JPH0611235B2 - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、α型インターフェロンに対して特異性がある
ことを特徴とする、雑種細胞系によって産生されたモノ
クローナル抗体に関する。

本発明は、またこのモノクローナル抗体を用いるα型イ
ンターフェロンの精製処理方法にも関する。

背景技術 近年、理論及び研究技術の進歩により、哺乳動物の免疫
応答系がどのように動作するかについてより詳しく理解
できるようになった。現在では、抗原が哺乳動物の体内
に取り入れられたとき、リンパ球細胞は、抗原にある特
定の部位（抗原決定基）と結合し、抗原を無害化する特
質を持つ抗体分子を合成するということが受け入られて
いる。免疫応答系の意図的な刺激は、抗血清を製造する
一般的な技術となっており、その応用例は多数に上る
（例えば、ワクチンの製造、病理学、医学及び動物学的
研究において）。

この方法で製造された抗血清に付随する一つの問題点
は、抗血清の示す生理学的活性に差異があるということ
である。

この結果、少くとも部分的には、刺激して免疫化させた
結果産生された特異性のある抗体の数にも因るであろ
う。免疫媒体中の抗原性の不純物に対して産生された抗
体に加えて、抗体を必要とする各抗原は複数の抗原決定
部位を保持することができる。このように、生体によっ
て産生された抗体の“カクテル”は複雑であり、且つそ
の組成は変り易く、相乗作用(synergistic effect)は明
白であり、異った哺乳動物に投与された際には、たとえ
同種内の哺乳動物に投与されたとしても、その生理的作
用は、与える方と受け取る方の哺乳動物に存在する抗原
決定基の組み合わせの相違の結果として、差異が生じが
ちである。

この方法での抗血清製造において更に問題となる点は、
臨床上要求される純度を有する標品を高価なものとする
抽出及び精製にかかる費用である。

分子生物学の分野における研究は、現在では抗体の代替
源を提供している。リンパ球細胞と哺乳動物（例えばマ
ウスやラット）に由来する骨髄腫細胞との間の融合は、
試験管内における複製可能の雑種細胞を産み出すことが
できるということ（コーラーとミルスタイン、ネイチャ
ー、２５６、４９５〜５９７参照）が発見されている。
このような雑種細胞は、予め決った特異性のある抗体を
分泌するという特質を有する。この特異性というのは、
融合に関与したリンパ球によって産生された抗体の持つ
特異性である。雑種細胞は、クロン化させ、また安定な
培養状態で育てれば特異性のある抗原決定基に対する抗
体の培養浮遊物試料を産生させることができる。このよ
うにして産生された抗体は、当該技術分野においてモノ
クローナル抗体として知られている。

上述したタイプの雑種細胞系を造り出す一般的方法は、
動物（普通にはラットかマウスであるが、必ずしもこの
２者の内の一つに限らない）にモノクローナル抗体を必
要とする抗原で免疫化する操作より成る。抗原に対し抗
体を分泌しているリンパ球細胞を産生させるために免疫
系に時間を与えた後、動物を殺し、脾臓細胞の懸濁液を
調製する。これらの細胞と骨髄腫細胞との融合は、融合
促進剤（例えば、ポリエチレングリコール）の存在下で
両者を接触させることによって達成される。極僅かの細
胞だけが融合して雑種の骨髄腫細胞ができる。免疫化の
結果、異なる抗原決定基に対してそれぞれ抗体を分泌し
ている複数の異なるリンパ球ができ、これらの形質は雑
種細胞に遺伝的に伝達されてゆく。慎重なスクリーニン
グを行うことによって、雑種細胞の培養物の中から所望
の特異性を持った細胞を分離することができる。このよ
うな細胞はクロン化して培養し得る。

この技術の利点は、哺乳動物を免疫化させた抗原又は免
疫物質に含まれる抗原性の不純物にある、他の抗原決定
基に対して産生した抗体によって汚染されていない特異
性のある抗体源を提供することである。この技術の他の
利点は、スクリーニング定量のために純粋な形で利用で
きない抗原や低濃度で免疫物質に存在する抗原であって
も使用することができることである。

明らかに、本発明の成功は、細胞融合の段階の後に行う
効率的なスクリーニング定量にかかっている。

本発明は、白血球インターフェロン（当該技術分野に於
てはα型インターフェロンとしても知られている）に対
するモノクローナル抗体に関するものである。このタン
パク質又はタンパク質のグループ（現在の証拠は、約１
５の別個の分子状のまとまりを示唆している）は、抗腫
瘍性と抗ウイルス性の作用が発見されてから、昨今医学
界における大きな興味の的となっている。世界中の研究
者達が興味を持つようになったことにより、臨床実験の
ためだではなく、哺乳動物の免疫応答系とその中のイン
ターフェロンの作用について更に詳しく探究しようとし
ている研究機関によっても使用できるような相当な量の
インターフェロンに対する需要が起って来た。アミノ酸
組成及びアミノ酸配列順序の解明も含めて、ヒト（及び
マウス）のインターフェロンの性質を明らかにすること
に関して顕著な進歩がなされた。

この需要の大きさや性質からして、大規模な精製段階を
含んだ大規模生産が必要であるが、その生産の複雑さ
が、インターフェロンの常用を経済的に耐えられないも
のとしている。

インターフェロンは、リンパ芽球様細胞、白血球細胞
（軟膜リンパ球）、及び遺伝的に変化させた細胞から得
たものも使用できる。精製技術が向上したことにより、
最近ではインターフェロンを精製して均質なものとする
ことができるようになった。ここまでで、３種の内の２
種のインターフェロンが精製されたことになる。即ち、
繊維芽細胞インターフェロン（β型インターフェロン）
と白血球インターフェロンである。

本発明の主題であるモノクローナル抗体は、これまでの
ところ大量には利用できなかった純品のインターフェロ
ンが得られることになる精製工程に使用することができ
る。

発明の開示 本発明によれば、α型インターフェロンに対して特異性
があることを特徴とする雑種細胞系によって産生された
モノクローナル抗体が提供される。

本発明に係るモノクローナル抗体の特長は次の通りであ
る。

人間のα型インターフェロンに対して特異性を持ってい
ること。

ＩｇＧ又はＩｇＭタイプの免疫グロブリン分子であるこ
と。

マウス、ラット、ヒト、モルモット、ウサギからなるグ
ループから選んだ動物の組織に由来する雑種細胞によっ
て産生されたものであること。

α型インターフェロンを精製するための処理において使
用されるものであること。

α型インターフェロンを免疫吸着によって精製処理する
際に使用されるものであること。

α型インターフェロンの免疫学的定量において使用され
るものであること。

発明を実施するための最良の形態 本発明を下記の実験結果によって説明するが、これらは
例示であって、本発明がこれらに限定されるものではな
い。実験の一般的概要次いで使用した方法の詳細な説明
を示す。

マウスとラットから成るグループを、完全フロイントア
ジュバントに乳濁化されたリンパ芽球様インターフェロ
ンを用いて２週間の間隔をあけて免疫化させる。ｌｏｇ
₁₀３．７の力価（２００のインターフェロンの５０％を
中和した血清の希釈物）を有するマウスを融合のために
選ぶ。免疫と融合の詳細は以下に述べる。

抗インターフェロン活性を示しそうな複数個の培養物の
中の３つ（３，５，１３）を軟寒天培地で後述するよう
に再クロン化し、それぞれ４８のクロンを取り出し、２
ｍの培養物で培養する。培養浮遊物は、逆プラーク定
量法（スポットテスト）を用いて分泌されるマウスの免
疫グロブリンの存在とＩＮＡＳ₅₀定量法（アサートンと
バークJ.gen Virol 29 297-304(1975)）で抗インターフ
ェロン活性とを試験した。結果は、他の多くの定量結果
と同じく、培養浮遊物によるインターフェロンの中和レ
ベルは、丁度検定の感度限界（時には越えることもあ
る）であることがはっきり示された。ＮＫ２／１３の陽
性クロンの選別の大事な段階で、逆プラーク定量法は最
も重要である。

抗インターフェロン活性は実際に免疫グロブリンによる
ものであることを確認し、又免疫グロブリンのクラスを
決定するため、¹⁴Ｃ−リジンを選んだクロンによって分
泌されるタンパク質中に入れ、そして還元状態で細胞外
培地をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）で分析した。それぞれの場合で２つの主要なバ
ンドだけが観察され、１つは免疫グロブリンのＨ鎖
（γ，ＮＫ２／１３．３５；μ，ＮＫ２／１３．３６）
と同じ移動度であり、もう１つは目印としてつけられた
免疫グロブリンのＬ鎖（ＮＳＩ）と同じように移動し
た。

クロンＮＫ２／１３．３５を再クロン化し、中和定量で
陽性が最も強かったサブクロン（ＮＫ２／１３．３５．
６）を大量培養した後、長期保存のために液体窒素で凍
結した。このクロンも¹⁴Ｃ−リジンの存在下で培養し、
放射性の分泌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た。２つの主要なバンドが観察でき、１つは免疫グロブ
リンのγ鎖と同じ移動度であり、もう１つはＮＳＩのＬ
鎖より若干低い移動度であった。ＮＳＩのＬ鎖に該当す
るバンドは検出されず、クロンＮＫ２／１３．３５．６
が抗体に特異的なＨ鎖とＬ鎖だけを産生することを示し
ていた。

通常は陽性であるＮＫ２／１３．３５．６の培養浮遊物
は、ずっと後に説明するインターフェロン中和定量法を
用い、インターフェロン活性を精々対照値の２５％に減
らせるぐらいのものである。従って、定量法に対する変
更が幾つか試みられた。限外過（アミコンＸＭ５０）
又は硫酸アンモニウム沈殿法による培養浮遊物の１０〜
２０倍の濃縮は増殖性を増大させたが、陽性と陰性の浮
遊物の差異がいつもはっきりしていた訳ではなかった。
しかし、実験結果は抗インターフェロン活性が、５０％
の飽和硫酸アンモニウムで沈殿した高分子量（ＭＷ）成
分と関連があるということを確かに示した。我々は、異
なる培養物からの混合浮遊物に相乗作用が働くというこ
とも探求したが、検出することはできなかった。このよ
うな作用は２つの中和しないモノクローナル抗体を混合
することにより生じるかもしれないが、それぞれの抗体
だけを検出することはできないであろう。同様な現象
は、細胞表面の抗原に対するモノクローナル抗体の研究
においても観察された。定量に対するより好適な修正は
（担体マウス免疫グロブリンと抗マウス免疫グロブリン
抗血清の添加によって）インターフェロン−抗インター
フェロン複合体が除去される間接免疫沈殿（ＩＩＰ）操
作（下記参照）を導入したことである。

定量においてより高濃度の免疫グロブリンが試験される
ように、ＮＫ２腫瘍を持ったマウスの血清から調製され
た精製ＩｇＧ分画を使用した。（マウスで培養されるＮ
Ｋ２融合物からの唯一のクロンは、ＮＫ２／１３．３
５．６なので、ＮＫ２と略される。）インターフェロン
は、抗体−抗原複合体を除去した後、定量のために希釈
するので、定量の中和部分からの抗体−抗原複合体の形
成物の分離にはかなり高濃度のインターフェロンを使用
した。このことは、定量の精度を非常に高めた。その理
由は、インターフェロンの定量のために試料の希釈率を
変えることによって、我々はいつも投与−応答曲線の中
央付近で研究ができたからである。このことは、中和定
量法においては不可能なことである。

ＩＩＰ定量法を使用して、我々は、約９０μｇｍ^-1の
抗体濃度で、９０％［６９６／７２０ Ｕ（ＭＲＣ標準
調製品６９／１９と関連して定められた標準調査単
位）］以上の投与インターフェロンを除去するのが可能
であることがわかった。

ここで使用した方法の詳細な説明は、下記の通りであ
る。

マウス接種の第１組に免疫原として使用したインターフ
ェロンは、ヒトのリンパ芽球様インターフェロン［Ｈｕ
ＩＦＮ−α（Ｌｙ）］である。このインターフェロン
は、酪酸ナトリウムで前処理した後、セイダイウイルス
で誘発されたナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞中に産生
されたものである。次にこのインターフェロンを硫酸ア
ンモニウムで沈殿させて濃縮すると、２×１０⁵標準調
査単位／ｍのインターフェロンを含み、５．３×１０
⁵標準調査単位／mgタンパク質の比活性を有する生成物
ができた。この物質は、接種の第１組用の免疫原として
用いた。マウス接種の第２組用の免疫原は、多少精製さ
れたＨｕＩＦＮ−α（Ｌｙ）であった。この物質は上述
したように調製され、免疫クロマトグラフイで多少精製
した。２つのバッチを用い、１つは最初の免疫のためで
あり、７．２×１０⁶標準調査単位／ｍを含み、２．
４×１０⁷単位／mgタンパク質の比活性を有するもの、
もう一つは最後の静脈接種（６０２／１０）のためであ
り、６．０×１０⁶標準調査単位／ｍを含み、９．３
×１０⁷単位／mgタンパク質の比活性を有するものであ
った。

６匹のＢａＣｌｂ／ｃ マウス（雌、１８〜２２ｇ）か
らなる１グループと３匹のラットからなる１グループに
注射をした。マウスには、完全なフロイントのアジュバ
ントに乳濁化された０．１６ｍ溶液中約３×１０⁴単
位のインターフェロンを２週間に１回ずつ腹腔内に注射
する（第１組）か０．１６ｍ溶液中約１０⁶単位のイ
ンターフェロンを１週間に１回ずつ注射し（第２組）、
それから２週間の間隔をあけ、１２週に亘って不完全な
フロイントのアジュバントに乳濁化されたインターフェ
ロンを同様に注射投与した。ラットには、足裏（の皮膚
内）と後脚（の筋肉内）又は多くの皮下部位に注射をし
た。完全なフロイントのアジュバント（総容量０．６ｍ
）に乳濁化された約１０⁶単位のインターフェロンを
２週間程の間隔をあけて、ラットに注射した。マウスと
ラットの尾の静脈から採血し、その後、残留インターフ
ェロン力価を定量する前に、血清の０．５ｌｏｇ₁₀ずつ
の希釈物を１０単位のリンパ芽球様インターフェロンと
一緒に３７℃で１時間培養することによって、インター
フェロンに対する抗体を産生させた。抗インターフェロ
ン力価は、インターフェロン力価を５０％減少させる血
清の希釈率の逆数と定めた。

インターフェロンは、次のウイルスＰＮＡ合成へのイン
ターフェロン前処理の効果が測定される核酸合成阻害
（ＩＮＡＳ）法によって常法通り定量した。定量に使用
した細胞は、ウシの鼻甲介細胞、ネコの肺細胞、ＥＢｔ
ｒ細胞、数株のヒトの繊維芽細胞、Ｌ６／ｌラット細
胞、Ｌ−９２９マウス細胞、マジン−ダービィ(Madin-D
erby)種の牛の腎臓（ＭＤＢＫ）である。幾つかの実験
では、インターフェロンを細胞変性効果（ｃ．ｐ．ｅ）
による減少法、産生減少法、プラーク減少法によっても
定量した。全てのヒトのインターフェロン力価は、Ｈｕ
ＩＦＮ−α標準調査品(reference researchstandard)６
９／１９を用いた標準調査単位(reference research un
it)で表記する。

マウスの２グループとラットの１グループを２通りの異
なったリンパ芽球様インターフェロン調合物で免疫化さ
せた。血清を試験することによって、インターフェロン
は両方の種において免疫原性があることが明らかになっ
た。ラットにおいて、最初の応答の後、短い第２の応答
が現われた。休止期間の後は抗体レベルを増加させるこ
とはできなかった。ラットは、融合には１匹も使用しな
かった。マウスの応答はマウス毎に異ったが、力価は通
常プラトーに達するまで増加し、更に免疫化させても殆
んど影響がなかった。応答の顕著な変化は、異なるマウ
ス間で見られた。粗製又は多少精製したインターフェロ
ンを免疫原として使用したときの抗インターフェロン力
価には差異が全く見られなかった。

それぞれのグループの中で、最も高い血清抗インターフ
ェロン力価を持ったマウスから得た脾臓を融合のために
使用した。

これらのマウスには、静脈内に１×１０⁵単位のインタ
ーフェロンを（第１組に）又は２．２×１０⁶単位のイ
ンターフェロンを（第２組に）注射し、４日後にマウス
から採血し、脾臓をＮＳＩ骨髄腫細胞との融合のために
取り出した。融合の後、細胞を４８個の２ｍ培地（２
４ウエール，リンブロ(Linbro)プレート使用）で培養
し、雑種細胞を選び出して上述したようにクロン化す
る。融合の後１乃至３週間、４８ウエールの全てで雑種
細胞の生長が見られ、培養浮遊物の抗インターフェロン
活性の定量を行った。

雑種細胞からの浮遊液の抗インターフェロン活性を直
接、又は免疫沈殿（ＩＩＰ）法により間接的に定量し
た。直接法では、浮遊液（０．５ｍ）を等量のダルベ
ツコの修正イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's
medium.EMEM)と混合した。２０％の胎児の牛血清（ギ
ブコービオカルト）は、約２単位のＨｕＩＦＮ−α（Ｌ
ｙ）を含んでいた。３７℃で１時間培養した後、２つの
同じ培養物とするため小さなガラスびん（直径１cm）２
×０．５ｍ容量を使用して、浮遊液のＨＦＦ細胞にあ
る残留インターフェロンをＩＮＡＳ定量法で定量した。
このインターフェロンの投与は、ウイルスＲＮＡの合成
を５０％低下させる。なお、１ＨＦＦインターフェロン
単位は、２標準調査単位(reference research unit)に
相当する。他の細胞系を定量のために使用したとき、イ
ンターフェロンの量は、それらの細胞のウイルスＲＮＡ
合成を５０％低下させるように調節した。抗インターフ
ェロン活性は、³Ｈ−ウリジンの取り込みの段階で増加
が見られる（ウイルスＲＮＡ合成に因るが、それ以上に
インターフェロン自体に因る）。続いてＩＩＰ定量法に
よる操作を行い、浮遊液の希釈物、マウス腹水液又はＰ
ＢＳ（１０μ）中のＩｇＧを約７２０単位のＨｕＩＦ
Ｎ−α（１０μ）と一緒にして３７℃で５時間培養し
た。抗原−抗体の複合体は、担体として５μの正常マ
ウスの血清を加え、更に（抗体を多少過剰に）７５μ
のヒツジ マウスの免疫グロブリン抗血清を加えること
によって沈殿した。３７℃で３０分間そして４℃で１６
時間培養した後、抗体−抗原沈殿物を取り除くため８０
００ｇで５分間試料を遠心分離し、次に浮遊物のＥＦＦ
細胞にある残留インターフェロン量をＩＮＡＳ法で定量
した。

抗インターフェロン活性は、直接法を用いて最初に調べ
た。試験では先ず、無関係の抗原を注射したマウスの脾
臓細胞を用い、その細胞の融合物の浮遊物であって一連
の番号付けした試料を定量することによって、微量の抗
インターフェロンを検出することができるかどうかを調
べた。融合に使用するマウスから得た血清の希釈物を用
いた。その結果として、マウス血清の1/5000倍までの希
釈の効果は³Ｈ−ウリジンの取り込みの増加によって検
出することができるということがわかった。無関係な浮
遊液は定量に少ししか影響を与えず、恐らくウイルスＲ
ＮＡ合成への非特異的な作用のために、見掛け上インタ
ーフェロンの抗ウイルス作用を増加させただけであっ
た。抗インターフェロン抗体を持つマウスから得た雑種
細胞の浮遊液を試験したとき、両方の組の数個の培養物
は低レベルの活性を示した。第２組の定量において、２
週間に亘って集めた培養液を定量したとき、１つの培養
物（ウエール番号１３）のみが活発に増殖していた。こ
の培養物であっても、抗ウイルス作用は非常に小さく、
放射能はウイルスコントロールの３％以下だけ増加し
た。幾つかの培養物（例えばウエール番号６）では、イ
ンターフェロン自体によって又は恐らく培地にある非特
異的にウイルスＲＮＡ合成を阻害する物質によって、３
％以下の放射能の取り込みの減少が見られた。この作用
を除去するため、以降の定量において全ての放射能は対
応するウイルスコントロールの割合で表示した。即ちイ
ンターフェロンと新培地の混合物ではなく、培養液と新
培地の混合物を培養した後の放射能である。低レベルの
抗インターフェロン活性を示した培養物からの細胞を軟
寒天培地でクロン化した後、抗インターフェロン活性を
示す多数のクロンを分離した。この活性は、ヒトの細胞
又は牛の鼻甲介細胞を定量したとき、ヒトのα型インタ
ーフェロン（白血球インターフェロン）に対して現わ
れ、またウイルス合成を常用のＩＮＡＳ法だけでなく、
ｃ．ｐ．ｅ．法、産生減少法又はプラーク形成法によっ
て測定したときにも現われた。培養液は、マウス又はラ
ット細胞中のウイルス生成若しくは同種細胞でのマウス
又はラットインターフェロンの作用には影響を与えなか
った。しかし、この見掛け上の抗インターフェロン活性
を示す大多数のクロンは、検出できるような量のＩｇＧ
を分泌せず、抗インターフェロン作用は、常に抗インタ
ーフェロン抗体に因るというわけではなく、時には他の
未確認の要因にも因るのだということが結論づけられ
た。最初の融合から得られたクロンは、抗インターフェ
ロン作用を示したクロンであって実際にＩｇＧを産生し
たものがなかったので棄てた。そして、同様の結果は、
第２の融合から得られたクロンによっても見られたので
あるが、マウス免疫グロブリンが分泌されているかどう
かを調べるための逆プラーク定量法を使用することによ
って、免疫グロブリンを分泌しているクロンを同定する
ことができた。このようにして、ウエール番号１３から
のクロン、ＮＫ２と呼ぶクロン３５、サブクロン６（ク
ロン１３．３５．６）を分離した。ＮＫ２細胞は、¹⁴Ｃ
−リジンを含む培地で培養し、培養浮遊物をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。乾燥ゲル
の放射線写真は、ＮＫ２細胞の主要な産生物は、Ｈ鎖の
移動度がγ鎖と同じであり、Ｌ鎖の移動度がＸ６３のＬ
鎖より若干大きい免疫グロブリンであることを示した。
ＮＫ２浮遊物には、ＮＫＩ親種骨髄腫によって産生され
たＸ６′３Ｌ鎖の痕跡すら検出されなかった。

第２回の融合から得たウエール番号１３の細胞は、２回
クロン化され、抗インターフェロン活性を示すクロンを
産生した。この活性は、クロンが分泌したＩｇＧによっ
ても現われ、容易にＩＩＰ抗インターフェロン定量法で
検出された。浮遊液に残留している添加インターフェロ
ンの割合で測定される中和程度を免疫グロブリン濃度に
対してプロットしたとき、中和曲線は直接インターフェ
ロン定量法で得られたものに非常に似ていた。直接法に
よる場合よりも高濃度の免疫グロブリンをより小容量で
使用することができ、またより高感度の試験であったた
め、間接試験は、直接法より明らかに満足するべきもの
であった。加えて、間接試験では、浮遊液に残留してい
るインターフェロン量を直接滴定し、そして中和程度は
ウイルスＲＮＡ合成を５０％阻害する希釈率を比較する
ことによって予想された。しかし、直接試験では、中和
の効果としてウイルスＲＮＡ合成量を増加させ、Ｓ字状
の投与−応答曲線を描き、極端な場合インターフェロン
力価に大きさ差異があってもウイルス合成量には小さな
差異しか生じない。このように、間接定量法には、２度
ずつ定量する０．５ｌｏｇ毎の５つの希釈物を使用して
インターフェロン調製物の力価を決定するが、直接定量
法では、１つの希釈物だけを２度ずつ定量する。従っ
て、間接定量法の方が当然より正確であることが明らか
である。

抗インターフェロン抗体は、異なるインターフェロンの
特質を明らかにし、マウスとヒトのインターフェロンを
精製するのに役立つことがわかった。しかし、その用途
は、最近まで不純なインターフェロン調製物が、動物の
免疫化に利用できただけということとこのようにして得
た抗血清は、主としてインターフェロン調製物中の汚染
物質に対して用いていたということにより、限られてい
たものであった。白血球及びリンパ芽球様インターフェ
ロンが均質に精製されるようになったことにより、精製
インターフェロンをより高い特異性の抗血清を得るため
に免疫原として使用することができ得るようになった。
しかし、家畜の免疫化用の現存のインターフェロンで
は、従来の抗血清を大量生産することが必要であった。
モノクローナル抗体技術は、小さな実験動物を免疫化す
るのに小量の不純インターフェロンを使用したり、非常
に高い特異性と（恐らく）高い結合能力を有する抗体を
大量に産生するクロンを選んだりして、これらの問題を
回避しなければならない。免疫吸着カラム用に十分なＩ
ｇＧを調製するため、ＮＫ２細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス
に皮下注射し（１マウス当り１０⁷細胞）、腫瘍ができ
たとき血清試料を集めてプールした。ＩｇＧを１８ｍ
の血清のプールから硫酸アンモニウム沈殿法とＤＥＡＥ
−イオン交換クロマトグラフィによって精製した。精製
ＮＫ２ＩｇＧ（１４mg）は１ｍのＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース（ファーマシア）と結合させ、免疫吸着剤とし
て試験した。結果は、ＮＫ２−セファロースの０．５ｍ
カラムに一回通過させるだけで、インターフェロン
（１．６×１０⁶単位／mg）の多少精製された調製物が
優に１００倍以上も精製されたことが示された。（使用
したインターフェロンの活性と比活性は提供者によって
提示され、別個に測定されたものではなかった。）タン
パク質濃度の正確な測定には不充分な材料しか利用でき
なかったのであり、そのため、ＮＫ２−セファロースカ
ラム（“ＩＦ−Ａ”）に一回通過させた後のインターフ
ェロン純度を知る代わりの方法として、アリコート(ali
quot)を放射性同位元素¹²⁵Ｉによって標識化を行い、そ
れをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

カラム（ＩＦ−Ａ）に保持された物質が実際ＮＫ２−セ
ファロースに確かに特異的に結合していることを示すた
めに、我々は同じカラムに２度目の通過をさせて¹²⁵Ｉ
−ＩＦ−Ａを再精製した。この時点で平均分子量１８，
０００のバンドは特異的に保持されていて、その後カラ
ムから溶離し、この段階でこの物質が純粋であることを
示唆していた。白血球インターフェロン成分の見掛けの
平均分子量が１７，５００か１８，０００であることが
あちらこちらで報告されていた。

リンパ芽球様インターフェロンを精製するＮＫ２−セフ
ァロースのより厳しい性能試験として、刺激を与えたナ
マルバ細胞から得られた細胞外培地の粗製試料を０．５
ｍカラムに対して使った。結果は、１回の操作で約
５，０００倍に精製されることを示された。我々は、ま
だこの物質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べてはいない
が、比活性はＩＦ−Ａによる値（１．２×１０⁸単位／m
g）と大体同じ位である。

上述した実験結果は、ＮＫ２によって産生されたモノク
ローナル抗体がヒトのリンパ芽球様インターフェロン精
製用の非常に有用な試剤であることをはっきり証明し
た。抗体は転移性腫瘍の産生物であり、また腫瘍を持っ
たマウスの血清から容易に精製できるので、免疫原とし
てのインターフェロンを更に必要としないで出来るＮＫ
２抗体の量には限りがないのである。故に、ここに述べ
た実験記録を、インターフェロンの大量精製のために容
易に規模を拡大することができる。このモノクローナル
抗体の重要な利点というのは、この精製法が、ＮＫ２抗
原決定基を持っていさえすれば、ヒトの白血球、大腸菌
由来のインターフェロン、実際ヒトインターフェロンの
他のどんな供給源からのものでも同様に適用できること
である。

本発明に係るモノクローナル抗体の他の用途は、α型イ
ンターフェロンの免疫定量においてである。このような
定量法の１つであるイムノラジオメトリックアセイ(imm
uno radiometric assay)では、ヒツジ抗インターフェロ
ン抗体がポリスチレンと付着し、試料中のインターフェ
ロンを固相に固定するのに役立つ。それから、固定イン
ターフェロンは、¹²⁵Ｉ−ＮＫ２（モノクローナル抗体
ｕ−ＩＦＮα）を加えた後、固相に固定されたインター
フェロンの総量を測定することによって検出する。我々
は、固相として３種類のポリスチレンを使用した。

(1)３ｍ試験管（ＬＰ３、英国、バンガースヒル、ラ
ッカムＬｔｄ．） (2)９６ウエールマイクロ滴定用トレー（Ｍ２４、英
国、アクスブリッジ、ギブコヨーロッパＬｔｄ．） (3)６．５mmビーズ（英国、フラムリントン、ノーサム
ブリアバイオロジカルズＬｔｄ．） 第１の容器では、全ての試験管を固定¹²⁵Ｉ−ＮＫ２を
測定するために定量した。トレーを使用したときは、そ
れぞれのウエールの底を高温の針金で切り取り、定量の
ためのきれいな試験管に変形した。第３の容器では、ビ
ーズ(beads)を２０個又は６０個のウエールがあるトレ
ー（９３−０４０２、英国、ベイシングストーク、アボ
ット・ラボラトリーズ）で培養した後、定量のために試
験管に移し変えた。培養量は、（試験管に）１ｍか
０．１ｍ、（ウエール）０．１ｍ、（ビーズに）
０．２ｍを使用した。３種類の支持物質は全て満足す
べきものであるが、多数の試料を定量するためには、ビ
ーズの方が便利さの故に好まれた。

ＮＫ２抗体は、硫酸アンモニウム沈殿とＤＥＡＥイオン
交換クロマトグラフィとによって、ＮＫ２腫瘍を持つマ
ウスの血清と腹水液とから精製し、クロラミンＴ法にて
ラベルし、その後セファデックスＧ−５０（ファイン）
カラムで脱塩した。標識化したＩｇＧは、約２Ｃｉ／μ
mole又はＩｇＧ１分子当り¹²⁵Ｉ１原紙位の比活性を持
っていた。

それぞれの定量では、標準曲線をインターフェロン標準
品ＭＲＣ６９／１９又は実験標準品(laboratory standa
rd)を用いて描いた。このような曲線の１つでは、８，
０００単位／ｍのときに固定されていたインターフェ
ロンの総量が最大であり、インターフェロン濃度を１０
⁶単位／ｍまで上げてもそれ以上の増加は観察されな
かった。入力カウントの中で非特異的な結合の割合が少
い（１％以下）ということは、この定量法の重要な特徴
である。

定量の条件は次の通りである。

ＩｇＧを、ヒツジ抗Ｈｕ−ＩＦＮ抗血清（４５０，００
０中和単位／ｍ）から硫酸アンモニウム沈殿法とＤＥ
ＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィで精製し、
ヒツジＩｇＧ（ＰＢＳ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｎ
ａＮ₃溶液中２０μｇ／ｍ）中に４℃１６時間培養す
ることによってＩｇＧをポリスチレンビーズ上に塗布し
た。数百のビーズが塗布され、ＰＢＳ、１０％ウマ血清
（英国、サセックス、クローリィ・ダウン、セラーラ
ブ）、０．１％ＮａＮ₃（ＨＳ培地）溶液で洗った後、
４℃でＨＳ培地に貯蔵した。定量トレー（２０個又は６
０個のウエールがあるアボット製トレー）は、タンパク
質がどこにも付着しないように、ＨＳ培地を用いて４℃
で培養した。インターフェロン試料は、ＨＳ培地で希釈
し、２個の試料（２００μ）を抗体が塗布されたビー
ズに加えた（１ウエール当り１ビーズ）。４℃で４時間
経過後、それぞれデイスペンサとアスピレータを組み合
わせたもの（「ペンタウオッシュ」、アボット）を使っ
て、ビーズを１２ｍのＨＳ培地で洗った。残留培地を
取り除いた後、¹²⁵Ｉ−ＮＫ２（精製ＩｇＧ、４０，０
００cpm）を加え、４℃で１６時間培養した。ビーズを
前と同じようにして洗った後、ガンマカウンタのところ
に運んだ。

このような条件は、インターフェロンの精製過程におけ
る試料の定量が便利なように選んだものである。このよ
うな試料は、略１０³〜１０⁷単位／ｍの値を有し、本
定量法はこのような分画を測定するために我々の研究室
で日常使用しているものである。１０³単位／ｍ以上
を含む溶液は順次希釈してゆき、得られた滴定曲線は標
準曲線と合っていた。

イムノラジオメトリックアセイは、通常の生物学的定量
に比して非常に有利になっている。抗体が塗布されたポ
リスチレンは４℃で貯蔵しておくことができるので、試
料は短時間で定量することができ、且つ結果は定量開始
から２４時間以内に得られるものである。各種定量法の
中で再現性は、イムノラジオメトリックアセイが遥かに
優れている。２，０００単位／ｍの同一溶液を４回測
定した結果では、入力cpmが４７，０００〜５３，００
０cpmに亘るそれぞれの定量で３０６３±３４５cpmの値
を示した。ポリスチレンに塗布するためのＩｇＧ溶液
は、大幅に定量の感度を減少させることなく数回繰り返
して使用することができるので、極少量のヒツジ抗体を
使用する。ヒツジ抗体の質は、定量の成功を左右するよ
うな要素とはなり得ないし、Ｈｕ−ＩＦＮαに対する他
の抗体でも恐らく同じように代替させることができる。
本定量法がモノクローナル抗体ＮＫ２の活性を利用し、
これが培養中の雑種骨髄腫細胞系の産生物であるので、
品質が変化することなく大量に産生させることができ
る。最後に、本定量法は経費が安く（特に、ビーズを除
いて、全てのプラスチック容器は再使用することができ
るため）、且つ自動化して数百の試料を１人が１日で定
量することもできる。

生体液のインターフェロンを定量するためには、定量法
が産生と精製の際におけるインターフェロンよりもずっ
と低レベルのインターフェロン量を検出することができ
なければならない。実施結果は、インターフェロン濃度
が低いとき、固定されたインターフェロンの総量はイン
ターフェロン濃度に比例することを示した。５０単位／
ｍ以上の濃度は容易に測定できることがわかる。

ＮＫ２抗体は、従来法により産生された抗体に対する重
要な進歩である。従来の抗体は、インターフェロン活性
を強く中和するが、インターフェロン分子にある種々の
抗原性部位に対する免疫グロブリン領域から成ってい
る。これらも動物を免疫化するために使用するインター
フェロン調製物に存在する不純物に対する抗体を含み、
このことがインターフェロン精製におけるその用途を制
限していた。それに対して、モノクローナル抗体は、イ
ンターフェロンの生物学的活性に対して高い中和力価を
示さないが、その特異性と雑種骨髄腫を注射したマウス
に抗体を量産させることの容易さの故に多くの利点を有
するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．256（1975）495 〜497Ｐ Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖ ｏｌ．８（1978）429〜436Ｐ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】α型インターフェロンの少なくとも１つの
   抗原決定基に特異的に結合しうることを特徴とする、ネ
   ズミに由来する雑種細胞系によって産生されたモノクロ
   ーナル抗体。
2. 【請求項２】ヒトα型インターフェロンの少なくとも１
   つの抗原決定基に特異的に結合しうる請求の範囲１項記
   載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】ＩｇＧ又はＩｇＭタイプの免疫グロブリン
   分子である請求の範囲１又は２項記載のモノクローナル
   抗体。
4. 【請求項４】α型インターフェロンを精製処理する際に
   使用する請求の範囲１項記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】α型インターフェロンの免疫吸着精製処理
   において使用する請求の範囲１項記載のモノクローナル
   抗体。
6. 【請求項６】α型インターフェロンの免疫定量において
   使用する請求の範囲１項記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】α型インターフェロンの少なくとも１つの
   抗原決定基に特異的に結合しうるネズミに由来する雑種
   細胞系によって産生され、固体支持体と結合したモノク
   ローナル抗体を含む免疫吸着カラムにα型インターフェ
   ロンを含む試料を通過させ、該試料よりα型インターフ
   ェロンを抽出する免疫精製方法。