本品は、悪性腫瘍、ウィルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感 受性疾患を治療又は予防するための乾燥注射剤として有用である。 実施例 3
[0055] <軟膏剤>
滅菌蒸留水にカルボキシビュルポリマー（商品名『ハイビスヮコ一』、和光純薬工業 株式会社販売（大阪、 日本)）と、パイロジェンを除去した高純度トレハロース (登録商 標『トレハ』、株式会社林原商事販売（岡山、 日本)）とをそれぞれ 1. 4% (wZv)及び 2. 0% (w/v)になるように溶解した後、実験 1 _ 3で得られた IFN α変異蛋白質『Μ UT1』、『MUT2』、『MUT3』又は『MUT4』、実験 2 _ 2で得られた IFNひ変異蛋白 質『MUT2』のリジン変換変異蛋白質『MUT2K31』又は『MUT2K134』、又は、実 験 3—1で得られた『MUT2K31』又は『MUT2K134』に 1分子のポリエチレングリコ ールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかの適量を均一に混合し、 pH7. 2 に調製して、 lg当り生理活性複合体を約 5 z g含むペースト状物を得た。
[0056] 延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウィルス性疾患、細菌感染症及び免 疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための軟膏剤として有用であ る。
実施例 4
[0057] <錠剤 >
無水結晶性 α—マルトース粉末 (登録商標『ファイントース』、株式会社林原商事販 冗 (
岡山、 日本)）に、実験 1 3で得られた IFN ct変異蛋白質『MUT1』、『MUT2』、『 MUT3』又は『MUT4』、実験 2— 2で得られた IFN α変異蛋白質『MUT2』のリジン 変換変異蛋白質『MUT2K31』又は『MUT2K134』、又は、実験 3— 1で得られた『 MUT2K31』又は『MUT2K134』に 1分子のポリエチレングリコールが結合した生 理活性複合体のうちのレ、ずれかの適量を均一に混合し、得られた混合物を常法によ り打錠して製品 1錠 (約 200mg)当り生理活性複合体を約 1 μ g含む錠剤を得た。
[0058] 摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウィルス性疾患、細菌感染症及び免 疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための錠剤として有用である 産業上の利用可能性 以上説明したとおり、本発明の IFN a変異蛋白質は、従来の IFN α製剤と比較して 著しく活性が高ぐまた、水溶性の高分子と結合させて生理活性複合体とした場合、 体内動態に優れ、注射投与しても、血中で高濃度状態が長時間持続する。したがつ て、本発明によれば、従来の IFNひを有効成分とする感受性疾患剤よりも、抗ウイノレ ス作用及び抗腫瘍作用に優れた感受性疾患剤を提供することができ、医薬品の分 野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウィルス疾患剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などと して多種多様の用途を有する。

Claims

請求の範囲
[1] 配列表における配列番号 1乃至 3のいずれかで示されるヒトインターフェロンひのサ ブタイプひ 8のアミノ酸配列において、 145番目のアルギニン残基をロイシン残基、ィ ソロイシン残基又はノ リン残基に、 146番目のァラニン残基をァスパラギン残基又は セリン残基に、及び、 149番目のメチォニン残基がチロシン残基に変換されたァミノ 酸配列を含んでなる変異蛋白質。
[2] 配列表における配列番号 4乃至 7のいずれかのアミノ酸配列を含んでなる請求項 1 に記載の変異蛋白質。
[3] 配列表における配列番号 1乃至 3のいずれかで示されるアミノ酸配列において、さ らに、 31及び 134番目のリジン残基のいずれかを保存し、それ以外のリジン残基の 全てが他のアミノ酸残基に変換された請求項 1に記載の変異蛋白質。
[4] 配列表における配列番号 8又は 9に記載のアミノ酸配列を含んでなる請求項 3に記 載の変異蛋白質。
[5] 請求項 1乃至 4のいずれかに記載の変異蛋白質と水溶性の高分子とが結合した生 理活性複合体。
[6] 請求項 1乃至 4のいずれかに記載の変異蛋白質及び請求項 5に記載の生理活性 複合体から選ばれる 1種又は 2種以上を含んでなる感受性疾患剤。
[7] 抗腫瘍剤、抗ウィルス剤又は抗アレルギー剤としての請求項 6に記載の感受性疾 患剤。
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