JPS63501769A - ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子に対するモノクローナル抗体及び該抗体を用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリドーマ細胞株及びヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子に対するそれ らのモノクローナル抗体 発明の背景 本発明は、一般に、生物学的液体からの造血成長因子（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ ｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｃｔｏｒ　）の単離及び定量的検出のための免疫学的 操作において利用される物質及び方法に関する。詳しくは、本発明は、新規ハイ ブリドーマ細胞株（Ａ、Ｔ、Ｃ１Ｃ，ＨＢ−８９５７、Ａ、　Ｔ、　Ｃ。

Ｃ，ＨＢ−８９５８、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５９、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ −８９６０、Ａ、　Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６１及びＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０ＨＢ−８ ９６２によって例示されるもの）により産生され造血成長因子と特異的に反応す るモノクローナル抗体、並びにアフィニティー精製技術による造血成長因子の単 離、造血成長因子の検出アッセイ及びこのような成長因子の研究のための免疫学 的技術におけるこれら抗体の用途に関する。更に詳しくは、本発明は、天然及び 組換え体由来のヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ−ＣＳＦ）と特 異的に反応するモノクローナル抗体に関する。

ヒト血液形成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マクロファージ及び好塩基 球／肥満細胞を含む）、赤血球（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／ 血小板）を補給する。平均的ヒト男性の造血系は毎年顆粒球及び赤血球を４．５ Ｘ１０”個のオーダーで産生ずると見積られており、この量は全体重を１年で入 れ替えた量に相当する。デクスターら、バイオエッセイズ、第２巻。

第１５４−１５８頁、１９８５年（Ｄｅｘｔｅｒ　ａｔ　ａｌ、。

ＢｌｏＥｓｓａｙｓ、　２．１５４−１５８　（１９８５））参照。

ある造血成長因子は、少量で少数の前駆“幹細胞”から様々な血液細胞系への分 化、これらの系の著しい増殖、及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化 の原因をなしていると考えられている。造血成長因子は極端に少量で存在してい るため、これら因子の検出及び確認はアッセイの仕方に依存していたが、現在ま でのところでは人工的条件下での培養細胞への刺激作用に基づき様々な因子の中 から区別し得るにすぎなかった。その結果、多数の名称が非常に少数の因子を表 示するために用いられてきた。例えば、このような混乱のために、ＩＬ−３、Ｂ ＰＡ、マルチ−Ｃ８Ｆ、ＨＣＧＦＳＭＣＧＦ及びＰＳＦという用語が用いられて いるが、これらはすべて単一のマウス造血成長因子に該当すると現在では考えら れている。メトカーフ、サイエンス、第２２９巻、第１６−２２頁、１９８５年 組換え遺伝子工学の利用により、この混乱から一定の秩序を見出すことができた 。例えば、赤血球産生を促進するヒトエリスロボエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配 列が明らかにされた（リン′（Ｌｌｎ）、１９８５年６月２０日公開のＰＣＴ公 開出願第８５１０２６１０号明細書参照）。

組換え方法は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ） 及びヒトマクロファージ特異的コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）に関するｃＤＮ Ａの単離のためにも利用された〔リーら、プロシーディンゲス幸オブ争ナショナ ルゆアカデミ−拳オブゆサイエンシズ（ＵＳＡ）、第８２巻、第４３６０−４３ ６４頁、１９８５年（Ｌｅｅ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｆ。

（ＵＳＡ）、８２．４３６０−４３６４　（１９８５）、ウオン（Ｖｏｎｇ）ら 、サイエンス、第２２８巻、第８１０−８１４頁（１９８５）、およびコワサキ （Ｋｏｖａｓａｋｌ）ら、サイエンス、第２３０巻、第２９１−２９６頁（１９ ８５））。

ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈｐＣＳＦ）又はプルリボエチン（ｐｌｕｒ ｉｐｏｌｅｔｌｎ）と称されるヒト造血成長因子は、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，寄託 番号ＨＴＢ　−９としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国 、メリーランド州、ロックビルに制限的条件下で寄託されたヒト膀胱癌細胞株５ ６３７の培地中に存在していることが示された。この細胞系から精製されたｈｐ ＣＳＦは、ヒト骨髄前駆細胞を用いたアッセイにおいて、すべての主な血液細胞 型の産生につながる多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進することが報告さ れた。ウェルト（Ｗｅｌｔｅ　）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ アカデミ−、オブ・サイエンシズ（ＵＳＡ）、第８２巻、第１５２６−１５３０ 頁（１９８５）。

予備研究では、ｈｌ）ＣＳＦと確認された因子がヒトＣＦＵ−ＧＭアッセイにお いて最初の７日間にわたり主に顆粒球コロニー刺激活性を有することが示されて いる。

ヒトＣ３Ｆ−βと称される別の因子も、ヒト膀胱癌細胞株５６３７から単離され ており、未標識マウス顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の場合と同一の用 量応答関係でＷＥＨＩ−３８Ｄ＋細胞との結合性に関しマウス１２５１−標識Ｇ −ＣＳＦの競合体であるとして記載されていた〔ニコラら、ネーチャー、第３１ ４巻、第６２５−６２８頁（Ｎｉｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、 　３１４　。

８２５−８２８　（１９８５））　）。この用量応答関係は未標識マウスＧ−Ｃ ３Ｆに対して独特であると既に報告されており、Ｍ−ＣＳＦＳＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ 　１−３のような因子では生じ得ない〔ニコラら、プロシーディンゲス・オブ・ ナショナルφアカデミー◆オブ・サイエンシズ（Ｕ　Ｓ　Ａ）、第８１巻、第３ ７６５−３７６９頁（１９８４）。更に、メトカーフら、リューケミア・リサー チ、第９巻、第５号、第５２１−５２７頁、１９８５年（ＬｅｕｋｅＩｌｉａＲ ｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、９．Ｎｏ、５．ｐｐ５２１−５２７　（１９８５）） 参照。Ｃ３Ｆ−β及びＧ−Ｃ３Ｆは、それらがＷＥＨＩ−３８Ｄ＋細胞の分化を 誘導する高い能力を有していることから、Ｃ５Ｆ類の中では同様に独特である〔 ニコラら、イムノロジー・トウデー、第５巻、第７６−８０頁（１９８４）（Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、５．７６−８０　（１９８４））　）　ｏ高 濃度では、Ｇ−Ｃ３Ｆは混合顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞を刺激す るが〔ニコラら、１９８４年、同上〕、このことは予備結果がヒト骨髄培養物と ｈｐＣ８Ｆとの１４日間のインキュベート後、顆粒球性、単球性、混合顆粒球性 ／単球性及び好酸球性のコロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の出現を示していること と一致する。Ｃ３Ｆ−βもマウス骨髄細胞を用いたアッセイにおいて好中性顆粒 球性コロニーの形成を促進するとして記載されていたが、このような性質は因子 をＧ−Ｃ３Ｆとして確認するための基準となっていたものである。これらの類似 性に基づき、ヒトＣ３Ｆ−βはＧ−ＣＳＦ　（顆粒球性コロニー刺激因子）と同 一であることが確認された。ニコラら、ネーチャー、第３１４頁、第６２５−６ ２８頁、１９８５参照。

これらの共通の性質に基づくと、ニコラらの上記のヒ）Ｃ５Ｆ−β及びウェルト らの上記のｈｐＣ３Ｆは適切にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐ Ｇ−ＣＳＦ）と称される同一の因子であるらしい。

引用により本明細書に組入れられる“多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の産生 ″に関する１９８５年８月２３日に出願された共同所有かつ同時係属中の米国特 許出願第７６８，９５９号明細書において、ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激 因子の一次構造コンホーメーションの一部もしくは全部及びその生物学的性質の うち１つ以上を有する新規組換え産生ポリペプチド類が開示されている。このポ リペプチド類をコードするＤＮＡ配列、このポリペプチド類をコードする形質転 換宿主細胞及び組換え法によるこの因子の合成方法も開示されている。

本発明の背景に関して重要なことは、選択された抗原物質に対して高度に特異的 なモノクローナル抗体を産生ずる腫瘍細胞株を製造するためのハイブリドーマ技 術に対して向けられている最近の研究である。モノクローナル抗体産生技術は当 該技術分野において一般に周知である。これらの操作の代表的解説は、ワンズ、 ジェイ・アール及びツラウスキー、ブイΦアール、ガストロエンテロロジー、第 ８０巻、第２２５頁、１９８１年（Ｗａｎｄｓ。

Ｊ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｚｕｒａｖｓｋｉ、　Ｖ、Ｒ，、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ ｌｏｇｙ　８０：２２５（１９８５））　、マーシャク−ロートシュタインら、 ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１２２巻、第２４９１頁。

１９７９年（Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ。

１２２：　２４９１　（１９７９）、オイ、ブイ・ティー及びエル・ニーΦヘル ツエンベルグ、　“免疫グロブリン産生ハイブリッド”、ミツシェル、ビー・ビ ー及びニス拳エム９シイギ（編集）、細胞免疫学における選択される方法、サン フランシスコニダブリニー・エッチ・フリーマン、パブリッシング、１９７９年 （Ｏｌ、Ｖ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｌ、Ａ、　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ。

”１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｙｂｒｉｄ、”　Ｍ ｌｓｈｅｌｌ、　Ｂ、Ｂ。

ａｎｄ　Ｓ、Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ　（ｅｄｓ、）　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　ｌｌｌ１ａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｓａｎ　Ｆｒ ａｎｃｔｓｃｏ：　Ｗ、Ｈ，ＦｒｅｅｍａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　１９７９ ）　、およびゴーディング、　“ハイブリドーマによる抗体産生２．ジャーナル ・オブ・イムノロジカル・メソッド、第３９巻、第２８５−３０８頁。

１９８０年［Ｇｏｄｉｎｇ、　”Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂ ｙＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　３９．２８ ５−３０８　（１９８０））でみることができる。簡単に要約すると、所望抗原 を予め注射した動物の牌臓から摘出されるリンパ球は、ポリエチレングリコール の存在下でミエローマ細胞と融合するよう誘導される。多数の“ハイブリッド２ ミエローマ細胞が融合により産生される。各々の“ハイブリドーマ。

細胞培養物の増殖液の上澄は望ましい抗体活性の存在に関して試験される。この ような活性が一つの細胞培養上澄中に存在する場合には、限界希釈法によりクロ ーニングされ、クローンは上澄活性について個別に試験される。

それらの免疫学的性質の高度に特異的な性質から、／％イブリドーマ技術に従っ て製造されるモノクローナル抗体は、診断試薬、治療剤及び粗製源からの特異的 交叉反応性抗原タンパク質のアフィニティー精製用試薬としての用途が提案され た。例えば、トレンズ・イン・バイオテクノロジー、第３巻、第７号、１９８５ 年７月（Ｔｒｅｎｄｓ　１ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＶｏｌＪ、Ｎｏ、 ７（Ｊｕｌｙ、１９８５））並びに米国特許第４．４６５，６２４号、第４．５ １４，５０５号及び第４，５１４，５０７号明細書参照。

ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のような造血成長因子を検出、単離、精 製及び研究するために使用される特異的モノクローナル抗体の実質的必要性が存 在するにもかかわらず、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆに対するモノクローナル抗体を得る上で ハイブリドーマ技術の適用が成功したという報告はなかった。

簡単な要約 本発明は、抗原／抗体反応によりヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子と特異 的に免疫反応するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を初めて 提供する。実例として、本発明は新規なマウス由来ハイブリドーマ細胞株、即ち Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５８、Ａ、　Ｔ 、Ｃ，Ｃ。

ＨＢ−８９５９、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６０、Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６１及びＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６２を提供す るが、これらは各々その増殖した培地の上澄の成分としてｈｐＧ−ＣＳＦと特異 的に反応するモノクローナル抗体を産生ずるものである。ハイブリドーマ細胞株 たるＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５８、Ａ、　Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５９、Ａ、Ｔ、Ｃ ，Ｃ，ＨＢ−８９６０、Ａ、　Ｔ。

Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６１及びＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６２は、米国メリ ーランド州２０８５２、ロックビル、バークローンドライブ１２３０１．アメリ カン・タイプ・カルチア−・コレクションに寄託されている。

本発明の実施に際し、ハイブリッド腫瘍細胞株は、オイ及びヘルッンベルグ、　 “免疫グロブリン産生ハイブリッド”、同上並びにゴーディング、　“ハイブリ ドーマによる抗体生産”、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、第３ ９巻、１９８０年、第２８５−３０８頁に記載されているような標準的免疫学的 技術を用いて製造される。天然ｈｐＧ−ＣＳＦで高度免疫化されたマウス由来の 牌臓細胞は、ポリエチレングリコールの存在下でマウスミエローマ細胞系と融合 される。各“ハイプリドーマ′細胞培養増殖物の上澄は、望ましい抗体活性の存 否に関して試験される。選択されたハイブリドーマ細胞は、その培養上澄中に高 度に特異的な抗ｈｐｃ−ＣＳＦ活性をもつ抗体を産生ずる細胞株を増やすために クローニングされる。

本発明のモノクローナル抗体は、天然又は組換え体からのｈｐＧ−ＣＳＦ　（及 び共通の又は類似のエピトープをもつ他の造血成長因子）のアフィニティー精製 及び単離のための免疫学的操作において用いられる。このような操作において、 選択され抗体は（例えばカラムに）固定され、供給源物質は固定された抗体と接 触せしめられる。ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ又は抗原的に類似の物質は、抗体と結合し、そ の結果高度に精製された形で固定抗体から溶離せしめられる。本発明の抗体は、 ｈｐＧ−Ｃ５Ｆの定量的検出用免疫学的操作（ＲＩＡＳＥＬＩＳＡその他）にお いて、単独で用いられるか又は互いに組合わせてもしくはポリモノクローナル抗 体と一緒に用いられる。本発明の抗体は、ｈｐＧ−ＣＳＦ又は類似因子の過剰産 生時にこのような因子と結合させるというイン・ビボでの利用性をも有している 。本発明の他の面は、下記の詳細な説明を考慮すれば明らかとなるであろう。

詳細な説明 下記の諸例は、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、Ａ。

Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５８、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５９、Ａ、　 Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６０、Ａ、　Ｔ。

Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６１、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ−株の製造、ｈｐＧ−ＣＳ Ｆに対する抗体の単離、並びにモノクローナル抗体の増幅及び特徴に関する本発 明の実施面について説明するものである。

更に詳しくは、例１は、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆに対するポリクローナル血清抗体の産生 に向けたマウス宿主の刺激、牌臓細胞とミエローマ細胞との融合、ハイブリドー マ細胞のスクリーニング、クローニング及び増殖、並びにそれからのモノクロー ナル抗体の単離に関する。例２は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ及びＲＩＡアッセイ、並びに 競合的阻害及び中和アッセイによる産生されるモノクローナル抗体の特徴づけ、 腹水法によるモノクローナル抗体収量の増幅に関する。例３は、本発明のモノク ローナル抗体の使用によるｈｐＧ−Ｃ５Ｆの単離及び精製のための操作について 記載する。例４は、本発明の抗体を用いたアッセイ技術の適用によるｈｐＧ−Ｃ ＳＦの定量的検出操作について記載する。

例Ｉ Ａ、ポリクローナル血清の製造 ＢＡＬＢ／Ｃマウスの各々に、米国特許出願第７６８、．９５９号明細書の例１ （ｂ）の操作に従いヒト膀胱癌細胞株５６３７　（サブクローンＩＡ６）からＨ ＰＬＣにより精製されたｈｐＧ−ＣＳＦを注射した。

この物質は純度８５％以上までＣＪＨＰＬＣカラムで精製され、５０％プロパツ ール及び１００ｍＭ酢酸アンモニウムからなる溶液（ｐＨ７）中において約６０ μｇ／ｍ１の濃度を有していた。１０匹のマウスに各々、ｈｐＧ−ＣＳＦ溶液１ ．２ｍｌからなる接種原のうち総量で約０．１ｍ１（ｖウス１匹当たりｈｐＧ− Ｃ３Ｆ７．２ｔｉｇ）をまず複数箇所に皮下注射したが、この溶液は高速減圧に より０．６ｍｌまで濃縮され、次いでＢＡＣＴＯ−フロイント完全アシュバン） Ｈ３７Ｒａ　（ＤＩＦＣＯ３１１Ｂ　−６０）　０．　６ｍｌと超音波処理によ り混合されたものである。１８日後、マウスに各々、０．７５ｍ１まで濃縮され かつフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製ＢＡＣＴＯ０６３９−６０ −６）０．７５ｍ１と混合されたｈｐＧ−ＣＳＦ溶液１．２ｍｌからなる接種原 のうち総量で約０．１５ｍ１（マウス１匹当たりｈｐＧ−ＣＳＦ７．２μｇ）を 複数箇所に皮下追加免疫注射した。

４日後、マウスから採血し、それらの血清を抗−ｈｐＧ−ＣＳＦ抗体の産生に関 してＲＩＡでスクリーニングした。血清アッセイで用いられたｈｐＧ−ＣＳＦは 、４回濃縮された、１００ｍＭ硫酸アンモニウム及び５０％プロパツール含有溶 液中約１００ｕｒ／ｍｌの濃度でかつ純度８０％のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ約０．５ｍｌ であった。上記溶液２５０ｕ　１を１５０μｌｌ、：濃縮し、５０ｍＭＣＯ３２ −／ＨＣＯ３１−緩衝液５ｍ１（ｐＨ９，２）と混合した。この物質５０μｌを 次いで９６ウエルトレー中の各ウェルに供し、室温で２時間及び４℃−夜インキ ユベートした。５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる阻止（ブロッキング） 化合物をウェル中で３０分間インキュベートした。１：５．１：２５．１　：　 ６２５及びに３１２５の比で希釈された試験血清並びに１：５及び１：１２５の 比で希釈されたコントロール（非接種）血清を５０μｌ／ウエルの量でウェル中 に加え、室温で２時間インキュベートした。次いでウェルをウォッシュ・ソリュ ーション（Ｗａｓｈ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　（カークガード・アンド・ぺり− ・ラボラトリーズ（Ｋｊｒｋｅｇｕａｒｄ　＆　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　ＫＰＬ　）　、ゲイザースバ←グ、メリーランド州〕を用いて３回洗 浄した。１２５■で標識されたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を次いで約１９９，０ ００カウント／分１５０μｌウェルとなるように加え、室温で１．５時間インキ ュベートした。次いでウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄し、それ らの放射能をガンマカウンターで計測した。

追加免疫注射の２１日後、抗ｈｐＧ−ＣＳＦ抗体の産生がＲＩＡで検出された５ 匹のマウスに３回目の注射を行なった。マウスを追加免疫注射の場合と同一の物 質で免疫し、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ約１０μｇ／マウスを投与した。

Ｂ、細胞融合 ハイブリドーマ産生操作において、接種マウスの肺臓細胞を破壊して、抗ｈｐＧ −ＣＳＦ抗体産生リンパ球を懸濁させる。これらの肺臓細胞をＳ　Ｐ　２１０ミ 工ローマ細胞株由来細胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成させる。膵臓及び ミエローマ細胞の細胞膜は、融合し、最初は２個以上の核を含む共通の細胞質を 囲っている。細胞膜融合の数日後、核は融合し、同期有糸分裂し得るようになる 。これらの融合細胞が分裂すると、双方の融合相手６不定数の染色体はハイブリ ッド細胞系が安定化するまで消失する。ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミ ジン（ＨＡＴ）培地はハイブリッド形成操作により産生される５Ｐ２１０　：　 ５Ｐ２１０ハイブリツド又は未融合　Ｓ　Ｐ　２１０細胞が増殖することを防止 するが、一方膵臓：膵臓細胞ハイブリッド又は未融合肺臓細胞は通常培養の２週 間後に死滅する。したがって、５Ｐ２１０：膵臓ハイブリッド細胞のみが培地中 で生存することになる。

二回目の追加免疫接種後３回目にマウスを頚部脱臼によって死亡させ、７０％エ タノールに浸漬させた。マウス牌臓を腹側から摘出し、ペニシリンＧ−ストレプ トマイシン溶液（ＩＸ”溶液）が補給されたＤＭＥＭ　（ダルベツコ修正イーグ ル培地、カタログに３２０−１８８５、ＧＩＢＣＯ社ロットＮ（Ｌｉ２に３２５ ２）を入れた氷上の無菌ペトリ皿中に移した。この液は以後“１×ＰＳ”溶液〔 アービン・サイエンティフィック社（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｌｅｎｔｌｆ’ｉｃ　 ）カタログＮｏ、９３６６３と称され、１ｍｌ当たりペニシリンＧ１００単位及 びストレプトマイシン１００μｇを含有する。膵臓に付着した脂肪組織を除去し 、膵臓を２ＸＰＳ（１ｍｔ当たりペニシリンＧ２００単位及びストレプトマイシ ン２００μｇ）含有ＤＭＥＭで２回洗浄し、氷上の無菌ストマツチャーバッグ（ ｓｔｏｍａｃｈｅｒ　ｂａｇ　）に入れた。バッグにＤＭＥＭ−２ＸＰＳ含有溶 液を加えた。膵臓をストマツチャー装置で破壊し、次いで無菌ガーゼ４層に通し て濾過し、５０ｍ１遠心管に入れた。バッグ及びフィルターをＤＭＥＭ−２×Ｐ Ｓ溶液からなる溶液４０ｍ１以内で洗浄した。次いで細胞をＩＥＣＮＨ−Ｓｎ遠 心分離機［ダモン／Ｉ　ＥＣ・ディビジョン（Ｄａｗｏｎ／ＩＥＣＤｉｖｉｓｌ ｏｎ）で１１０００ｒｐで１０分間遠心分離し、上澄を静かに吸引した。

次いで細胞をＤＭＥＭ−２ｘＰＳからなる溶液で２回及び添加剤なしのＤＭＥＭ で１回洗浄した。しかる後細胞をＤＭＥＭに再懸濁した。

ミエローマ細胞（ＳＰ２１０）をＩＸＰＳ及び１％牛脂児血清（ＦＢＳ）（アー ビン・サイエンティフィック社カタログＮｏ、３０００、ロットＮα２０９６０ ８、加熱不活化）含有ＨＢＩＯＩ培地中で増殖させ、対数増殖相中で３日間培養 した。Ｓ　Ｐ　２１０細胞をＩＥＣＮＨ−３ＩＩ遠心分離機で１１００Ｏｒｐで １０分間ペレット化することにより回収した。細胞をＤＭＥＭ溶液で洗浄し、次 いでＤＭＥＭ溶液に懸濁した。

次いで肺臓細胞を５０ｍ１遠心管中ミエローマ細胞と４＝１の比で混合し、１１ ０００ｒｐで１０分間遠心分離し、上澄を吸引した。しかる後ベレットをフード 付３７℃水浴中に入れた。ポリエチレングリコール〔分子量１５００、エム・ニ ー拳バイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　、カタログＮ ｏ、１７−７８０２．　ｏット魔４ＪＯ３０）を融解し、ＤＭＥＭ溶液と１＝１ の容量比で混合し、５０％溶液をつくった。次いで、ＰＥＧ溶液を下記操作に従 い細胞に加えた。最初の１分間において、５０％ＰＥＧ溶液１．０ｍｌを加えた 。次の１分間では、溶液をピペットで静かに攪拌し、円状の動きで一定に攪拌し たが、但し管の側部又は底部に触れることは避けた。

次の１分間では、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ及びＩＸＰＳからなる溶液１ｍｌを加 えた。次の１分間では、同一溶液１．０ｍｌを再び加えた。次の２分間では、同 一溶液８．０ｍｌを再び加えた。次いで混合物をＩＥＣＮＨ−８■遠心分離機で １１００Ｏｒｐで１０分間遠心分離した。遠心管中の上澄を吸引し、細胞を１０ ％ＦＢＳ及び１ｘＰＳ含有ＤＭＥＭからなる培地１００〜１５０　ｍｌに静かに 再懸濁した。次いで細胞懸濁液をＣＯ２インキュベーターで予め平衡化された８ 、５個の９６ウエルプレート上の約８００個のウェル中に懸濁液０．１ｍｌ／ウ ェルの割合で加えた。しかる後プレートを約７％ＣＯ２含有の３７℃のＣＯ２イ ンキユベーターに戻した。。

１日後、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ含有ＨＡＴ培地１００μｍを各ウェルに加え た。２日目、消費された培地１００μｍを各ウェルから吸引し、１０％ＦＢＳ含 有ＤＭＥＭ中の新鮮ＨＡＴ培地１００μｌと交換した。この操作は、２日目、４ 日目、７日目及び１１日目に繰返した。１４日目、消費された培地１００μｌを 各ウェルから除去し、ヒボキサンチン１．３６ａ＋ｇ／ｄｉ及びチミジン０．７ ６■／ｄｌ含有ＨＴ培地１００μｌと交換した。

この操作を１８日目、２２日目及び２６日目に繰返した。

２８日目、培養物に１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭからなる完全培地で栄養補給した 。培養物にしがる後この完全培地で週２回再度栄養補給した。１７日目、抗マウ スＩｇＧ抗体を用いて、免疫グロブリンの産生に関して、各ウェルをスクリーニ ングした。ＲＩＡ及びＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイでは、８００ウエル中の約２６０ がマウスＩｇＧに関して有意に陽性であった。

鳳−ｌ Ａ、モノクローナル抗体の初期的特徴 ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ｈｐＧ−ＣＳＦ抗体を産生ずるクローンの検出のため に行なった。５０ｍＭＣＯ３２−／ＨＣＯ３−緩衝液（ｐＨ９，２）で希釈した ９０％純度のｈｐＧ−ＣＳＦｌｏｏｎｇを含む溶液的５０μｌを９６ウエルトレ ーの各ウェルに加え、室温で２時間、４℃で一夜インキユベートすることによっ て被覆した。しかる後ウェルを５％ＢＳＡ阻止溶液で処理し、３０分間インキュ ベートした。

ハイブリドーマ培養物の上澄を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，０）で希釈 し、次いで被覆ウェルに加えて室温で２時間インキュベートした。しかる後ウェ ルをワラシュ・ソリューションで３回洗浄し、１：３ｏＯ希釈の西洋ワサビペル オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＭＢ　Ｎα６０５−２５０）で１．５ 時間処理した。

ウェルを次いでウォッシュ・ソリューションで５回洗浄し、ペルオキシダーゼ基 質ＡＢＴＳ　（ＫＰＬ）を５０μｌ／ウエルの割合で加えた。ウェルをティチル チック・マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃｏｎ）スペクトロ フォトメーター〔フロー・ラプス（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ　）　＊　マクリーン、 バージニア州〕で４１４ｎｍの吸光度の値について読んだ。ウェルのうちの２３ 個（Ｎα３，４，５，２０゜２１．２８，３５，３７，３９，４０．５８，６１ ゜６３．６４，６６．６８，７２，７４，７５，９８゜１５１．１８２及び２３ １）は還元ｈｐＧ−ＣＳＦと顕著に反応することが見出された。

陽性ウェルから得たハイブリッド細胞の正式なりローニングは、ウェル３個当た り細胞約１個となるような割合で他のウェルを使って細胞を希釈することにより 行なった。通常、活性ウェルからの正式なりローニングでは正式なりローンを産 生じ、この正式なりローンは同一のハイブリドーマ細胞のサブクローンとなって いたようであるが、数例の場合において異なる抗体サブタイプ及び反応性を示す 異なるクローン群を発現していた。同一ウェルから得られるサブクローンを文字 で標識した（例えば、ウェル４から得られるクローンを４Ａ、４Ｂ等のように標 識した）。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは、天然ｈＰＧ−ＣＳＦ及び還元された天然ｈｐＧ−Ｃ ３Ｆに対するモノクローナル抗体の反応性を調べるために行なった。ｈｐＧ−Ｃ ＳＦと反応する抗体を産生ずることが判明したウェルから得られる上澄を、天然 ｈｐＧ−ＣＳＦ及びＳＤＳ／メルカブトエダノールで変性された天然ｈｐＧ−Ｃ ＳＦの双方に対して試験した。クローンからの抗体はほぼ同等の特異性で双方の 物質と反応したが、このことは抗体がタンパク質のアミノ酸連続配列（−次構造 ）から主に決定される抗原性エピトープと特異的に反応していることを示唆して いる。

Ｂ、哺乳動物及び組換え体ｈｐＧ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体の反応性 この例において、活性ウェルから得られるハイブリドーマ上澄の反応性を測定す るための固相ＲＩＡ及びＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは、哺乳動物ｈｐＧ−ＣＳＦ及 び組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｌａ　ｃｏｌｌ）産生ｈｐＧ−ＣＳＦに関 して行なわれた。１つのケースを除いてすべての場合に、哺乳動物産生（天然） ｈｐｃ−ｃｓｐと反応したモノクローナル抗体は組換え体産生ｈｐＧ−ＣＳＦと も十分に等しく反応した。例外のケースとは、直接結合アッセイにおいて哺乳動 物由来物質よりも組換え物質の方が著しく低くしか反応しない抗体を産生ずるサ ブクローン３５Ｂ、３５Ｄ及び３５１を用いた場合であった。

Ｃ１抗体サブタイプに関するスクリーニングこの例において、始めから活性であ ることがわかっている２３個のウェルから得た正式なりローンを、それらの抗体 サブタイプの決定のためにＲＩＡでスクリーニングした。９６ウエルトレーを異 なるサブタイプ特異性のウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体で処理した。抗マウ ス免疫グロブリン抗体としては、ウサギ抗マウス■ｇＧ１　〔マイルス・ラボラ トリーズ（ＭＩＬＥＳ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）　、ナバービル、イリノ イ州、６４−３６０−１）、ウサギ抗マウスＩ　ｇ　Ｇ　２　ａ（マイルス、６ ４３６１−１）、ウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（マイルス、６４−３６２はい）、 ウサギ抗マウス■ｇＧ３（マイルス。

６４−３６３−１）、ウサギ抗マウスＩｇＭ（マイルス。

６４−３６５−１）及びウサギ抗マウスＩｇＧ（マイルス、６５−１５７−２） があった。各ウェルを、抗体的０．５μｇ含有ＣＯ２／ＨＣＯ−（ｐＨ９，６） 緩衝液中の抗マウス免疫グロブリン抗体溶液５０μｌで被覆し、室温で２時間及 び４℃で一夜インキユベートした。

次いでウェルを５％ＢＳＡ溶液で３０分間インキュベートすることによりブロッ キングした。しかる後各ウェルをハイブリドーマ組織培養上澄と室温で２時間イ ンキュベートし、ウォッシュ・ソリューションで３回洗浄した。

抗１ｇＧ抗体で処理したウェルを１２５Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体５０μｌ ／ウェルで１．５時間インキュベートし、一方抗１ｇＭで処理したウェルを１２ ５ニ一ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体５０μｌ／ウェルで１．５時間インキュベート した。次いでウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄し、ガンマカウン ターで計測した。

オリジナルの２３個のクローンの分析結果は、２つのウェル（Ｎｏ、３７及び１ ８２）がＩｇＧ合成を停止し、１つのウェルがＩｇＧ陽性であるものの初期スク リーニングでｈｐＧ−Ｃ５Ｆとの反応性がなく（阻５８）、１５のウェルがＩ　 ｇ　Ｇ　１に関し陽性である（Ｎα４Ｃ１５，２訳３９．４０．６１．６３．６ ４．６６．６８．７２．７４．７５．９８及び２３１）ことを示している。これ らのうち１つのサブクローンは、抗Ｉ　ｇ　Ｇ　３及び抗ＩｇＭの双方の抗体と 反応することが判明した。４つのウェルはＩｇＧ２ａ産生に関し陽性であり（ｋ ３．４Ａ。

２１及び１５１）、１つのウェルはＩ　ｇ　Ｇ　２　ｂ産生に関し陽性であった （Ｎｏ、３５）。

Ｄ、３Ｈ−チミジン取込みにより測定されるｈｐｃ−Ｃ８Ｆ活性の中和 この例において、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆに対するモノクローナル抗体を、ヒト骨髄細胞 中への３Ｈ−チミジンの取込みを促進するｈｐＧ−Ｃ８Ｆの生物学的活性の中和 能力に関して試験した。３Ｈ−チミジン取込み中和に関して試験するために、組 換え又は天然ｈｐＧ−ＣＳＦを本発明の様々な濃度の抗体と一緒に４℃で１２時 間インキュベートした。次いで溶液を低密度非付着性ヒト骨髄細胞に加え、同時 係属米国特許出願第７６８，９５９号明細書の例７に記載された方法に従い操作 した。様々ある中で、Ｎα２０Ａ、３５Ｂ、３９Ｂ、４０Ａ、６１Ｄ。

６３Ｄ、７５Ａ及び１５１にのクローン由来の抗体を試験したところ、クローン Ｎｏ、７５Ａの抗体は３Ｈ−チミジン取込みにおけるｈｐＧ−Ｃ８Ｆの作用を最 も有効に中和し、上記抗体のすべてが３Ｈ−チミジン取込み作用を様々な度合で 中和したが、但しクローンＮａ３５Ｂから産生される抗体は例外であった。

Ｅ、細胞分化誘導により測定されるｈｐＧ−ＣＳＦ活性の中和 この例において、ｈｐＧ−ＣＳＦに対する抗体を、マウス骨髄単球白血病細胞系 ＷＥＨＩ−３８Ｄ　の分化を誘導するｈｐＧ−ＣＳＦの効力を中和する能力に関 して試験した。本発明に従い（クローンＮｏ、２０Ａ、３９Ｂ。

４０Ａ、６１Ｄ、６３Ｄ及び７５Ａから）産生される様々な濃度の抗体をｈｐＧ −Ｃ３Ｆと一緒に４℃で１２時間インキュベートした。次いで溶液を、同時係属 米国特許出願第７６８，９５９号明細書の例７に記載された方法に従い、寒天懸 濁液中のＷＥＨＩ−３８Ｄ　細胞に加えた。クローンＮ０．４０Ａ、６１Ｄ及び ７５Ａから産生される抗体は、分化阻止能を示した。これらのモノクローナル抗 体はｈｐＧ−ＣＳＦに対して異なる沈降能を有していることから、あるものはｈ ｐＧ−ＣＳＦの分化誘導能を阻止し一方他のものは阻止しないという事実は親和 性の強さのみによって説明することができない。特に、クローン７５Ａから産生 されるモノクローナル抗体はＷＥＨＩ−３８Ｄ　細胞の分化を阻止したのみなら ず細胞増殖をも阻止したということは、このモノクローナル抗体はＷＥＨＩ−３ ８Ｄ　細胞から分泌されるマウス成長因子と交叉反応しかつｈｐＧ−Ｃ３Ｆに結 合するその効力とは別に抗増殖作用を有することを示唆している。

Ｆ、エピトープの特徴 この例において、競合的結合試験はクローン７５Ａ及び１５１に由来の１２５Ｉ 標識抗体並びに固定された組換え体産生ｈｐＧ−ＣＳＦを用いて行なわれた。こ れらの試験において、他のクローン由来の抗体は、組換え体産生ｈｐＧ−ＣＳＦ に結合した７５Ａ及び１５１に放射線標識モノクローナル抗体に対して競合する ことができた。

当該技術分野で周知の操作法に従いインキュベート及び洗浄した後、７５Ａ産生 抗体又は１５１に産生抗体がｈｐＧ−ＣＳＦから離脱された量を調べるために放 射線計測を行なった。

これらのアッセイの結果では、クローンＮへ６３Ｄ１７５Ａ及び１５１Ｋから産 生される抗体がｈｐＧ−ＣＳＦタンパク質上において共通抗原エピトープの重複 部分を有することを示している。しがち結果は、クローンＮｏ、４Ｃ，２８Ａ及 び３５Ｂから産生される抗体は７５Ａ及び１５１に産生抗体が特異的に反応しな いｈｐＧ−Ｃ３Ｆタンパク質のエピトープ又はエピトープ群と反応するらしいこ とを示している。更に結果は、クローン４０Ａ及び６１Ｄから産生された抗体の ｈｐｃ−Ｃ８Ｆ結合性がりｏ−ン４Ｃ，２８Ａ、３５Ｂ、７５Ａ及び１５１Ｋか ら産生される抗体のそれとは異なることを示唆している。

Ｇ、寄託された代表的細胞株由来の抗体の性質本発明により提供される抗体類を 代表するモノクローナル抗体を産生じ得る代表的な新規ハイブリドーマ細胞株は 、米国メリーランド州、ロックビル、バークローン拳ドライブ、１２３０１　Ｍ Ｄ２０８５２、アメリカン拳タイプ・カルチア−・コレクションに寄託流である 。

これらの細胞系は、正式のクローニング操作中に開発された細胞系に下記のよう に対応する。クローン４Ｃ（Ａ。

Ｔ、Ｃ０Ｃ，ＨＢ−８９６２）　、クローン２８Ａ　（Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７）、クローン３５Ｂ（Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９６０）　、りｏ−＞６３０　（Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５８）　、クローン７５Ａ（Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５９）及びクローン１５１Ｋ（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ− ８９６１）。これらのクローンから産生される抗体の性質は下記第１表に要約さ れている。

Ｈ１腹水法による抗体収量の増幅 組織培養で産生されたものよりも高濃度の抗体を得るため、本発明のモノクロー ナル抗体を、ケンネスら（編集）、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物 学的分析の新ししい次元、第４０３頁、ニューヨーク、ブレナム・プレス、１９ ８１年［Ｋｅｎｎｅｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　（ｅｄｓ）。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｈｙｂｒｌｄｏｍａｓ：　Ａ 　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎ　Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ 、　ｐ、４０３．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　ＰｌｅｎｕｌｌＰｒｅｓｓ　（１９８ １））に一般的に記載された腹水法によって増幅させた。この操作法に従い、２ ５または２７ゲージ針で腹腔内に注射することにより、ブリスタン［２，６゜１ ９．１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリッチ・ケミカル社（ＡＩｄｒｌ ｃｈ　Ｃｈｅｉｉｃｏｌ　Ｃｏ、）製］　０．　５ｍｌでマウスを処置した。ブ リスタン処理は、腹腔内において腹水型の腫瘍細胞を増殖させる。約１〜２週間 後、無血清ダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（アービン・サイエンティ フィック社）又はＨＢＩＯＩ　［ハンチ・バイオロジカルス（Ｈａｎｎａ　Ｂｉ ｏｌｏｇｌｃａｌｓ　）　、バークレー。

カリフォルニア州〕中の約１０６個のハイブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射 する。各々のクローンに関する一連の注射をマウスで行なう。

ハイブリドーマ細胞の注射後的１〜３透口に、皮膚に小さな傷をつけ液体をピペ ットで取出すことにより、腹水をマウス腹腔内から採取した。腹水を遠心分離及 び次いで凍結により清澄化した。腹水抗体は、４５％硫酸アンモニウムでの沈降 及びプロティンＡ−セファロースクロマトグラフィーによって腹水アルブミンか ら更に精製することができる。

例３ 造血成長因子の単離及び精製 高底に特異的かつ高度に反応性の抗ｈｐＧ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用いる ことにより、本発明では初めて当該技術分野で周知のアフィニティー精製操作に より発酵培養物及び天然哺乳動物源からｈｐＧ−Ｃ８Ｆ及び造血成長因子を単離 することができる。簡単に述べると、好ましい単離操作では、本発明の抗体を固 体支持体（例えば、クロマトグラフィー用カラム）に固定化し、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ 又は造血因子含有液体を固定抗体と接触させ、しかる後抗体との免疫複合結合体 から精製されたｈｐｃ−ｃｓｉ；’又は造血成長因子を溶離させる。使用される 特定の抗体を調整することにより、不正確に折重ねられた又は変性されたｈｐＧ −Ｃ３Ｆから正確に折重ねられた構造をもつ天然ｈｐＧ−ＣＳＦを単離すること ができる。ｈｐＧ−ＣＳＦの類似物も、造血成長因子分子の特異的抗原エピトー プの場合と同様に、単離しかつ研究することができた。

匹−丘 造血成長因子の定量的検出 高度に特異的な抗ｈｐＧ−Ｃ５Ｆモノクローナル抗体を用いることにより、本発 明では、２個以上の抗体を用いて液体サンプル中のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ及び造血成長 因子の定量的検出用の新規な固相又は液相アッセイを可能にすることもできる。

固相アッセイは典型的には下記の工程からなる： （１）液体中でｈｐＧ−Ｃ３Ｆの第一抗原決定基と反応する第一の固定抗体に液 体を接触させて、ｈｐｃ−Ｃ３Ｆ及び第一抗体の免疫学的複合体を形成し、（２ ）第一抗原決定基以外のｈｐＧ−ＣＳＦの抗原決定基と反応する第二の抗体に工 程（１）で形成された複合体を接触させて、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆと第二抗体の免疫学 的複合体を形成させる。次いで（３）工程（２）で形成された免疫学的複合体に 結合した第二抗体の量を定量する。

液相競合アッセイでは、ｈｐＧ−ＣＳＦを標識しておき、それを本発明の１個以 上の抗体で沈降させる。未標識ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ又は類似因子の定性は次いで競合 的結合方式で行なうことができる。かかるアッセイ操作では好ましくは上記モノ モノクローナル抗体を２種用いるが、しかしながら１種のモノクローナル抗体及 びｈｐｃ−ＣＳＦに対するポリクローナル血清由来抗体を用いても行なわれる。

本発明の実施に際して多数の改良及び変更は、その好ましい態様の前記記載に基 づき当業者であれば考え得ることが予想される。従って、下記の特許請求の範囲 に示されるような限定のみが本発明になされるべきである。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原／抗体反応により特異的にｈｐＧ−ＣＳＦと結合し得るモノクローナル 抗体をその増殖培地中で産生することができるマウス由来ハイブリドーマ細胞株 。
2. ２．ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３からなる群より選 択されるサブタイプのモノクローナル抗体を産生することができる、請求の範囲 第１項記載のハイブリドーマ細胞株。
3. ３．Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、ＨＢ−８９５８、ＨＢ−８９５９、ＨＢ −８９６０、ＨＢ−８９６１及びＨＢ−８９６２からなる細胞株の群から選択さ れる、請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞株。
4. ４．抗原／抗体反応により特異的にｈｐＧ−ＣＳＦと結合し得るモノクローナル 抗体をその増殖培地中で産生することができる細胞株によって産生されるモノク ローナル抗体。
5. ５．ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３からなる群より選 択されるサブタイプの、請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
6. ６．細胞系がＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、ＨＢ−８９５８、ＨＢ−８９５ ９、ＨＢ−８９６０、ＨＢ−８９６１及びＨＢ−８９６２からなる細胞株の群か ら選択される、請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
7. ７．培養中でＷＥＨＩ３ＢＤ＋細胞の分化を誘導させるｈｐＧ−ＣＳＦの効力を 中和することができる、請求の範囲第４項、第５項又は第６項記載のモノクロー ナル抗体。
8. ８．骨髄細胞によるチミジンの取込みを促進させるｈｐＧ−ＣＳＦの効力を中和 することができる、請求の範囲第４項、第５項又は第６項記載のモノクローナル 抗体。
9. ９．ｈｐＧ−ＣＳＦに特異的な抗体との選択的免疫反応に基づく生物学的液体か らの生物学的活性ｈｐＧ−ＣＳＦの単離のための免疫学的方法において、抗原／ 抗体反応により特異的にｈｐＧ−ＣＳＦと結合し得るモノクローナル抗体を用い ることからなる改良。
10. １０．モノクローナル抗体がＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩ ｇＧ３からなる群より選択されるサブタイプのものである、請求の範囲第９項記 載の免疫学的方法。
11. １１．モノクローナル抗体がＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、ＨＢ−８９５８ 、ＨＢ−８９５９、ＨＢ−８９６０、ＨＢ−８９６１及びＨＢ−８９６２からな る群より選択される細胞株によって産生される、請求の範囲第９項記載の免疫学 的方法。
12. １２．ｈｐＧ−ＣＳＦに特異的な抗体との１以上の選択的免疫反応に基づく生物 学的液体中のｈｐＧ−ＣＳＦの定量的検出のための免疫学的方法において、抗原 ／抗体反応により特異的にｈｐＧ−ＣＳＦと結合し得る１種以上のモノクローナ ル抗体を用いることからなる改良。
13. １３．モノクローナル抗体がＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩ ｇＧ３からなる群より選択されるサブタイプである、請求の範囲第１２項記載の 免疫学的方法。
14. １４．モノクローナル抗体がＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９５７、ＨＢ−８９５８ 、ＨＢ−８９５９、ＨＢ−８９６０、ＨＢ−８９６１及びＨＢ−８９６２からな る群より選択される細胞株によって産生される、請求の範囲第１２項記載の免疫 学的方法。