WO2009116491A1 - ヒトインターフェロンαサブタイプα８及びその変異蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

ヒトインターフェロンαサブタイプα８及びその変異蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体 Download PDF

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human
antibody
mutant protein
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知恵 牛尾
晴美 有安
徹 栢野
利夫 有安
恒孝 太田
福田　恵温
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株式会社林原生物化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody against human interferon ⁇ (hereinafter, interferon may be abbreviated as “IFN”), and specifically, human IFN ⁇ subtype ⁇ 8 (hereinafter referred to as human IFN ⁇ subtype ⁇ 8).
  • IFN ⁇ 8 human IFN ⁇ subtype ⁇ 8
  • monoclonal antibody specific for the mutant protein a novel monoclonal antibody against human interferon ⁇
  • IFN ⁇ subtype ⁇ 8 human IFN ⁇ subtype ⁇ 8
  • monoclonal antibody specific for the mutant protein a novel monoclonal antibody against human interferon ⁇
  • IFN was discovered as a virus growth inhibitory factor produced by cells infected with the virus.
  • IFN three types of ⁇ / ⁇ , ⁇ , and ⁇ with different receptors are known for IFN, and at least 13 types of subtypes are known for human IFN ⁇ .
  • Human IFN ⁇ is a recombinant preparation produced in E. coli, a natural preparation induced by stimulating peripheral blood leukocytes or cultured lymphoblastoid cells with Sendai virus (HVJ), etc. It is widely applied clinically as a therapeutic agent for malignant neoplasms and hepatitis B and C.
  • IFN has been studied for its immunoregulatory action, allergic diseases, autoimmune diseases such as diabetes, and the involvement of diseases caused by viral infection, and is interested in the dynamics in vivo.
  • a bioassay based on antiviral activity using cultured cells is used for measuring the activity of IFN.
  • the bioassay best reflects the physiological activity of IFN, it is known that it takes time to measure and is susceptible to factors that affect the physiological function of cells used in the assay.
  • a natural IFN containing a plurality of types and subtypes is produced (for example, Yanai Y.), “Journal of Interferon and Cytokine Research ( Journal of Interferon & Cytokine Research), Vol. 21, No. 10, pp. 835 to 841 (2001)), and directly measuring the activity of each of these subtypes and analyzing their functions was extremely difficult.
  • IFN ⁇ 4 human IFN ⁇ subtype ⁇ 4
  • kits that can specifically quantify human IFN ⁇ using mouse-derived monoclonal antibodies are also available (for example, sold by JIMRO Corporation, trade name) Although it is a “human IFN- ⁇ measurement kit”), the IFN ⁇ subtype cannot be specifically identified.
  • IFN ⁇ 8a IFN ⁇ 8a
  • IFN ⁇ 8b IFN ⁇ 8b
  • IFN ⁇ 8c IFN ⁇ 8c
  • human IFN ⁇ may act as a co-agonist (enhancement agent) of other subtypes (Japanese Patent Publication No. 9-509955), and IFN ⁇ 8 mutant proteins having different specific activities (International Publication No. WO 2006/051805 pamphlet), researching the physiological functions of these human IFN ⁇ subtypes and mutant proteins, and developing them as pharmaceutical preparations, When examining blood kinetics and comparing them, an assay system that allows specific, accurate, and sensitive quantification of the protein mass without being affected by other physiological factors as in bioassays Is needed.
  • Monoclonal antibodies can recognize specific antigenic determinants (epitope), but there are differences in their specificity and affinity, so they are suitable for constructing an IFN ⁇ 8-specific and highly sensitive assay system. There is a need to develop monoclonal antibodies. Further, in order to use IFN ⁇ 8 or a mutant protein thereof for pharmaceutical purposes, it is necessary to purify the IFN ⁇ 8 or the mutant protein specifically and in large quantities. It is necessary to develop a monoclonal antibody suitable for the preparation of an antibody column in which nonspecific adsorption of other proteins is small and IFN ⁇ 8 or its mutant protein can be easily eluted from an antibody column prepared using the monoclonal antibody .
  • the first object of the present invention is to provide a monoclonal antibody specific to IFN ⁇ 8 and its mutant protein.
  • the second object of the present invention is to provide a hybridoma capable of producing such a monoclonal antibody.
  • the third object of the present invention is to provide a method for detecting IFN ⁇ 8 and its mutant protein using such a monoclonal antibody.
  • the present invention provides various viral diseases, autoimmune diseases, diabetes, psoriasis, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, Behcet's disease, aplastic anemia, nephritis, systemic lupus erythematosus, comprising such a monoclonal antibody as an active ingredient.
  • Another object is to provide a therapeutic agent for immunodeficiencies including acquired.
  • the present inventors have intensively studied a novel monoclonal antibody that specifically recognizes IFN ⁇ 8 and its mutant protein, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody that specifically recognizes IFN ⁇ 8 and its mutant protein.
  • a method for specifically detecting IFN ⁇ 8 and its mutant protein is provided.
  • a method for specifically purifying IFN ⁇ 8 and its mutant protein from a test sample containing impurities is provided.
  • therapeutic agents for various diseases such as allergies, immunodeficiencies or autoimmune diseases, which involve IFN ⁇ 8.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically binds to IFN ⁇ 8 and its mutant protein, and does not substantially bind to other IFN types and subtypes. Therefore, since the monoclonal antibody of the present invention exhibits an immune reaction only with IFN ⁇ 8 and its mutant protein in the test sample, IFN ⁇ 8 and its mutant protein in the test sample are specifically, qualitatively or quantitatively detected. Has the advantage of being able to. Further, it has an advantage that IFN ⁇ 8 and its mutant protein can be collected with high purity and efficiency from a mixture containing IFN ⁇ 8 and its mutant protein and a contaminant.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing an example of a calibration curve of rIFN ⁇ 8 obtained by an enzyme immunoassay by a sandwich method using the monoclonal antibody ⁇ 8 # 139 mAb of the present invention as a solid phase antibody and ⁇ 8Y36-2 mAb as a labeled antibody.
  • the IFN ⁇ 8 referred to in the present invention refers to a known polypeptide having the amino acid sequence of IFN ⁇ 8 described in, for example, International Publication No. WO 2006/051805 pamphlet, and the amino terminus (hereinafter referred to as “N terminus”) is cysteine. It refers to three types of polypeptides having an amino acid sequence composed of 165 or 166 amino acids.
  • the polypeptides may be referred to as IFN ⁇ 8a, IFN ⁇ 8b, and IFN ⁇ 8c (see, for example, International Publication No. WO 2006/051805 pamphlet), and in this specification, these may be collectively referred to as IFN ⁇ 8. Regardless of the origin and origin of the polypeptide, it may be natural, recombinant, or chemically synthesized.
  • the mutated protein of IFN ⁇ 8 in the present invention refers to a polypeptide in which one or two or more amino acids constituting a polypeptide having the amino acid sequence of IFN ⁇ 8 are substituted with other amino acids, and at least described below, Hybridoma mAb-IFN ⁇ 8 # 139 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, Deposit Number FERM BP-11081, hereinafter abbreviated as “ ⁇ 8 # 139”) and mAb-IFN ⁇ 8Y36-2 (Independent Administrative Industrial Technology)
  • ⁇ 8 # 139 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, Deposit Number FERM BP-11081, hereinafter abbreviated as “ ⁇ 8 # 139”
  • mAb-IFN ⁇ 8Y36-2 Independent Administrative Industrial Technology
  • the 145th arginine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of IFN ⁇ 8 disclosed by the present applicant in International Publication No. WO 2006/051805 is converted to a leucine residue, isoleucine residue or valine residue.
  • the monoclonal antibody referred to in the present invention includes all monoclonal antibodies specific to the above-mentioned IFN ⁇ 8 and its mutant proteins, and the origin / origin, class, isotype, etc. are not limited.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using IFN ⁇ 8 or a mutant protein thereof or an antigenic fragment thereof as an antigen. Specifically, for example, a hybridoma of an antibody-producing cell collected from a mammal immunized with such an antigen and a cell derived from a mammal capable of infinite growth is prepared, and the monoclonal antibody of the present invention is produced from this. Can be obtained by selecting clones of hybridomas capable of producing, and culturing them in vitro and in vivo.
  • IFN ⁇ 8 that can be an antigen and its mutant protein
  • IFN ⁇ 8 induced by adding a virus such as HVJ to lymphoblastoid cells such as BALL-1 cells.
  • IFN ⁇ 8 prepared by gene recombination technique or chemical synthesis method or a mutant protein thereof may be used.
  • BALL- One cell-derived IFN ⁇ 8 may be prepared, and IFN ⁇ 8 or a mutant protein thereof may be prepared by the method described in International Publication No.
  • WO 2006/051805 pamphlet They are usually used in a completely purified or partially purified state. In order to obtain an antigenic fragment, these completely purified products or partially purified products are chemically or enzymatically degraded, or the amino acid sequence of IFN ⁇ 8a, IFN ⁇ 8b or IFN ⁇ 8c disclosed in International Publication No. WO 2006/051805 pamphlet is used. Based on this, the desired peptide may be synthesized.
  • Immunization may be performed by a conventional method.
  • the above-mentioned IFN ⁇ 8, a mutant protein thereof or a fragment thereof may be administered alone or together with an appropriate adjuvant into mammals intravenously, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, and kept for a certain period of time.
  • the mammal is not particularly limited, and the type, size, and sex are not limited as long as the desired antibody-producing cells can be obtained.
  • rodents such as rats, mice, hamsters and the like are used, and the optimal one is selected in consideration of compatibility with cells derived from mammals capable of infinite growth described later.
  • the inoculation amount of the antigen is usually about 5 to 500 ⁇ g / animal and divided into 2 to 5 times at intervals of about 1 to 2 weeks. Inoculate. Then, 3 to 5 days after the final inoculation, the spleen is removed and dispersed to obtain spleen cells as antibody-producing cells.
  • the antibody-producing cells thus obtained are fused with cells derived from mammals capable of infinite growth to obtain fused cells containing the target hybridoma.
  • Mammals derived from mammals capable of infinite growth usually include P3-NS1-Ag4-1 cells (ATCC TIB18), P3-X63-Ag8 cells (ATCC TIB9) and SP2 / O-Ag14 cells (ATCC CRL1581), Y3Ag1 .2 (ATCC CRL1631) and other mouse and rat myeloma-derived cell lines, or mutants thereof are used.
  • fusion accelerators such as polyethylene glycol and Sendai virus, and methods using electric pulses are used.
  • cell fusion is derived from mammals capable of infinite growth with antibody-producing cells in a fusion medium containing a fusion accelerator.
  • the cells are suspended at a ratio of about 1: 1 to 1:10, and incubated in this state at about 30 to 40 ° C. for about 1 to 5 minutes.
  • a general common medium such as MEM medium, RPMI 1640 medium and Iskov modified Dulbecco medium may be used, and it is desirable to remove serum such as bovine serum.
  • the fused cells obtained as described above are transferred to a selection medium such as HAT medium, and cultured at about 30 to 40 ° C. for about 3 days to 3 weeks to obtain cells other than the hybridoma. To kill.
  • the hybridoma is cultured by a conventional method, and the reactivity of the antibody secreted into the culture with IFN ⁇ 8 and its mutant protein is tested.
  • conventional methods for detecting antibodies such as enzyme immunoassay, radioimmunoassay and bioassay are used. For example, Koji Toyama and Minami Ando "Monoclonal Antibody Experiment Manual" published by Kodansha Scientific Co., Ltd.
  • a hybridoma producing an antibody specific for IFN ⁇ 8 and its mutant protein is immediately cloned by a limiting dilution method or the like to obtain a single-cloned hybridoma according to the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing such a hybridoma in vitro or in vivo.
  • a conventional method for culturing cells derived from mammals is used.
  • the culture is transplanted to a warm-blooded animal other than a human.
  • monoclonal antibodies are collected from the ascites and / or blood.
  • ⁇ 8 # 139 Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary, Accession Number FERM BP-11081
  • ⁇ 8Y36-2 Independent Administrative Institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary, Accession No.
  • the monoclonal anti-IFN ⁇ 8 antibody produced by (2) has a low non-specific reaction when these antibodies are used for detection of IFN ⁇ 8 and its mutant protein, and can detect a small amount of IFN ⁇ 8 specifically and with high sensitivity. .
  • these hybridomas are characterized by high production ability of monoclonal antibodies and easy culture in vivo and in vitro. To collect monoclonal antibodies from culture, ascites or blood, conventional methods in the art for purifying antibodies in general are used.
  • Individual methods include, for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, centrifugation, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, gel electrophoresis and isoelectric focusing. Electrophoresis etc. are mentioned, These are applied in combination as needed.
  • the purified monoclonal antibody is then concentrated and dried to be liquid or solid depending on the application.
  • the monoclonal antibody of the present invention is, for example, a DNA encoding a heavy chain and light chain variable region containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 and 5 in the sequence listing, or SEQ ID NO: 12 or 13, DNAs encoding the heavy chain and light chain variable regions having the base sequence shown by 14, respectively, and known DNAs encoding heavy chain and light chain constant regions (see, for example, JP-A-2007-252372), respectively.
  • a ligated gene is synthesized by PCR or chemical synthesis, and is transformed into a known expression vector (pcDNA3.1 (available from Invitrogen)) that enables expression of the gene by a conventional method to prepare a transformant.
  • pcDNA3.1 available from Invitrogen
  • These antibodies are produced by expressing them in a host such as Chinese high-star ovary cells (CHO cells) or E. coli. From the nutrient solution can be obtained by purifying the antibody using Protein A column or the like.
  • the antibodies produced by these methods may be used as they are for the purpose described later. As long as they have the ability to bind to IFN ⁇ 8 and its mutant proteins, Fv, scFv, Fab containing the antigen recognition site of the antibody. , F (ab ′), Fab ′ and the like can be advantageously used.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a wide range of uses in various fields that require detection of IFN ⁇ 8 and / or its mutant protein. That is, when a labeled immunoassay such as a radioimmunoassay, an enzyme immunoassay, or a fluorescent immunoassay is applied to the monoclonal antibody of the present invention, qualitative or quantitative analysis of IFN ⁇ 8 and / or its mutant protein in a test sample specifically, quickly and accurately. can do. In such analysis, the monoclonal antibody of the present invention is used after being labeled with, for example, a radioactive substance, an enzyme and / or a fluorescent substance.
  • a labeled immunoassay such as a radioimmunoassay, an enzyme immunoassay, or a fluorescent immunoassay
  • a labeled immunoassay is characterized by being able to analyze a large number of test samples at one time, requiring less time and labor for analysis, and being highly accurate in analysis compared to a bioassay. Therefore, the detection method according to the present invention is extremely useful for process control, quality control of products when producing IFN ⁇ 8 and / or its mutant protein, and clinical diagnosis of diseases involving IFN ⁇ 8.
  • the present invention does not relate to the labeling of the monoclonal antibody or the labeling assay itself, and therefore will not be described in detail.
  • P. Thyssen translated by Eiji Ishikawa, “Enzyme Immunoassay”, published in 1989 by Tokyo Chemical Dojin, Various methods are described in detail on pages 196 to 348.
  • these monoclonal antibodies can be used as a solid phase antibody and / or a labeled antibody in the enzyme antibody method to obtain IFN ⁇ 8 and its antibody. Mutant proteins can be specifically detected.
  • the protein is 50 to 2,000 pg / ml. It is possible to construct a highly sensitive assay system that can be detected within a range of 1 and that substantially does not detect other human IFN ⁇ subtypes other than IFN ⁇ 8.
  • monoclonal antibodies suitable for the highly sensitive enzyme antibody method by the sandwich method include, for example, ⁇ 8 # 139 (Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Accession No.
  • FERM BP-11081 A monoclonal antibody produced by a hybridoma of ⁇ 8Y36-2 (Incorporated Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Accession No. FERM BP-11082) can be exemplified.
  • these two types of monoclonal antibodies are used as a solid phase antibody and a labeled antibody, human IFN ⁇ subtypes other than IFN ⁇ 8 are not detected even at a concentration of 2,000 pg / ml, and non-specific Since almost no reaction due to adsorption is observed, IFN ⁇ 8 and its mutant protein can be measured with high sensitivity and accuracy.
  • the monoclonal antibody of the present invention is also extremely useful for purification of IFN ⁇ 8 and its mutant protein by immunoaffinity chromatography.
  • a purification method comprises contacting the monoclonal antibody of the present invention with a mixture of the IFN ⁇ 8 and its mutant protein and a contaminant such as a contaminant protein other than the protein to adsorb only the protein to the monoclonal antibody;
  • the method comprises a step of desorbing the adsorbed protein from the monoclonal antibody, and both steps are usually performed in an aqueous medium.
  • the monoclonal antibody of the present invention is usually used in a state of being bound to a gel-like water-insoluble carrier, and the water-insoluble carrier is packed into a cylindrical tube or the like in a column shape, and for example, the lymphoblastoid cell line BALL is used.
  • the culture supernatant containing IFN ⁇ produced by stimulating -1 with HVJ the culture medium of a transformant capable of producing IFN ⁇ 8 or its mutant protein, or a partially purified product thereof is passed through, substantially only the protein Adsorbs to the monoclonal antibody on the water-insoluble carrier.
  • the adsorbed protein can be easily desorbed by changing the hydrogen ion concentration around the monoclonal antibody.
  • the pH is on the acidic side, usually pH 2 to 3
  • a monoclonal antibody belonging to the IgM class when used, it can be eluted at an alkaline pH, usually pH 10-11.
  • a monoclonal antibody suitable for this purpose for example, monoclonal antibodies produced by ⁇ 8 # 139 and ⁇ 8Y36-2 can be exemplified.
  • the monoclonal antibody of the present invention is expressed in CHO cells or E. coli using the above-described recombinant techniques, etc. to prepare chimeric antibodies, humanized antibodies or human antibodies.
  • IFN ⁇ 8 develops by preparing fragments such as Fv, short chain antibody (scFv), Fab, F (ab ′), Fab ′ fragment, diabodies and minibodies having the antigen recognition site of Various viral diseases, allergies, atopic diseases, autoimmune diseases, diabetes, psoriasis, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, Behcet's disease, aplastic anemia, nephritis, systemic lupus erythematosus and It can also be advantageously used as an active ingredient of a therapeutic agent for various diseases such as immunodeficiencies including acquired diseases.
  • An antibody produced by ⁇ 8 # 139 that can be produced is desirable.
  • An antibody produced by hybridoma ⁇ 8 # S56-1 described later can also be advantageously used because it can neutralize IFN ⁇ 8 activity.
  • the preparation of the monoclonal antibody alone can be used, but usually, a form of preparation containing one or more pharmaceutically acceptable additives is desirable and used for the treatment of the disease. It is optional to further blend other active ingredients.
  • the daily dose of the monoclonal antibody of the present invention is 0.001 mg to 2,000 mg, preferably 0.01 to 1,000 mg, more preferably 0.1 mg to 1,000 mg per day for an adult. Or it may be divided into multiple doses.
  • the monoclonal antibody of the present invention which is preferable as an immunoassay, IFN ⁇ 8 or its mutant protein purification, or a therapeutic agent for diseases associated with the onset or exacerbation of IFN ⁇ 8, will be described more specifically.
  • a monoclonal antibody capable of achieving the intended object of the present invention If so, antibodies produced by hybridomas of ⁇ 8 # 139 and ⁇ 8Y36-2 are desirable, regardless of their origin or amino acid sequence.
  • the heavy chain variable region contains one or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 23 in the sequence listing, and / or the light chain variable region contains amino acids shown in SEQ ID NOs: 24 to 26.
  • an antibody comprising one or more of the sequences, or a heavy chain variable region comprising one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 27 to 29 in the sequence listing, and / or a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 30 to 32
  • An antibody comprising one or more amino acid sequences represented by Furthermore, the heavy chain variable region includes all amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 21 to 23 in the sequence listing, and the light chain variable region includes all amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 24 to 26, or heavy antibodies. More preferred is an antibody comprising all the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 27 to 29 in the chain variable region and all the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30 to 32 in the light chain variable region.
  • an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 in the sequence listing, and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing in the light chain variable region, or SEQ ID NO: 18 in the sequence listing in the heavy chain variable region Further preferred is an antibody comprising the amino acid sequence represented by 19 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing in the light chain variable region.
  • an antibody comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 in the heavy chain variable region and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the light chain variable region has neutralizing activity against IFN ⁇ 8. It is desirable because it has a high correlation with activity.
  • These antibodies can be used as they are, by using their partial sequences, or by preparing recombinants by deleting, adding, or substituting about 1 to 100 of these amino acids.
  • Human IFN ⁇ 8 and its mutations Quantitative and qualitative analysis of IFN ⁇ 8 that specifically recognizes protein, IFN ⁇ 8 purification, and further, chimeric antibody, humanized antibody, or human antibody suitable for each use such as disease treatment involving IFN ⁇ 8, clinical diagnosis, Preparation by a known method (for example, JP 2004-533217 A or JP 2007-252372 A) can also be advantageously carried out.
  • amino acid deletions, additions and substitutions are preferably in the range of several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2. Such deletions and addition substitutions may be introduced into hypervariable sites that define the specificity of the antibody, but other sites are usually desirable.
  • the recombinant human IFN ⁇ subtype and the IFN ⁇ 8 mutant protein containing IFN ⁇ 8 (hereinafter, the recombinant type may be abbreviated as “r”) used in the following examples are both Hayashibara Corporation. Using materials prepared with E. coli at the Institute of Biochemistry (Yanai Y., etc.), “Journal of Interferon & Cytokine Research”, Volume 21, Volume 10 No., pages 835 to 841 (2001) and international publication WO 2006/051805). As rIFN ⁇ 8, a peptide having the amino acid sequence of IFN ⁇ 8b was used (see International Publication No.
  • WO 2006/051805 pamphlet human IFN ⁇ subtype ⁇ 2b (hereinafter abbreviated as “IFN ⁇ 2”), nIFN ⁇ 8, mouse IFN ⁇ / ⁇ and rat IFN ⁇ of natural type (hereinafter, the natural type may be abbreviated as “n”) are: “Journal of Interferon & Cytokine Research”, Vol. 21, No. 10, using materials prepared by Hayashibara Biochemical Research Institute, Inc. (Yanai Y.) 835-841 (2001)).
  • Human IFN ⁇ (hereinafter human IFN ⁇ is abbreviated as “IFN ⁇ ”) and consensus IFN (hereinafter sometimes referred to as “Con IFN”) are products sold by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. and Astellas Pharma Inc., respectively. Were purchased and used.
  • Human IFN ⁇ (hereinafter, human IFN ⁇ is abbreviated as “IFN ⁇ ”) and human tumor necrosis factor (human TNF ⁇ , hereinafter, human TNF ⁇ is abbreviated as “TNF ⁇ ”) are purchased from Cosmo Bio Corporation. did.
  • IFNs and cytokines used in the following examples are summarized in Table 5 described later.
  • the subtypes ⁇ 1, ⁇ 5, ⁇ 6, and ⁇ 10 of human IFN ⁇ are abbreviated as IFN ⁇ 1, IFN ⁇ 5, IFN ⁇ 6, and IFN ⁇ 10, respectively.
  • IFN ⁇ 1, IFN ⁇ 5, IFN ⁇ 6, and IFN ⁇ 10 are abbreviated as IFN ⁇ 1, IFN ⁇ 5, IFN ⁇ 6, and IFN ⁇ 10, respectively.
  • IFN ⁇ 8-MUT2 the 145th arginine residue from the N-terminal cysteine residue of the amino acid sequence of IFN ⁇ 8b consisting of 166 amino acid residues, the 146th alanine residue as the serine residue and the 149th as the 149th
  • IFN ⁇ 8-MUT2 A mutant protein of IFN ⁇ 8 in which the methionine residue is replaced with a tyrosine residue, and the 145th arginine residue from the N-terminal cysteine residue of the amino acid sequence of IFN ⁇ 8b are leucine.
  • IFN ⁇ 8-MUT3 A mutated protein of IFN ⁇ 8 (hereinafter abbreviated as “IFN ⁇ 8-MUT3”) in which the 146th alanine residue was substituted with a serine residue and the 149th methionine residue was substituted with a tyrosine residue was used.
  • rIFN ⁇ 8 derived from E. coli, protein concentration 510 ⁇ g / ml, 1.27 ⁇ 10 8 IU / ml
  • the titer of IFN (international unit: IU) was measured by a bioassay using as an index the inhibitory effect on cytopathic effect of Sindbis virus on FL cells.
  • Intravenous injection 10 ⁇ g of antigen containing no adjuvant was intravenously administered as the final immunization 3 days before cell fusion
  • the spleen cells and the parent mouse SP2 / O-Ag14 cells were cultured in serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2), which had been prewarmed to 37 ° C., with a cell density of 2.5 ⁇ 10 5 cells. / Ml and 5 ⁇ 10 4 cells / ml, and after centrifugation, the precipitate was collected.
  • 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) containing 50% (w / v) polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 daltons was added dropwise to this precipitate over 1 minute, followed by incubation at 37 ° C. for 1 minute.
  • hybridoma culture supernatant The culture supernatant of each well in which the hybridoma has grown (hereinafter referred to as “hybridoma culture supernatant”) is collected and subjected to an enzyme immunoassay by the direct method described below to produce a hybridoma that produces an antibody reactive to rIFN ⁇ 8. Selected. Subsequently, this hybridoma was repeatedly applied with limiting dilution according to a conventional method, and clones of hybridomas ⁇ 8 # 44, ⁇ 8 # 59, ⁇ 8 # 98, ⁇ 8 # 139 that stably produce monoclonal antibodies showing affinity for rIFN ⁇ 8, ⁇ 8 # 145 was obtained.
  • hybridoma ⁇ 8 # 139 that is, mAb-IFN ⁇ 8 # 139, on February 15, 2008, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited with the Patent Organism Depositary and deposited with the deposit number FERM BP-11081.
  • Monoclonal antibodies produced by these hybridomas can be used as immunoassays for qualitative and quantitative analysis of IFN ⁇ 8 and its mutant proteins and as antibodies for purification of these proteins.
  • RIFN ⁇ 8 used as an antigen was diluted to 2 ⁇ g / ml with a protein concentration of 50 ⁇ l / well (rIFN ⁇ 8 protein mass: 100 ng / 50 ⁇ l / well) and added to the Covalent NH module (sold by NUNC).
  • o-PD o-phenylenediamine
  • rIFN ⁇ 8 antibody-producing hybridoma ⁇ Preparation of rat anti-IFN ⁇ 8 antibody-producing hybridoma>
  • the rIFN ⁇ 8 used in Example 1 was mixed with complete Freund's adjuvant as an antigen in the abdominal cavity of a 10-week-old BN rat, and the protein amount was immunized intraperitoneally at a rate of 20 ⁇ g / animal. Thereafter, the same amount of antigen was mixed with incomplete adjuvant every two weeks and inoculated twice, and one week after the last administration, the same amount of antigen without adjuvant was further intravenously injected. Three days later, the spleen was removed and dispersed to obtain splenocytes.
  • the spleen cells and rat myeloma-derived Y3Ag1.2.3 cells were added to serum-free RPMI1640 medium (pH 7.2) pre-warmed to 37 ° C., and the cell density was 2.5 ⁇ 10 5. number / ml and 5 ⁇ 10 4 cells were suspended so that / ml, after centrifugation, was collected precipitate portion. 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) containing 50% (w / v) polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 daltons was added dropwise to this precipitate over 1 minute, followed by incubation at 37 ° C. for 1 minute.
  • hybridoma ⁇ 8Y36-2 that is, mAb-IFN ⁇ 8Y36-2
  • the hybridoma ⁇ 8Y36-2 was dated February 15, 2008, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at the Patent Biological Deposit Center and deposited under the deposit number FERM BP-11082.
  • Monoclonal antibodies produced by these hybridomas can be used as antibodies for immunoassays for qualitative and quantitative determination of IFN ⁇ 8 and its mutant proteins and for purification of these proteins.
  • monoclonal antibodies produced by these hybridomas are involved in the onset or exacerbation of IFN ⁇ 8 as it is or by using recombinant technology or the like to prepare chimeric antibodies, humanized antibodies or human antibodies. It can also be used as an active ingredient of therapeutic agents for various diseases.
  • ⁇ Preparation of rat-mouse anti-IFN ⁇ 8 antibody-producing heterohybridoma> The same rIFN ⁇ 8 protein used in Experiment 1 was mixed into the abdominal cavity of 10-week-old BN rats in a complete Freund's adjuvant and immunized intraperitoneally at a protein amount of 20 ⁇ g / animal. Thereafter, the same amount was boosted twice every two weeks, and the same amount was further intravenously administered one week after the last immunization. Three days later, the spleen was removed and dispersed to obtain splenocytes.
  • the spleen cells and mouse myeloma-derived SP2 / O-Ag14 cells were added to serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) pre-warmed to 37 ° C., respectively, with a cell density of 2.5 ⁇ 10 5.
  • the suspension was suspended at 5 ⁇ 10 4 cells / ml and centrifuged, and the precipitate was collected.
  • 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) containing 50% (w / v) polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 daltons was added dropwise to this precipitate over 1 minute, followed by incubation at 37 ° C. for 1 minute.
  • hybridoma clones ⁇ 8 # S18-1 and ⁇ 8 # S56-1 which stably produced the monoclonal antibody of the present invention.
  • monoclonal antibodies can be used as antibodies for immunoassay for qualitative and quantitative determination of IFN ⁇ 8 and its mutant proteins and for purification of these proteins.
  • monoclonal antibodies produced by these hybridomas are involved in the onset or exacerbation of IFN ⁇ 8 as it is or by using recombinant technology or the like to prepare chimeric antibodies, humanized antibodies or human antibodies. It can also be used as an active ingredient of therapeutic agents for various diseases.
  • Hybridoma clones ⁇ 8 # 44, ⁇ 8 # 59, ⁇ 8 # 98, ⁇ 8 # 139 (Patent Biodeposition Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, accession number FERM BP-11081) and ⁇ 8 # obtained by the method of Example 1 145 is a serum-free medium (sold by Invitrogen, trade name “Hybridoma-SFM Complete DMP”) or 10% (v / v) fetal bovine serum so that each cell density is about 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the suspension was suspended in RPMI1640 medium supplemented with (FCS), and cultured at 37 ° C. in a 5% (v / v) CO 2 incubator while expanding the culture scale.
  • FCS RPMI1640 medium supplemented with
  • hybridomas, pre, pristane into the peritoneal cavity of BALB / c mice of 8 weeks old, which had been injected 0.5 ml / mouse intraperitoneally, each 1 ⁇ 10 7 cells /
  • the mice were inoculated and bred for 10 days in the usual manner. Ascites was collected from the mice, diluted 3 times with PBS, ammonium sulfate was added to 50% saturation, allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, centrifuged, and the precipitate was collected.
  • the precipitate is dialyzed against PBS and applied to a protein G-coupled Sepharose column (sold by GE Healthcare Biosciences, trade name “Protein G Sepharose 4FF column”) to purify the IgG fraction. did.
  • anti-IFN ⁇ 8 produced by hybridoma clones ⁇ 8 # 44, ⁇ 8 # 59, ⁇ 8 # 98, ⁇ 8 # 139 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, accession number FERM BP-11081), ⁇ 8 # 145
  • the antibodies are called ⁇ 8 # 44 mAb, ⁇ 8 # 59 mAb, ⁇ 8 # 98 mAb, ⁇ 8 # 139 mAb, and ⁇ 8 # 145 mAb, respectively.
  • Hybridomas ⁇ 8 # Y19-1 and ⁇ 8Y36-2 obtained in Example 2 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, accession number FERM BP-11082), hybridoma ⁇ 8 # S18-1 obtained in Example 3 And ⁇ 8 # S56-1 to a cell density of about 1 ⁇ 10 6 cells / ml, respectively, a serum-free medium (sold by Invitrogen, trade name “Hybridoma-SFM Complete DMP”) or 10% ( v / v) Suspended in RPMI 1640 medium supplemented with fetal calf serum (FCS) and cultured in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C.
  • FCS fetal calf serum
  • the culture supernatant is collected, concentrated, and subjected to a protein G-Sepharose 4FF column (sold by GE Healthcare Bioscience) by an ordinary method, and the IgG fractions produced by each hybridoma are collected. Was purified.
  • hybridomas ⁇ 8 # Y19-1, ⁇ 8Y36-2 Patent Biodeposition Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, accession number FERM BP-11082
  • anti-products produced by hybridomas ⁇ 8 # S18-1 and ⁇ 8 # S56-1 The IFN ⁇ 8 antibody is called ⁇ 8 # Y19-1 mAb, ⁇ 8Y36-2 mAb, ⁇ 8 # S18-1 mAb, and ⁇ 8 # S56-1 mAb, respectively.
  • FIG. 1 shows a Western blotting pattern when using the culture supernatant of ⁇ 8 # 139 using the IFN ⁇ s shown in FIG. Furthermore, an equal amount of a culture supernatant of these hybridomas and a solution obtained by diluting the IFNs or IFN ⁇ 8 mutants shown in Table 3 to 30 to 70 IU / ml are mixed to neutralize the antiviral activity ( Whether or not the activity decreased) was confirmed by measuring the antiviral activity using Sindbis virus cytopathy on FL cells as an index. The results are shown in Table 3. In Western blotting, the case where the band of IFNs or TNF protein was stained was determined to be reactive (+), and the case where it was not stained was determined to be non-reactive (-).
  • the neutralization activity was determined to be neutrality activity (+) when the antiviral activity was not substantially measured, and to have no neutralization activity ( ⁇ ) otherwise.
  • ⁇ Western blotting analysis> After adding rIFN ⁇ 8 or nIFN ⁇ 2 used as an antigen in Example 1 to a mixed solution consisting of 0.5 ml of 10% (w / v) SDS aqueous solution and 1 ml of glycerol and incubating at 37 ° C. for 1 hour, the amount of each protein was 10 or 100 ng. / The lane was charged and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Proteins contained in a gel in the range of about 20 to 29 kilodaltons (hereinafter abbreviated as “KDa”) corresponding to the molecular weight of IFNs are transferred to a nitrocellulose membrane by a conventional method, and nonspecific In order to suppress the reaction, it was immersed in a blocking solution (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., trade name “Block Ace”).
  • KDa kilodaltons
  • This blocking nitrocellulose membrane was immersed in a solution containing 2 ⁇ g / ml of any of 9 types of monoclonal antibodies purified using protein G sepharose at room temperature for 1 hour, and then 0.05% (v / v ) The excess antibody was removed by washing with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing Tween 20.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in an HRP-labeled anti-mouse immunoglobulin or anti-rat immunoglobulin (both sold by DAKO Cytomation) for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.05% (v / v) Tween 20 for 30 minutes, and then the color development reaction was performed using a commercially available Western blotting detection kit (GE Healthcare Biosciences). Sales, product name “ECL Western blotting detection reagent and Hyperfilm ECL”).
  • the molecular weight markers include commercially available molecular weight markers for SDS-PAGE (sold by Bio-Rad, trade name “Prestain SDS-PAGE Standard Broad Range”, composition: myosin (204 KDa), ⁇ -galactosidase (120 KDa), BSA ( 100 KDa), ovalbumin (52 KDa), carbonic anhydrase (37 KDa), soybean trypsin inhibitor (29 KDa), lysozyme (20 KDa) and aprotinin (7 KDa).
  • the monoclonal antibodies obtained in Examples 1 to 3 were all IgG class antibodies (light chain is ⁇ ). Further, as is clear from Tables 1 and 2, these antibodies react only with rIFN ⁇ 8, nIFN ⁇ 8 and two types of IFN ⁇ 8 mutant proteins, and other human IFN ⁇ subtypes, IFN ⁇ , IFN ⁇ , ConIFN, mouse IFN ⁇ / ⁇ , It became clear that these antibodies did not react with rat IFN ⁇ and TNF ⁇ , and these antibodies specifically recognize IFN ⁇ 8 and its mutants. As is clear from FIG.
  • ⁇ Construction of an enzyme immunoassay system for IFN ⁇ 8> Using 9 types of monoclonal antibodies prepared by the method of Example 4, screening of antibodies suitable for construction of an enzyme immunoassay system capable of specifically quantifying IFN ⁇ 8 was performed as follows.
  • ⁇ Antibody> Nine types of monoclonal antibodies prepared in Example 4, rabbit polyclonal anti-IFN ⁇ antibody (hereinafter abbreviated as “polyIFN ⁇ ”) and mouse monoclonal anti-IFN ⁇ antibody (hereinafter abbreviated as “mAbIFN ⁇ 14”) (all are stocks) Company Hayashibara Biochemical Laboratories) was used. In addition, polyIFN ⁇ and mAbIFN ⁇ 14 have reactivity with IFN ⁇ 8 and other human IFN ⁇ subtypes.
  • the 11 kinds of antibodies were labeled with HRP by the periodate oxidation method. That is, 10 mg of HRP (sold by Roche) was dissolved in 2 ml of distilled water, 125 ⁇ l of 0.1 M sodium periodate was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes in the dark. Thereafter, 100 ⁇ l of ethylene glycol was added, dialyzed against 1 mM sodium acetate buffer (pH 4.2) for 5 minutes at room temperature in the dark, and then concentrated so that HRP was 15 mg / ml or more.
  • HRP sold by Roche
  • bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as “BSA”) is dissolved to 1%, membrane filtered (pore size is 0.22 ⁇ m), and HRP-labeled antibody (hereinafter “labeled antibody”) is obtained. ”) was prepared.
  • BSA bovine serum albumin
  • labeled antibody HRP-labeled antibody
  • the 11 types of HRP-labeled antibodies and 11 types of unlabeled antibodies (hereinafter referred to as “unlabeled antibodies”) used for the labeling were used as solid-phase antibodies, and 121 combinations by the sandwich method were used. It was tested whether rIFN protein could be quantified by enzyme immunoassay.
  • each well was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween 20. After removing PBS used for washing, the 11 kinds of labeled antibodies were diluted to 1 ⁇ g / ml with PBS each containing 5% FCS, 1% BSA, 0.15 M NaCl and 0.1% CHAPS. Each was added 50 ⁇ l / well to a well in which 11 types of unlabeled antibodies were used as solid phases, and shaken at room temperature for 2 hours.
  • required the average.
  • the minimum concentration of rIFN ⁇ 8 protein in which the correlation coefficient (r value) for determining linearity by regression analysis of the calibration curve based on the measured absorbance is in the range of 0.997 or more, and the absorbance when the control well is measured.
  • the value obtained by adding 3 times the standard deviation of the measured value to (OD) and the value obtained by subtracting the value obtained by multiplying the standard deviation of the measured value by 3 from the measured value of the minimum concentration of rIFN ⁇ 8 protein Then, the rIFN ⁇ 8 protein concentration corresponding to the larger value was taken as the lower detection limit concentration of rIFN ⁇ 8 protein by the tested enzyme immunoassay.
  • mAbIFN ⁇ 14 or polyIFN ⁇ when used as a labeled antibody, these antibodies may react with IFN ⁇ subtypes other than IFN ⁇ 8. Therefore, an enzyme immunoassay system specific to IFN ⁇ 8 subtype is ⁇ 8 # 139 mAb as a solid phase antibody. And the combination using ⁇ 8Y36-2 mAb as the labeled antibody was judged to be particularly desirable.
  • the rIFN ⁇ 8 protein concentration corresponding to the maximum OD value in the range where the correlation coefficient (r value) indicating the linearity of the calibration curve is 0.997 or more is obtained, and the upper limit concentration of rIFN ⁇ 8 protein detected by the enzyme immunoassay is determined. It shows together with Table 5.
  • ⁇ Method of enzyme immunoassay> ⁇ 8 # 139 mAb as a solid phase antibody was diluted to 20 ⁇ g / ml with PBS, and dispensed at 100 ⁇ l / well onto an immunoplate (sold by NUNC). After allowing to stand at room temperature for 3 hours, the solid phase solution was discarded, PBS containing 1% BSA was added at 250 ⁇ l / well, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. overnight for blocking. After removing PBS containing 1% BSA, prepare a standard solution by diluting rIFN ⁇ 8 to 10 to 2,000 pg / ml with PBS containing 2.5% FCS, 0.5% BSA and 0.5M NaCl. did.
  • rIFN ⁇ 8 was 0.05 to 2 ng / ml (50 to 2 ng / ml). In the range of 1,000 pg / ml), a linear increase in absorbance proportional to the protein mass was observed. This result indicates that the protein at a concentration of at least about 50 to 2,000 pg / ml can be detected with high accuracy by using the enzyme immunoassay system.
  • the enzyme immunoassay system allows any one of nIFN ⁇ 8, rIFN ⁇ 8 and IFN ⁇ subtypes other than mutants thereof, IFN ⁇ , IFN ⁇ , Con IFN, rat IFN ⁇ , mouse IFN ⁇ / ⁇ , TNF ⁇ , Even when a solution containing 10 ng / ml corresponding to 200 times the detection lower limit concentration of IFN ⁇ 8 (5 times the upper detection limit concentration) is measured, the absorbance is different from the case of only the buffer solution in which these proteins are dissolved. I was not able to admit. This result indicates that the enzyme immunoassay has no cross-reactivity with IFNs other than IFN ⁇ 8 and its mutants and cytokines, and an enzyme immunoassay system specific to IFN ⁇ 8 and its mutants has been established.
  • ⁇ Detection of rIFN ⁇ 8 protein by radioimmunoassay> ⁇ 8 # 139 mAb obtained by the method of Example 4 was adsorbed to polystyrene beads for radioimmunoassay by a conventional method and allowed to stand overnight at 4 ° C. in PBS containing 2% (w / v) BSA. Thus, solid phase antibody beads were prepared.
  • nIFN ⁇ 8 protein derived from BALL-1 cells by enzyme immunoassay> NIFN ⁇ induced by adding HVJ to BALL-1 cells (owned by Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.), a human lymphoblastoid cell line, is a ratio of 72 ⁇ 9: 28 ⁇ 9 between nIFN ⁇ 2 and nIFN ⁇ 8 (IFN ⁇ 8b). It is known that it contains a small amount of nIFN ⁇ 7 (for example, Shigeharu Fukuda et al., “Lymphokine”, Vol. 7, No. 2, 175 thru 185 (1988)).
  • BALL-1 cells were transplanted subcutaneously in the back of hamster neonates, and the proliferated BALL-1 cells were suspended in RPMI 1640 medium, and HVJ was added and cultured overnight.
  • HVJ inactivated solution hereinafter abbreviated as “BALL-1 culture supernatant”
  • human nIFN ⁇ purified from the solution with a monoclonal antibody column (trade name “NK2-Sepharose” sold by Lonza).
  • the samples were subjected to bioassay and enzyme immunoassay specific for IFN ⁇ 2 or IFN ⁇ 8.
  • the results are shown in Table 6.
  • Table 6 also shows the results of measuring the activity of a preparation in which the anti-IFN ⁇ 8 antibody ( ⁇ 8 # 139 mAb) prepared in Example 4 was previously added to specifically neutralize the activity of nIFN ⁇ 8.
  • the enzyme immunoassay the assay system constructed in Example 6 was used for quantification of nIFN ⁇ 8, and a commercially available IFN ⁇ assay kit (trade name “human IFN- ⁇ measurement kit”, sold by JIMRO Co., Ltd.) was used for nIFN ⁇ 2. did.
  • the measurement used 3 wells per sample, and calculated
  • human nIFN ⁇ contained in the BALL-1 culture supernatant was calculated as nIFN ⁇ 8 in the bioassay with about 38% of the total human IFN ⁇ activity.
  • nIFN ⁇ 8 human nIFN ⁇ 8 in the bioassay with about 38% of the total human IFN ⁇ activity.
  • the same culture supernatant was measured by an enzyme immunoassay specific for nIFN ⁇ 2 and nIFN ⁇ 8, about 40% of the total human IFN ⁇ activity was calculated as nIFN ⁇ 8.
  • the sample obtained by purifying the BALL-1 culture supernatant with an antibody column about 37% of the total human IFN ⁇ activity was calculated as IFN ⁇ 8 in the bioassay.
  • nIFN ⁇ derived from BALL-1 cells
  • nIFN ⁇ 8 mutant protein Human nIFN ⁇ (containing 6.46 ⁇ g of nIFN ⁇ 2 and 1.81 ⁇ g of nIFN ⁇ 8), IFN ⁇ 8-MUT2 (containing 5.83 ⁇ g) or IFN ⁇ 8-MUT3 (containing 5.38 ⁇ g) used in Example 6, 4 BALB / c mice (Nihon Charles River Co., Ltd., female, 9 weeks old) were subcutaneously administered at about 10 6 IU / animal. After administration, blood was sampled from the tail vein over time (0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 24 hours), and the plasma obtained after centrifugation was the same as that used in Example 8.
  • nIFN ⁇ 8 contained in human nIFN ⁇ is less than one third of nIFN ⁇ 2, but when human nIFN ⁇ is administered subcutaneously to mice, nIFN ⁇ 8 is less pharmacokinetic than nIFN ⁇ 2.
  • the constant AUC was 3.6 times ( ⁇ 1975 ⁇ 553), and the MRT was 1.7 times ( ⁇ 3.9 ⁇ 2.4). It was also found that the blood kinetics of the IFN ⁇ 8 mutant protein resembles nIFN ⁇ 2 rather than nIFN ⁇ 8 when viewed from MRT and EBA.
  • a water-insoluble carrier trade name “CNBr-activated Sepharose 4B”, sold by GE Healthcare Biosciences Inc.
  • the collected fractions were pooled, concentrated, and then the protein content was measured. As a result, it was found that a purified protein having a purity of 99.8% or more was obtained. Further, when this purified protein was subjected to IFN ⁇ 2 or IFN ⁇ 8-specific enzyme immunoassay used in Example 8, no IFN ⁇ 2 protein was detected, and only IFN ⁇ 8 was detected. The amount of protein was in good agreement with the antiviral activity of the purified protein considering the specific activity of nIFN ⁇ 8, and almost all of nIFN ⁇ 8 contained in human nIFN ⁇ loaded on the column was recovered. The antibody column was found to be suitable for IFN ⁇ 8 purification.
  • RNA preparation kit (sold by QIAGEN, trade name “RNeasy Mini Kit (Cat. No. 74104)”) was used to extract RNA from cell homogenates according to “total RNA purification from animal cells using centrifugation” in the instruction manual to obtain 30 to 60 ⁇ g of RNA.
  • the cell homogenate was prepared using a commercially available column (available from QIAGEN, trade name “QIAshredder Spin Column”), and DNAase I treatment was not performed.
  • RNA reverse transcriptase reaction and PCR reaction were carried out using a commercially available kit (trade name “SuperScript III reverse transcriptase (catalog number 18080-044)” sold by Invitrogen) and its instruction manual “First Strand cDNA Synthesis”.
  • the reverse transcriptase reaction was carried out using commercially available oligo (dT) 12-18 (available from Invitrogen, catalog number 18418-012) as a primer.
  • a PCR reaction was performed using a commercially available Mouse Ig-Primer set (available from Novagen, catalog number # 69831-3) as a primer.
  • KOD kit As the DNA polymerase, a commercially available product (sold by TOYOBO, trade name “KOD-Plus- (catalog number KOD-201)”, hereinafter referred to as “KOD kit”) was used, and amplification was not possible with this KOD kit.
  • the product name is “TaKaRa Ex Taq (code RR001A)” sold by Takara Bio Inc., hereinafter referred to as “Ex Taq kit”. )It was used.
  • the tube is repeatedly treated 30 to 35 times at three temperature cycles of 94 ° C., 1 minute, treatment temperature *, 1 minute, 72 ° C., 1 minute, and cooled to 4 ° C.
  • Treatment temperature *; 5′A and B Leader primers were 50 ° C., and 5 ′ CG Leader primer was 60 ° C.
  • the purified DNA fragment obtained was ligated to pPCR-Script Cam SK (+) Vector using Stratagene PCR-Script Cam Cloning Kit (# 211192), and transformed into competent cell XL10-Gold of the same kit. . Subsequently, after seeding on a plate containing X-gal, chloramphenicol and IPTG, white colonies were picked up, and clones containing inserts of the desired size were selected by colony direct PCR.
  • a plasmid was prepared from a culture solution of a colony containing a fragment of the desired size using a commercially available plasmid preparation kit (sold by QIAGEN, trade name “QIAprep spin Miniprep Kit (Cat No. 27106))”. The reaction conditions for the colony direct PCR method are shown below.
  • the DNA base sequence was a DNA automatic sequencer (trade name “CEQ8000”, sold by BECKMAN COULTER), a vector T3 primer (5′AATTAACCCTCACTAAAGGG3 ′: SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and a T7 primer (5′GTATATACGCACTCACTATAGGGC3 ′: Sequencing reaction was performed in both directions using SEQ ID NO: 2) in the sequence listing to obtain 3 clones containing DNA encoding heavy chain variable region and 3 clones containing DNA encoding light chain variable region Thus, the base sequence of the DNA was determined.
  • CEQ8000 DNA automatic sequencer
  • T3 primer 5′AATTAACCCTCACTAAAGGG3 ′: SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • a T7 primer 5′GTATATACGCACTCACTATAGGGC3 ′: Sequencing reaction was performed in both directions using SEQ ID NO: 2) in the sequence listing to obtain 3 clones containing DNA encoding heavy chain variable region and 3 clones containing DNA
  • amino acid sequences Based on the base sequences of the above three DNAs, the results of estimating the amino acid sequences including the heavy chain and light chain variable region of ⁇ 8 # 139 mAb following the amino acid sequence of the 5 ′ primer portion used for cloning, The amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 6 to 8 in the sequence listing.
  • amino acid at the carboxy terminus of the heavy chain and the light chain is determined based on the amino acid sequence at the amino terminus of the known heavy chain and light chain constant region, and the amino acid in the variable region of the heavy chain and light chain of ⁇ 8 # 139 mAb The sequence was determined and shown in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 9 to 11 in the sequence listing.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing among the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, the 37th phenylalanine (Phe) from the amino terminus is isoleucine (Ile) and the 79 th isoleucine ( Ile) had a sequence substituted with threonine (Thr).
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of ⁇ 8 # 139 mAb has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and some antibodies are represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. It tells you that it has the amino acid sequence shown.
  • amino acid sequences Based on the nucleotide sequences of the above three DNAs, the results of estimating the amino acid sequences including the heavy chain and light chain variable region of ⁇ 8Y36-2 mAb following the amino acid sequence of the 5 ′ primer portion used for cloning, The amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 15 to 17 in the sequence listing. Further, the amino acid at the carboxy terminus of the heavy chain and the light chain is determined based on the amino acid sequence at the amino terminus of the known heavy chain and light chain constant region, and the amino acid in the variable region of the heavy chain and light chain of ⁇ 8Y36-2 mAb The sequence was determined and shown in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 20 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing is a sequence in which the 19th glycine (Gly) from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in the sequence listing is substituted with aspartic acid (Asp). Had. From the number of clones obtained, the amino acid sequence of the heavy chain variable site of ⁇ 8Y36-2 mAb has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, and some antibodies are represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing. It tells you that it has the amino acid sequence shown.
  • Examples 12 and 13 were obtained by using the base sequences and amino acid sequences of the variable regions of the heavy and light chains of ⁇ 8 # 139 mAb and ⁇ 8Y36-2 mAb, and using the partial sequences as they were.
  • a recombinant is prepared by deleting, adding, or substituting about 1 to 100 of these amino acids, and human IFN ⁇ 8 and its mutant protein are specifically recognized.
  • Purification of IFN ⁇ 8, and further, chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies used as therapeutic agents for IFN ⁇ 8-related diseases, clinical diagnostic agents, etc. can be obtained by known methods (for example, JP-A-2004-533217 and 2007-252372) shows that it can also be advantageously carried out.
  • the hypervariable sites of the heavy chain of ⁇ 8 # 139 mAb are the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 23 in the sequence listing, respectively, and the hypervariable sites of the light chain are the amino acids shown in SEQ ID NOs: 24 to 26 in the sequence listing, respectively. It turned out to be an array.
  • the hypervariable sites of ⁇ 8Y36-2 mAb heavy chain and light chain are the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 27 to 29 in the sequence listing, respectively, and the hypervariable sites of the light chain are SEQ ID NOS: 30 to 32 in the sequence listing, respectively. It became clear that it is an amino acid sequence shown by.
  • a recombinant is prepared by adding about 1 to 100 amino acids, and further deleting, adding, or substituting amino acids at hypervariable sites as appropriate, and specifically recognizes human IFN ⁇ 8 and its mutant protein. Quantitative and qualitative analysis of IFN ⁇ 8, purification of IFN ⁇ 8, and preparation of chimeric, humanized, or human antibodies suitable for use as therapeutic agents for IFN ⁇ 8-related diseases, clinical diagnostic agents, etc. It tells you what you can do.
  • This product is useful as a therapeutic agent for various diseases in which IFN ⁇ 8 is involved in onset or exacerbation.
  • Each of these 9 dry preparations was dissolved in physiological saline, and each preparation was dissolved in 5 rats (average body weight 123 g / animal) once a day for 7 days, 5 ml / animal (as a monoclonal antibody). (750 mg / animal / dose) administered intraperitoneally and body weight was measured daily.
  • 5 rats (average body weight 127 g / animal) were intraperitoneally administered with saline 5 ml / animal once daily for 7 days, and body weight was measured daily.
  • no difference from the control was observed when any preparation was administered.
  • no abnormalities were observed in the rats to which the preparations were administered and the control rats.
  • ⁇ Therapeutic agent> The base sequence (SEQ ID NO: 3 to 5 in the sequence listing) encoding the region containing the heavy chain and light chain variable sites of ⁇ 8 # 139 mAb obtained in Example 12 and the amino acid sequence of the variable site (SEQ ID NO: 9 to sequence listing in the sequence listing) 11), a humanized antibody is prepared by a conventional method, purified to a purity of 99.98% or higher, and the antibody is 200 mg / ml, ⁇ , ⁇ -trehalose (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., pyrogen-free).
  • mice This product was dissolved in physiological saline and intravenously administered to 5 mice (average body weight 23 g / animal) once a day for 7 days, 0.5 ml / animal (100 mg / animal / times as a monoclonal antibody) Dosage and body weight was measured daily.
  • 5 mice As a control, 5 mice (average body weight 24 g / animal) were intravenously administered with physiological saline 0.5 ml / mouse once daily for 7 days, and body weight was measured daily.
  • body weights of mice administered with this product and control mice were compared, no difference was observed. In addition, no abnormalities were observed in the mice to which this product was administered and in the control mice even by visual observation.
  • ⁇ Therapeutic agent> A base sequence (SEQ ID NO: 12 to 14 in the sequence listing) encoding the region containing the heavy chain and light chain variable sites of ⁇ 8Y36-2 mAb obtained in Example 13 and its amino acid sequence (SEQ ID NO: 18 to 20 in the sequence listing) Based on the above, a humanized antibody was prepared by a conventional method, purified to 99.98% or higher, and then 200 mg / ml, ⁇ , ⁇ -trehalose (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., pyrogen-free) 140 ml / ml, L-histidine hydrochloride 3.4 mg / ml, L-histidine 2.2 mg / ml, and Tween 20 dissolved in purified water to 0.6 mg / ml.
  • the lyophilized preparation was prepared by a conventional method.
  • This product can be used as an injection by dissolving in physiological saline at the time of use.
  • This product is useful as a therapeutic agent for various diseases in which IFN ⁇ 8 is involved in onset or exacerbation.
  • This product was dissolved in physiological saline and intravenously administered to 5 mice (average body weight 23 g / animal) once a day for 7 days, 0.5 ml / animal (100 mg / animal / times as a monoclonal antibody) Dosage and body weight was measured daily.
  • 5 mice (average body weight 23 g / animal) were intravenously administered with physiological saline 0.5 ml / animal once daily for 7 days, and body weight was measured daily.
  • no difference was observed.
  • no abnormalities were observed in the mice to which this product was administered and in the control mice even by visual observation.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with IFN ⁇ 8 and its mutant protein. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention has a wide variety of uses for the detection and purification of such IFN ⁇ 8 and mutant proteins thereof.
  • Such a useful monoclonal antibody of the present invention can be easily obtained in a desired amount by a production method using a hybridoma.
  • the present invention exhibits such remarkable operational effects, and it can be said that it is a very significant invention to contribute to the world.

Abstract

　本発明は、インターフェロンαサブタイプα８（以下、ＩＦＮα８）及びその変異蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を提供すること、該抗体を産生し得るハイブリドーマを提供すること、該抗体によるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の検出方法を提供すること、該抗体によるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の精製方法を提供すること、該抗体を有効成分とするＩＦＮα８が発症や増悪に関与する各種疾患の治療剤を提供することを課題とする。 ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生し得るハイブリドーマ、該抗体を使用した免疫反応によるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の検出方法、該抗体を使用したＩＦＮα８或いはその変異蛋白質の精製方法、並びに該抗体を有効成分とするＩＦＮα８が発症や増悪に関与する各種疾患の治療剤を提供することで解決する。  

Description

ヒトインターフェロンαサブタイプα８及びその変異蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体
　本発明はヒトインターフェロンα（以下、インターフェロンを「ＩＦＮ」と略記する場合がある。）に対する新規なモノクローナル抗体に関するものであり、詳細には、ヒトＩＦＮαサブタイプα８（以下、ヒトＩＦＮαサブタイプα８を「ＩＦＮα８」と略記する。）及びその変異蛋白質に特異的なモノクローナル抗体に関する。
　ＩＦＮは、ウイルスに感染した細胞が産生するウイルス増殖抑制因子として発見された。現在、ＩＦＮには、受容体の異なるα／β、γ、λの３タイプが知られており、ヒトＩＦＮαには、少なくとも１３種類以上のサブタイプの存在が知られている。ヒトＩＦＮαは、大腸菌で生産した組換型製剤や、末梢血白血球や培養株化されたリンパ芽球様細胞をセンダイウイルス（ＨＶＪ）などで刺激して誘発した天然型製剤が、腎癌などの悪性新生物や、Ｂ型及びＣ型肝炎の治療剤として広く臨床応用されている。また、ＩＦＮの免疫調節作用、アレルギー疾患、糖尿病などの自己免疫疾患や、ウイルス感染に起因する疾患への関与も研究されており、生体内での動態にも関心が持たれている。ＩＦＮの活性測定には、培養細胞を使用した抗ウイルス活性に基づくバイオアッセイが用いられている。バイオアッセイは、ＩＦＮの生理活性を最もよく反映するものの、測定に時間がかかることに加えて、アッセイに使用する細胞の生理機能に影響する因子の影響を受けやすいことなどが知られている。また、白血球やリンパ芽球をウイルス等で刺激すると複数のタイプやサブタイプを含む天然型のＩＦＮが産生される（例えば、ヤナイ　ワイ．（Ｙａｎａｉ　Ｙ．）等、『ジャーナル　オブ　インターフェロン　アンド　サイトカイン　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＆　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第２１巻、第１０号、第８３５乃至８４１頁（２００１年）を参照）ため、これらの各々サブタイプの活性を直接測定することやその機能を解析することは極めて困難であった。
　ヒトＩＦＮαの定量や精製のために、数多くの抗ヒトＩＦＮαモノクローナル抗体が調製されている（例えば、特公平６－１１２３５号公報、特表２００４－５３３２１７号公報、特開２００７－６３１７７号公報を参照）。また、ヒトＩＦＮαサブタイプα４（以下、ヒトＩＦＮαサブタイプα４を「ＩＦＮα４」と略記する。）に特異的に結合するモノクローナル抗体（『モレキュラー　イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』、第２９巻、第３号、第３９１－３９９頁（１９９２年）を参照）が調製されており、マウス由来のモノクローナル抗体を利用したヒトＩＦＮαを特異的に定量できるキットも販売されている（例えば、株式会社ＪＩＭＲＯ販売、商品名「ヒトＩＦＮ－α測定キット」）ものの、ＩＦＮαサブタイプを特異的に識別することはできない。
　一方、ＩＦＮα８には、３種類の分子種の存在が知られており、各々ＩＦＮα８ａ、ＩＦＮα８ｂ、及び、ＩＦＮα８ｃと呼ばれている（例えば、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットを参照）。ＩＦＮα８は、ヒトＩＦＮαサブタイプα２ａやヒトＩＦＮαサブタイプα２ｂなどの既存の医薬成分よりも優れた生理活性を有することから、ＩＦＮα８やその変異蛋白質を有効成分とする感受性疾患治療剤が提案されている（例えば、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレット及び特表平９－５０９９５５号公報を参照）。また、ヒトＩＦＮαのサブタイプによっては、他のサブタイプのコアゴニスト（増強剤）として作用する可能性も指摘されている（特表平９－５０９９５５号公報）し、比活性の異なるＩＦＮα８変異蛋白質も存在する（国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレット）ので、これらのヒトＩＦＮαサブタイプやその変異蛋白質の生理的な機能を研究したり、医薬用の製剤として開発する上で、その生理活性や血中動態を調べて比較するような場合、バイオアッセイのように他の生理学的な因子の影響を受けることなく、その蛋白質量が特異的に、且つ、正確に、高感度で定量できるアッセイ系が必要とされている。また、モノクローナル抗体は特定の抗原決定基（エピトープ）を認識できるものの、その特異性や親和性には差があるため、ＩＦＮα８特異的で、且つ、高感度のアッセイ系の構築には、それに適したモノクローナル抗体を開発する必要がある。また、ＩＦＮα８或いはその変異蛋白質を、医薬用途に使用するためには、該ＩＦＮα８やその変異蛋白質を特異的に、且つ、大量に精製する必要があるので、ＩＦＮα８やその変異蛋白質以外のＩＦＮやこれら以外の蛋白質の非特異的吸着が少なく、且つ、該モノクローナル抗体を用いて調製した抗体カラムからのＩＦＮα８或いはその変異蛋白質の溶出が容易な抗体カラムの調製に適したモノクローナル抗体を開発する必要がある。
　本発明は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を提供することを第一の課題とする。
　本発明は、斯かるモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを提供することを第二の課題とする。
　本発明は、斯かるモノクローナル抗体によるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の検出方法を提供することを第三の課題とする。
　本発明は、斯かるモノクローナル抗体によるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の精製方法を提供することを第四の課題とする。
　本発明は、斯かるモノクローナル抗体を有効成分とする、各種ウイルス性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、乾癬、慢性関節リュウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良貧血、腎炎、全身性エリスマトーデス及び／又は後天性を含む免疫不全症の治療剤を提供することを第五の課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に認識する新規モノクローナル抗体について鋭意研究を行い、本発明を完成するに到った。
　すなわち、本発明の要旨とするところは、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に認識する新規モノクローナル抗体を提供することにある。
　本発明の他の態様によれば、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に検出する方法が提供される。
　また、本発明の他の態様によれば、夾雑物を含む被験試料からＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に精製する方法が提供される。
　また、本発明の他の態様によれば、ＩＦＮα８が関与する、アレルギー症、免疫不全症或いは自己免疫疾患など各種疾患の治療剤が提供される。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的に結合し、これ以外のＩＦＮのタイプやサブタイプには実質的に結合しない。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、被験試料中のＩＦＮα８及びその変異蛋白質のみと免疫反応を呈するので、被験試料中のＩＦＮα８及びその変異蛋白質を、特異的に、且つ、定性的又は定量的に検出することができるという利点を有する。また、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質と夾雑物質とを含む混合物から、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を高純度、且つ、効率的に採取することができるという利点を有する。
ＩＦＮ類を、各々の蛋白質量が１０ｎｇ／レーンとなるようにチャージしてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルに含まれるＩＦＮ類をニトロセルロース膜に移して、本発明のモノクローナル抗体（α８＃１３９ｍＡｂ）を反応させたウエスタンブロッティングの一例を示す説明図である。 本発明のモノクローナル抗体α８＃１３９ｍＡｂを固相抗体とし、α８Ｙ３６－２ｍＡｂを標識抗体として使用した、サンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイにより求めたｒＩＦＮα８の検量線の一例を示す説明図である。
　本発明でいうＩＦＮα８とは、例えば国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットに記載されたＩＦＮα８のアミノ酸配列を有する既知のポリペプチドをいい、アミノ末端（以下、「Ｎ末端」という。）がシステインではじまる１６５又は１６６個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を有する３種類のポリペプチドをいう。当該ポリペプチドはＩＦＮα８ａ、ＩＦＮα８ｂ、及び、ＩＦＮα８ｃと呼ばれる場合があり（例えば、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレット参照）、本明細書ではこれらを総称してＩＦＮα８という場合がある。当該ポリペプチドの出所、由来は問わず、天然型であっても組換型であってもよいし、化学的に合成したものであってもよい。
　本発明でいうＩＦＮα８の変異蛋白質とは、ＩＦＮα８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを構成する１個又は２個以上数個以下のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換したポリペプチドをいい、少なくとも後述の、ハイブリドーマｍＡｂ－ＩＦＮα８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１、以下「α８＃１３９」と略記する。）及びｍＡｂ－ＩＦＮα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２、以下「α８Ｙ３６－２」と略記する。）が産生するモノクローナル抗体により認識される抗原決定部位を有するポリペプチドであって、ＩＦＮα８のアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はカルボキシ末端（以下、「Ｃ末端」という。）にアミノ酸が１個又は２個以上数個以下付加したもの、及び、そのポリペプチド内、そのＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個又は２個以上数個以下欠失したものを含む。具体的には、本出願人が国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットにおいて開示した、ＩＦＮα８のアミノ酸配列のＮ末端から１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基、イソロイシン残基又はバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基又はセリン残基に、或いは、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に置換したポリペプチドや、これらペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から３１番目及び１３４番目のリジン残基のいずれかを保持し、他のリジン残基の全てが他のアミノ酸残基に変換されたものなどを例示することができる。
　本発明でいうモノクローナル抗体とは、前述のＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的なモノクローナル抗体全般を包含するものとし、その出所・由来、クラス、イソタイプなどは問わない。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８又はその変異蛋白質或いはこれらの抗原性フラグメントを抗原として用いることにより得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳動物由来の細胞とのハイブリドーマを作製し、これより本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、これを生体内外で培養することにより得ることができる。
　抗原となり得るＩＦＮα８及びその変異蛋白質は、その由来や製法に制限はなく、例えば、ＢＡＬＬ－１細胞などのリンパ芽球様細胞にＨＶＪなどのウイルスを加えることにより誘導されるＩＦＮα８であってもよく、遺伝子組換技術や化学的合成法により調製されるＩＦＮα８或いはその変異蛋白質であってもよい。具体的には、例えば、ヤナイ　ワイ．（Ｙａｎａｉ　Ｙ．）等、『ジャーナル　オブ　インターフェロン　アンド　サイトカイン　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＆　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第２１巻、第１０号、第８３５乃至８４１頁（２００１年）に記載された方法により、ＢＡＬＬ－１細胞由来のＩＦＮα８を調製してもよく、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットに記載された方法により、ＩＦＮα８又はその変異蛋白質を調製することもできる。それらは、通常、完全精製又は部分精製した状態で使用される。抗原性フラグメントを得るには、これら完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットなどに開示されたＩＦＮα８ａ、ＩＦＮα８ｂ或いはＩＦＮα８ｃのアミノ酸配列に基づき目的とするペプチドを合成すればよい。
　免疫感作は常法によればよく、例えば、上記のＩＦＮα８、その変異蛋白質或いはこれらのフラグメントを単独又は適宜アジュバントとともに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に投与して、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所期の抗体産生細胞が得られるかぎり、種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後述の無限増殖可能な哺乳動物由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択される。哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至５回に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞を得る。
　つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳動物由来の細胞とを融合させて、目的のハイブリドーマを含む融合細胞を得る。無限増殖可能な哺乳動物由来の細胞には、通常、Ｐ３－ＮＳ１－Ａｇ４－１細胞（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ１８）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ９）及びＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）、Ｙ３Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６３１）などのマウスやラットの骨髄腫由来細胞株、又はこれらの変異株が用いられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる方法が用いられ、一例を挙げると、融合促進剤を含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、この状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダルベコ培地を始めとする通常一般のものを用いればよく、ウシ血清などの血清類は除いておくのが望ましい。
　目的のハイブリドーマを選択するには、まず、上記のようにして得た融合細胞をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至３週間培養してハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。次に、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物中に分泌された抗体につき、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質との反応性を試験する。試験には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗体を検出するための慣用の方法が用いられ、例えば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュアル』、講談社サイエンティフィク発行、第１０５乃至１５２頁（１９９１年）にはそのための方法が種々詳述されている。ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的な抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法などにより、直ちにクローニングされ、単一クローン化された本発明によるハイブリドーマを得る。
　本発明のモノクローナル抗体は、斯かるハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳動物由来の細胞を培養するための慣用の方法が用いられ、例えば、生体外の培養培地で培養するときには、その培養物から、一方、ヒト以外の温血動物に移植し、生体内で培養するときには、その腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取する。後述のα８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）及びα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）の産生するモノクローナル抗ＩＦＮα８抗体は、これらの抗体をＩＦＮα８及びその変異蛋白の検出に使用したとき、非特異的反応が低く、微量のＩＦＮα８を特異的に、かつ、感度よく検出することができる。また、これらのハイブリドーマは、モノクローナル抗体の産生能が高く、しかも、生体内外における培養が容易であるという特徴がある。培養物、腹水或いは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動などが挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮、乾燥し、用途に応じて液状又は固状とする。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、配列表における配列番号３又は４と、５で示される塩基配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、或いは、配列番号１２又は１３と、１４で示される塩基配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを各々、重鎖および軽鎖の定常領域をコードする既知のＤＮＡ（例えば、特開２００７－２５２３７２号公報参照）とそれぞれ連結した遺伝子を、ＰＣＲ法、または、化学合成により合成し、定法により、その遺伝子の発現を可能とする公知の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売）等に組み込んで形質転換体を調製し、チャイニーズハイスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）や大腸菌等の宿主中で発現させることによって抗体を産生し、これらの培養液から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等を用いて抗体を精製することによって得ることができる。
　これらの方法で産生された抗体は、後述する目的で、抗体全体をそのまま使用してもよく、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に結合能を有する限り、当該抗体の抗原認識部位を含むＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ’などの断片として使用することも有利に実施できる。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及び／又はその変異蛋白質の検出を必要とする諸分野に広範な用途を有する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体にラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被験試料中のＩＦＮα８及び／又はその変異蛋白質を、特異的に、迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。斯かる分析において、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的に反応するので、その免疫反応を、これら標識物質を指標に測定すれば、被験試料中のごく微量のＩＦＮα８及びその変異蛋白質を精度よく検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被験試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。したがって、本発明による検出方法は、ＩＦＮα８及び／又はその変異蛋白質を製造する際の工程管理や製品の品質管理、さらにはＩＦＮα８が関与する疾患の臨床診断などにきわめて有用である。なお、本発明はモノクローナル抗体の標識や標識アッセイそのものに係わるものではないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、１９８９年、東京化学同人発行、第１９６乃至３４８頁などにはそのための方法が種々詳述されている。また、本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に認識する抗体なので、これらのモノクローナル抗体を、酵素抗体法の固相抗体及び／又は標識抗体として使用することにより、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を特異的に検出することができる。なかでも、本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法による酵素抗体法において、固相抗体及び標識抗体として使用して、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質の検出に適用したときには、当該蛋白質を５０乃至２，０００ｐｇ／ｍｌの範囲で検出可能であり、且つ、ＩＦＮα８以外の他のヒトＩＦＮαサブタイプを実質的に検出しない、高感度のアッセイ系を構築することができる。この目的、とりわけ、サンドイッチ法による高感度の酵素抗体法に適したモノクローナル抗体として、例えば、後述するα８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）及びα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）のハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を例示することができる。この２種類のモノクローナル抗体を固相抗体及び標識抗体として使用する場合には、ＩＦＮα８以外のヒトＩＦＮαサブタイプを、その濃度が２，０００ｐｇ／ｍｌでも検出することはなく、かつ、非特異的な吸着による反応も殆ど認められないので、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質を高感度で、且つ、正確に測定することができる。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の精製にもきわめて有用である。斯かる精製方法は、本発明のモノクローナル抗体を当該ＩＦＮα８及びその変異蛋白質と当該蛋白質以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物に接触させてモノクローナル抗体に当該蛋白質のみを吸着させる工程と、吸着した蛋白質をモノクローナル抗体から脱着させる工程を含んでなり、両工程は、通常、水性媒体中で行なわれる。本発明のモノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体に結合した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒管などにカラム状に充填し、これに、例えば、リンパ芽球様細胞株ＢＡＬＬ－１をＨＶＪで刺激して製造したＩＦＮαを含む培養上清、ＩＦＮα８或いはその変異蛋白質の産生能をもつ形質転換体の培養液又はそれらの部分精製品を通液すると、実質的に当該蛋白質のみが水不溶性担体上のモノクローナル抗体に吸着する。吸着した蛋白質は、モノクローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることにより、容易に脱着させることができ、例えば、ＩｇＧのクラスに属するモノクローナル抗体を用いる場合は酸性側のｐＨ、通常、ｐＨ２乃至３で、一方、ＩｇＭのクラスに属するモノクローナル抗体を用いる場合はアルカリ側のｐＨ、通常、ｐＨ１０乃至１１で溶出させることができる。この目的に適したモノクローナル抗体として、例えば、上記α８＃１３９及びα８Ｙ３６－２の産生するモノクローナル抗体を例示することができる。
　さらに、本発明のモノクローナル抗体は、上記のごとき組換技術等を利用して、ＣＨＯ細胞や大腸菌で発現させて、キメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体を調製して、さらには、これらの抗体の抗原認識部位を有するＦｖ、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ’断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などの断片を調製して、ＩＦＮα８が、発症や増悪に関与している各種ウイルス性疾患、アレルギー症、アトピー症、自己免疫疾患、糖尿病、乾癬、慢性関節リュウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良貧血、腎炎、全身性エリスマトーデス及び／又は後天性を含む免疫不全症等の各種疾患の治療剤の有効成分としても有利に使用できる。この治療剤の有効成分として使用可能なモノクローナル抗体として、具体的には、上記のハイブリドーマα８＃１３９及びα８Ｙ３６－２の産生するモノクローナル抗体を例示することができ、とりわけ、ＩＦＮα８活性を中和することのできるα８＃１３９の産生する抗体が望ましい。また、後述するハイブリドーマα８＃Ｓ５６－１の産生する抗体も、ＩＦＮα８活性を中和することができるので有利に利用できる。この場合、モノクローナル抗体単独の製剤とすることもできるが、通常、製剤学的に許容される添加剤を１種又は２種以上を加えた製剤の形態が望ましく、当該疾患の治療に使用される他の有効成分をさらに配合することも随意である。これらの製剤は通常、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内などに投与すればよく、その際の投与量は、対象とする疾患に対して治療効果を発揮する量を適宜選択すればよく、通常は、成人１日当たり、本発明のモノクローナル抗体を、０．００１ｍｇ乃至２，０００ｍｇ、望ましくは０．０１乃至１，０００ｍｇ、より望ましくは、０．１ｍｇ乃至１，０００ｍｇを、１回乃至複数回に分けて投与すればよい。
　前記、イムノアッセイ、ＩＦＮα８又はその変異蛋白精製やＩＦＮα８が発症や増悪に関与する疾患治療剤として好ましい本発明のモノクローナル抗体についてより具体的に説明すると、本発明の所期の目的を達成できるモノクローナル抗体であれば、その由来やアミノ酸配列は問わず、とりわけ、α８＃１３９及びα８Ｙ３６－２のハイブリドーマが産生する抗体が望ましい。そのアミノ酸配列についていえば、重鎖可変領域に配列表における配列番号２１乃至２３で示されるアミノ酸配列の１種以上を含み、及び／又は、軽鎖可変領域に配列番号２４乃至２６で示されるアミノ酸配列の１種以上を含む抗体、或いは、重鎖可変領域に配列表における配列番号２７乃至２９で示されるアミノ酸配列の１種以上を含み、及び／又は、軽鎖可変領域に配列番号３０乃至３２で示されるアミノ酸配列の１種以上を含む抗体が望ましい。さらには、重鎖可変領域に配列表における配列番号２１乃至２３で示される全てのアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号２４乃至２６で示される全てのアミノ酸配列を含む抗体、又は、重鎖可変領域に配列表における配列番号２７乃至２９で示される全てのアミノ酸配列を含み軽鎖可変領域に配列番号３０乃至３２で示される全てのアミノ酸配列を含む抗体がより望ましく、重鎖可変領域に配列表における配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列表における配列番号１１で示されるアミノ酸配を含む抗体、又は、重鎖可変領域に配列表における配列番号１８又は１９で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列表における配列番号２０で示されるアミノ酸配を含む抗体がさらに望ましい。特に、重鎖可変領域に配列表における配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列表における配列番号１１で示されるアミノ酸配を含む抗体は、ＩＦＮα８に対する中和活性を有することから、活性との相関が高いので望ましい。
これらの抗体は、そのままで、その部分配列を利用して、或いは、それらのアミノ酸の１乃至１００個程度を、欠失、付加、置換するなどにして組み換え体を調製し、ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白を特異的に認識する、ＩＦＮα８の定量・定性、ＩＦＮα８精製、さらには、ＩＦＮα８の関与する疾患治療、臨床診断などの各々の用途に適したキメラ抗体、ヒト化抗体、或いは、ヒト抗体を、公知の方法（例えば、特開２００４－５３３２１７号公報や特開２００７－２５２３７２号公報）により調製することも有利に実施できる。通常、アミノ酸の欠失、付加、置換は、数個の範囲が望ましく、１乃至５個が望ましく、１乃至３個が望ましく、１又は２個が特に望ましい。このような、欠失、付加置換は、抗体の特異性を規定する超可変部位に導入してもよいが、通常は、それ以外の部位が望ましい。
　以下、実施例に基づき本発明を説明するが、本発明は、これら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例で使用したＩＦＮα８を含む組換型（以下、組換型を「ｒ」と略記する場合がある）のヒトＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮα８の変異蛋白質は、いずれも、株式会社林原生物化学研究所で、大腸菌を用いて調製したものを使用し（ヤナイ　ワイ．（Ｙａｎａｉ　Ｙ．）等、『ジャーナル　オブ　インターフェロン　アンド　サイトカイン　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＆　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第２１巻、第１０号、第８３５乃至８４１頁（２００１年）及び国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットを参照）。ｒＩＦＮα８はＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列を有するペプチドを使用した（国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットを参照）。また、天然型（以下、天然型を「ｎ」と略記する場合がある。）のヒトＩＦＮαサブタイプα２ｂ（以下、「ＩＦＮα２」と略記する。）、ｎＩＦＮα８、マウスＩＦＮα／β及びラットＩＦＮαは、株式会社林原生物化学研究所で調製したものを使用した（ヤナイ　ワイ．（Ｙａｎａｉ　Ｙ．）等、『ジャーナル　オブ　インターフェロン　アンド　サイトカイン　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＆　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第２１巻、第１０号、第８３５乃至８４１頁（２００１年）を参照）。ヒトＩＦＮβ（以下、ヒトＩＦＮβを「ＩＦＮβ」と略記する。）、コンセンサスＩＦＮ（以下、「Ｃｏｎ　ＩＦＮ」と略記する場合がある。）は、各々、持田製薬株式会社及びアステラス製薬株式会社販売の製品をそれぞれ購入して使用した。ヒトＩＦＮγ（以下、ヒトＩＦＮγを「ＩＦＮγ」と略記する。）及びヒト腫瘍壊死因子（ヒトＴＮＦα、以下、ヒトＴＮＦαを「ＴＮＦα」と略記する。）はコスモバイオ株式会社の製品を購入して使用した。
　また、以下の実施例で使用したＩＦＮ類及びサイトカイン（表５に示す比活性は、安定化等の目的で添加した蛋白質成分を含まない）は、後述の表５にまとめて示す。なお、以下、ヒトＩＦＮαのサブタイプα１、α５、α６及びα１０を、各々ＩＦＮα１、ＩＦＮα５、ＩＦＮα６及びＩＦＮα１０と略記する。また、以下の実施例では、ＩＦＮα８の変異体として、ヤナイ　ワイ．（Ｙａｎａｉ　Ｙ．）等、『ジャーナル　オブ　インターフェロン　アンド　サイトカイン　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＆　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第２１巻、第１０号、第８３５乃至８４１頁（２００１年）の実験１－１乃至１－３において開示した変異体Ｎｏ．２及びＮｏ．３、すなわち、１６６のアミノ酸残基からなるＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列のＮ末端のシステイン残基から１４５番目のアルギニン残基をイソロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をセリン残基に、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に置換したＩＦＮα８の変異蛋白質（以下、「ＩＦＮα８－ＭＵＴ２」と略記する。）、及び、ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列のＮ末端のシステイン残基から１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をセリン残基に、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に置換したＩＦＮα８の変異蛋白質（以下、「ＩＦＮα８－ＭＵＴ３」と略記する。）を使用した。
＜マウス抗ＩＦＮα８抗体産生ハイブリドーマの調製＞
＜抗原＞
　抗原として、国際公開第ＷＯ　２００６／０５１８０５号パンフレットに記載された方法により調製したＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列を有するｒＩＦＮα８（大腸菌由来、蛋白質濃度５１０μｇ／ｍｌ、１．２７×１０８ＩＵ／ｍｌ）を使用した。なお、ＩＦＮの力価（国際単位：ＩＵ）は、ＦＬ細胞のシンドビスウイルスによる細胞変性の抑制作用を指標とするバイオアッセイで測定した。測定には、国際標準品（Ｇａ２３－９０１－５３２）を使用して検定した自社標準品（株式会社林原生物化学研究所調製）を使用した。
＜免疫方法＞
　抗原（１０μｇ／匹）とフロイントのコンプリートアジュバント（株式会社ディフコ（ＤＩＦＣＯ）販売）とを混合して、エマルジョンを作成し、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、９週齢、メス、株式会社日本チャールスリバー販売）に、腹腔内に免疫した。２回目以降はフロイントのインコンプリートアジュバント（株式会社ディフコ（ＤＩＦＣＯ）販売）に変更して、腹腔内に２週間隔で計３回免疫した。
＜細胞融合＞
　最後の免疫後、７日目に尾静脈より部分採血し抗体価を確認した。抗体価の上昇が認められた個体について、細胞融合を行う３日前に、最終免疫として、アジュバントを含まない抗原１０μｇを静脈内に投与（以下、「静注」という。）した。この静注を行って３日目のマウスの脾臓を、常法により採取し、分散して脾細胞を得た。この脾細胞と親株であるマウスＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）を３７℃に予温しておいた血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度２．５×１０５個／ｍｌ及び５×１０４個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ培地に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに２００μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で２週間インキュベートしてハイブリドーマを選択した。細胞融合は、１回に１匹のマウスから得た脾細胞を使用して、同様の方法で３回実施した。ハイブリドーマが増殖した各ウエルの培養上清（以下、「ハイブリドーマの培養上清」という。）を採取し、後述の直接法によるエンザイムイムノアッセイに供して、ｒＩＦＮα８に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマを、常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、ｒＩＦＮα８に親和性を示すモノクローナル抗体を安定して産生するハイブリドーマのクローンα８＃４４、α８＃５９、α８＃９８、α８＃１３９、α８＃１４５を得た。なお、ハイブリドーマα８＃１３９、すなわち、ｍＡｂ－ＩＦＮα８＃１３９については、平成２０年２月１５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１として受託された。これらのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質の定性や定量のためのイムノアッセイ用やこれらの蛋白質の精製用の抗体として使用することができる。また、これらのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、そのままで、或いは、組換技術等を利用して、キメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体を調製して、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与している各種疾患の治療剤の有効成分としても使用することができる。
＜直接法による抗ＩＦＮα８抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング＞
　抗原として使用したｒＩＦＮα８を、その蛋白質濃度を２μｇ／ｍｌに希釈して、５０μｌ／ウエル（ｒＩＦＮα８の蛋白質量：１００ｎｇ／５０μｌ／ウエル）で、コバレントＮＨモジュール（ＮＵＮＣ社販売）に加え、ビス　スルフォサクシニミジル　スベレイトを用いて吸着させて固相とした。各ウエルに加えたｒＩＦＮα８を含む溶液を除去し、１％ＢＳＡ含ＰＢＳでブロッキング処理後、処理液を除去した。この各ウエルに、上記のハイブリドーマの培養上清を加えて、室温で２時間振とうした。この培養上清を除去後、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」と略記する。）標識したウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ　サイトメイション（ＤＡＫＯ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社販売）を加えた。この標識抗体を含む溶液を除去後、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのｏ－フェニレンジアミン（以下、「ｏ－ＰＤ」と略記する。）と０．０３％の過酸化水素を含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて、発色反応を行い、２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止して、マルチプレートリーダーで吸光度（ＯＤ：Ａ４９０／６５０ｎｍ）を測定して、ｒＩＦＮα８に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
＜ラット抗ＩＦＮα８抗体産生ハイブリドーマの調製＞
　１０週齢ＢＮラットの腹腔内に実施例１で使用したｒＩＦＮα８を抗原として、コンプリートフロイントアジュバントに混和して、その蛋白質量が２０μｇ／匹の割合で腹腔内に免疫した。その後、２週間おきに同一量の抗原をインコンプリートアジュバントに混合して２回接種し、最後の投与から１週間後に、アジュバントを含まない抗原を、同一量さらに静注した。その３日後に脾臓を摘出し、分散して脾細胞を得た。この脾細胞とラット骨髄腫由来のＹ３Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６３１）を３７℃に予温しておいた血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度２．５×１０５個／ｍｌ及び５×１０４個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ培地に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに２００μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で２週間インキュベートしてハイブリドーマを選択した。各ウエルにおける培養上清中に分泌された抗体につき、後述のサンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイにより調べ、ｒＩＦＮα８に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマに常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、本発明のモノクローナル抗体を安定して産生するハイブリドーマのクローンα８＃Ｙ１９－１及びα８Ｙ３６－２を得た。なお、ハイブリドーマα８Ｙ３６－２、すなわち、ｍＡｂ－ＩＦＮα８Ｙ３６－２については、平成２０年２月１５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２として受託された。これらハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質の定性や定量のためのイムノアッセイ用やこれらの蛋白質の精製用の抗体として使用することができる。また、これらのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、そのままで、或いは、組換技術等を利用して、キメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体を調製して、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与している各種疾患の治療剤の有効成分としても使用することができる。
＜サンドイッチ法による抗ＩＦＮα８抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング＞
　イムノプレート（ＮＵＮＣ社販売）を、ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ　サイトメイション（ＤＡＫＯ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社販売）でコーティングし、ハイブリドーマの培養上清を加えて、室温で１～２時間振とうし、培養上清を除去して、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳで３回洗浄して、ｒＩＦＮα８を５ｎｇ／５０μｌ／ウエル添加し、さらにＨＲＰ標識したウサギポリクローナル抗ＩＦＮα抗体（株式会社林原生物化学研究所調製）を、５０ｎｇ／５０μｌ／ウエル加えた。実施例１と同様に、発色反応を行い、マルチプレートリーダーで吸光度（ＯＤ：Ａ４９０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定して、ｒＩＦＮα８に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
＜ラット－マウス抗ＩＦＮα８抗体産生ヘテロハイブリドーマの調製＞
　１０週齢ＢＮラットの腹腔内に、実験１で使用したものと同じｒＩＦＮα８蛋白質をコンプリートフロイントアジュバントに混和して、蛋白質量が２０μｇ／匹の割合で腹腔内に免疫した。その後、２週間おきに同一量を２回追加免疫し、最後の免疫から１週間後に同一量をさらに静注した。その３日後に脾臓を摘出し、分散して脾細胞を得た。この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）を３７℃に予温しておいた血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度２．５×１０５個／ｍｌ及び５×１０４個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部分を採取した。この沈澱に平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ培地に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに２００μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で２週間インキュベートしてハイブリドーマを選択した。各ウエルにおける培養上清中に分泌された抗体につき、実施例１又は実施例２と同様の方法でＩＦＮα８との反応性をエンザイムイムノアッセイにより調べ、ｒＩＦＮα８に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマに、常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、本発明のモノクローナル抗体を安定して産生するハイブリドーマのクローンα８＃Ｓ１８－１及びα８＃Ｓ５６－１を得た。これらのモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質の定性や定量のためのイムノアッセイ用やこれらの蛋白質の精製用の抗体として使用することができる。また、これらのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、そのままで、或いは、組換技術等を利用して、キメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体を調製して、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与している各種疾患の治療剤の有効成分としても使用することができる。
＜モノクローナル抗体の調製＞
＜マウス抗ＩＦＮα８モノクローナル抗体の調製＞
　実施例１の方法により得たハイブリドーマのクローンα８＃４４、α８＃５９、α８＃９８、α８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）及びα８＃１４５を、各々細胞密度約１×１０６個／ｍｌになるように無血清培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社販売、商品名「ハイブリドーマ－ＳＦＭコンプリートＤＭＰ」）又は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で培養した。所期の細胞密度に達した時点で、ハイブリドーマを、予め、プリスタンを０．５ｍｌ／匹腹腔内注射しておいた８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、各々１×１０７個／匹注射接種し、通常の方法で１０日間飼育した。マウスから腹水を採取し、ＰＢＳで３倍希釈した後、硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加え、４℃で２４時間静置し、遠心分離後、沈澱部を採取した。沈殿をＰＢＳで透析し、常法により、プロテインＧ結合セファロースカラム（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス）社販売、商品名「プロテインＧセファロース４ＦＦカラム」）に供し、ＩｇＧ画分を精製した。以下、ハイブリドーマのクローンα８＃４４、α８＃５９、α８＃９８、α８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）、α８＃１４５の産生する抗ＩＦＮα８抗体を、各々α８＃４４ｍＡｂ、α８＃５９ｍＡｂ、α８＃９８ｍＡｂ、α８＃１３９ｍＡｂ、α８＃１４５ｍＡｂとよぶ。
＜ラット或いはラット－マウス抗ＩＦＮα８モノクローナル抗体の調製＞
　実施例２で得たハイブリドーマα８＃Ｙ１９－１及びα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）、実施例３で得たハイブリドーマα８＃Ｓ１８－１及びα８＃Ｓ５６－１を、各々、細胞密度約１×１０６個／ｍｌになるように、無血清培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社販売、商品名「ハイブリドーマ－ＳＦＭコンプリートＤＭＰ」）又は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で所定量の培養規模になるまで培養した。この培養上清を回収し、濃縮して、常法により、プロテインＧ－セファロース４ＦＦカラム（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス）社販売）に供し、各々のハイブリドーマの産生したＩｇＧ画分を精製した。以下、ハイブリドーマα８＃Ｙ１９－１、α８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）、ハイブリドーマα８＃Ｓ１８－１及びα８＃Ｓ５６－１の産生する抗ＩＦＮα８抗体を、各々α８＃Ｙ１９－１ｍＡｂ、α８Ｙ３６－２ｍＡｂ、α８＃Ｓ１８－１ｍＡｂ及びα８＃Ｓ５６－１ｍＡｂとよぶ。
＜モノクローナル抗体の特徴＞
　これら９種類の抗体のイソタイプを、各ハイブリドーマを無血清培地で培養した培養上清を使用して、市販のエンザイムイムノアッセイキット（Ｚｙｍｅｄ社販売、商品名「Ｒａｔ　ＭｏｎｏＡＢ　ＩＤ　ｋｉｔ」又は「Ｍｏｕｓｅ　ＭｏｎｏＡＢ　ＩＤ　ｋｉｔ」）により決定した結果を表１に示す。さらに、これら９種類のモノクローナル抗体の、表１又は２に示すＩＦＮ類及びＴＮＦαに対する反応性を、後述のウエスタンブロッティング分析により確認した結果を表１及び表２に併せて示す。また、代表的なウエスタンブロッティングの結果として、図１に示すＩＦＮα類を使用して、α８＃１３９の培養上清を用いた時のウエスタンブロッティングのパターンを図１に示す。さらに、これらのハイブリドーマの培養上清と、表３に示すＩＦＮ類又はＩＦＮα８の変異体を３０乃至７０ＩＵ／ｍｌに希釈した溶液とを等量混合して、その抗ウイルス活性が中和される（活性が減少する）かどうかを、ＦＬ細胞に対するシンドビスウイルスの細胞変性を指標とする抗ウイルス活性測定により確認した。その結果を表３に示す。なお、ウエスタンブロッティングは、ＩＦＮ類或いはＴＮＦ蛋白質のバンドが染色された場合を反応性あり（＋）、染色されない場合を反応性なし（－）と判定した。また、中和活性は、実質的に抗ウイルス活性が測定されない場合を中和活性あり（＋）、それ以外の場合を中和活性なし（－）と判定した。
＜ウエスタンブロッティング分析＞
　１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液０．５ｍｌ及びグリセロール１ｍｌからなる混液に実施例１で抗原として使用したｒＩＦＮα８或いはｎＩＦＮα２を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、各々の蛋白質量が１０又は１００ｎｇ／レーンとなるようにチャージして、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。ＩＦＮ類の蛋白質の分子量に相当する約２０乃至２９キロダルトン（以下、「ＫＤａ」と略記する。）の範囲のゲルに含まれる蛋白質を、常法により、ニトロセルロース膜に移し、非特異的な反応を抑制するためブロッキング溶液（大日本住友製薬社販売、商品名「ブロックエース」）に浸漬した。このブロッキング処理したニトロセルロース膜を、プロテインＧセファロースを用いて精製した９種類のモノクローナル抗体のいずれかを２μｇ／ｍｌ含有する溶液に、室温で１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰の抗体を除いた。ニトロセルロース膜を、ＨＲＰ標識した抗マウスイムノグロブリン又は抗ラットイムノグロブリン（何れもダコ　サイトメイション（ＤＡＫＯ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社販売）溶液に、室温で１時間浸漬した。この膜を０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３０分間洗浄後、発色反応は、市販のウエスタンブロッティング検出キット（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス社販売、商品名「ＥＣＬ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ」）を用いて行った。なお、分子量マーカーには、市販のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用分子量マーカー（バイオラッド社販売、商品名「プレステイン　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　スタンダード　ブロードレンジ」、構成：ミオシン（２０４ＫＤａ）、β－ガラクトシダーゼ（１２０ＫＤａ）、ＢＳＡ（１００ＫＤａ）、オボアルブミン（５２ＫＤａ）、カーボニックアンヒドラーゼ（３７ＫＤａ）、ソイビーントリプシンインヒビター（２９ＫＤａ）、リゾチーム（２０ＫＤａ）及びアプロチニン（７ＫＤａ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１から明らかなように、実施例１乃至３で得たモノクローナル抗体はいずれもＩｇＧクラス（軽鎖はκ）の抗体であった。また、表１及び２から明らかなように、これらの抗体は、ｒＩＦＮα８、ｎＩＦＮα８及び２種類のＩＦＮα８変異蛋白質とのみ反応し、その他のヒトＩＦＮαサブタイプ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＣｏｎＩＦＮ、マウスＩＦＮα／β、ラットＩＦＮα及びＴＮＦαと反応せず、これらの抗体がＩＦＮα８及びその変異体を特異的に認識する抗体であることが明からになった。また、図１から明らかなように、ウエスタンブロッティング分析では、分子量が２０乃至２９ＫＤａに認められるｎＩＦＮα８及びｒＩＦＮα８蛋白質のバンドのみが発色し、他のＩＦＮαの蛋白質のバンドは染色していないので、α８＃１３９ｍＡｂは、ｎＩＦＮα８及びｒＩＦＮα８蛋白質特異的に反応することが明らかになった。また、α８＃１３９ｍＡｂのｎＩＦＮα８とｒＩＦＮα８に対する反応性を比較すると、ブロッティングには、等質量のｎＩＦＮα８とｒＩＦＮα８の蛋白質を使用したにもかかわらず、ｎＩＦＮα８の方が強く染色されているので、このモノクローナル抗体は組換型よりも天然型のＩＦＮα８に対する反応性が強いと判断した。また、具体的なウエスタンブロッティングのパターンは示さないが、表１及び表２に示すとおり、他の８つのハイブリドーマの産生する抗体は、いずれも天然型、組換型のＩＦＮα８及びＩＦＮα８変異蛋白質とのみ反応し、他のＩＦＮ類やＴＮＦαには反応しなかった。また、天然型と組換型ＩＦＮαに対する反応性も、α８＃１３９ｍＡｂと同様のパターンを示した。さらに、表３から明らかなように、ＩＦＮα８の抗ウイルス活性に対する中和活性は、α８＃１３９ｍＡｂ及びα８＃Ｓ５６－１ｍＡｂでのみ認められた。また、α８＃１３９ｍＡｂ及びα８＃Ｓ５６－１ｍＡｂの場合も、ｎＩＦＮα２、ＩＦＮβ及びＩＦＮγの抗ウイルス活性に対する中和活性は認められなかったことから、これら２種類のモノクローナル抗体の持つ中和活性はＩＦＮα８特異的であることが判明した。
＜ＩＦＮα８に対するエンザイムイムノアッセイ系の構築＞
　実施例４の方法により調製した９種類のモノクローナル抗体を使用して、ＩＦＮα８を特異的に定量できるエンザイムイムノアッセイ系の構築に適した抗体のスクリーニングを以下のように行った。
＜抗体＞
　実施例４で調製した９種類のモノクローナル抗体、ウサギポリクローナル抗ＩＦＮα抗体（以下、「ｐｏｌｙＩＦＮα」と略記する。）及びマウスモノクローナル抗ＩＦＮα抗体（以下、「ｍＡｂＩＦＮα１４」と略記する。）（何れも、株式会社林原生物化学研究所調製）を使用した。なお、ｐｏｌｙＩＦＮα及びｍＡｂＩＦＮα１４は、ＩＦＮα８及びそれ以外のヒトＩＦＮαサブタイプとの反応性を有している。
＜ペルオキシダーゼ標識抗体の調製＞
　常法にしたがって、前記１１種類の抗体を、過ヨウ素酸化法によりＨＲＰ標識した。すなわち、ＨＲＰ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社販売）１０ｍｇを蒸留水２ｍｌに溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１２５μｌを添加して遮光下、室温で１５分間静置した。その後、エチレングリコール１００μｌを添加後、遮光下で、室温で５分間、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）に対し透析した後、ＨＲＰが１５ｍｇ／ｍｌ以上になるように濃縮した。この濃縮したＨＲＰ８ｍｇと、予め２０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮した前記１１種類の抗体のいずれか１０ｍｇとを混合し、水を加えて全量を８５０μｌにした後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１５０μｌを添加して、ｐＨを約９．３に調整して、遮光下、４℃で２時間静置した。その後、４ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウムを１００μｌ添加して、遮光下、室温で、３時間静置後、ゲル濾過用カラム（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス社販売、商品名「Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ＨＲ」）によるゲルろ過にて、ＨＲＰ標識抗体画分を回収した。回収した画分に、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略記する。）を１％となるよう溶解し、膜ろ過（ポアサイズが０．２２μｍ）して、ＨＲＰ標識抗体（以下、「標識抗体」という。）を調製した。
＜エンザイムイムノアッセイの方法＞
　前記ＨＲＰ標識した１１種類の抗体と、その標識に使用した１１種類の未標識の抗体（以下、「未標識抗体」いう。）を固相抗体として使用して、サンドイッチ法による１２１通りの組み合わせによるエンザイムイムノアッセイで、ｒＩＦＮ蛋白質の定量が可能かどうかを試験した。すなわち、１１種類の未標識抗体を、各々抗体濃度が２０μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、その各々をイムノプレートに５０μｌ／ウエル添加して、室温２時間静置後、溶液を除去し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加えて、４℃で一晩、ブロッキング処理をおこなった。ブロッキング後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを除去し、ｒＩＦＮα８を、５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１Ｍ　ＮａＣｌを含むＰＢＳで６９ｐｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌに希釈したもののいずれかを、５０μｌ／ウエル添加した。室温で２時間振とう後、各ウエルを、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。洗浄に使用したＰＢＳを除去後、前記１１種類の標識抗体を、各々５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ及び０．１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈して、それぞれを、１１種類の未標識抗体を固相に使用したウエルに、５０μｌ／ウエル添加して、室温で２時間振とうした。この標識抗体を含む溶液を除去後、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．５ｍｇ／ｍｌのｏ－フェニレンジアミン（ｏ－ＰＤ）と０．０３％Ｈ２Ｏ２とを含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ウエル加えて発色させ、２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止して、マルチプレートリーダーで吸光度（ＯＤ：Ａ４９０／６５０ｎｍ）を測定した。対照として、ｒＩＦＮα８を含まない、５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１Ｍ　ＮａＣｌを含むＰＢＳを加えた場合の吸光度を同様に測定した。なお、測定は１試料につき３ウエルを使用し、その平均を求めた。また、測定した吸光度に基づく検量線の回帰分析による直線性を判定する相関係数（ｒ値）が０．９９７以上の範囲となるｒＩＦＮα８蛋白質の最小濃度と、対照のウエルを測定した時の吸光度（ＯＤ）に、その測定値の標準偏差値を３倍した値を加えた値と、ｒＩＦＮα８蛋白質最小濃度の測定値からその測定値の標準偏差値を３倍した値を減じた値とを比較して、数値の大きい方に相当するｒＩＦＮα８蛋白質濃度を、試験したエンザイムイムノアッセイによるｒＩＦＮα８蛋白質の検出下限濃度とした。
＜ＩＦＮα２との交差反応性の確認＞
　前記エンザイムイムノアッセイの方法において、ｒＩＦＮα８に換えてｒＩＦＮα２を使用した以外は、全く同じ方法で、エンザイムイムノアッセイを行った。ｒＩＦＮα２の濃度に依存した吸光度の上昇が認められた場合を交差反応あり（「有」）、認められなかった場合を交差反応なし「無」と判定した。
＜測定結果＞
　１１種類の未標識抗体（固相）と１１種類の標識抗体による１２１通りの組み合わせのエンザイムイムノアッセイのうち、ｒＩＦＮα８の濃度に依存した吸光度（ＯＤ）の上昇が認められ、且つ、ＩＦＮα８を含まない溶液（５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１Ｍ　ＮａＣｌ）の吸光度（ＯＤ）が比較的低かった（ＯＤが０．４以下）、１４通りの組合せのみを表４に示す。また、表４に示す抗体の組み合わせで、ｒＩＦＮα８に替えて、ＩＦＮα２を使用した場合にｒＩＦＮα２の濃度に依存した吸光度（ＯＤ）の上昇が認められるかどうか（ＩＦＮα２との交差反応の有無）も確認して、その結果を併せて表４に示す。また、上記方法により求めた、１４類の組み合わせによるエンザイムアッセイの検出下限濃度（ｐｇ／ｍｌ）を表４に併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示す固相抗体と標識抗体の１４種類の組合せで、エンザイムイムノアッセイを行った場合に、ｒＩＦＮα８の濃度に依存した吸光度の上昇が認められた。固相抗体としてα８＃１３９ｍＡｂ又はα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用した組み合わせで、検出下限濃度が６９又は２０６ｐｇ／ｍｌとなった。また、ｐｏｌｙＩＦＮαとα８＃Ｓ５６－１との組み合わせでは、ｒＩＦＮα２に対する交差反応が認められた。エンザイムアッセイは、ＩＦＮα８に特異的で、且つ、検出感度が高く、測定精度も高いことが求められるので、ＩＦＮα２と交差反応が「無」く、ｒＩＦＮα８の検出下限濃度が低く、且つ、検量線の傾きが大きい（対照とＩＦＮα８濃度５０ｎｇ／ｍｌの吸光度差が大きい）という要件を満たす組み合わせとしては、固相抗体にα８＃１３９ｍＡｂを使用し、標識抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂ又はｍＡｂＩＦＮα１４を使用する組み合わせと、固相抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用し、標識抗体としてｐｏｌｙＩＦＮαを使用した場合が考えられた。これらの結果は、固相抗体としてＩＦＮα８を特異的に認識するα８＃１３９ｍ又はＡｂα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用することにより、高感度のＩＦＮα８を特異的に検出するアッセイ系が構築できることを物語っている。しかしながら、標識抗体としてｍＡｂＩＦＮα１４又はｐｏｌｙＩＦＮαを使用すると、これらの抗体はＩＦＮα８以外のＩＦＮαサブタイプと反応する可能性があるので、ＩＦＮα８サブタイプ特異的なエンザイムイムノアッセイ系としては、固相抗体としてα８＃１３９ｍＡｂを使用し、標識抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用する組み合わせが特に望ましいと判断した。
＜ＩＦＮα８サブタイプ特異的なエンザイムイムノアッセイ系によるＩＦＮα８の検出範囲＞
　実施例５でＩＦＮα８の特異的な検出に使用可能と判断した、固相抗体としてα８＃１３９ｍＡｂを使用し、標識抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用するエンザイムイムノアッセイを、後述の方法でおこない、ｒＩＦＮα８の検量線を作成した結果を図２に示す。また、この検量線に基づき算出した当該エンザイムアッセイ系によるＩＦＮα８蛋白質の検出下限濃度を、実施例５に記載した方法に基づき算出して表５に併せて示す。また、この検量線の直線性を示す相関係数（ｒ値）が０．９９７以上の範囲の最大のＯＤ値に相当するｒＩＦＮα８蛋白質濃度を求めて、当該エンザイムイムノアッセイによるｒＩＦＮα８蛋白質の検出上限濃度として表５に併せて示す。
＜ＩＦＮα８サブタイプ特異的なエンザイムイムノアッセイの特異性の確認＞
　前記の固相抗体としてα８＃１３９ｍＡｂを使用し、標識抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用するエンザイムイムノアッセイ系がＩＦＮα８以外のＩＦＮ類やサイトカイン蛋白を検出しないことを確認するために、表５に示す蛋白質濃度のＩＦＮ類及びサイトカイン類を当該エンザイムイムノアッセイ系に供したときの吸光度の測定結果を表５に併せて示す。
＜エンザイムイムノアッセイの方法＞
　固相抗体としてα８＃１３９ｍＡｂを、２０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して、イムノプレート（ＮＵＮＣ社販売）に１００μｌ／ウエルで分注した。室温で３時間静置後、固相溶液を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを２５０μｌ／ウエル加えて、４℃で一晩静置してブロッキングを行った。１％ＢＳＡを含むＰＢＳを除去後、標準品として、２．５％ＦＣＳ、０．５％ＢＳＡ及び０．５Ｍ　ＮａＣｌを含むＰＢＳで、ｒＩＦＮα８を１０乃至２，０００ｐｇ／ｍｌに希釈した溶液を調製した。また、表５に示すＩＦＮ類又はサイトカイン類を被験試料として、ｒＩＦＮα８の希釈に使用したものと同じＦＣＳ、ＢＳＡ及びＮａＣｌを含むＰＢＳで１０ｎｇ／ｍｌに希釈した溶液のいずれかを、１００μｌ／ウエル添加して室温で、３時間振とうした。その後、標準品溶液或いは被験試料を含む溶液を除去後、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄液を除去後、５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ及び０．１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識したα８Ｙ３６－２ｍＡｂを、１００μｌ／ウエル添加して、室温２時間振とう後、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。洗浄液を除去後、０．５ｍｇ／ｍｌのｏ－ＰＤと０．０３％Ｈ２Ｏ２を含有する０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ウエル添加して発色させた後、２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウエル添加して発色反応を停止させて、マルチプレートリーダーで吸光度（ＯＤ：Ａ４９０／６５０ｎｍ）を測定した。なお、測定は１試料につき３ウエルを使用し、その平均を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図２から明らかなように、前記条件に従って、固相抗体にα８＃１３９ｍＡｂを使用し、標識抗体としてα８Ｙ３６－２ｍＡｂを使用したエンザイムイムノアッセイの場合、ｒＩＦＮα８が０．０５乃至２ｎｇ／ｍｌ（５０乃至２，０００ｐｇ／ｍｌ）の範囲において、その蛋白質量に比例した吸光度に直線的な上昇が認められた。この結果は、当該エンザイムイムノアッセイ系を使用することにより、少なくとも約５０乃至２，０００ｐｇ／ｍｌの濃度の当該蛋白質を精度よく検出できることを物語っている。また、表５から明らかなように、当該エンザイムイムノアッセイ系により、ｎＩＦＮα８、ｒＩＦＮα８及びその変異体以外のＩＦＮαサブタイプ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、Ｃｏｎ　ＩＦＮ、ラットＩＦＮα、マウスＩＦＮα／β、ＴＮＦαのいずれかを、ＩＦＮα８の検出下限濃度の２００倍量（検出上限濃度の５倍量）に相当する１０ｎｇ／ｍｌ含む溶液を測定しても、その吸光度は、これらの蛋白質を溶解した緩衝液のみの場合と差は認められなかった。この結果は、当該エンザイムイムノアッセイが、ＩＦＮα８及びその変異体以外のＩＦＮ類やサイトカインとの交差性はなく、ＩＦＮα８及びその変異体に特異的なエンザイムイムノアッセイ系が確立できたことを物語っている。
＜ラジオイムノアッセイによるｒＩＦＮα８蛋白質の検出＞
　常法にしたがって、実施例４の方法により得たα８＃１３９ｍＡｂを常法によりラジオイムノアッセイ用ポリスチレンビーズに吸着させ、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中、４℃で一晩静置して固相抗体ビーズを調製した。
　試験管にこの固相抗体ビーズを１個ずつとり、実施例１で使用したｒＩＦＮα８を０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳにより適宜濃度に希釈して０．２ｍｌずつ加え、４℃で４時間静置した。固相抗体ビーズを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０と０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、実施例４の方法により得たα８Ｙ３６－２ｍＡｂを常法により１２５Ｉ標識して０．２ｍｌ（１×１０５ｃｐｍ）ずつ加え、４℃で一晩静置した。過剰の標識抗体を除去し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０と０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、ガンマカウンタによりビーズの放射能を測定したところ、１０乃至１，０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮα８及びその変異蛋白質を精度よく検出することができた。
＜エンザイムイムノアッセイによるＢＡＬＬ－１細胞由来のヒトｎＩＦＮα８蛋白質の定量＞
　ヒトリンパ芽球様細胞株のＢＡＬＬ－１細胞（株式会社林原生物化学研究所所有）にＨＶＪを加えて誘導されたｎＩＦＮαは、ｎＩＦＮα２とｎＩＦＮα８（ＩＦＮα８ｂ）とを、７２±９：２８±９の比率（質量）で含有し、ｎＩＦＮα７をわずかに含むことが知られている（例えば、シゲハル　フクダ等（Ｓｈｉｇｅｈａｒｕ　Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．）、『リンフォカイン（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ）』、第７巻、第２号、第１７５乃至１８５頁（１９８８年）参照）。実施例６で使用した本発明のエンザイムイムノアッセイ系が、このＢＡＬＬ－１細胞由来のヒトｎＩＦＮα中のｎＩＦＮα８を特異的に定量できることを確認するために以下の試験を行った。すなわち、ＢＡＬＬ－１細胞をハムスターの新生仔の背部皮下に移植し、増殖させたＢＡＬＬ－１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させて、ＨＶＪを加えて一晩培養した培養上清に紫外線を照射してＨＶＪを不活化した溶液（以下、「ＢＡＬＬ―１培養上清」と略記する。）、及び、当該溶液をモノクローナル抗体カラム（ロンザ社販売、商品名「ＮＫ２－セファロース」）で精製したヒトｎＩＦＮα標品を、バイオアッセイ、及び、ＩＦＮα２又はＩＦＮα８特異的なエンザイムイムノアッセイに供した。その結果を表６に示す。また、バイオアッセイでは、予め、実施例４で調製した抗ＩＦＮα８抗体（α８＃１３９ｍＡｂ）を加えてｎＩＦＮα８の活性を特異的に中和した標品の活性を測定した結果も併せて表６に示す。なお、エンザイムイムノアッセイには、ｎＩＦＮα８の定量は、実施例６で構築したアッセイ系を使用し、ｎＩＦＮα２は市販のＩＦＮαアッセイキット（株式会社ＪＩＭＲＯ販売、商品名「ヒトＩＦＮ－α測定キット」）を使用した。また、測定は１試料につき３ウエルを使用し、その平均を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６から明らかなように、ＢＡＬＬ－１培養上清に含まれるヒトｎＩＦＮαは、バイオアッセイでは総ヒトＩＦＮα活性の約３８％がｎＩＦＮα８と計算された。また、同じ培養上清を、ｎＩＦＮα２及びｎＩＦＮα８に特異的なエンザイムイムノアッセイで測定した場合は、総ヒトＩＦＮα活性の約４０％がｎＩＦＮα８と計算された。また、ＢＡＬＬ－１培養上清を抗体カラムで精製した標品では、バイオアッセイでは総ヒトＩＦＮα活性の約３７％がＩＦＮα８と計算された。また、同じ培養上清を、ｎＩＦＮα２及びｎＩＦＮα８に特異的なエンザイムイムノアッセイで測定した場合も、総ヒトＩＦＮα活性の約３２％がｎＩＦＮα８と計算された。このエンザイムイムノアッセイに基づく、総ヒトＩＦＮα活性に占めるＩＦＮα８活性の割合（％）は、バイオアッセイによる活性測定の誤差を勘案すると、文献値や今回のバイオアッセイの結果とよく一致していると判断した。また、表には示していないものの、市販の抗体カラム（ＮＫ２－セファロースカラム）で精製した標品（抗体カラム精製ヒトｎＩＦＮα）の蛋白質量を、ブラッドフォード法により測定したところ、１８４．９μｇ／ｍｌとなって、エンザイムイムノアッセイの結果から計算したｎＩＦＮα２とｎＩＦＮα８との合計の蛋白質量１７３μｇ／ｍｌともほぼ一致した。これら結果は、本発明のモノクローナル抗体を使用したエンザイムイムノアッセイ系は、ＩＦＮα８蛋白質量を特異的に、かつ、バイオアッセイとの相関もよく測定できることを物語っている。
＜ヒトｎＩＦＮα（ＢＡＬＬ－１細胞由来）及びｎＩＦＮα８の変異蛋白質の薬物動態＞
　ヒトｎＩＦＮα（ｎＩＦＮα２を６．４６μｇ、ｎＩＦＮα８を１．８１μｇ含有）、実施例６で使用したＩＦＮα８－ＭＵＴ２（５．８３μｇ含有）又はＩＦＮα８－ＭＵＴ３（５．３８μｇ含有）を、各々４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（株式会社日本チャールスリバー販売、メス、９週齢）に、約１０６ＩＵ／匹で皮下投与した。投与後、経時的（０、０．５、１、２、３、６、２４時間）に尾静脈から血液をサンプリングし、遠心後得られた血漿を、実施例８で使用したものと同じＩＦＮα２、ＩＦＮα８特異的なエンザイムイムノアッセイに供した。測定結果に基づき、ＩＦＮα８又はその変異蛋白質を投与したときの各マウスにおけるＡＵＣ（血中濃度－時間曲線下面積）、ＭＲＴ（平均滞留時間）、Ｃｍａｘ（最高血中濃度）、Ｔｍａｘ（最高血中濃度到達時間）及びＥＢＡ（生物学的利用率）を求め、各ＩＦＮ標品を投与した４匹のマウスの平均を求めて表７に示す。なお、測定は１試料につき３ウエルを使用し、その平均を求めた。
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　表７から明らかなように、ヒトｎＩＦＮαに含まれているｎＩＦＮα８はｎＩＦＮα２の３分の１にも満たないものの、ヒトｎＩＦＮαをマウスの皮下に投与した場合、ｎＩＦＮα８はｎＩＦＮα２に比べて、薬動力学定数であるＡＵＣでは３．６倍（≒１９７５÷５５３）、ＭＲＴでは１．７倍（≒３．９÷２．４）高かった。また、ＩＦＮα８変異蛋白質の血中動態は、ＭＲＴやＥＢＡから見るとｎＩＦＮα８よりもむしろｎＩＦＮα２に似ていることが判明した。これらの結果は、本発明のＩＦＮα８に特異的なエンザイムイムノアッセイ系が、ＩＦＮα８やその変異蛋白質の体内動態、分布排泄等の生体内での挙動をモニターするために、バイオアッセイよりも適したアッセイ方法であることを物語っている。
＜イムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルの調製＞
　実施例４の方法により得たα８＃１３９ｍＡｂの精製品を８０ｍｇとり、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して４℃で一晩透析した。水不溶性担体（ジーイー　ヘルスケア　バイオサイエンス社販売、商品名「ＣＮＢｒ－活性化セファロース４Ｂ」）４ｇを１ｍＭ塩酸水溶液中で膨潤させ、新鮮な１ｍＭ塩酸水溶液、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）の順序で洗浄した後、上記のモノクローナル抗体水溶液約１０ｍｌを加え、室温下で２時間、４℃でさらに一晩緩やかに攪拌した。その後、ゲルを１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．０）で洗浄し、さらに、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）をこの順序で用いて洗浄する工程を５回繰返し、最後にＰＢＳで洗浄してイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを得た。常法により分析したところ、ゲル１ｍｌ当たり、約６ｍｇのモノクローナル抗体α８＃１３９ｍＡｂが結合していた。
＜イムノアフィニティークロマトグラフィーによるｎＩＦＮα８の精製＞
　実施例１０で得たイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲル１０ｍｌをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄後、特許第１１２３０１号公報に記載された方法により、免疫抑制したハムスターに移植して増殖させたＢＡＬＬ－１細胞に、ＨＶＪを加えて産生させたヒトｎＩＦＮαを約０．１ｍｇ／ｍｌ含む画分４０ｍｌを負荷した。新鮮なＰＢＳで洗浄した後、カラムに、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ１．９）を通液し、抗ウイルス活性のある画分を採取した。採取した画分をプールし、濃縮後、蛋白質含量を測定したところ、純度９９．８％以上の精製蛋白質が得られたことが判明した。また、この精製蛋白質を、実施例８で使用したＩＦＮα２或いはＩＦＮα８特異的なエンザイムイムノアッセイに供したところ、ＩＦＮα２蛋白質は検出されず、ＩＦＮα８のみが検出された。その蛋白質量は、ｎＩＦＮα８の比活性を勘案すると、当該精製蛋白質の抗ウイルス活性とよく一致しており、また、カラムに負荷したヒトｎＩＦＮαに含まれているｎＩＦＮα８のほぼ全量が回収されていたので、当該抗体カラムがＩＦＮα８精製用に好適なことが判明した。
＜α８＃１３９の産生するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変部領域のｃＤＮＡ断片クローニングと塩基配列の同定＞
　ハイブリドーマα８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）の産生するモノクローナル抗体α８＃１３９ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変部を含む領域のｃＤＮＡ断片のクローニングと塩基配列（アミノ酸配列を含む）の同定を以下のようにおこなった。
＜ＲＮＡの抽出＞
　α８＃１３９を常法により培養して、約３×１０６個の細胞を調製した。市販のＲＮＡ調製キット（ＱＩＡＧＥＮ社販売、商品名「ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）」）
を用いてその取扱説明書中の「遠心法を用いた動物細胞からのトータルＲＮＡ精製」に従って、細胞のホモジネートからＲＮＡを抽出して、３０乃至６０μｇのＲＮＡを得た。なお、細胞のホモジネートの調製には、市販のカラム（ＱＩＡＧＥＮ社販売、商品名「ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ」）を使用し、その際ＤＮＡａｓｅＩ処理は行わなかった。
＜逆転写酵素反応及びＰＣＲ反応＞
　逆転写酵素反応及びＰＣＲ反応は、市販のキットを使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売、商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ逆転写酵素（カタログ番号１８０８０－０４４）」）を用いて、その取扱説明書「Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」に従って、市販のｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売、カタログ番号１８４１８－０１２）をプライマーとして逆転写酵素反応を実施した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、市販のＭｏｕｓｅ　Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒセット（Ｎｏｖａｇｅｎ社販売、カタログ番号＃６９８３１－３）をプライマーとして、ＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼは、市販品（ＴＯＹＯＢＯ社販売、商品名「ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（カタログ番号ＫＯＤ－２０１）」、以下、「ＫＯＤキット）という）を使用した。また、このＫＯＤキットで増幅ができなかった場合には、タカラバイオ社販売、商品名「ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（ｃｏｄｅ　ＲＲ００１Ａ）」、以下、「Ｅｘ　Ｔａｑキット」という。）を使用した。なお、Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒセットのうち、α８＃１３９ｍＡｂの重鎖可変部領域のＤＮＡ増幅には、５’プライマーとして６本のプライマー「ＭｕＩｇＧＶＨ５’Ａ～Ｆ」と、３’プライマーとして１本のプライマー「ＭｕＩｇＧＶＨ３’－２」を用いた組み合わせでＰＣＲを行った。α８＃１３９ｍＡｂの軽鎖可変部領域の増幅には、５’プライマーとして７本のプライマー「ＭｕＩｇκＶＨ５’Ａ～Ｇ」と３’プライマーとして１本のプライマー「ＭｕＩｇκＶＬ３’－１」を使用した。なお、５‘プライマーは何れも、開始コドンを含む塩基配列含むものを使用した。以下に、ＫＯＤキットとＥｘ　Ｔａｑキット使用時の反応条件を示す。
＜ＫＯＤキットの反応条件＞
ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（１Ｕ／μｌ）　　　　　　　　　　０．５μｌ
１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　　　　　　２．５μｌ
２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５μｌ
逆転写酵素反応後鋳型　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
５’プライマー：
　５’Ａ　ａｎｄ　Ｂ　プライマーの場合　　　　　　１２．５ｐｍｏｌ
或いは、
５’Ｃ－Ｇ　プライマーの場合　　　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
３’プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｐｍｏｌ
適量の蒸留水を加えて全量を２５μｌ／チューブとする。
 
このチューブを、９４℃　２分処理後、９４℃、１５秒、処理温度＊、３０秒、６８℃　１分の３つの温度サイクルで、３０乃至４０回繰り返し処理し、４℃に冷却する。
処理温度＊；５’Ａ　ａｎｄ　Ｂ　Ｌｅａｄｅｒプライマーは５０℃、５’Ｃ－Ｇ　Ｌｅａｄｅｒプライマーは６０℃で行った。
＜Ｅｘ　Ｔａｑキットの反応条件＞
Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）　　　　　　　　　　　　０．２５μｌ
１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　５μｌ
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　４μｌ
逆転写酵素反応後鋳型　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
５’プライマー：　　　　　　　　　　　　　　　
５’Ａ　ａｎｄ　Ｂ　プライマーの場合　　　　　　　　２５ｐｍｏｌ
或いは、
５’Ｃ－Ｇ　プライマーの場合　　　　　　　　　　　　１０ｐｍｏｌ
３’プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
適量の蒸留水を加えて全量を５０μｌ／チューブとする。
このチューブを、９４℃、１分、処理温度＊、１分、７２℃、１分の３つの温度サイクルで、３０乃至３５回繰り返し処理し、４℃に冷却する。
処理温度＊；５’Ａ　ａｎｄ　Ｂ　Ｌｅａｄｅｒプライマーｓは５０℃、５’Ｃ－Ｇ　Ｌｅａｄｅｒプライマーは６０℃で行った。
＜ＤＮＡ断片調製＞
　上記の重鎖及び軽鎖可変部領域のＤＮＡを増幅したＰＣＲ反応液を、各々アガロースゲル電気泳動に供し、約５００ｂｐのＤＮＡ増幅断片を含むゲルから、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ　社販売、商品名「ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」）を使用して、その取扱説明書の「ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」、或いは、市販のキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社販売、商品名「ＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（＃２１１１９２）」に含まれる「ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」）を使用して、その取扱説明書の「Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」に従って、ＰＣＲ後の反応液からＰＣＲ増幅断片を精製した。また、Ｅｘ　Ｔａｑキットで増幅したＤＮＡ断片は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔの操作方法「Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」に従ってＤＮＡ断片の末端の平滑化を行った。
＜形質転換及びスクリーニング＞
　得られた精製ＤＮＡ断片は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（＃２１１１９２）　を用いて　ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　ＳＫ（＋）Ｖｅｃｔｏｒにライゲートし、同キットのコンピテントセルＸＬ１０－Ｇｏｌｄをトランスフォームした。続いてＸ－ｇａｌ、クロラムフェニコール、ＩＰＴＧ含有プレートに播種後、白いコロニーをピックアップし、コロニーダイレクトＰＣＲ法により、目的とするサイズのインサートを含むクローンを選択した。目的とするサイズの断片を含むコロニーの培養液から、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ社販売、商品名「ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ　Ｎｏ．２７１０６）」）を用いてプラスミドを調製した。以下に、コロニーダイレクトＰＣＲ法の反応条件を示す。
＜コロニーダイレクトＰＣＲ反応条件＞
Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）　　　　　　　　　　　　０．０５μｌ
１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　１μｌ
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　０．８μｌ
Ｔ３　プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｎｇ
Ｔ７　プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｎｇ
蒸留水を加えて全量を１０μｌ／チューブとする。
チップでついたコロニーのレプリカをとり、チューブの反応液に混ぜる。
このチューブを、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、１分の３つ温度サイクルで、３０乃至３５回繰り返し処理し、４℃に冷却する。
＜シークエンス＞
　ＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡ自動シークエンサー（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社販売、商品名「ＣＥＱ８０００」）を用い、ベクターのＴ３プライマー（５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ３’：配列表における配列番号１）、Ｔ７プライマー（５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’：配列表における配列番号２）を用いて双方向よりシーケンシング反応を行い、重鎖可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン３個及び軽鎖可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン３個を得て、そのＤＮＡの塩基配列を決定した。重鎖可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン３個のうちの２個のクローンは配列表における配列番号３で示される塩基配列を、残りの１クローンは配列表における配列番号４で示される塩基配列を有していた。また、軽鎖可変部領域の配列を含む３個のクローンは、いずれも配列表における配列番号５で示される塩基配列を有していた。
＜アミノ酸配列＞
　上記３個のＤＮＡの塩基配列に基づき、クローニングに使用した５’プライマー部分のアミノ酸配列に続く、α８＃１３９ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部領域を含むアミノ酸配列を推定した結果を、各々、配列表における配列番号６乃至８で示されるアミノ酸配列に示す。また、既知の重鎖及び軽鎖の不変領域のアミノ末端のアミノ酸配列に基づき、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端のアミノ酸を決定し、α８＃１３９ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部領域のアミノ酸配列を決定して、各々配列表における配列番号９乃至１１で示されるアミノ酸配列に示す。配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列のうちの、アミノ末端から３７番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）で、７９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）がスレオニン（Ｔｈｒ）で置換された配列を有していた。得られたクローンの数からすると、α８＃１３９ｍＡｂの重鎖可変部位のアミノ酸配列は、配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、一部の抗体は、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有していることを物語っている。
＜α８Ｙ３６－２の産生するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変部領域のｃＤＮＡ断片クローニングと塩基配列の同定＞
　ハイブリドーマα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）の産生するモノクローナル抗体α８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変部領域のｃＤＮＡ断片のクローニングと塩基配列（アミノ酸配列を含む）の同定を、以下のようにおこなった。即ち、α８Ｙ３６－２を常法により培養して、約３×１０６個の細胞を調製した。ＲＮＡの抽出以降の操作は、実施例１２と同一の方法で行った。重鎖の可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン３個及び軽鎖可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン２個を得て、そのＤＮＡの塩基配列を決定した。重鎖の可変部領域をコードするＤＮＡを含むクローン３個のうちの２クローンは配列表における配列番号１２で示される塩基配列を、残りの１クローンは配列表における配列番号１３で示される塩基配列を有していた。また、軽鎖可変部領域の配列を含む２個のクローンは、いずれも配列表における配列番号１４で示される塩基配列を有していた。
＜アミノ酸配列＞
　上記３個のＤＮＡの塩基配列に基づき、クローニングに使用した５’プライマー部分のアミノ酸配列に続く、α８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部領域を含むアミノ酸配列を推定した結果を、各々、配列表における配列番号１５乃至１７で示されるアミノ酸配列に示す。また、既知の重鎖及び軽鎖の不変領域のアミノ末端のアミノ酸配列に基づき、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端のアミノ酸を決定し、α８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部領域のアミノ酸配列を決定して、各々配列表における配列番号１８乃至２０で示されるアミノ酸配列に示す。配列表における配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうちの、アミノ末端から１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）で置換された配列を有していた。得られたクローンの数からすると、α８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖可変部位のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有し、一部の抗体は、配列表における配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有していることを物語っている。
　また、実施例１２及び１３の結果は、α８＃１３９ｍＡｂ及びα８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部位のＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を利用して、そのままで、その部分配列を利用して、或いは、それらのアミノ酸の１乃至１００個程度を、欠失、付加、置換するなどにして、組み換え体を調製し、ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白を特異的に認識する、ＩＦＮα８の定量・定性、ＩＦＮα８の精製、さらには、ＩＦＮα８の関与する疾患治療剤、臨床診断薬などとして使用するキメラ抗体、ヒト化抗体、或いは、ヒト抗体を公知の方法（例えば、特開２００４－５３３２１７号公報や特開２００７－２５２３７２号公報）により調製することも有利に実施できることを物語っている。
　さらに、実施例１２及び１３で得られたα８＃１３９ｍＡｂ及びα８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部位のアミノ酸配列を基に、カバット（Ｋａｂａｔ）等の方法（ＮＩＨ出版、Ｎｏ．９１－３２４２、第Ｉ巻、６４７乃至６６９頁（１９９１年）参照）により、α８＃１３９ｍＡｂ及びα８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部位中に各々３箇所存在する、超可変部位のアミノ酸配列を決定した。α８＃１３９ｍＡｂの重鎖の超可変部位は、各々配列表における配列番号２１乃至２３で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖の超可変部位は、各々配列表における配列番号２４乃至２６で示されるアミノ酸配列であることが判明した。また、α８Ｙ３６－２ｍＡｂ重鎖及び軽鎖の超可変部位は、各々配列表における配列番号２７乃至２９で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖の超可変部位は、各々配列表における配列番号３０乃至３２で示されるアミノ酸配列であることが判明した。この結果は、α８＃１３９ｍＡｂ及びα８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖のもつ、その抗体の特異性を規定する超可変部位のＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を利用して、それらのアミノ酸配列に、１乃至１００個程度のアミノ酸を付加して、さらには、超可変部位のアミノ酸を適宜、欠失、付加、置換して、組み換え体を調製し、ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白を特異的に認識する、ＩＦＮα８の定量・定性、ＩＦＮα８精製、さらには、ＩＦＮα８の関与する疾患治療剤、臨床診断薬などとしての使用に適したキメラ抗体、ヒト化抗体、或いは、ヒト抗体を調製することも有利に実施できることを物語っている。
＜治療剤＞
　実施例４の方法により調製した９種類のモノクローナル抗体のいずれかを１５０ｍｇ／ｍｌ、α，α－トレハロース（株式会社林原生物化学研究所製造、パイロジェンフリー）を１４０ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－塩酸ヒスチジンを３．４ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－ヒスチジンを２．２ｍｇ／ｍｌ、及び、ツイーン２０を０．６ｍｇ／ｍｌとなるように精製水に溶解して、１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、常法により、９種類の注射用の凍結乾燥製剤を調製した。本品は、使用時に生理食塩水に溶解して注射剤とし使用することができる。本品は、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与する各種疾患の治療剤として有用である。これら９種類の乾燥製剤を、各々生理食塩水で溶解し、各製剤を、各々５匹のラット（平均体重１２３ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、５ｍｌ／匹（モノクローナル抗体として７５０ｍｇ／匹／回）腹腔内投与して、体重を毎日測定した。対照として、５匹のラット（平均体重１２７ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、生理食塩水を５ｍｌ／匹腹腔内投与して、体重を毎日測定した。各製剤を投与したラットの体重と対照のラットの体重とを比較したところ、何れの製剤を投与した場合にも、対照と差は認められなかった。また、外観的な観察でも、各製剤を投与したラット及び対照のラットに、何ら異常は認められなかった。
＜治療剤＞
　実施例１２で得たα８＃１３９ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部位を含む領域をコードする塩基配列（配列表における配列番号３乃至５）及び可変部位のアミノ酸配列（配列表における配列番号９乃至１１）に基づき、常法によりヒト化抗体を調製して、純度９９．９８％以上に精製後、その抗体を２００ｍｇ／ｍｌ、α，α－トレハロース（株式会社林原生物化学研究所製造、パイロジェンフリー）を１４０ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－塩酸ヒスチジンを３．４ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－ヒスチジンを２．２ｍｇ／ｍｌ、及び、ツイーン２０を０．６ｍｇ／ｍｌとなるように精製水に溶解して、１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、常法により、凍結乾燥製剤を調製した。本品は、使用時に生理食塩水に溶解して注射剤とし使用することができる。本品は、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与する各種疾患の治療剤として有用である。本品を生理食塩水で溶解して、５匹のマウス（平均体重２３ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、０．５ｍｌ／匹（モノクローナル抗体として１００ｍｇ／匹／回）静脈内投与して、体重を毎日測定した。対照として、５匹のマウス（平均体重２４ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、生理食塩水を０．５ｍｌ／匹静脈内投与して、体重を毎日測定した。本品を投与したマウスと対照のマウスの体重を比較したところ、差は認められなかった。また、外観的な観察でも、本品を投与したマウス及び対照のマウスに、何ら異常は認められなかった。
＜治療剤＞
　実施例１３で得たα８Ｙ３６－２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変部位を含む領域をコードする塩基配列（配列表における配列番号１２乃至１４）及びそのアミノ酸配列（配列表における配列番号１８乃至２０）に基づき、常法によりヒト化抗体を調製して、純度９９．９８％以上に精製後、その抗体を２００ｍｇ／ｍｌ、α，α－トレハロース（株式会社林原生物化学研究所製造、パイロジェンフリー）を１４０ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－塩酸ヒスチジンを３．４ｍｇ／ｍｌ、Ｌ－ヒスチジンを２．２ｍｇ／ｍｌ、及び、ツイーン２０を０．６ｍｇ／ｍｌとなるように精製水に溶解して、１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、常法により、凍結乾燥製剤を調製した。本品は、使用時に生理食塩水に溶解して注射剤とし使用することができる。本品は、ＩＦＮα８が発症や増悪に関与する各種疾患の治療剤として有用である。本品を生理食塩水で溶解して、５匹のマウス（平均体重２３ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、０．５ｍｌ／匹（モノクローナル抗体として１００ｍｇ／匹／回）静脈内投与して、体重を毎日測定した。対照として、５匹のマウス（平均体重２３ｇ／匹）に、１日１回、７日間毎日、生理食塩水を０．５ｍｌ／匹静脈内投与して、体重を毎日測定した。本品を投与したマウスと対照のマウスの体重を比較したところ、差は認められなかった。また、外観的な観察でも、本品を投与したマウス及び対照のマウスに、何ら異常は認められなかった。
　以上説明したごとく、本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的に反応する。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、斯かるＩＦＮα８及びその変異蛋白質の検出及び精製などに多種多様の用途を有することとなる。斯くも有用な本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いる製造方法などにより、所望量を容易に得ることができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であるといえる。

Claims (14)

  1. 　抗ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）αモノクローナル抗体であって、ヒトＩＦＮαサブタイプα８（ＩＦＮα８）及びその変異蛋白質との結合能を有し、ヒトＩＦＮαサブタイプα１、α２、α５、α６、α１０、コンセンサスＩＦＮ、ヒトＩＦＮβ、ヒトＩＦＮγ、マウスＩＦＮα／β、ラットＩＦＮα及びヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）と実質的に結合しない単離されたモノクローナル抗体。
  2. 　ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白質の定量に使用する請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  3. 　ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白質の精製に使用する請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  4. 　ヒトＩＦＮα８の変異蛋白質が、ヒトＩＦＮαサブタイプα８ｂのアミノ酸配列のアミノ末端のシステイン残基から１４５番目のアルギニン残基をイソロイシン残基又はロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をセリン残基に、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  5. 　重鎖可変領域に配列表における配列番号２１、２２、２３、２７、２８及び２９で示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  6. 　軽鎖可変領域に配列表における配列番号２４、２５、２６、３０、３１又は３２で示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  7. 　重鎖可変領域に配列表における配列番号９、１０、１８及び１９で示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  8. 　軽鎖可変領域に配列表における配列番号１１又は２０で示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  9. 　ハイブリドーマｍＡｂ－ＩＦＮα８＃１３９（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８１）又はｍＡｂ－ＩＦＮα８Ｙ３６－２（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０８２）が産生するモノクローナル抗体か、該モノクローナル抗体の抗原結合部位と相同の結合部位を有する請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  10. 　ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白質の抗ウイルス活性に対する中和能を有する請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  11. 　ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的な定量方法であって、請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１種又は２種を用いる定量方法。
  12. 　ヒトＩＦＮα８及びその変異蛋白質に特異的な精製方法であって、請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選ばれるいずれかを担体に固定化した抗体カラムを使用する工程を含む精製方法。
  13. 　請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  14. 　請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原認識部位を有する断片を含む医薬組成物又は臨床診断薬。
     
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