FI91542B - Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä vastaan - Google Patents

Description

91542

Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä vastaan

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee yleisesti materiaaleja ja me netelmiä käytettäväksi immunologisissa menetelmissä hema-topoieettisten kasvutekijöiden eristämiseksi ja kvantitatiiviseksi toteamiseksi biologisista nesteistä. Erityisesti keksintö koskee uusien hybridoomasolulinjojen solulin-10 jojen A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 tuottamia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti hematopoieettisten kasvutekijöiden kanssa, sekä näiden vasta-aineiden käyttöä hematopoieet-15 tisten kasvutekijöiden eristämisessä affiniteettipuhdis-tusmenetelmillä, määritysmenetelmissä hematopoieettisten kasvutekijöiden toteamiseksi ja näitä kasvutekijöitä tutkittaessa käytettävissä immunologisissa menetelmissä. Vielä tarkemmin sanottuna keksintö koskee monoklonaalisia 20 vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti luonnollisista lähteistä olevan ja yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistetun ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-CSF) kanssa.

Ihmisen verta muodostava (hematopoieettinen) sys-. 25 teemi muodostaa uusia erityyppisiä valkoisia verisoluja (mukaan lukien neutrofiilit, makrofagit ja basofiilit/ syöttösolut), punaisia verisoluja (erytrosyyttejä) sekä hyytymän muodostavia soluja (megakaryosyyttejä/verihiuta-leita). On arvioitu, että keskiarvomiehen hematopoieetti-30 nen systeemi tuottaa granulosyyttejä ja erytrosyyttejä vuosittain luokkaa 4,5 x 1011 olevan määrän, joka on yhtä suuri kuin kokonaisruumiinpainon vuotuinen korvautuminen (Dexter et ai., BioEssays 2 (1985) 154 - 158).

Uskotaan, että pienet määrät tiettyjä hematopoieet-35 sisiä kasvutekijöitä vastaa pienen määrän esikantasoluja • · 2 91542 (progenitor "stem cells") erilaistumisesta moniksi eri verisolulinjoiksi, näiden solulinjojen valtavasta lisääntymisestä sekä näistä solulinjoista peräisin olevien kypsien verisolujen lopullisesta erilaistumisesta. Koska he-5 matopoieettisia kasvutekijöitä esiintyy erittäin pieniä määriä, näiden tekijöiden toteaminen ja identifiointi on perustunut suureen joukkoon määritysmenetelmiä, jotka toistaiseksi kuitenkin erottavat eri tekijät viljeltyihin soluihin kohdistuvien stimuloivien vaikutusten perusteella 10 keinotekoisissa olosuhteissa. Tästä seurauksena on muodostettu suuri määrä nimiä nimeämään paljon pienempää määrää tekijöitä. Esimerkkinä syntyneestä sekaannuksesta termit IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF ja PSF ovat kaikki lyhenteitä, joiden tällä hetkellä uskotaan kuvaavan yhtä ainoaa 15 hiiren hematopoieettista kasvutekijää (Metcalf, Science 229 (1985) 16 - 22).

Yhdistelmä-DNA-menetelmien soveltaminen on tuonut tähän kaaokseen jonkin verran järjestystä. Esimerkiksi erytrosyyttien tuotantoa stimuloivan ihmisen erytropoie-20 tiinin aminohappo- ja DNA-sekvenssit on selvitetty (katso Lin, PCT-hakemusjulkaisu nro 85/02610, joka on julkaistu kesäkuun 20. päivänä, 1985). Yhdistelmä-DNA-menetelmiä on sovellettu myös ihmisen granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloivan tekijän (GM-CSF) ja ihmisen makrofagispesifi-25 siä pesäkkeitä stimuloivan tekijän (CSF-1) cDNA:n eristämisessä [katso Lee et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 4360 - 4364; Wong et ai., Science 228 (1985) 810 -814 ja Kowasaki et ai., Science 230 (1985) 291 - 296].

Ihmisen hematopoieettisen kasvutekijän, jota kutsu-30 taan ihmisen monitehoiseksi pesäkkeitä stimuloivaksi teki-jäksi (hpCSF) tai pluripoietiiniksi, on osoitettu esiinty- 1 · k vän ihmisen rakkosyöpäsolulinjan, joka on nimetty 5637:ksi ja joka on talletettu rajoittavien olosuhteiden alaisena American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 35 Rockville, Maryland, A.T.C.C. -talletusnumerolla HTB-9, • ·

II

3 91542 viljelyväliaineessa. Tästä solulinjasta puhdistetun hpCSF:n on raportoitu stimuloivan monitehoisten kantasolu-jen lisääntymistä ja erilaistumista, jolloin tuotetaan kaikkia verisolujen päätyyppejä, ihmisen luuytimen kanta-5 soluja käyttävissä määritysmenetelmissä [Welte et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526 - 1530].

Alustavat tutkimukset osoittavat, että hpCSF:ksi identifioidulla tekijällä on ensisijaisesti granulosyytti-pesäkkeitä stimuloiva vaikutus ensimmäisten seitsemän päi-10 vän aikana ihmisen CFU-GM-määritysmenetelmässä.

Myös toinen tekijä, joka on nimetty ihmisen CSF-β-.ksi, on eristetty ihmisen rakkosyöpäsolulinjasta 5637, ja sen on kuvattu kilpailevan hiiren lz5I-leimatun granulo-syyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (G-CSF) kanssa sitou-15 tumisesta WEHI-3B D* -soluihin annos-vaste -suhteessa, joka on identtinen leimaamattoman hiiren G-CSF:n annos-vaste -suhteen kanssa [Nicola et ai., Nature 314 (1985) 625-628]. Aikaisemmin oli raportoitu, että tämä annos-vaste -suhde on ainutlaatuinen leimaamattomalle hiiren G-CSF:lie ja 20 ettei sellaisilla tekijöillä kuin M-CSF, GM-CSF tai 11-3 ollut tätä aktiivisuutta [Nicola et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei (USA) 81 (1984) 3765 - 3769; katso myös Metcalf et ai., Leukemia Research (1985) Voi 9, nro 5, s. 521 - 527]. CSF-8 ja G-CSF ovat ainutlaatuisia CSF:iä myös siinä, että 25 ne molemmat pystyvät suuressa määrin indusoimaan WEHI-3B D* •« -solujen erilaistumista [Nicola et ai., Immunology Today 5 (1984) 76 - 80]. Korkeina pitoisuuksina G-CSF stimuloi granulosyytti-makrofagi-sekapesäkkeitä muodostavia soluja (mixed granulocyte-macrophage colonyforming cells) [Nico-30 la et al., (1984), yllä], mikä on yhtäpitävää alustavien tulosten kanssa, jotka osoittavat, että granulosyyttisiä pesäkkeitä, monosyyttisiä pesäkkeitä, granulosyyttis-mo-nosyyttisiä sekapesäkkeitä sekä eosinofiilisia pesäkkeitä (CFU-GEMM) ilmestyy, kun ihmisen luuydinviljelmiä on inku-35 boitu 14 päivää hpCSF:n kanssa. CSF-B:n on myös kuvattu • · · 4 91542 stimuloivan neutrofiilisten granulosyyttipesäkkeiden muodostumista hiiren luuydinsoluja käyttävissä määritysmenetelmissä, mikä on ominaisuus, jota on pidetty kriteeriona tekijän identifioimiseksi G-CSF:ksi. Näiden saman kaltai-5 suuksien perusteella ihmisen CSF-β on identifioitu G-CSF:n (granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä) kanssa [katso Nicola et ai., Nature 314 (1985) 625 - 628].

Yhteisten ominaisuuksiensa perusteella vaikuttaa siltä, että Nicola et ai.'n, yllä, ihmisen CSF-8 ja Welte 10 et ai.'n, yllä, hpCSF ovat sama tekijä, johon voitaisiin asianmukaisesti viitata ihmisen monitehoisena granulosyyttipesäkkeitä stimuloivana tekijänä (hpG-CSF).

Yhdessä omistetussa ja samanaikaisesti käsittelyn alaisena olevassa US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanume-15 ro 768 959: "Production of Pluripotent Granylocyte Colony--Stimulating Factor", joka on jätetty elokuun 23. päivänä, 1985, ja joka on liitetty tähän viitteeksi, julkaistaan uudet, yhdistelmä-DNA-menetelmillä tuotetut polypeptidit, jotka sisältävät osan ihmisen monitehoisen granulosyytti-20 pesäkkeitä stimuloivan tekijän primaarirakenteen konfor-maatiosta tai sen kokonaan ja joilla on yksi tai useampia ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän biologisia ominaisuuksia. Hakemusjulkaisussa julkaistaan myös näitä polypeptidejä koodaavat DNA-sekvens-25 sit, näitä polypeptidejä koodaavat transformoidut isäntä- • l solut sekä menetelmät näiden tekijöiden syntetisoimiseksi yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen.

Keksinnön taustan kannalta mielenkiintoista on tämänhetkinen tutkimus, joka kohdistuu hybridoomamenetelmiin 30 valittua antigeenistä ainetta vastaan muodostettuja, erittäin spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien •« kasvainsolulinjojen tuottamiseksi. Menetelmät monoklonaa-listen vasta-aineiden tuottamiseksi ovat yleisesti hyvin tunnettuja alalla. Tyypillisiä kuvauksia näistä menetel-35 mistä voidaan löytää julkaisuista Wands, J.R. ja Zurawski,

♦ · I

II

5 91542 V.R., Gastroenterology 80 (1981) 225; Marshak-Rothstein et ai., J. Immunol. 122 (1979) 2491 sekä Oi, V.T. ja Herzen-berg, L.A., "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. ja Shiigi, S.M. (toim.): Selected Methods in Cellular 5 Immunology, San Francisco, W.H. Freeman Publishing, 1979, ja Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39 (1980) 285 - 308. Lyhyesti kuvattuna lymfosyytit, jotka on otettu mielenkiinnon kohteena olevalla antigeenillä aikaisemmin injektoidun eläimen pernasta, 10 indusoidaan fuusioitumaan myeloomasolujen kanssa polyety-leeniglykolin läsnä ollessa. Fuusiosta syntyy tuhansia "hybridi" -myeloomasoluja. Jokaisen "hybridooma"-soluviljelmän supernatantti testataan halutun vasta-aineaktiivi-suuden suhteen. Kun tällainen aktiivisuus löytyy yhden 15 soluviljelmän supernatantista, se kloonataan rajoittavia laimennuksia käyttäen, ja kloonit määritetään yksittäin supernatantin aktiivisuuden suhteen.

Hybridoomamenetelmillä kehitettyjen monoklonaalis-ten vasta-aineiden immunologisten ominaisuuksien erittäin 20 spesifisestä luonteesta johtuen niitä on ehdotettu käytettäväksi diagnostisina reagensseina, terapeuttisina aineina ja reagensseina puhdistamattomista raaka-ainelähteistä peräisin olevien, spesifisesti ristiin reagoivien antigeenisten proteiinien affiniteettipuhdistuksessa [katso 25 esim. Trends in Biotechnology, Voi 3, nro 7 (heinäkuu 1985) ja US-patenttijulkaisut nro:t 4 465 624, 4 514 505 ja 4 514 507] .

Vaikka onkin olemassa huomattava tarve spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista käytettäväksi hematopoi-30 eettisten kasvutekijöiden, kuten ihmisen monitehoisen gra-nulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän, toteamiseksi, eristämiseksi, puhdistamiseksi ja tutkimiseksi, raportteja hybridoomamenetelmien onnistuneesta käytöstä hpG-CSF:ää vastaan muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden 35 valmistamiseksi ei ole ollut.

91542 6

Lyhyt yhteenveto Tämä keksintö antaa käyttöön ensimmäistä kertaa hybridoomasolulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisesti immunoreaktiivisia ih-5 misen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän kanssa antigeeni/vasta-aine-reaktiossa. Niinpä tämä keksintö koskee uusia hiiriperäisiä hybridoomasolu-linjoja A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-10 8962, joista kukin tuottaa viljelmänsä supernatantin kom ponenttina monoklonaalista vasta-ainetta, joka spesifisesti reagoi hpG-CSF:n kanssa. Hybridoomasolulinjat A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 on 15 talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852.

Tämän keksinnön käytännön mukaisesti hybridikas-vainsolulinja tuotetaan käyttämällä normaalia immunologista menetelmää, kuten julkaisuissa Oi ja Herzenberg, "Immu-20 noglobulin Producing Hybrid", yllä, ja Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39 (1980) 285 - 308, on kuvattu. Luonnollisella hpG-CSF:llä hyperimmunisoitujen hiirien pernasolut fuusioidaan hiiren myeloo-masolulinjan kanssa polyetyleeniglykolin läsnäollessa. Jo-,, 25 kaisen "hybridooma" -soluviljelmän supernatantti testataan halutun vasta-aineaktiivisuuden suhteen. Valikoitu hybri-doomasolu kloonataan sellaisen solulinjan kasvattamiseksi, joka tuottaa kasvatussupernatanttiinsa vasta-ainetta, jolla on erittäin spesifinen anti-hpG-CSF-aktiivisuus.

30 Tämä keksintö koskee myös monoklonaalisia vasta- aineita, joille on tunnusomaista, että ne pystyvät spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-CSF) kanssa antigeeni/-vasta-aine-reaktiossa ja että niitä voidaan tuottaa vilje-35 1emällä solulinjaa A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, »

II

7 91542 A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 tai A.T.C.C. HB-8962.

Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää immunologisissa menetelmissä hpG-CSF:n 5 (samoin kuin muiden hematopoieettisten kasvutekijöiden, joissa saattaa esiintyä samanlaisia tai samantyyppisiä epitooppeja) affiniteettipuhdistamiseksi ja eristämiseksi luonnollisista tai yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistetuista lähdemateriaaleista. Tällaisessa menetelmässä va-10 littu vasta-aine kiinnitettäisiin paikoilleen (esim. pylvääseen) ja lähdemateriaali saatettaisiin kosketukseen paikoilleen kiinnitetyn vasta-aineen kanssa. hpG-CSF tai antigeenisesti sitä läheisesti muistuttava materiaali sitoutuisi vasta-aineeseen, minkä jälkeen se voitaisiin elu-15 oida paikoilleen kiinnitetystä vasta-aineesta erittäin puhtaassa muodossa. Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan myös käyttää yksin tai yhdessä toistensa tai poly-klonaalisten vasta-aineiden kanssa immunologisissa menetelmissä (RIA:t, ELISA:t ja vastaavat) hpG-CSF:n toteami-20 seksi kvantitatiivisesti. Muut tämän keksinnön piirteet käyvät ilmi tarkasteltaessa seuraavaa yksityiskohtaista kuvausta.

Yksityiskohtainen kuvaus

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön käytännön 25 suoritusta tuotettaessa lukuisia hybridoomasolulinjoja mukaan lukien A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 hpG-CSF:ää vastaan muodostettuja vasta-aineita eristettäessä ja monoklonaalisten vasta-aineiden monista-30 misessa ja karakterisoinnissa.

Tarkemmin sanottuna, esimerkki 1 koskee hiiri-isännän stimulointia tuottamaan polyklonaalisia seerumin vasta-aineita hpG-CSF:ää vastaan, pernasolujen fuusiota mye-loomasolujen kanssa sekä hybridoomasolujen seulontaa, 35 kloonausta ja kasvatusta sekä monoklonaalisen vasta-aineen 91542 8 eristämistä. Esimerkki 2 koskee näin tuotettujen monoklo-naalisten vasta-aineiden karakterisointia ELISA- ja RIA-määritysmenetelmillä sekä kompetetiivinen inhibitio- ja neutralointimääritysmenetelmillä samoin kuin monoklonaali-5 sen vasta-aineen saantojen monistamista askites-menetel-mällä. Esimerkki 3 kuvaa menetelmiä hpG-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi käyttämällä keksinnön mukaisia mono-klonaalisia vasta-aineita. Esimerkki 4 kuvaa menetelmiä hpG-CSF:n toteamiseksi kvantitatiivisesti käyttämällä kek-10 sinnön mukaisia vasta-aineita käyttäviä määritysmenetelmiä.

Esimerkki 1 A. Polyklonaalisen seerumin tuottaminen

Kukin BALB/C-hiiri injektoitiin ihmisen rakkosyöpä-15 solulinjasta nro 5637 (alaklooni 1A6) HPLC:llä puhdistetulla hpG-CSF:llä US-patenttihakemusjulkaisun sarjanumero 768 959 esimerkin 1(b) menetelmien mukaisesti. Materiaali puhdistettiin C4-HPLC-pylväällä yli 85-%:iseen puhtauteen ja sen pitoisuus oli noin 60 pg/ml liuoksessa, joka sisäl-20 si 50 % propanolia ja 100 mmpl/l ammoniumasetaattia (pH 7). Kullekin 10 hiirelle annettiin aluksi useita ihonalaisia injektioita, jotka yhteensä sisälsivät noin 0,1 ml rokotettavaa ainetta (7,2 pg hpG-CSF:ää hiirtä kohti) ja jotka muodostuivat 1,2 mlrsta hpG-CSF-liuosta, joka oli 25 konsentroitu 0,6 ml:ksi nopealla vakuumikonsentroinnilla ja sekoitettu sitten sonikoimalla 0,6 mlraan BACTO-Freund-'s Complete Adjuvant H37 Ra -adjuvanttia (DIFCO 3113-60).

18 päivän kuluttua jokaiselle hiirelle annettiin useita ihonalaisia tehosteinjektioita, jotka yhteensä sisälsivät 30 noin 0,15 ml rokotettavaa ainetta (7,2 pg hpG-CSF:ää hiirtä kohti) ja jotka muodostuivat 1,2 ml:sta hpG-CSF-liuosta, joka oli konsentroitu 0,75 ml:ksi ja sekoitettu 0,75 ml:aan Freund's Incomplete Adjuvant -adjuvanttia (BACTO 0639-60-6, DIFCO).

II

9 91542

Neljän päivän kuluttua hiiristä otettiin verta ja seerumit seulottiin RlA:lla anti-hpG-CSF-vasta-aineiden tuottamisen suhteen. Seerumin määritysmenetelmässä käytetty hpG-CSF sisälsi noin 0,5 ml 80-%:isesti puhdasta hpG-5 CSFtää, joka oli konsentroitu neljä kertaa, pitoisuutena noin 100 pg/ml liuoksessa, joka sisälsi 100 mmol/1 ammo-niumsulfaattia ja 50 % propanolia. 250 μΐ yllä olevaa liuosta konsentroitiin 150 piiksi ja sekoitettiin 5 mitään 50 mmol/1 C03-2/HC03'-puskuria (pH 9,2). Sitten 50 μΐ tätä 10 ainetta pipetoitiin 96-kuoppaisen kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan ja levyä inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja yli yön 4 eC:ssa. Lisäreaktiot estävää yhdistettä ("blokkausyhdiste"), joka sisälsi 5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), inkuboitiin kuopissa 30 minuuttia. Testi-15 seerumi laimennettuna suhteissa 1:5, 1:25, 1:625 ja 1:3125 ja kontrolliseerumi (rokottamaton) laimennettuna suhteissa 1:5 ja 1:125 pipetoitiin kuoppiin, 50 μΐ/kuoppa, ja inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten kuopat pestiin kolme kertaa käyttäen Wash Solution -pesuliuosta 20 [Kirkequard Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, Maryland]. Tämän jälkeen 125l:llä leimattua kanin anti-hiiren IgG-vasta-ainetta lisättiin siten, että saatiin noin 199 000 pulssia/min/50 μΐ/kuoppa, ja inkuboitiin 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten kuopat pestiin viisi ker-25 taa Wash Solution -pesuliuoksella ja niiden radioaktiivisuus määritettiin gammalaskijalla.

21 päivää tehosteinjektion jälkeen viidelle hiirelle, joiden RIAtlla todettiin tuottavan anti-hpG-CSF-vasta-aineita, annettiin kolmas injektio. Hiiret immuni-30 soitiin samalla materiaalilla kuin tehosteinjektiossakin, mutta ne saivat noin 10 pg hpG-CSF:ää hiirtä kohti.

B. Solufuusio

Hybridooman tuottamismenetelmässä rokotettujen hiirten pernat hajotetaan anti-hpG-CSF-vasta-ainetta tuot-35 tavien lymfosyyttien suspendoimiseksi. Nämä pernasolut • 10 91542 fuusioidaan SP2/0-myeloomasolulinjan solujen kanssa hybri-disolujen muodostamiseksi. Perna- ja myeloomasolujen solukalvot fuusioituvat ja aluksi ympäröivät yhteistä sytoplasmaa, jossa on kaksi tai useampia tumia. Useiden päi-5 vien kuluttua solukalvojen fuusiosta tumat fuusioituvat ja pystyvät samanaikaiseen mitoosiin. Kun nämä fuusioituneet solut jakautuvat, vaihteleva määrä molempien fuusioituneiden osapuolien kromosomeja menetetään, kunnes hybridisolu-linjat stabiloituvat. Hypoksantiini-aminopteriini-tymidii-10 ni (HAT) -väliaine estää hybridisäätiön aikana muodostuneiden SP2/0:SP2/0-hybridien tai fuusioitumattomien SP2/0-solujen kasvun, kun taas perna:perna-soluhybridit yleensä kuolevat viljelmässä kahden viikon kuluttua. Siten vain SP2/0:perna-hybridisolut pysyvät elossa viljelmissä.

15 Kolmen päivän kuluttua toisesta tehosterokotukses ta hiiret tapettiin katkaisemalla selkäranka ja valeltiin 70-%:isella etanolilla. Hiirten pernat poistettiin aseptisesti ja laitettiin jäiden päällä olevalle steriilille petrimaljalle, joka sisälsi DMEM-väliainetta (Dulbecco's 20 Modified Eagle's Medium, luettelonumero 320-1885, erä 18K3252, GIBCO) täydennettynä penisilliini G-strepto-mysiiniliuoksella ("lX-liuos"), jota tästä lähtien nimitetään "1XPS"-liuokseksi (luettelonumero 9366, Irvine Scientfic) ja joka sisälsi 100 yksikköä penisilliini G:tä 25 ja 100 pg streptomysiiniä millilitrassa. Pernojen rasvakudos poistettiin, ja pernat pestiin kahdesti DMEM-väliai-neella, joka sisälsi 2XPS:ää (200 yksikköä penisilliini G:tä ja 20 pg streptomysiiniä millilitrassa), ja laitettiin jäiden päällä olevaan steriiliin stomacher-pussiin.

30 Pussiin lisättiin DMEM-2XPS-liuosta. Pernat hajoitettiin stomacher-laitteessa, jonka jälkeen ne suodatettiin nelikerroksisen steriilin harsokankaan läpi 50 ml:n sentrifu-giputkiin. Pussi ja suodattimet pestiin enintään 40 ml:11a DMEM-2XPS-liuosta. Sitten soluja sentrifugoitiin kymmenen 35 minuuttia kierrosnopeudella 1 000 rpm IEC NH-SII -sentri- •

II

11 91542 fugissa (Damon/IEC Division), ja supernatantti imettiin pois varovasti. Sitten solut pestiin kahdesti DMEM-2XPS-liuoksella ja kerran DMEM-väliaineella, jossa ei ollut lisäaineita. Sitten solut suspendoitiin DMEM-väliainee-5 seen.

Myeloomasolut (SP2/0) kasvatettiin HB101-väliaineessa, joka sisälsi lCPS:ää ja 1 % naudan sikiön seerumia (FBS, Irvine Scientific, luettelonumero 3000, eränumero 209608, lämpöinaktivoitu), ja niiden annettiin lisääntyä 10 logaritmisen kasvun vaiheessa kolmen päivän ajan. SP2/0-solut otettiin talteen sentrifugoimalla IEC NH-SII -sent-rifugissa kierrosnopeudella 1 000 rpm kymmenen minuuttia. Solut pestiin DMEM-liuoksella, minkä jälkeen ne suspendoitiin DMEM-liuokseen.

15 Tämän jälkeen pernasolut yhdistettiin myeloomaso- luihin 50 ml:n sentrifugiputkessa suhteessa 4:1, ja seosta sentrifugoitiin kymmenen minuuttia kierrosnopeudella 1 000 rpm, ja supernatantti imettiin pois. Sitten solunappi laitettiin 37 eC:n vesihauteeseen kuvun alle. Polyetyleeni-20 glykoli (MP 1500, M. A. Bioproducts, luettelonumero 17-780Z, eränumero 4J030) sulatettiin ja sekoitettiin sitten tilavuussuhteessa 1:1 DMEM-liuokseen, jolloin saatiin 50-%:inen liuos. Sitten PEG-liuos lisättiin soluihin seuraa-valla menetelmällä. Ensimmäisen minuutin aikana 1,0 ml 50-- 25 %:ista PEG-liuosta lisättiin. Seuraavan minuutin aikana liuosta sekoitettiin varovasti pipetillä, jolla sekoitettiin tasaisesti pyörivällä liikkeellä mutta välttäen koskettamasta putkien seiniä tai pohjaa. Kolmannen minuutin aikana lisättiin 1,0 ml liuosta, joka sisälsi DMEM:tä, 10 30 % FCS:ää ja lXPS:ää. Neljännen minuutin aikana lisättiin taas 1,0 ml samaa liuosta. Viidennen ja kuudennen minuutin aikana lisättiin taas 8,0 ml samaa liuosta. Sitten seos sentrifugoitiin kierrosnopeudella 1 000 rpm 10 minuuttia 35 IEC NH-SII -sentrifugissa. Supernatantti imettiin pois 12 91542 sentrifuglputkesta ja solut suspendoitiin varovasti 100 -150 ml:aan väliaineita, jotka sisälsivät DMEM:ä, 10 % FCS:ää ja lXPSiää. Sitten solususpensiota levitettiin 0,1 ml suspensiota kuoppaa kohti noin 800 kuoppaan kahdeksalla 5 ja puolelle 96-kuoppaisella levyllä, jotka oli etukäteen tasapainotettu C02-inkubaattorissa. Sitten levyt laitettiin takaisin C02-inkubaattoriin, jonka C02-pitoisuus oli noin 7 % 37 °C:ssa.

Yhden päivän kuluttua 100 μΐ HAT-väliainetta 10 DMEMissa, joka sisälsi 10 % FCS:ää, lisättiin jokaiseen kuoppaan. Toisena päivänä jokaisesta kuopasta imettiin 100 μΐ käytettyä väliainetta ja korvattiin 120 pl:lla tuoretta HAT-väliainetta DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCS:ää. Tämä toimenpide toistettiin päivänä 2, päivänä 4, päivänä 7 ja 15 päivänä 11. Päivänä 14 jokaisesta kuopasta poistettiin 100 μΐ käytettyä väliainetta ja korvattiin 100 pl:lla HT-väli-ainetta, joka sisälsi 1,36 mg/dl hypoksantiinia ja 0,76 mg/dl tymidiiniä. Toimenpide toistettiin päivänä 18, päivänä 22 ja päivänä 26. Päivänä 28 viljelmiin vaihdettiin 20 lopullinen väliaine, joka sisälsi DMEM:ä ja 10 % FCS:ää.

Tämän jälkeen viljelmiin vaihdettiin tämä lopullinen väliaine kahdesti viikossa. Päivänä 17 kuopat seulottiin immu-noglobuliinin tuottamisen suhteen käyttäen anti-hiiren IgG -vasta-ainetta. RIA- ja ELISA-määritykset osoittivat, että 25 800 kuopasta noin 260 oli merkittävästi positiivisia hii ren IgG:n suhteen.

Esimerkki 2 A. Monoklonaalisten vasta-aineiden alkukarakteri- sointi 30 ELISA-määritys suoritettiin anti-hpG-CSF-vasta-ai- neita tuottavien kloonien toteamiseksi. 96-kuoppaisten levyjen kuopat päällystettiin pipetoimalla niihin noin 50 μΐ liuosta, joka sisälsi 100 ng 90-%:isesti puhdasta hpG-CSF:ää, joka liuotettiin 50 mmol/1 C03'2/HC03—puskuri-35 liuokseen (pH 9,2) huoneen lämpötilassa kahden tunnin

II

13 91542 ajan, minkä jälkeen liuos lisättiin levyjen jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin yli yön 4 °C:ssa. Sitten kuoppia käsiteltiin 5 % BSA:ta sisältävällä, lisäreaktiot estävällä liuoksella ("blokkausliuoksella"), jota inkuboitiin 30 5 min ajan.

Hybridoomaviljelmien supernatantti laimennettiin PBS-liuoksella (pH 7,0), joka sisälsi 1 % BSA:ta, ja inkuboitiin sitten päällystetyissä kuopissa kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen kuopat pestiin kolmes-10 ti Wash Solution -pesuliuoksella ja käsiteltiin piparjuu-riperoksidaasilla leimatulla anti-hiiren IgG-vasta-aineel-la .(BMB No 605-250), joka oli laimennettu 1:300, 1,5 tuntia. Sitten kuopat pestiin viisi kertaa Wash Solution -pesuliuoksella ja peroksidaasin substraattia ABTS (KPL) 15 lisättiin 50 μΐ/kuoppa. Sitten kuopat luettiin absorbans- sin suhteen aallonpituudella 414 nm Titertek Multiscan -spektrofotometrillä (Flow Labs, McLean, VA). 23 kuopan (nro:t 3, 4, 5, 20, 21, 28, 35, 37, 39, 40, 58, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98, 151, 182 ja 231) havaittiin 20 merkittävästi reagoivan pelkistetyn hpG-CSF:n kanssa.

Positiivisista kuopista saatujen hybridoomasolujen varsinainen kloonaus suoritettiin laimentamalla solut uusiin kuoppiin sellaisessa suhteessa, että saatiin noin yksi solu kolmea kuoppaa kohti. Yleisesti aktiivisen kuo-25 pan varsinainen kloonaus tuotti varsinaisia klooneja, jotka näyttivät olevan saman hybridoomasolun alaklooneja mutta jotka useissa tapauksissa paljastuivat eri kloonipopu-laatioiksi, joilla oli eri vasta-ainealatyypit ja reaktio-ominaisuudet. Saman kuopan alakloonit merkittiin kirjai-30 mella (esim. kuopasta 4 saadut kloonit merkittiin 4A:ksi, 4B:ksi jne).

ELISA-määritys suoritettiin monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuuden luonnollista hpG-CSF:ää samoin kuin pelkistettyä luonnollista hpG-CSF:ää vastaan toteami-35 seksi. Supernatantti, joka oli saatu kuopista, joiden oli • 14 91542 havaittu tuottavan hpG-CSF:n kanssa reaktiivisia vasta-aineita, testattiin sekä luonnollista hpG-CSF:ää että SDS/ merkaptoetanolilla denaturoitua hpG-CSF:ää vastaan. Kloonien vasta-aineet reagoivat molempia materiaaleja vastaan 5 suunnilleen samansuuruisella spesifisyydellä, mikä viittaa siihen, että vasta-aineet voivat spesifisesti reagoida sellaisten antigeenisten epitooppien kanssa, joita ensi sijaisesti määrittävät proteiinin jatkuvat aminohapposekvenssit (primaarirakenne).

10 B. Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus imettäväisten ja yhdistelmä-DNA-menetelmällä valmistettua hpG-CSF:ää vastaan Tässä esimerkissä suoritettiin kiinteä faasi -RIA-ja ELISA-määritykset aktiivisista kuopista saatujen hybri-15 doomasupernatanttien reaktiivisuuden mittaamiseksi käyttäen sekä imettäväisten hpG-CSF:ää että yhdistelmä-DNA-menetelmällä E. colissa tuotettua hpG-CSF:ää. Yhtä tapausta lukuunottamatta imettäväisten tuottaman (luonnollisen) hpG-CSF:n kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-ainemate-20 riaali reagoi yhtä hyvin yhdistelmä-DNA-menetelmällä valmistetun hpG-CSF:n kanssa. Tuo tapaus käsitti alakloonit 35B, 35D ja 351, jotka tuottivat vasta-aineita, jotka reagoivat merkittävästi vähemmän yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistetun materiaalin kanssa kuin imettäväisperäisen 25 materiaalin kanssa molemmissa suorissa sitoutumismääritys-menetelmissä.

C. Vasta-ainealatyyppien seulonta Tässä esimerkissä alunperin aktiivisiksi havaituista 23 kloonista saadut varsinaiset kloonit seulottiin 30 RIA:lla niiden vasta-ainealatyypin määrittämiseksi. 96-kuoppaisia levyjä käsiteltiin kanin anti-hiiren immunoglo-buliini-vasta-aineilla, joilla oli erilaiset alatyyppispe-sifisyydet. Antihiiren immunoglobuliini-vasta-aineet olivat kanin anti-hiiren IgGx (MILES Laboratories, Naperville, 35 IL, 64-360-1), kanin anti-hiiren IgG2a (MILES 64-361-1), •

II

15 91542 kanin anti-hiiren IgG2b (MILES 64-362-1), kanin anti-hiiren IgG3 (MILES 64363-1), kanin anti-hiiren IgM (MILES 64-365-1) ja kanin anti-hiiren IgG (MILES 65-157-2). Jokainen kuoppa päällystettiin 50 yl:lla noin 0,5 yg vasta-ainetta 5 sisältävää anti-hiiren immunoglobuliini-liuosta C03"2/HC03' -puskuriliuoksessa ja inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja yli yön 4 °C:ssa. Sitten lisäreaktiot estettiin inkuboimalla kuoppia 5-%:isella BSA-liuoksella 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen jokaista kuoppaa inkuboi-10 tiin hybridoomakudosviljelysupernatantin kanssa kaksi tun tia huoneen lämpötilassa ja pestiin kolmesti Wash Solution -pesuliuoksella. Sitten anti-IgG-vasta-aineella käsiteltyjä kuoppia inkuboitiin 1,5 tuntia 125I-kanin anti-hiiren IgG-vasta-aineen kanssa, 50 μΐ kuoppaa kohti, kun taas 15 anti-IgM:llä käsiteltyjä kuoppia inkuboitiin 1,5 tuntia 125I-kanin anti-hiiren IgM-vasta-aineen kanssa, 50 μΐ kuoppaa kohti. Tämän jälkeen kuopat pestiin viisi kertaa Wash Solution -pesuliuoksella ja laskettiin gammalaskijassa. Alkuperäisten 23 kloonin analyysin tulokset osoittavat, 20 että kaksi kuoppaa (nro:t 37 ja 182) lakkasivat syntetisoimasta IgG:tä, yksi kuoppa osoittautui IgG-positiivisek-si, mutta ei osoittanut reaktiivisuutta aikaisemmassa seulonnassa hpG-CSF:lle (nro 58); 15 kuoppaa olivat positiivisia IgG1:lle (nro:t 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, , 25 68, 72, 74, 75, 98 ja 231). Erään näistä alakloonin, nro 5d:n, havaittiin reagoivan sekä anti-IgG3- että anti-IgM-vasta-aineiden kanssa. Neljä kuoppaa oli positiivisia IgG2a:n tuotannon suhteen (nro:t 3, 4A, 21 ja 151) ja yksi kuoppa IgG2b:n tuotannon suhteen (nro 35).

30 D. hpG-CSF-aktiivisuuden neutraloituminen mitattu na 3H-tymidiinin sisäänoton avulla Tässä esimerkissä hpG-CSF:ää vastaan nostetut monoklonaaliset vasta-aineet testattiin sen suhteen, pystyi-vätkö ne neutraloimaan hpG-CSF:n biologisen aktiivisuuden 35 stimuloida 3H-tymidiinin ottoa ihmisen luuydinsoluihin. 3H- 91542 16 tymidiinin sisäänoton neutraloinnin testaamiseksi yhdis-telmä-DNA-menetelmällä valmistettua tai luonnollista hpG-CSF:ää inkuboitiin keksinnön mukaisten vasta-aineiden eri pitoisuuksissa 4 °C:ssa 12 tunnin ajan. Sitten liuokset 5 lisättiin tiheydeltään alhaisiin, non-adherentteihin ihmisen luuydinsoluihin ja käsiteltiin samanaikaisesti käsittelyn alaisena olevan US-patenttihakemusjulkaisun sarjanumero 768 959 esimerkissä 7 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Mm. kloonien nro:t 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 63D, 10 75A ja 151K vasta-aineet testattiin ja kloonin 75A vasta- aineet olivat tehokkaimpia neutraloimaan hpG-CSF:n vaikutusta 3H-tymidiinin sisäänottoon, ja kaikki yllä olevat vasta-aineet neutraloivat eriasteisesti 3H-tymidiinin sisäänottoa lukuun ottamatta kloonin 35B tuottamia vasta-15 aineita.

E. hpG-CSF-aktiivisuuden neutraloituminen mitattuna solun erilaistumisen indusoitumisen avulla Tässä esimerkissä hpG-CSF:ää vastaan nostetut vasta-aineet testattiin sen suhteen, pystyvätkö ne neutraloi-20 maan hpG-CSF:n kykyä indusoida hiiren myelomonosyyttisen leukemiasolulinjan WEHI-3B D* erilaistumista. Eri pitoisuuksia keksinnön mukaisesti tuotettuja vasta-aineita (klooneista nro:t 20A, 39B, 40A, 61D, 63D ja 75A) inkuboitiin hpG-CSF:n kanssa 4 °C:ssa 12 tuntia. Sitten liuokset 25 lisättiin WEHI-3B D+ -soluihin agar-suspensiossa käyttäen

menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 7 US-patenttihakemus julkaisussa sarjanumero 768 959, joka samanaikaisesti on käsittelyn alaisena. Kloonien nro:t 40A, 61D ja 75A

tuottamat vasta-aineet kykenivät estämään erilaistumisen.

30 Koska nämä monoklonaaliset vasta-aineet kykenevät seosta maan hpG-CSF:ää eri lailla, sitä tosiasiaa, että jotkut estävät hpG-CSF:n kyvyn indusoida erilaistumista, vaikka toiset eivät siihen pysty, ei voida selittää vain affiniteetin voimakkuuden perusteella. On merkittävää, että 35 kloonin 75A tuottama monoklonaalinen vasta-aine ei vain

II

17 91542

Inhiboinut WEHI-3B D* -solujen erilaistumista, vaan myös inhiboi solun kasvua, mikä viittaa siihen, että se saattaa ristireagoida WEHI-3B D* -solujen erittämän hiiren kasvutekijän kanssa ja sillä saattaa olla lisääntymistä 5 estäviä vaikutuksia riippumatta sen kapasiteetista sitoa hpG-CSF:ää.

F. Epitooppikarakterisointi Tässä esimerkissä suoritettiin kompetetiivisia si-toutumistutkimuksia käyttäen 125I:llä leimattua vasta-10 ainetta klooneista 75A ja 151K sekä paikoilleen kiinnitettyä, yhdistelmä-DNA-menetelmällä valmistettua hpG-CSF:ää. Näissä tutkimuksissa muiden kloonien vasta-aineiden annettiin kilpailla radioaktiivisella isotoopilla leimattuja kloonien 75A ja 151K tuottamia monoklonaalisia vasta-ai-15 neita vastaan, jotka oli sidottu yhdistelmä-DNA-menetelmällä valmistettuun hpG-CSF:ään. Inkuboinnin ja pesun jälkeen, jotka suoritettiin alalla hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti, säteilypulssit mitattiin sen määrittämiseksi, kuinka paljon joko 75A:n tuottamaa vasta-ai-20 netta tai 15lK:n tuottamaa vasta-ainetta oli syrjäytetty hpG-CSF:stä.

Näiden määritysten tulokset osoittavat, että kloonien 63D, 75A ja 151K tuottamissa vasta-aineissa saattaa esiintyä päällekkäin meneviä hpG-CSF-proteiinin yhteisen 25 antigeenisen epitoopin osia. Tulokset osoittavat myös, että kloonien 4C, 28A ja 35B tuottamat vasta-aineet näyttävät reagoivan sellaisen hpG-CSF-proteiinin epitoopin (tai epitooppien) kanssa, jonka kanssa 75A:n ja 151K:n tuottamat vasta-aineet eivät reagoi spesifisesti. Nämä 30 tulokset myös viittaavat siihen, että kloonien 40A ja 61D tuottamien vasta-aineiden hpG-CSF:ää sitovat ominaisuudet saatetaan voida erottaa kloonien 4C, 28A, 35B, 75A ja 151K tuottamien vasta-aineiden vastaavista ominaisuuksista.

91 5^2 18 G. Talletettujen keksinnön mukaisten solulinjojen tuottamien vasta-aineiden ominaisuudet

Uudet hybridoomasolulinjat, jotka pystyvät tuottamaan tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-ainei-5 ta, on talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Nämä solulinjat vastaavat solulinjoja, jotka on kehitetty varsinaisen kloonausprosessin aikana seuraavasti: klooni 4C (A.T.C.C. HB-8962), klooni 28A (A.T.C.C. HB-8957),

10 klooni 35B (A.T.C.C. HB-8960), klooni 63D (A.T.C.C. HB-8958), klooni 75A (A.T.C.C. HB-8959) ja klooni 151A

(A.T.C.C. HB-8961). Näiden kloonien tuottamien vasta-aineiden ominaisuuksien yhteenveto on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

15

Taulukko 1

Samanlaisuus epitooppi-

Sitoutuminen Neutraloituminen karakterisoin-20 3

Klooni Η-Thy (Ihmi- WEHI nissa

nro Tyyppi E. coli Natiivi sen luuydin) 38 D*3 75A 151K

4C IgG1 + + ND ND

28A IgG1 + + ND ND -

35B IgG2b - + ND

63D IgG1 + + ♦ + + 25 75A JgQ^ + + + + + + + + 151K I^G2a + + ++ ND + + ND (koetta ei suoritettu) 30 H. Vasta-ainesaantojen monistaminen askites-mene- telmän avulla

Jotta saataisiin konsentroidumpaa vasta-ainetta kuin kudosviljelmässä tuotettu vasta-aine, tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet monistettiin käyttäen askites-mene-35 telmää, joka on yleisesti kuvattu kirjassa Monoclonal An-

II

19 91542 tibodies, Hybrldomas: A New Dimension in Biological Analysis, Kenneth et al., (toim. ), s. 403, New York, Plenum Press (1981). Tämän menetelmän mukaisesti hiiret esikäsi-tellään 0,5 ml:11a Pristanea (2,6,19,14-tetrametyylipenta-5 dekaani, Aldrich Chemical Co.), joka injektoidaan niiden vatsaonteloihin käyttäen 25 tai 27 gaugen neuloja. Prista-ne-käsittely sallii kasvainsolujen kasvun askites-muodossa vatsaontelossa. Noin 1-2 viikon kuluttua noin 106 hybri-doomasolua injektoidaan hiirien vatsaonteloihin seerumit-10 tomassa Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) -väliaineessa (Irvine Scientific Co.) tai HBlOl-väliaineessa (Hanna Biologicals, Berkeley, Kalifornia). Sarja injektioita suoritetaan hiiriin jokaista kloonia käyttäen.

Noin 1-3 viikon kuluttua hybridoomasolujen injektiosta, 15 askites-neste otettiin talteen hiirten vatsaonteloista tekemällä pienet viillot ihoon ja pipetoimalla neste ulos. Askitesneste kirkastettiin sentrifugoimalla, minkä jälkeen se pakastettiin. Askistesnesteen vasta-aineet voidaan puhdistaa edelleen askitesnesteen albumiinista saos-20 tamalla 45-%:isella ammoniumsulfaatilla ja proteiini A-sepharose -kromatografiällä.

Esimerkki 3

Hematopoieettisten kasvutekijöiden eristys ja puhdistus 25 Antaessaan käyttöön erittäin spesifisiä ja reaktii visia anti-hpG-CSF-monoklonaalisia vasta-aineita tämä keksintö mahdollistaa ensimmäisen kerran hpG-CSF:n ja hematopoieettisten kasvutekijöiden eristämisen fermentointivil-jelmistä samoin kuin luonnollisista imettäväislähteistä 30 käyttäen alalla hyvin tunnettuja affiniteettipuhdistusme-netelmiä. Lyhyesti sanottuna edulliset eristysmenetelmät käsittäisivät keksinnön mukaisen vasta-aineen kiinnittämisen paikoilleen kiinteään kantajaan (esim. kromatografiseen pylvääseen), hpG-CSF:ää tai hematopoieettista tekijää 35 sisältävän nesteen saattamisen kosketukseen paikoilleen • 91542 20 kiinnitetyn vasta-aineen kanssa ja tämän jälkeen puhdistetun hpG-CSF:n tai hematopoieettisen kasvutekijän eluoimi-sen vasta-aineen kanssa muodostetusta immunokompleksista. Valitsemalla tietty käytetty vasta-aine puhdistusmenetelmä 5 saattaa sallia natiivin hpG-CSF:n eristyksen oikein ko- koonkiertyneessä konformaatiossaan väärin kokoonkierty-neestä tai denaturoituneesta hpG-CSF:stä, hpG-CSF:n analogeja samoin kuin hematopoieettisen kasvutekijämolekyylien spesifisiä epitooppeja voitaisiin eristää ja niitä voitai-10 siin tutkia.

Esimerkki 4

Hematopoieettisten kasvutekijöiden kvantitatiivinen toteaminen

Antaessaan käyttöön erittäin spesifisiä anti-hpG-15 CSF -monoklonaalisia vasta-aineita tämä keksintö mahdol listaa myös uudet kiinteät faasi- tai nestefaasimääritys-menetelmät hpG-CSF:n ja hematopoieettisten kasvutekijöiden toteamiseksi nestenäytteestä, joissa menetelmissä käytetään useampia kuin yhtä vasta-ainetta. Kiinteä faasi -mää-20 ritysmenetelmä käsittäisi tyypillisesti vaiheet: (1) saatetaan neste kosketukseen ensimmäisen, paikoilleen kiinnitetyn vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine reagoi nesteessä olevan hpG-CSF:n ensimmäisen antigeenisen determinantin kanssa, jolloin muodostuu hpG-CSF:n ja en- 25 simmäisen vasta-aineen immunokompleksi; (2) saatetaan vaiheessa (1) muodostettu kompleksi kosketukseen toisen vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine reagoi toisen hpG-CSF:n antigeenisen determinantin kuin ensimmäisen antigeenisen determinantin kanssa, jolloin 30 muodostuu hpG-CSF:n ja toisen vasta-aineen immunokompleksi; ja « (3) kvantitoidaan vaiheessa (2) muodostettuun immu-nokompleksiin sitoutuneen toisen vasta-aineen määrä.

Nestefaasi-kompetetiiviset määritysmenetelmät kä-35 eittäisivät hpG-CSF:n leimaamisen ja sen saostamisen yh-

II

21 91542 dellä tai useammalla keksinnön mukaisella vasta-aineella. Leimaamattoman hpG-CSF:n tai sitä läheisesti muistuttavien tekijöiden määrittäminen voitaisiin sitten suorittaa kom-petetiivinen sitoutuminen -formaattia käyttäen. Tällaiset 5 määritysmenetelmät edullisesti sisältäisivät kaksi yllä kuvattua monoklonaalista vasta-ainetta, mutta ne voidaan myös kehittää sellaisiksi, että käytetään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta ja polyklonaalisesta seerumista peräisin olevaa vasta-ainetta hpG-CSF:ää vastaan.

10 Lukuisten modifikaatioiden ja variaatioiden keksin nön käytännön suorituksessa otaksutaan olevan ilmeisiä alan asiantuntijoille tarkasteltaessa sen edullisten suoritusmuotojen edellä olevaa kuvausta. Niinpä keksinnölle tulisi asettaa vain sellaiset rajoitukset, jotka esiinty-15 vät seuraavissa patenttivaatimuksissa.

*

Claims (10)

22 91 542

1. Hiirestä peräisin oleva hybridoomasolulinja, tunnettu siitä, että se pystyy tuottamaan kasvu- 5 väliaineeseensa monoklonaalista vasta-ainetta, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyt-tipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-CSF) kanssa antigeeni /vasta-aine-reaktiossa, ja että se on jokin solulinjoista A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959,

10 A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridoomasolulinja, . tunnettu siitä, että se tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, jonka alatyyppi on IgGl, IgG2a tai IgG2b.

3. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-CSF) kanssa antigeeni/vasta-aine-reaktiossa ja että sitä voidaan tuottaa viljelemällä solulinjaa A.T.C.C. HB-20 8957, A.T.C.C. HB-8958,-A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB- 8960, A.T.C.C. HB-8961 tai A.T.C.C. HB-8962.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sen alatyyppi on IgGl, IgG2a tai IgG2b.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy neutraloimaan hpG-CSF:n kykyä indusoida WEHI-3B D+ -solujen erilaistumista viljelmässä.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen 30 vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy neutraloimaan hpG-CSF:n kykyä stimuloida luuydinsolujen tyrni -diinin sisäänottoa.

7. Immunologinen menetelmä biologisesti aktiivisen ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan 35 tekijän (hpG-CSF) eristämiseksi biologisesta nesteestä II 91542 hpG-CSF:lle spesifisen vasta-aineen kanssa selektiivisen immunologisen reaktion perusteella, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 3 mukaista monoklo-naalista vasta-ainetta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen immunologinen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on alatyyppiä IgGl, IgG2a tai IgG2b.

9. Immunologinen määritysmenetelmä ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-

10 CSF) kvantitiiviseksi toteamiseksi biologisessa nesteessä yhden tai useamman hpG-CSF:lle spesifisen vastaaineen kanssa selektiivisen immunologisen reaktion perusteella, tunnettu siitä, että käytetään yhtä tai useampaa patenttivaatimuksen 3 mukaista monoklonaalista vasta-ai-15 netta.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen immunologinen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaaliset vasta-aineet ovat alatyyppiä IgGl, IgG2a tai IgG2b. 91542