JPH0630619B2

JPH0630619B2 - モノクロ−ナル抗ヒト顆粒球コロニ−刺激因子抗体

Info

Publication number: JPH0630619B2
Application number: JP60272121A
Authority: JP
Inventors: 仁野村; 郁夫今関
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-12-03
Filing date: 1985-12-03
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: EP0225583A3; EP0225583A2; JPS62130698A; CA1330768C

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規なモノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー刺
激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと記す）抗体および該抗体を
用いてヒトＧ−ＣＳＦの精製方法ならびに定量方法に関
する。

従来の技術ヒトＧ−ＣＳＦとは主としてヒト顆粒球細胞のコロニー
を形成させるために必要な特異的な刺激因子である。

ＣＳＦと総称される因子は、２層軟寒天培養法で、上層
に標的細胞として骨髄細胞を、下層に腎細胞や胎児細胞
を入れて培養すると、上層の細胞の一部が増殖分化し、
好中球系顆粒球（以下「顆粒球〔グラニュロサイト(gra
nulocyte)」と称す〕や単球マクロファージからなるコ
ロニーが形成されることから、生体内にその存在が確認
された〔プラズニクおよびサッチ(Pluznik and Sach)，
ジャーナルオブセリュラーアンドコンパラティブ
フィジオロジィ(J.Cell.Comp.Physiol.),66,319(196
5)；ブラッドレイおよびメトカルフ(Bradley and Metca
lf,)，オーストラリアンジャーナルオブエクスペ
リメンタルバイオロジカルアンドメディカルサ
イエンス(Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci),44,287(1966)〕。

この因子は、正常に広く生体内分布する細胞、たとえ
ば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細
胞などより産生されることが知られている。ＣＳＦには
顆粒球・単球マクロファージの幹細胞に作用して、その
増殖を刺激し分化を誘導し、軟寒天中で顆粒球や単球マ
クロファージから成るコロニーを形成させる作用をもつ
顆粒球一単球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦと略
記する）、主として単球マクロファージのコロニーを形
成させる作用をもつ単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−Ｃ
ＳＦと略記する）、より未分化な多能性幹細胞に作用す
る多能性ＣＳＦ(multi−ＣＳＦと略記する）、あるいは
主として顆粒球系コロニーを形成させる作用をもつ顆粒
球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦと略記する）などのサブクラスが
存在し、それぞれのサブクラスによって標的細胞の分化
段階も異なることが考えられる様になってきた〔アサノ
(Asano)，代謝−メタボリズムアンドディジーズ(Me
tabolism and Disease),22,249(1985)；ユニース(Yuni
s)等，グロースアンドマチュレーションファクタ
ーズ(Growthand Maturation Factors)，ガロフ(Guroff)
編ジョンウィリーアンドサンズ(john Wiley&Sons)
社，ニューヨーク，１，209(1983)〕。

従って、個々のサブクラスを精製し、その化学的性状や
生物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々
の血液学的疾患の病態の解析のために極めて重要なこと
である。中でも、Ｇ−ＣＳＦの生物学的作用として、骨
髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が注
目されており、特に白血病の治療と予防へのヒトＧ−Ｃ
ＳＦの臨床的有用性が大いに期待されている。かかる現
状に於いて、高純度のヒトＧ−ＣＳＦを大量に得ること
は、非常に重要であり、ヒトＧ−ＣＳＦの巧妙な単離精
製法の開発への要請が高まってきた。

従来、試みられたヒトＧ−ＣＳＦの単離精製は、ヒトＧ
−ＣＳＦ産生細胞を培養し、その培養上清から、ゲル濾
過による分子量別の分画、限外濾過による濃縮等をへて
ヒトＧ−ＣＳＦを単離精製する方法であったが、この方
法には以下に詳述する様な問題点があった。

発明が解決しようとする問題点以上述べてきた様に、ヒトＧ−ＣＳＦは生物学上、ある
いは医学上非常に興味深い生体内因子であり、大量の高
純度ヒトＧ−ＣＳＦを得る為のヒトＧ−ＣＳＦ単離精製
法の開発が渇望されていた。

従来、ヒトＧ−ＣＳＦの単離精製は、ヒトＧ−ＣＳＦ産
生細胞を培養し、その培養上清に対して、ゲル濾過によ
る分子量別の分画、限外濾過による濃縮等の工程を組み
合せることによって行われてきた。しかしながら、上記
ゲル濾過は、均一な標的物質を得るためには複数回行う
必要があり、またそれぞれの操作毎に、各画分の活性の
定量を行わなければならず、その操作はかなり複雑であ
る。更に、標的物質がＣＳＦの様な活性を持つ物質であ
る場合には、ゲル濾過、限外濾過等の精製操作中に失活
する恐れがあり、その操作条件は厳密を要する。

ところが、ヒトＧ−ＣＳＦは培養上清中に低濃度で放出
されるにすぎないため、大量の培養液から微量のヒトＧ
−ＣＳＦしか得ることができない。従って、ヒトＧ−Ｃ
ＳＦを大量に得る為には、精製工程をかなりスケールア
ップしなければならないが、それには、上記した複雑で
厳密な注意を要する精製工程は適用が困難である。

従って、操作が簡単で、大量の培養液を用いるのに適し
たヒトＧ−ＣＳＦ精製法、更にはこのヒトＧ−ＣＳＦの
簡単かつ精度のよい定量法を開発することは非常に重要
である。

そこで、本発明の目的のひとつは、高純度のヒトＧ−Ｃ
ＳＦを容易かつ大量に得ることを可能とするリガンドを
提供することにある。

また、本発明の更なる目的は、該リガンドを用いたヒト
Ｇ−ＣＳＦの精製法および定量法を提供することにあ
る。

問題点を解決するための手段本発明者等はヒトＧ−ＣＳＦ含有液からヒトＧ−ＣＳＦ
を高純度に精製すべく種々検討、研究した結果、ヒトＧ
−ＣＳＦにより免疫された実験動物の抗体産生細胞とミ
エローマ細胞とのハイブリドーマを得、該ハイブリドー
マをスクリーニングしクローニングして得られたクロー
ンを使用することが、上記本発明の目的を達成する上で
非常に有利であるとの知見を得、本発明を完成するに至
った。

本発明のモノクローナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体は新規で
あり、また、該モノクローナル抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法によるヒトＧ−ＣＳＦ精製法
ならびにヒトＧ−ＣＳＦの免疫学的定量法も該モノクロ
ーナル抗体と同様に文献未載の新規な方法である。

本発明者等は、例えば口腔底癌由来のヒトＧ−ＣＳＦを
抗原として実験動物に免疫したのち、その脾臓細胞を取
り出し、ミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを
作製し、次いでこの中からモノクローナル抗ヒトＧ−Ｃ
ＳＦ抗体を高濃度かつ安定的に産生するクローンを得た
〔このクローンはＮＺ−11と命名し、財団法人醗酵研究
所（ＩＦＯ）に寄託番号-50066として寄託した〕。そし
て当該クローンを培養しその培養上清から、モノクロー
ナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体を得ることに成功した。当該
モノクローナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体は上記口腔底癌由
来のヒトＧ−ＣＳＦに対して免疫化学的に反応するのは
もちろんのこと、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子ｃ
ＤＮＡあるいは同じくヒトＧ−ＣＳＦをコードする染色
体由来の遺伝子例えば、これらの遺伝子はそれぞれ工業
技術院微生物工業研究所に寄託番号「ＦＥＲＭＰ−
８３５２」で寄託され、特願昭６０−２０６０６６に開
示されているｃＤＮＡ、「ＦＥＲＭＰ−８４５３」
で寄託され、特願昭６０−２０９６３８に開示されてい
るｃＤＮＡ、「ＦＥＲＭＰ−８４５４」で寄託さ
れ、特願昭６０−２１７１５０に開示されている染色体
由来の遺伝子であるを大腸菌あるいは動物細胞に遺伝子
組換え技術によりトランスフォームして作製したトラン
スフォーマントの細胞抽出液あるいは培養上清中から得
たヒトＧ−ＣＳＦとも免疫化学的に反応する。

モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下
記のような作業工程が必要である。即ち、(a)抗原とし
て使用する生体高分子を精製、(b)マウスへの抗原の注
射による免疫および血液を採取し、アッセイして脾臓摘
出の時期を決定することにより成る抗体産生細胞の調
製、(c)骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、(d)脾臓摘出
および脾細胞とミエローマの場合、(e)目的とする抗体
を産生するハイブリドーマ群の選別、(f)単一細胞クロ
ーンへの分割（クローニング）、(g)場合によってはモ
ノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドー
マの培養またはハイブリドーマを移植したマウスの飼
育、(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体
の生理活性、あるいは標識試薬としての特性の検定等が
挙げられる。

(a)〜(h)の工程はそれぞれ、モノクローナル抗体を産出
するハイブリドーマを作成する為の常法〔ハイブリドー
マテクニックス(Hybridoma Techniques)，コールド
スプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbo
r Laboratory),1980年版〕に従った。

以下、本発明のモノクローナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体の
作製法を上記工程に沿って以下に詳述するが、これに制
限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエロー
マ、他の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用で
きることはいうまでもない。

(a)抗原の精製抗原としてはヒトＧ−ＣＳＦが有効であり、これにつき
本発明者らは著名な好中球の増多が認められた口腔底癌
患者の腫瘍から好中球コロニー形成を刺激する因子、ヒ
トＧ−ＣＳＦ、を特異的に産生する細胞株ＣＨＵ−２
〔コレクションナショナールドゥクルチュール
ドゥミクロオーガニズム(Collection Nationale De C
ultures De Microorganismes（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．））寄
託番号Ｉ−483〕を確立し、該細胞株の培養上清から高
純度の製品として単離することに成功している。

以上の如くして得たヒトＧ−ＣＳＦは分子量１９０００
±１０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であり、Ｎ末端から２
１残基目までのアミノ酸配列は、次の如くであった。

Ｈ_２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−(10) Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−（Ｃｙｓ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−(20) Ｘ−Ｖａｌ− (b)抗体産生細胞の調製ヒトＧ−ＣＳＦを特異的に産生する細胞株ＣＨＵ−２
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ−483)の培養上清より適
当な方法で分離、精製したヒトＧ−ＣＳＦとフロインド
完全または不完全アジュバントまたはカリミョウバンの
ような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫す
る。実験動物としては、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する
ことが好ましく、これは、多用されるマウス由来のミエ
ローマが全てＢＡＬＢ／ｃマウスを起源にしており、し
かもその性質が比較的詳しく研究されており、更に、抗
体産生細胞とミエローマが共にＢＡＬＢ／ｃマウス由来
であれば、得られるハイブリドーマがＢＡＬＢ／ｃマウ
ス腹腔内で増殖できるため、複雑な手順なしに腹水より
モノクローナル抗体が得られるという利点があるためで
ある。しかし、本発明がこれに制限されないことは上記
の通りである。

免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静
脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮
下注射または腹腔内注射が好ましい。

免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間乃至
５週間間隔で複数回繰返し行ってもよい。免疫した動物
の血清中の該抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が充
分高くなった動物を抗体産生細胞のソースとして用いれ
ば、その後の操作の効果を上げることができる。融合に
は、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を
用いることが好ましい。

ここで用いる抗体価の測定法としては、放射性同位元素
免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩ
ＳＡ法）、螢光抗体法、受身血球凝集反応法等種々の公
知技術が上げられるが、感度、迅速性、正確性および自
動化の可能性等の観点から、ＲＩＡ法およびＥＬＩＳＡ
法が好ましい。

本発明による抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によ
れば、以下のような手順により行うことができる。即
ち、抗原を固相に吸着させ、さらに抗原が吸着していな
い固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えば、牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）により覆い、該表面を洗浄後、
第１抗体として、段階希釈した試料（例えばマウス血
清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ヒトＧ−ＣＳＦ
抗体を結合させ、らに第２抗体として酵素標識されたマ
ウス抗体に対する抗体を加え、マウス抗体に結合させ、
洗浄後、該酵素の基質を加え、基質分解に基づく、発色
等を測定することにより、抗体価算出を行うことができ
る。

(c)骨髄腫細胞の調製工程骨髄細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化
細胞、たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレントトピックスインマイクロ
バイオロジーアンドイムノロジー(Current Topics
in Microbiology and Immunology),81,1-7(1978)〕；Ｐ
３−ＮＳＩ／１−Ａｇ4.1（ＮＳ−１）〔ユーロピアン
ジャーナルオブイムノロジー(European J.Immuno
logy),6,511-519(1976)〕；ＳＰ２／０−Ａｇ14（ＳＰ
−２）〔ネーチャー(Nature)，２７６，２６９−２７０
（１９７８）〕；Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ8.653(653)〔ジャ
ーナルオブイムノロジー(J.Immunology),123,1548-
1550(1979)〕；Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔ネー
チャー(Nature),256,495-497(1975)〕等を用いることが
好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−
アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−1640培地にグルタミン
(1.5mM)、２−メルカプトエタノール（５×10^-5Ｍ）、
ジエンタマイシン（10μｇ／ｍ）および牛胎児血清
（ＦＣＳ；10％）を加えた正常培地に８−アザグアニン
を加えた培地〕、ＩＭＤＭ〔イスコブモディファイド
デュルベッコ培地(Iscove Modified Dulbecco's Medi
um)〕またはデュルベッコ(Dulbecco's)ＭＥＭで、継代
培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で継代培
養し、融合当日３×10⁷以上の細胞数を確保する。

(d)細胞融合抗体産生細胞は形質細胞およびその前駆細胞であるリン
パ球であり、これは固体のいずれの部位から得てもよ
く、一般には脾、リンパ節、末梢血またはこれらの適宜
の組み合せから得ることができるが、脾臓細胞が最も一
般的に用いられる。

最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスより抗体産
生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生
細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程(c)で
得られた骨髄腫細胞を融合させる手段として、現在最も
一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく、
融合作用も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法
である。

この方法は、以下の手順よりなる。

脾細胞と骨髄腫細胞を培地またはフォスフェートバッ
ファーセイライン（ＰＢＳ）でよく洗浄し、脾細胞と
骨髄腫細胞との比が５〜10：１程度になるように混合
し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈殿した細胞群を
よくほぐした後、攪拌しながらポリエチレングリコール
（ＰＥＧ，分子量1000〜4000)と培地との混液を0.1〜1.
0ｍ中の脾細胞数が10³個となるように加え、数分後に
遠心分離した後、適量のＨＢＳＳ溶液〔ハンクスバラ
ンスドソルトソリューション(Hank's Balanced Sal
t Solution)〕及び20％ＦＣＳを含む正常倍地、例えば
ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ−1640等を静かに加え
て細胞をほぐし、その後さらに遠心分離して上清を捨
て、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン10^-6〜10^-3
Ｍ、アミノプテリン10^-8〜10^-7Ｍ、チミジン10^-6〜10^-4
Ｍを加えた培地）を加えて再び細胞をほぐし懸濁する。

(e)ハイブリドーマ群の選択この懸濁液を培養用プレート上の穴に分注し、ＣＯ_２イ
ンキュベーター中、35〜40℃で10〜30時間培養する。以
後１〜３日間に亘り10〜30時間目ごとに、培養上清半溶
液を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地等を加え、ＣＯ_２イ
ンキュベーター中、35〜40℃で10〜14日間培養する。

上記ミエローマ細胞株は、８−アザグアニン耐性株であ
り、該ミエローマ細胞およびミエローマ細胞同しのハイ
ブリドーマは、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジン含有培地（ＨＡＴ培地）中では生存できない。

しかしながら、抗体産生細胞どうしあるいは、抗体産生
細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存するこ
とができ、さらに抗体産生細胞どうしのハイブリドーマ
には寿命がある為、ＨＡＴ培地での培養によってハイブ
リドーマの選択が可能となる。

コロニー状に生育してきたハイブリドーマの認められる
穴について、上清半容量を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地
からアミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１
〜３日間10〜30時間目ごとにＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日培養後、培養上清の一部をとり、例
えばＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）により、抗ヒトＧ
−ＣＳＦ抗体価を測定する。

以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いたが、その
他のものもハイブリドーマの選択に応じて使用すること
ができ、その場合当然使用する培地組成も変化する。

(f)クローニング上記抗体価の測定により特異的抗体を産生することが判
明したハイブリドーマを、別のプレートに移し、クロー
ニングを行う。このクローニング法としては、限界希釈
により１穴に１個のハイブリドーマが含まれるように希
釈してまき込む方法；軟寒天培地上にまきこみコロニー
を取る軟寒天法；マイクロマニピュレーターによって１
個の細胞を取り出しまきこむ方法；セルソーターによっ
て１個の細胞を分離する「ソータクローン」等が挙げら
れるが、限界希釈法が簡単であり良く用いられる。

抗体価の認められた穴について、例えば限界希釈法によ
りクローニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の
認められたものを、抗ヒトＧ−ＣＳＦモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株として選択する。

(g)ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調
製クローニングを完了したハイブリドーマはＨＴ培地より
通常の培地に変えて培養される。大量培養は、大型培養
瓶を用いた回転培養あるいはスピナー培養で行われる。
この大量培養における上清に、ゲル濾過等を行い、IgG
画分を集め精製することにより抗ヒトＧ−ＣＳＦモノク
ローナル抗体を得ることができる。

また同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）あ
るいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でも増殖させることが
可能である。即ち、例えばプリスタン処理した８〜10週
令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに(d)で得られた抗ヒトＧ−
ＣＳＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜
４×10⁶Cells／匹を腹腔内注射すると10〜21日でハイブ
リドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取
し、遠心分離して固形分を除去後、モノクローナル抗体
としてヒトＧ−ＣＳＦの精製・定量用等に供することが
できる。

さらに精製が必要な場合には、上記遠心分離上澄液をＤ
ＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−セファロ
ースカラムなどに通塔し、ＩｇＧ画分を集める操作を少
なくとも１回行うことにより実施できる。

(h)モノクローナル抗体の同定かくして得られたモノクローナル抗体のクラシフィケー
ション即ちイソタイプ、サブクラスの決定は以下のよう
に行う。同定法としてはオクテルロニー(Ouchterlony)
法、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法等がある。オクテルロ
ニー法は簡単ではあるが、単クローン抗体の濃度が低い
場合には濃縮しなければならない。

ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いれば培養上清をその
まま、抗原吸着固相と反応させ、さらに第２次抗体とし
て各種ＩｇＧサブクラスに対する抗体を用いることが可
能である。

さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法および
280nmでの吸光度〔1.4(OD₂₈₀)＝イムノグロブリン１μ
ｇ／ｍ〕より算出することができる。

以下の実施例で述べるように、このような方法により、
ＮＺ−11と命名したハイブリドーマから得られるモノク
ローナル抗体がＩｇＧクラスのイソタイプであり、Ｉｇ
Ｇ_１のサブクラスに属するものであることが判明した。

かくして得られたモノクローナル抗体はヒトＧ−ＣＳＦ
に対して高い特異性をもっており、更に上記ハイブリド
ーマの培養によって、均一かつ大量に得られるため、ヒ
トＧ−ＣＳＦ精製・回収用のアフィニティクロマトグラ
フィー法におけるリガンドとして用いることが可能であ
る。

アフィニティクロマトグラフィー法は、混合物から担体
に特異的に結合する物質のみを単離精製する場合、極め
て効果的な方法であり、混合物のゲル濾過と比較して、
必要な精製過程を大巾に減少することができる。

このアフィニティクロマトグラフィーにおいて有用な固
定化モノクローナル抗体は各種酵素の固定化方法に準じ
て行うことができ、例えばＣＮＢｒ活性化担体を使用す
る方法が一般的に利用でき、またこのような担体として
はクロマトグラフィーに一般的に使用されている各種材
料、例えばセルロース、アガロース、架橋デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスあるいはこれら
の担体にスペーサを導入したもの、特にセファロース４
Ｂ、アフィゲル(Affigel)-10、バイオゲル(Biogel)など
が好ましい例として挙げられる。

この固定化モノクローナル抗体を用いて実際にヒトＧ−
ＣＳＦを精製するには、これらをカラムに充填した後、
これにヒトＧ−ＣＳＦを含む溶液を通塔する。この操作
で50〜70％のヒトＧ−ＣＳＦがカラムに吸着される。溶
媒、例えばグリシン−ＨＣｌ緩衝液（pH2.5)、塩化ナト
リウム溶液、プロピオン酸、ジオキサン、エチレングリ
コール、カオトロピック塩、塩酸グアニジンまたは尿素
などで溶出することにより、吸着したヒトＧ−ＣＳＦが
高純度で溶出する。

本発明のモノクローナル抗体はまた免疫化学的測定法に
より、ヒトＧ−ＣＳＦを定量するためにも使用できる。

免疫学的定量法は、それぞれの抗原物質に対応する抗体
が、選択的に反応するという抗原抗体反応の特異性に基
づく反応を応用したものであり、検出感度も高く、抗原
物質、抗体価の定量を行うのに適している。

既に述べた様に、免疫学的定量法としては、例えばＲＩ
Ａ法、ＥＬＩＳＡ法、螢光抗体法、受身血球凝集反応法
等があり、種々の点においてＥＬＩＳＡ法が最も適して
いる。

ＥＬＩＳＡ法に基づいた本発明の抗ヒトＧ−ＣＳＦモノ
クローナル抗体を用いた、ヒトＧ−ＣＳＦの定量法は、
例えば、以下のようにして行われる。即ち、本発明によ
る特異的抗体を固相に吸着させ、抗原と無関係なタンパ
ク質により、該抗体により吸着されていない固相表面を
おおう。該表面を洗浄後、酵素標識抗原と試料とを加
え、反応させる。これに酵素基質を加え、試料添加によ
る吸光度の減少を測定することにより、抗原の定量を行
うことができる。

実施例以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する
が、以下の実施例はなんら本発明の範囲を限定しない。

以下の実施例において利用したＣＳＦ活性（以下ＣＳＡ
と略す）の測定法は次のとおりである。

「ＣＳＡの測定方法」 (a)ヒト骨髄細胞を用いる場合：ブラドレイティー．アール．，メトカルフディー．
（Bradley T.R.,Metcalf D.）等の方法〔オーストラリ
アンジャーナルオブエクスペリメンタルバイオ
ロジカルアンドメディカルサイエンス(Aust.J.ex
p.Biol.med.Sci.)44,287〜300(1966)〕に準じて単層軟
寒天培養法により行った。すなわちＦＣＳ0.2ｍ、被
検体0.1ｍ、ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液0.1ｍ（１
〜２×10⁵有核細胞）、改変マッコイ(McCoy's)５Ａ培養
液0.2ｍ、寒天を0.75％含む改変マッコイ５Ａ培養液
0.4ｍを混合して直径35mmの組織培養プラスティック
ディッシュに入れて固まらせた後、37℃、５％炭酸ガス
／95％空気、100％湿度の条件で培養を行い、10日後に
形成されたコロニー数（50個以上の細胞からなる集落を
１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する
活性を１単位(Unit)としてＣＳＡを求めた。

(b)マウス骨髄細胞を用いる場合：ウマ血清0.4ｍ、被検体0.1ｍ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（メ
ス）マウスの骨髄細胞浮遊液0.1ｍ(0.5〜１×10⁵有核
細胞）、寒天を0.75％含む改変マッコイ５Ａ培養液0.4
ｍを混合し、直径35mmの組織培養用プラスチックディ
ッシュに入れて固まらせた後、37℃、５％炭酸ガス／95
％空気、100％湿度の条件にて５日間培養し、形成され
たコロニー数（50個以上の細胞からなる集落を１コロニ
ーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１
単位(Unit)としてＣＳＡを求めた。

尚、上記(a)、(b)の方法において用いた「改変マッコイ
５Ａ培養液および(a)で用いたヒト骨髄非付着性細胞浮
遊液は次の如くして作製した。

(i)「改変マッコイ５Ａ培養液（２倍濃度）」マッコイ５Ａ培養液〔ギブコ(GIBCO)社製〕12ｇ、ＭＥ
Ｍアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55ｇ、重炭
酸ナトリウム2.18ｇ，ペニシリンＧカリウム5000単位を
２回蒸溜水500ｍに溶解後、0.22μｍのミリポアフィ
ルターにて濾過滅菌を行った。

(ii)「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭＩ−1640培
養液にて５倍に希釈し、フィコール−パック（Ficol-Pa
que：ファルマシア社製）に重層し、400×ｇ、30分、25
℃にて遠心を行い、界面の細胞層（比重＜1.077)を回収
する。この細胞を洗滌後、20％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−
1640培養液にて５×10^-6Cells／ｍの濃度に調製し、2
5cm²の組織培養用プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガ
ス培養器にて30分インキュベートした後、上清の非付着
性細胞を回収し、再度25cm²の組織培養用プラスチック
フラスコに入れ、２時間30分インキュベートした後、上
清の非付着性細胞を集めて用いた。

実施例１ (a)抗原タンパク質（ヒトＧ−ＣＳＦ）の調製ヒトＧ−ＣＳＦを特異的に産生する細胞株ＣＨＵ−２
を、10％ＦＣＳ含有Ｆ−10培養液を入れた150cm²の培養
フラスコ２本を用いて培養した。細胞が完全に密に増殖
した時点で細胞を回収し、これを10％ＦＣＳ含有ＲＰＭ
Ｉ−1640培養液500ｍに浮遊させたのち、1580cm²のガ
ラス製ローラーボトル〔ベルコ(Belco)社製〕に移し、
0.5r.p.m.の速度で回転培養を行った。細胞がローラー
ボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血清
を含まないＲＰＭＩ−1640に交換し、４日間培養したの
ち培養上清を回収し、10％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−1640を
加えて培養を続行する。３日間培養した後、再び血清を
含まないＲＰＭＩ−1640への液替えを行い、４日後に培
養上清を回収した。以下同様の操作を繰り返すことによ
り、毎週１ボトルより500ｍずつの血清を含まない培
養上清が得られ、しかもこの方法によりかなり長期間に
わたって細胞を維持し、培養上清を回収することが可能
であった。

得られた培養上清５を１バッチとし、これに0.01％ツ
ィーン20を添加後、ホローファイバー(Hollow Fiber)
ＤＣ−４およびアミコン(Amicon)ＰＭ−10（アミコン社
製）を用いた限外濾過法により約1000倍に濃縮したの
ち、これを以下の順序で精製した。

(i)直径4.6cm、長さ90cmのウルトロゲル(Ultrogel)Ａｃ
Ａ54カラム（ＬＫＢ社製）を用い、0.15ＭＮａＣｌお
よび0.01％ツィーン20（半井化学社製）を含む0.01Ｍト
リス塩酸緩衝液(pH7.4)を用いて前記濃縮した培養上清
５ｍを流速約50ｍ／時でゲル濾過した。尚、カラム
はあらかじめＢＳＡ（分子量67,000)、オボアルブミン
（分子量45,000)、チトクロームＣ（分子量12,400)にて
キャリブレーションにしたものである。ゲル濾過終了
後、各画分より0.1ｍずつを採取し、10倍に希釈した
後、前述した「ＣＳＡの測定方法(b)」により活性を示
す画分を調べた。この結果、先ずＶｅ＝400〜700ｍの
画分がマクロファージ優位のＣＳＡを示し、Ｖｅ＝800
〜1200ｍの画分が顆粒球優位のＣＳＡを示すことがわ
かったので、後者の画分を集めＰＭ−10（アミコン社
製）を用いる限外濾過法によって約５ｍに濃縮した。

(ii)上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成社製、
アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％トリフルオロ酢
酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、15,0
00r.p.m.にて10分間遠心分離することにより沈澱を除去
した。次いで、先のｎ−プロパノールおよびトリフルオ
ロ酢酸を含む水溶液で平衡化したマイクロボンダパッ
ク（μBondapak）Ｃ１８カラムウォーターズ(Waters)社
製、セミ分取用、８mm×30cm〕に吸着後、30〜60％の直
線濃縮勾配のｎ−プロパノールを含む0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速流体クロマト装置は
日立685−50型を、検出は日立638−41型検出器（いずれ
も日立製作所製）を用い、220nmと280nmの吸収を同時に
測定した。溶出後、各画分より10μを分取し、100倍
希釈したのち、前述の「ＣＳＡの測定方法(b)」により
活性を示す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノール
40％にて溶出されるピークに活性が認められたので、こ
のピークを集め再度同じ条件でクロマトグラフィーにか
け、溶出を行い上記と同様にしてＣＳＡを調べたとこ
ろ、やはりｎ−プロパノール40％の位置のピークに活性
が認められたので、このピークに対応する画分を集め
（４画分＝４ｍ）、凍結乾燥した。

(iii)上記凍結乾燥粉末を、ｎ−プロパノールを40％含
む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μに溶解し、ＴＳ
Ｋ−Ｇ3000ＳＷカラム（東洋曹達社製、7.5mm×60cm）
を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にか
けた。溶出は同水溶液により0.4ｍ／分の流速で行
い、フラクションコレクターＦＲＡＣ−100（ファルマ
シア社製）により0.4ｍずつ分取した。分取した各画
分についてＣＳＡを前記と同様にして調べた結果、保持
時間が37〜38分の画分（分子量約２万に相当）に活性が
認められたので、この画分を回収し、更に分析用マイク
ロボンダパックＣ18カラム(4.6mm×30cm)による精製
操作を施したのち、メインピークを回収し凍結乾燥し
た。得られた標品について前述の「ＣＳＡの測定方法
(a)」によって検定したところヒトＧ−ＣＳＦ活性を有
することを認めた。

以上の如くして得たヒトＧ−ＣＳＦは分子量19000±100
0（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であり、Ｎ末端から21残基目ま
でのアミノ線配列は、次の如くであった。

Ｈ_２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−(10) Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−（Ｃｙｓ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ(20) −Ｘ−Ｖａｌ− (b)免疫マウス脾細胞の調製８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス３匹にアジュバントとし
て水酸化アルミニウムゲル２mg／匹と、抗原として上記
(a)で得たヒトＧ−ＣＳＦ20μｇ／匹を腹腔内投与し免
疫した。

以後、２週間おきにヒトＧ−ＣＳＦを20μｇ／匹腹腔内
に投与し、２回目以降の免疫をかけた。３回目の免疫以
降、免疫の５〜７日後に眼底静脈叢より採血し、血清中
の抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体価を前述の固相法による酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で調べた。

（固相酵素免疫法） 96穴のＥＩＡ用プレート〔イムノプレート(Immunoplat
e)II，ヌンク(Nunc)社製〕に、特異的抗原〔ヒトＧ−
ＣＳＦが１μｇ／mlとなるように、0.1Ｍグリシン−NaO
H緩衝液、pH9.0で希釈した溶液〕を40μ／穴づつ分注
し、室温で２時間放置して抗原をプレート穴底面にコー
トさせ、その後10％ＦＣＳ／リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）
混合溶液200μ／穴当て分注し、室温で30分放置し
て、プレート底面上の蛋白質結合性残基をＢＳＡでコー
トする。上記プレートをＰＢＳでよく洗滌後、第１抗体
として、段階希釈した試料（マウス血清、ハイブリドー
マ培養上清、モノクローナル抗体等）を40μ／穴分注
し、室温で２時間放置する。ＰＢＳで３回洗滌後、第２
抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ−パーオキシダーゼ結
合物の100倍希釈液を40μ／穴分注し、室温で２時間
放置する。ＰＢＳで洗滌後、パーオキシダーゼ基質液
（１％過酸化水素水、0.1Ｍ酢酸−0.05Ｍリン酸緩衝
液、２ｍＭ２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベン
ゾチアゾリンサルフェート）200μ／穴を分注し、
室温で10〜30分間放置後、414nmで比色定量し、抗体価
を算出する。

３回免疫以降３匹全例で抗体価が認められたが、ＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体を効率よく得るために、さ
らに免疫を行った。

最後にヒトＧ−ＣＳＦ20μｇ／匹を腹腔内投与して追加
免疫し、３日後、このマウスから脾細胞を調製して細胞
融合に用いた。

(c)マウス骨髄腫細胞の調製８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕ１を正
常培地〔ＲＰＭＩ−1640にグルタミン1.5ｍＭ、２−メ
ルカプトエタノール５×10^-5Ｍ、ジェンタマイシン10μ
ｇ／ｍおよびＦＣ0.1μ／ｍを加えた培地〕に培
養し、４日後に２×10⁷以上の細胞を得た。

(d)ハイブリドーマの作製ＭＥＭ（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾細
胞1.2×10⁸個とマウス骨髄脾細胞Ｐ３−Ｕ１1.2×10⁷個
を混合し、1000rpmで５分間遠心分離にかけた。

沈殿として得られた脾細胞およびＰ３−Ｕ１を混合した
細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら37℃、ポリエチ
レングリコール−1500（ＰＥＣ−1500)２ｇ，ＭＥＭ２
ｍを加え、１分後に600r.p.m.で５分間遠心分離した
後、５ｍのＨＢＳＳ溶液及び５ｍの20％ＦＢＳ／Ｍ
ＥＭ溶液を静かに加えて細胞をほぐし、１分後さらに1,
000r.p.m.で５分間遠心分離して上清を捨て、５ｍの
ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン10^-4Ｍ、アミノ
プテリン４×10^-7Ｍ、チミジン1.5×10^-5Ｍを加えた培
地）を加えて再び細胞をほぐし懸濁させた。

(e)ハイブリドーマ群の選別懸濁液を24穴培地用プレート「フロウラボラトリー(F
low Laboratory)社（米）製〕に１ｍ／穴づつ分注
し、５％ＣＯ_２、95％空気中のＣＯ_２インキュベーター
中、37℃で24時間培養した。培養プレートに１ｍ／穴
のＨＡＴ培地〔上記正常培地にヒポキサンチン10^-4Ｍ、
チミジン1.5×10^-5Ｍおよびアミノプテリン４×10^-7Ｍ
を加えた培地〕を加え、さらに24時間培養した。培養上
清１ｍを捨て、あらたにＨＡＴ培地１ｍを加え、37
℃でさらに24時間培養した。培養上清１ｍを捨て、Ｈ
ＡＴ培地１ｍを加え、37℃でさらに10〜14日間培養し
た。

コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上清１ｍを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培地より
アミノプテリンを除いた培地〕を１ｍ加えて37℃で培
養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い、培
養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗ヒトＧ−
ＣＳＦ抗体価を上記の固相酵素免疫測定法により測定し
た。

(f)クローニング抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰返し、安定して抗体価の認められた
クローンを抗ヒトＧ−ＣＳＦモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ株として選択した。

(g)モノクローナル抗体の部分精製プリスタン処理〔２，６，10,14−テトラメチルペンタ
デカン0.2ｍ／匹を腹腔内投与し、１週間飼育〕した
８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに上記で得られたハイブ
リドーマ株５×10⁶Cells／匹を腹腔内注射した。10−21
日後にハイブリドーマ株は腹水癌化する。10〜21日後に
腹水のたまったマウスから腹水（１〜10ｍ）を採取
し、遠心分離し、固形分を除去、上清をモノクローナル
抗体とした。

(h)モノクローナル抗体の検定 (i)モノクローナル抗体の抗原特異性ニトロセルロース膜を用いたウエスタンブロックティン
グ法により、モノクローナル抗体がヒトＧ−ＣＳＦ（上
記抗原、および前述の「ＦＥＲＭＰ−8352」、「ＦＥ
ＲＭＰ−8453」、「ＦＥＲＭＰ−8454」の遺伝子を
トランスフォームしたトランスフォーマントが産生した
ヒトＧ−ＣＳＦ）に特異的なものであることを確認し
た。

(ii)モノクローナル抗体の分類上述の固相酵素免疫測定法（上記工程(b)参照）によ
り、この抗体はＩｇＧ_１サブクラスの抗体であると同定
された。

実施例２アフィニフィクロマトグラフィー法によるヒ
トＧ−ＣＳＦの精製実施例１で得られた抗ヒトＧ−ＣＳＦ1.5mgを溶解した
ＰＢＳをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ〔ファルマシ
ャファインケミカルズ(Pharmacia Fine Chemicals)
社製〕１ｍと反応させ、固定化モノクローナル抗体を
得た。この固定化モノクローナル抗体をカラムに充填
し、そのカラムに101μｇのヒトＧ−ＣＳＦを含んだＣ
ＨＵ−２細胞株の培養上清20ｍを通塔したところ、63
μｇ（約62％）にヒトＧ−ＣＳＦがカラムに吸着した。

次に、ＰＢＳで洗浄した後pH2.5のグリシン−ＨＣｌ緩
衝液で溶出したところ60μｇ（吸着量の95％）のヒトＧ
−ＣＳＦが溶出した。この１回の通塔によりヒトＧ−Ｃ
ＳＦが約675倍精製された。

実施例３固相酵素免疫測定法 96穴のＥＩＡ〔エンザイムイムノアッセイ(Enzyme
Immuno Assay)用プレート〔イムノプレート(Immunoplat
eII），ヌンク(Nunc)社製〕に特異抗原〔ヒトＧ−Ｃ
ＳＦを0.1Ｍ−グリシン−ＮａＯＨ緩衝液(pH9.0)に１μ
ｇ／ｍの濃度で溶解したもの〕を40μ／穴ずつ分注
し、室温で２時間放置して抗原をプレート穴底面にコー
トさせ、その後10％、ＦＣＳ／ＰＢＳ〔0.05％ツィーン
(Tween20)および0.01％メルチオレート(Merthiolate)を
含む〕溶液200μ／穴を分注し室温で30分間放置して
プレート底面上の蛋白質結合性残基を血清蛋白でコート
する。このプレートをＰＢＳ−ＴＭ（ＰＢＳに0.05％ツ
イーン20,0.01％メルチオレートを加えたもの）でよく
洗浄した後、第一次抗体としてこのモノクローナル抗体
を40μ／穴当て分注し、室温で２時間放置する。その
後、ＰＢＳ−ＴＭでよく洗浄後、第二次抗体としてヤギ
の抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−パーオキシダーゼ結合物〔カ
ペル(Cappel)社製〕の100倍希釈液を40μ／穴分注
し、室温で２時間放置する。

ＰＢＳ−ＴＭで十分に洗浄した後パーオキシダーゼ基質
液〔１％過酸化水素水、0.1Ｍ酢酸−0.05Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液、２ｍＭＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ジ
−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−サルフェー
ト））〕200μ／穴当て分注し、室温で10〜30分放置
後414nmで比色定量し、抗体価を算出する。

この方法によりコートするヒトＧ−ＣＳＦの量を変えて
検出できる最小のヒトＧ−ＣＳＦ量を求めたところ、添
付第１図に示すとおり、Ａ_４１４＝0.100付近までとす
ると、約30ngまでであることがわかった。また、上記方
法の変法として第二次抗体にウサギ抗マウスＩｇＧを用
い、さらに第三次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ−パー
オキシダーゼ結合物を用いることにより10倍感度が上が
り、約５ngまで検出できることも確認した。

さらに、ヒトＧ−ＣＳＦ以外にも爽雑物を含む液状物中
のヒトＧ−ＣＳＦの定量は、第１次抗体とこのサンプル
とを混合して反応させ、洗浄後同様の手法で第２次抗体
及び基質液を加えて、吸光度の減少を測定することによ
り、実施することができた。

発明の効果かくして、得られた抗ヒトＧ−ＣＳＦモノクローナル抗
体により、該抗体をリガンドとして用いた新規アフィニ
ティクロマトグラフィー法、および免疫化学的定量法を
行うことが可能となり、ヒトＧ−ＣＳＦ単離精製の精度
を向上させるとともに、その簡略化を行うことができ
た。その結果、大量のヒトＧ−ＣＳＦ含有培養上清を扱
い、大量かつ純度の高いヒトＧ−ＣＳＦを得ることがで
きるようになった。

また、本発明によるモノクローナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗
体は、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子ｃＤＮＡある
いは染色体由来の遺伝子を大腸菌あるいは動物細胞にト
ランスフォームして得られるトランスフォーマントが産
生するヒトＧ−ＣＳＦとも反応するため、該ヒトＧ−Ｃ
ＳＦの単離精製にも効果よく適用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体
を用いた拮抗阻害法によるヒトＧ−ＣＳＦ定量の検量線
を示すグラフであり、ヒトＧ−ＣＳＦの添加量に伴う吸
光度変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト顆粒球コロニー刺激因子で免疫した脾
臓脂胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマによって生
産され、かつ、ヒト顆粒球コロニー刺激因子に反応する
ことを特徴とするモノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー
刺激因子抗体。
【請求項２】該モノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー刺
激因子抗体がＩｇＧイソタイプに属することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】該モノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー刺
激因子抗体がＩｇＧ_１サブクラスに属することを特徴と
する特許請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】上記脾臓細胞がマウス脾臓細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノクローナ
ル抗体。
【請求項５】固体担体上にヒト顆粒球コロニー刺激因子
で免疫した脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドー
マによって生産され、かつ、ヒト顆粒球コロニー刺激因
子に反応するモノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー刺激
因子抗体を結合してなる吸着剤にヒト顆粒球コロニー刺
激因子含有液を接触させてヒト顆粒球コロニー刺激因子
を吸着させ、次いで溶出し、吸着分としてヒト顆粒球コ
ロニー刺激因子を取得することを特徴とするヒト顆粒球
コロニー刺激因子の精製方法。
【請求項６】上記固体担体がセルロース、アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス
あるいはこれらの担体にスペーサを導入したものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のヒト顆粒
球コロニー刺激因子の精製方法。
【請求項７】上記溶出をグリシン−ＨＣ１緩衝液、塩化
ナトリウム溶液、プロピオン酸、ジオキサン、エチレン
グライコール、カオトロピック塩、塩酸グアニジンまた
は尿素で行うことを特徴とする特許請求の範囲第５項ま
たは第６項記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子の精製方
法。
【請求項８】上記脾臓細胞がマウス脾臓細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第５項記載のヒト顆粒球コ
ロニー刺激因子の精製方法。
【請求項９】ヒト顆粒球コロニー刺激因子で免疫した脾
臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマによって生
産され、かつ、ヒト顆粒球コロニー刺激因子に反応する
モノクローナル抗ヒト顆粒球コロニー刺激因子抗体を用
いることを特徴とするヒト顆粒球コロニー刺激因子の免
疫化学的定量方法。
【請求項１０】上記免疫化学的定量方法が放射性同位元
素免疫アッセイ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法または受
身血球凝集反応法であることを特徴とする特許請求の範
囲第９項記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子の免疫化学
的定量方法。
【請求項１１】上記脾臓細胞がマウス脾臓細胞であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第９項または第１０項記
載のヒト顆粒球コロニー刺激因子の免疫化学的定量方
法。