JPH01243986A

JPH01243986A - 抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体，抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法

Info

Publication number: JPH01243986A
Application number: JP63070335A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Yoshikawa; 和宏吉川; Susumu Iwasa; 岩佐　進
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1988-03-23
Publication date: 1989-09-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】鼠１五Ａ秤肛立」本発明はヒト固形癌細胞に対して結合能を有するヒトモ
ノクローナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略記することがあ
る）、抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法に関
する。本発明のヒトＭｏＡｂは癌治療薬あるいは診断用
試薬として有用である。

癌に関しては種々の薬物や治療法１診断薬などが開発さ
れているが、癌細胞以外にも正常組織や正常細胞にも反
応し、重篤な副作用や誤診断をもたらすものが多く、そ
の使用に限界があった。

近年この欠点を克服するために、特異性の高い免疫反応
を利用した治療法１診断法が開発されてきている。その
１つに抗癌抗体の利用がある。かってはポリクローナル
な抗癌抗体が用いられてきたが、ケーラーやミルスタイ
ンにより開発されたＭｏＡｂ作製法（Ｋ′６ｈｌａｒ、
　Ｇ、　ａｎｄ　　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，。

、ネーチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５（１
９７５））の導入により、癌細胞上の癌特異抗原あるい
は癌関連抗原を特異的に認識するＭｏＡ　ｂを得ること
が可能となった。これらの抗体の利用により、正常組織
に損傷を与えることなく癌細胞に特異的に結合し、これ
を排除することが可能となるので、癌指向性のきわめて
高い抗癌剤の開発が考えられる。

また診断薬の分野においても、血清、尿あるいは糞便中
の正常成分とは交差反応せずに、感度良くこれら血清、
尿、糞便中の癌特異抗原、癌関連抗原を検出できるもの
と思われる。

しかしながら、これらの抗癌抗体はもっばらマウス、ラ
ットなどの異種動物由来のものが使用されているため、
当然のこととしてヒト体内への投与により、アナフィラ
キシ−やその他のアレルギー反応などの重篤な副作用を
惹起しうるという新たな問題が生じている。かかる問題
を解決するため、異種動物からではなくヒト由来の抗癌
抗体が開発され、臨床へ応用されることが強く期待され
ているのが現状である。

また一方で、抗ヒト癌ヒトモノクローナル抗体の開発に
ついても現時点では多くの問題点を抱えている。例えば
、異種動物のように癌抗原の人為的な免疫操作ができな
いことや、また何よりも、得られる抗体産生ハイブリド
ーマの安定性が非常に悪いことなどである。

課題を解決するための手段本発明者らは、かかる技術的な背景のもとに、ヒト固形
癌細胞に結合能を有するヒトＭｏＡ　ｂの安定的な生産
、あるいは臨床への応用を目的として鋭意研究した結果
、ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞とのマウス・ヒトヘ
テロハイブリドーマを親株として、その親株と固形癌患
者由来のリンパ球とを融合させることにより、ヒト固形
癌細胞に結合するヒトＭｏＡｂを長期にわたり安定に産
生ずるハイブリドーマを取得し、さらに研究を進め本発
明を完成した。

すなわち本発明は、抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗
体を産生ずる（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマ、
該抗体および該抗体の製造法に関するものである。

本発明の抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体は治療用
および診断用のヒト免疫グロブリン製剤として有用であ
り、抗体単独での使用のみならず、適切な抗ヒト癌活性
を有する物質、例えばメトトレキセート、ダウノマイシ
ン、ビンクリスチン、シスプラチンなどの抗癌化学療法
剤、あるいはりシン、アブリン、ジフテリア毒素、ネオ
カルチノスタチンなどの毒素蛋白、さらに腫瘍壊死因子
、リンホトキシン、インターフェロン、インターロイキ
ンなどのサイトカインと結合させ、いわゆるミサイル療
法剤として特異的に癌細胞のみを排除せしめる抗癌剤と
しても使用可能である。

また本発明の抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマは液体培地中での培養法のみならず、ヌ
ードマウスを用いる腹水化法でも安定的に増殖し抗体の
大量調製が可能なため、臨床応用の面でも非常に優れた
特性を有している。

本発明では抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体産生（
マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマを作成するための
親株としてマウス・ヒトヘテロハイブリドーマを用いた
。このマウス・ヒトヘテロハイブリドーマはヒトリンパ
球をマウス骨髄腫細胞と融合して得られる。

上記ヒトリンパ球としては、健常人あるいは固形癌患者
の牌臓、リンパ節、末哨血などのいずれ由来のものでも
よいが、とりわけ健常人末梢血リンパ球が好都合に用い
られる。これらのヒトリンパ球はそのまま融合に用いて
もよいが、融合前にＢ細胞刺激性因子１例えばホークラ
イードマイト−ジエン（以下、ＰＷＭと略記することが
ある）、スタフィロコッカス・コーワンＩＪ’Ｃミュー
血清すどで刺激、活性化後融合に供するのが好ましい。

またマウス骨髄腫細胞としては、すでに公知の種々の細
胞、例えばＮ５−１．Ｐ３ＵＩ、Ｘ４５．Ｓｐ２などが
使用されるが、好ましくはＰ２Ｏ３が用いられる。

細胞融合は公知の方法に孕じて実施され、例えばポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧと略記することがある
）などが融合促進剤として使用され、マウス・ヒトヘテ
ロハイブリドーマが作成される。これらのマウス・ヒト
ヘテロハイブリドーマは次の融合時における選択培養の
ためＨＡＴ感受性とすることが望ましく、そのため例え
ば６−チオグアニン（ＴＧ）や８−アザグアニン（ＡＺ
Ｇ）に馴化させ、これらの薬剤耐性株を取得するのがよ
い。これらのＨＡＴ感受性マウス・ヒトヘテロハイブリ
ドーマはいずれのものでも用いうるが、特に公知のマウ
ス・ヒトヘテロハイブリドーマＨＭ−５〔市森ら、バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（ＢＬｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｌ１．）、　ｌ　２９　、２６
　（１９８５）、特開昭６１−１２８８８号公報〕が非
常に安定的に増殖し、かつ効率良く固形癌患者由来のリ
ンパ球と融合して本発明の（マウス・ヒト）−ヒトハイ
ブリドーマが得られるので好ましく用いられる。

本発明の（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマは固形
癌患者由来のリンパ球をマウス・ヒトヘテロハイブリド
ーマと融合しＨＡＴ添加培地中などで選択培養すること
により作成される。

上記した固形癌としては、例えば胃癌、大腸癌。

食道癌、肝癌、膵癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌
。

乳癌、膀胱癌、腎癌などが挙げられ、なかでも胃癌。

大腸癌、肝癌、肺癌が好ましい。

固形癌患者由来のリンパ球としては牌臓、リンパ節、末
梢血などのいずれ由来のものでもよいが、抗体産生細胞
の含有率あるいは入手し易さなどの点からリンパ節リン
パ球が好ましく用いられる。

これらのヒトリンパ球はそのまま融合に用いてもよいが
、融合前にＢ細胞刺激性因子、例えばｐｗＭ、スタフィ
ロコッカス・コーワンＩＪミュー血清などで刺激、活性
化後融合に供するのが好ましい。

ヒト固形癌患者由来のリンパ球は、親株マウス・ヒトヘ
テロハイブリドーマと融合促進剤含有培地中でインキュ
ベートし細胞融合される。融合促進剤としては、例えば
ＰＥＧ、センダイウィルスなどが挙げられるが、特にＰ
ＥＧが好ましく用いられる。ＰＥＧを用いる融合方法に
おいて、ＰＥＧの重合度は一般に約ｔ、ｏｏｏ〜６，０
００．インキュベーション時間は約０．５〜３０分、Ｐ
ＥＧの濃度は約ｌＯ〜８０％などが用いられる。好まし
くは、約３５〜５５％のＰＥＧ４，０００ないし６，０
００を用いて約３７℃で約１−１０分細胞を処理するの
がよい。

抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには、種々の方法が使用できるが、
例えば癌細胞への指示赤血球の吸着でみる混合血球凝集
反応（以下、Ｍ　ＨＡと略記することがある）、癌細胞
に結合した抗体に補体を介して赤血球が粘着する現象を
みる免疫粘着反応（以下、ＩＡと略記することがある）
、蛍光標識した第２抗体（抗ヒト免疫グロブリン抗体）
で癌細胞を染色し蛍光分析する免疫蛍光法（以下、ＩＦ
と略記することがある）あるいはマイクロプレートに粘
着した癌細胞への結合を酵素免疫測定法（以下、ＥＬ　
Ｉ　ＳＡと略記することがある）でみるｃｅｌｌ−ＥＬ
　ｒ　ＳＡ法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイブ
リドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常これ
は限界希釈法などで容易に実施される。クローン化され
た（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマの培養上清に
ついては、上記の方法でその抗体価を測定し、安定的に
力価の高い抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、目
的とするモノクローナルなハイブリドーマを取得するこ
とができる。

該抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体の生成。

蓄積は、本発明の（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドー
マを通常液体培地中もしくはヌードマウスの腹腔内で培
養し実施するが、以下にそれらの培養の例を挙げる。

液体培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地〔例
、イスコツ培地とハムＦＩ２培地の等量混合培地（■・
Ｈ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地など〕に牛胎児血清
（以下、Ｆｅ２と略記することがある）などを添加した
ものあるいはＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社販売）
〔特開昭６０−１４５０８８号公報参照〕などが挙げら
れる。培養は通常約３〜６０日間好ましくは約５〜ＩＯ
日間、約３０〜３８℃好ましくは約３７℃で実施される
。

ヌードマウス腹腔内への移植については、【匹当り約２
ＸｌＯ’〜５Ｘ１０７個好ましくは約５×１０’個の抗
体産生ハイブリドーマを腹腔内に移入し、約１０〜３５
日間の飼育で充分量の抗体含有腹水液的３〜１０ｄが得
られる。

液体培地あるいは腹水液中の抗体の精製については、公
知の生化学的手法を組み合せて用いることによりできる
。例えば、該抗体含有液を遠心分離後、上清液を塩析し
く通常は硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウムを用
いる）、得られた蛋白沈澱物を適当な緩衝液に溶解し、
透析後カラムクロマトグラフィー（イオン交換カラム、
ゲルろ過カラムなど）に付すことにより、目的とする抗
体を分離、精製することができる。以上のような分離、
精製操作により、例えば５００−の液体培地から蛋白重
量比で９０％以上の純度の抗ヒト固形癌ヒトＭｏＡｂを
約５〜１５履ｇ得ることができる。

また５０１Ｒ１の腹水液からは同様の抗体が約５〜７０
Ｂ得られる。これらの精製抗体標品においては、異種蛋
白であるウシ血清アルブミンおよびウシ免疫グロブリン
あるいはマウス由来の不純蛋白の含有量は約０．１％以
下であるので、医薬として人体に投与する場合好都合で
ある。

以上のようにして得られたヒトＭｏＡｂを蛋白分解酵素
（パパイン、ペプシンなど）処理、還元剤処理などによ
り、ヒト固形癌細胞に対する結合能を保持したままのＰ
　ａｂ、　Ｐ　ａｂ’　、　Ｆ　（ａｂ’）を断片を得
ることかでき、本発明のヒトＭｏＡｂと同様の目的で用
いられる。

本発明によりヒト固形癌細胞表面上のヒト固形癌特異抗
原もしくはヒト固形癌関連抗原を特異的に認識し、ヒト
固形癌細胞に結合するが、ヒト繊維芽正常細胞やヒト胎
児組織と反応しない抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗
体が製造されるが、なかでも以下の特性を示す抗ヒト固
形癌ヒトモノクローナル抗体を製造することができる。

■認識抗原タイプ：　癌細胞膜表在型 ■ヒト癌細胞との反応性：　胃癌（ＮＵ（、Ｃ−４゜Ｋ
ＡＴＯ−Ｉｌｌ）、大腸癌（ＳＷ−１２２２）、肺癌（
ＡＤＬＣ−ＤＡ）に対して陽性。

■ヒト正常細胞との反応性：　繊維芽細胞（ＬＯＶＥ　
５ｋｉｎ、　Ｗ　Ｉ　−３８）に対して陰性。

■ヒト胎児組織（胃、小腸、肺、肝、腎、胸腺、牌）と
反応しない。

上記した特性を示す本発明の抗ヒト固形癌ヒトモノクロ
ーナル抗体は、例えば、クリニカル・ケミストリー（Ｃ
１ｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　２７　、
１７９７−１８０６（１９８１）、ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、　ｌ５Ｉｌｕｎｏ１．
　Ｍｅｔｈｏｄｓ）。

８０、ｔｏ　ｌ−１１６（１９８５）などに記載の方法
に従ってヒト固形癌の診断薬とし、健常人と固形癌患者
の診断に利用することができる。

本発明の抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体は均質で
高力価なため、生化学的製剤として用いるのにきわめて
適している。例えば、メンブレンフィルターなどによる
ろ過除菌操作後にそれ自体あるいは適宜の薬理的に許容
され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、注射剤な
どとして製剤化することができる。

以上のようにして得られたヒトＭｏＡｂ製剤は、単にヒ
ト固形癌特異抗原もしくはヒト固形癌関連抗原の分析、
血中抗原の検出あるいは診断薬への応用のみならず、予
防薬、治療薬としてヒトに投与することが可能である。

特に抗癌剤としての抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗
体は、それ自体の抗癌効果のみならず、しかるべき抗癌
剤のキャリヤーすなわちミサイル療法剤として固形癌患
者に投与して固形癌を根治せしめることが期待されてい
る。

以上のようにして本発明の抗ヒト固形癌ヒトモノクロー
ナル抗体は、ヒト由来のためマウス、ラットなど異種動
物由来の抗体と比べてヒトに対する抗原性、毒性がきわ
めて低く副作用もほとんどないため、疾病の予防、治療
のために直接ヒトに投与することが可能である。また該
抗体産生（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマは生体
外で安定的にしかも収率良く抗体を産生しうるので、結
合能の高い品質の一定した抗体を安定的に大量製造する
ことができる。

以下、参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお実施例３に開示する（マウス・ヒト）−ヒトハイブ
リドーマ７１−５．２Ｆ９は、昭和６３年３月　２日か
ら財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ｒｐｏ　　
！；ｏ／６３　として、また昭和６３年３月２３日から
通商産業省微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号
ＦＥＲＭ　　Ｈｐ−／ｇｏととして寄託されている。

参考例１　混合血球吸着法（ＭＨＡ）対象となる細胞のうち付着性の細胞は、２４あるいは４
８時間前より６０穴マイクロプレート（ヌンク（ＮＵＮ
Ｃ）社製）に５００個／ウェルとなるよう分注して培養
した。浮遊性の細胞は、検査当日に血清無添加の培養液
に浮遊後同じ数の細胞を各ウェルに分注し、４００Ｘｇ
、５分遠心してプレートに付着させた。

指示血球の作製は、リン酸食塩緩衝液（ＰＢＳ）で３回
洗浄したＲｈ＋のヒト０型血球をＰＢＳで２％浮遊液と
し、この浮遊液にＰＢＳで１６倍希釈した血液型判定用
ヒト由来抗Ｒｈ抗体（オルソ（Ｏｒｔｈｏ）社製）を等
量混合して３７℃、３０分反応させた。この血球をＰＢ
Ｓで３回洗浄し、２％に再浮遊した。次にＰＢＳで２５
倍に希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ダコー（ＤＡＫ
Ｏ）社製）を等量混合し、さらに３７℃１３０分反応さ
せた。その後ＰＢＳで３回洗浄して２％浮遊液として保
存した。

細胞を付着させたプレートを、０．１Ｍ　　ＭｇＣＱ、
−０，０３Ｍ　　ＣａＣＣ，−０，１％グルコースジエ
チルバルビタール酸食塩緩衝液（ｖｅｒｏｎａｌｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ　　５ａｌｉｎｅ）、ｐＨ７，４（Ｖ　Ｂ　
Ｍ）にウシ胎児血清（Ｆｅ２）を５％含む溶液で洗浄後
、培養上清あるいは腹水を各ウェルに分注し、室温１時
間静置した。ＶＢＭでこのプレートを洗浄後、５％ＦＯ
９−ＶＢＭで０．２％に希釈した指示血球を各ウェルに
分注し室温で４０分静置した。次に未反応の血球をＶＢ
Ｍで洗浄除去し、顕微鏡下で観察した。抗体を添加して
いない反応陰性コントロールとしてのウェルでのロゼツ
ト形成が１％以下であり、本試験のウェルにおいて標的
細胞の２５％以上にロゼツト形成を認めた場合を反応陽
性とした。

参考例２　免疫吸着法（ＩＡ）標的細胞の準備と結果の観察および判定法はＭＨＡ法と
同様に行った。抗体の反応は、４℃、１時間、湿潤箱内
に静置して行なった。ＶＢＭで洗浄したプレートに、Ｐ
ＢＳで洗浄したヒトＯ型赤血球を０．２％、モルモット
の新鮮血清をｌ／６０〜１／１００量ＶＢＭに加えたも
のを各ウェルに分注し、３７℃、３０分、５％ＣＯ１加
通気培養器内で静置した。次に未反応の血球をＶＢＭで
洗浄除去し、結果の観察と判定を行った。

参考例３　免疫蛍光法（Ｉ　Ｐ）ＯＣＴコンパウンド（マイルス（Ｍｉｌｅｓ）社製）中
に急速凍結後、−８０℃に保存したヌードマウス移植ヒ
ト腫瘍、胎児組織等から凍結切片を作製し、アセトン固
定して蛍光抗体染色に供した。

先ず切片上に培養上清あるいは適度に希釈した腹水を載
せ、湿潤箱内で３７℃、４０分反応させた。ＰＢＳにて
１０分、３回洗浄後、蒸留水で１回洗浄し、乾燥した。

次にＰＢＳで適度に希釈したＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ
抗体（タボ−（ＴＡＧＯ）社製）で同様の方法で反応さ
せ、ＰＢＳで１０分、２回洗浄した。さらに２００艷の
ＰＢＳに２％のエバンス・ブルー（ｅｖａｎｓ　　ｂｌ
ｕｅ）を数滴加えた溶液中でカウンター・スティン（ｃ
ｏｕｎｔｅｒ　　５ｔａｉｎ）を行った。この染色液を
蒸留水で洗浄除去、乾燥し、５０％グリセリン−ＰＢＳ
で封入後蛍光顕微鏡で観察した。なおマウス・ヒトヘテ
ロハイブリドーマＨＭ−５の培養上清、あるいは未処置
ヌードマウスの血清による反応を陰性対照として結果を
判定した。

実施例１　マウス・ヒトヘテロハイブリドーマの８−ア
ザグアニン耐性株の樹立（ｉ）　　マウス・ヒトヘテロハイブリドーマの製造健
常人の末稍血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用い
た比重遠心法で、リンパ球（ＰＢＬ）を分離し、ＩＯ％
非動化Ｆ’Ｃ９を含有するｒ−Ｈ培地（■・Ｉ−■−１
０Ｆ）に２Ｘ１０’個／−になるよう浮遊させた。

このリンパ球浮遊液を組織培養用フラスコ（コーニング
社製Ｆ’−１５０フラスコ）に分注し、３．２μｇ／−
の蟲度になるようＰＷＭを添加して、３７℃、炭酸ガス
ふらん器内で、３日間培養した。

培養後リンパ球とＨＧＰＲＴ欠損ＨＡＴ感受性マウスミ
エローマ細胞Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３ＵＩ）
（カレントトピヅクス・イン・ミクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（Ｃｕｒ、　Ｔｏｐｉｃｓ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｓ＋ｉｕｎ、）、８上、１−
７（１９７８））とを、２：１の細胞比になるよう混合
し、４５％１’ＥＧ６０００（コツホライト社製）で７
分間処理することによって、細胞融合を行なっｌこ。融
合後、腫瘍細胞を！・Ｈ−１０Ｆに２ｘｌＯ’／蔵にな
るよう浮遊させ、リンプロ２４ウエルマルチデイシユに
１ｄずつ播種し、３７℃、炭酸ガスふらん器内で培養し
た。培！１２４時間後、ＨＡＴ（ヒボキサンチン：１Ｘ
１０″″４Ｍ、アミノプテリン：４×１０”−’Ｍ、チ
ミジン１．６　ｘ　１０−’Ｍ）含有１−Ｈ−１０Ｆ（
）（ＡＴ培地）をｌｄ加えることによりＨＡＴ選択培養
を開始した。さらに、最初加えた日から３．５．７日の
奇数日後に、四肢をｌ−拾で、ｌ−の新しいＨＡＴ培地
を加えることにより、ＨＡＴ選択培養を継続した。ハイ
ブリドーマの増殖は、細胞融合後１０−１４日に認めら
れた。

（ｉｉ）　　８−アザグアニン耐性株の取得（ｉ）で得
られたマウス・ヒトヘテロハイブリドーマで、増殖能が
優れかつ抗体産生の認められない株を、ＨＡＴ感受性株
とすべく、８−ＡＺＧ添加培地での培養を行なった。す
なわちｌμＭａ度の８−ＡＺＧを含有するＲＰＭＩ−１
０Ｆで培養を開始し、８−ＡＺＧａ度を１８Ｍから順次
２倍ずつ上昇させ培養を続けた。１００μＭの８−ＡＺ
Ｇに耐性となった株についてはＨＡＴｇ受性を検討し、
感受性のマウス・ヒトヘテロハイブリドーマＩ（Ｍ−５
（）（Ｍ’−５株）を取得した。

実施例２　（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマの作
成胃癌患者からのリンパ節を小さなハサミで細断し、ステ
ンレスメツシュを通過せしめることによりリンパ細胞懸
濁液を採取しＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。得ら
れた細胞懸濁液（２ＸｌＯ”個／ｒｎ１．）をＰＷＭ（
ギプコ（ＧＩＢＣＯ）社製）の１００倍希釈液と共に、
４日間培養、活性化したのち細胞融合に供した。

細胞融合は上記の活性化ヒトリンパ球と実施例１で得た
ＨＭ−５株とを５：ｌの比率で混合し、さらに融合促進
剤として４２，５％のＰＥＧを添加して実施した。３７
℃、１分間混和、融合後、！０％ＦＣＳを含む夏ＩＡＴ
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で選択培養を開始した。適
宜新鮮培地との交換を実施し、細胞融合１０〜１４日後
にハイブリドーマの増殖が認められた。

培養上清中の抗ヒト固形癌抗体を参考例１および２に記
載のＭＨＡおよびＩＡ法で測定、スクリーニングに供し
、ヒト固形癌細胞に結合能を有する抗体産生（マウス・
ヒト）−ヒトハイブリドーマを採取した（第１表）。

第１表　抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマの取得実験　
播種　　播種　　増殖　　抗体陽性ウェル２）■）１　　１ＸＩＯ’　　　　７６８　　　７６８　　　　
３２　　　　２２２　　１ｘ１０５　　３６８　　　３
６８　　　　　６　　　　　１３　　５ｘｌＯ’　　　
　　３８４　　　　３８４　　　　　０　　　　　１４
１ＸｌＯ’　　　　４８０　　　４５１　　　　　１　
　　　　０５　２．５ｘｌＯ’　　　８８　　　　８８
’　　　　Ｏ１６５ｘｌＯ’　　　　１２４８　　　３
９８　　　　　０　　　　　０７５ｘｌＯ’　　　　７
５２　　　５５６　　　　１１　　　　　９１）ｔウェ
ル当り播種した活性化リンパ球数。

２）参考例！、及び２による方法で検索した。

実施例３　抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマのクローニング実施例２で得られた抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマの中で抗体価の高いものを選び、
限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわち、
ハイブリドーマが１０゜３０および９０個／ｒｎ１にな
るように１０％ＦＣ９添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮
遊させ、９６穴マイクロプレートに各１００μＱ／ウエ
ルで分注した。フィーダー細胞としてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り２ＸＩＯ’個にな
るように加えた。このようにして約２週間後には細胞増
殖が認められるようになり、培養上清の抗体価を参考例
１および２で示したＭＨＡおよびＩＡ法で測定、スクリ
ーニングしたところ、幾つかのクローンに固形癌細胞結
合性の抗体活性を認めた。それらの中で特に増殖能に優
れ、かつ抗体産生能の高い（マウス・ヒト）−ヒトハイ
ブリドーマ７１−５．２Ｆ９が選別、育種された（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−７と０８．［ＦＯタｏ／６３　）。

実施例４　ヒトモノクローナル抗体の製造■（マウス・
ヒト）−ヒトハイブリドーマ７１−５゜２Ｆ９（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｂｐ−１Ｈｏ＆、ＩＦＯダＯ／６３）をＧＥＴ培
地に馴化させたのち、２ＸＩＯ’個／−の濃度で同じＧ
ＥＴ培地に浮遊させ３７℃で約５日間培養した。得られ
た培養上清５００ｄに硫酸アンモニウムを４５％の濃度
になるように加え、４℃で６０分間塩析した。得られた
蛋白沈澱物を０．２Ｍ　　ＮａＣσ含有２ｈＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，９）に溶解し、同じ緩衝液３ｇに対して
透析した。２回の透析外液の交換後、同じリン酸食塩緩
衝液で馴化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷのゲルろ過カ
ラム（東洋曹達販売）を用いて高速液体クロマトグラフ
ィーに供した。分子量５０万以上の素通り画分を集め濃
縮することにより、抗ヒト固形癌ヒトＭｏＡｂ７１−５
．２Ｆ９約９約ｆｇを採取した（第２表）。

第２表　抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体７１−５
．２Ｐ９の精製ヒト　ウシ　　ウシ血清（ｍｌり　　（ｍｇ）　　（ｍｇ）　　（ｍｇ）　　　
　（ｍｇ）培養上清　　５００　１，６５ｆｊ１３　　
　４．６　　　６８０硫安塩析　　　７　　　２８　１
０　　０．０２９　　０．０４２り４５％硫酸アンモニ
ウム　２）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラムの高速液体
クロマトグラフィー実施例５　ヒトモノクローナル抗体
の製造■（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマ７１−
５゜２Ｆ９（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−／？０♂、Ｉ　Ｆ”Ｏ
ダ０７６３）を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培
地で培養後、生理食塩水で洗浄し５Ｘ１０８個／ｄの濃
度で浮遊させた。次いで、１Ｍ１．のブリスタン（アル
ドリッチ・ケミカル社製）を予め腹腔内接種したヌード
マウスの腹腔内へ上記ハイブリドーマ懸濁液をｌ−移植
し、３〜５週後に腹水液を採取した。腹水液はリン酸食
塩緩衝液で倍量希釈したのち、実施例４における培養上
清と同様に硫安塩析および高速液体クロマト処理に供し
た。その結果、５０−の腹水液から約３５ｍｇのヒトＭ
ｏＡｂ７１−５．２Ｆ９が得られた。

なお、標的癌細胞への抗体の結合を参考例２記載のＩＡ
法により測定して腹水液の抗体希釈曲線を求めた。結果
は第１図に示すとおりとなった。

第１図において、縦軸はヒトＭｏＡｂ７１−５　、　２
Ｆ９が結合した細胞の割合（％）を示し、横軸は腹水希
釈倍数を示す。α−−リ１口−−−一一口。

△−−−△は標的癌細胞がそれぞれＮＵＧＣ−４゜ＨＣ
Ｔ−１５，５Ｗ−４８０であることを示し、を−−１は
標的癌細胞が５Ｋ−Ｃｏ−１，５Ｗ−１０８３、Ｃａｐ
ａｎ　−１またはＢＸＰＣ３であることを示す。

実施例６　ヒトモノクローナル抗体７１−５．２Ｆ９の
特性実施例４および５で得られたヒトＭｏＡｂ７１−５．２
Ｆ９の性状を参考例２および３で示したＩＡ法およびＩ
Ｆ法で測定したところ、第３表および第４表の結果が得
られた。

第３表においては、ＩＦ法で測定した胎児の各種組織お
よびヌードマウス移植可能ヒト癌細胞に対する反応性を
示した。本発明の抗体は胎児組織とは全く反応せず、数
珠の癌細胞とのみ特異的に反応した。

第４表においては、ＩＡ法で測定した各種癌細胞および
正常細胞などに対する反応性を示した。

正常細胞には反応せず数種の癌細胞に特異的な結合能を
示した。

本発明の抗体の免疫グロブリンクラスはオフタロニー法
で測定したところ、ヒト１ｇＭタイプであった。

また第５表においては本発明の抗体が認識する細胞表面
抗原の性状について検討した。標的胃癌細胞ＮＵＧＣ−
４を熱処理、トリプシン処理あるいはノイラミニダーゼ
処理しても細胞に対する抗体結合能に変化はなく、一方
で過ヨウ素酸処理で細胞の抗原性が失われることから、
本発明のヒトＭｏＡｂ７１−５．２Ｆ９は癌細胞膜表在
型、アシアロタイプの糖鎖関連抗原を認識することが判
明した。

第３表　ヒトモノクローナル抗体７１−５．２Ｆ９の反
応性標的細胞および　　　　　　標的細胞および組織にＮＵ
ＧＣ−４胃癌　　　　　　　十ＰＴＧＣ−１− ＰＴＧＣ−２＋Ｃｏ−３大腸癌　　　　　　− １ｕｃ　ｉ〜３　　　　　肺癌　　　　　　　士Ｃａ１
ｕ−１− Ｌ−２７− ＳＣＬＣ−ＭＯ− ＡＭ−ＯＶ−１メラノーマ　　　　− 胃　　　　　　胎児組織　　　　　− 小腸　　　　　　　　　　　　　　　−肺　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　−肝　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−腎　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　−胸腺　　　　　　　　　　
　　　　　−脛　　　　　　　　　　　　　　　　−第
４表　ヒトモノクローナル抗体７１−５．２Ｆ９の特異
性２）陽性細胞：　胃癌（ＮＵＧＣ−３，−４，ＫＡＴ
Ｏ〜ＩＩ［、ＭＫＮ−２８）。

大腸癌（ＳＷ−４０３，−４８０，−１２２２，５Ｋ−
Ｃｏ−１７゜ＨＣＴ−１５）、肺癌（ＡＤＬＣ−ＤＡ、
ＭＨ）、ザルコーマ陰性細胞：　癌細胞株〔胃癌（ＮＵ
ＧＣ−２，ＭＫＮ−１，ＡＭ−ＧＣ−１）。

大腸癌（ＳＷ−６２０，−１０８３，−１１１６，−１
４１７，５Ｋ−ＣＯ−１，−１５，ＨＣＴ−１１６，Ｉ
Ｔ−２９，ＬＯＶＯ，ＣａＣｏ−２）。

肺癌（ＳＣＬＣ−１２，−１３，−１７，−ＭＯ，Ｌｕ
ｃｉ−４，−６゜ＳＫ−ＭＥＳ−１，ＭＭ、ＭＴ、ＯＴ
、ＳＡ、ＳＭ、ＭＯＡ、Ｃａ１ｕ−１゜５ＢＣ−３，０
Ｇ−９０，ＰＣ−１０，Ｌｕ−１３４，Ａ−４３１，８
５７）。

膵癌（Ｃａｐａｎ−１，−２，ＢｘＰｃ−３，ＡｓＰｃ
−１）、肝癌（ＨｅｐＧ−２）、腎癌（ＳＫ−ＲＣ−１
８，Ｄｅｍａｔｏｌｅｙ。

５ｃａｔｏ１ａ、Ｙｉｏｌａ、Ｎｏｍｅｔｈ）、膀胱癌
（Ｔ−２４，ＫＫ−４７）、乳癌（ＢＴ　−２０）　、
子宮頚癌（ＭＥ−１８０）、卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ−３，
ＣｏＬｏ−３，ＲＯＡＣ，ＡＲＡ、Ｋｌ）。

メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８，−３３，−３７，Ｍ
−１４）。

神経芽腫（ＳＫ−Ｎ−８Ｈ，ＧＯＴＯ，ＣＨＰ）、グリ
オーマ（ＳＫ−ＭＧ−１，Ｂｅｃｋｅｒ）。

ザルコーマ（Ｕ−２０−Ｓ）、Ｔ細胞白血病（ＨＵＴ　
−７８、−１０２，ＭＴ−１，−２ｊＵＲＫＡＴ、ＭＯ
ＬＴ−３，ＳＯＭＭＥＲ。

ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ）、１３細胞白血病
（Ｒａｊ　ｉ　。

Ｄａｕｄｌ）、骨髄性白血病（Ｕ−９３７）、ヌル細胞
正常細胞株〔繊維芽細胞（ＬＯＶＥ　５ｋｉｎ、Ｗｂ２
）参考例２記載のＩＡ法で測定。

第５表　ヒトモノクローナル抗体７１−５．２Ｆ９の認
識する細胞膜抗原の性状標的細胞　の処理方法　　　標的細胞１）に対する抗体
結合能１ｏｏ＝。、ｔｏ分。加熱処理　　　　　　　＋２）３
７・。、３０分。。−２５％　　　　　　　　　＋　２
　）トリプシン分解処理室温、ｔｏ分の２％　　　　　　　　　３）ＮａｌＯｉ
酸化処理３７℃、３０分ＯＩＵ／、＋３）ｌ）胃癌細胞株ＮＵＧＣ−４を使用。

２）参考例２記載のＩＡ法により測定。

３）参考例３記載のＩＦ法により測定。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例５で得られた（マウス・ヒト）−ヒトハ
イブリドーマ７１−５．２Ｆ９移植ヌードマウス腹水液
の抗体希釈曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞とを融合して得
られるマウス・ヒトヘテロハイブリドーマと固形癌患者
由来のリンパ球とを融合して得られる、抗ヒト固形癌ヒ
トモノクローナル抗体を産生する（マウス・ヒト）−ヒ
トハイブリドーマ。
（２）マウス骨髄腫細胞がＰ３Ｕ１である請求項１記載
のハイブリドーマ。
（３）マウス・ヒトヘテロハイブリドーマがマウス・ヒ
トヘテロハイブリドーマＨＭ−５である請求項１記載の
ハイブリドーマ。
（４）固形癌患者由来のリンパ球が固形癌患者のリンパ
節由来のリンパ球である請求項１記載のハイブリドーマ
。
（５）マウス・ヒトヘテロハイブリドーマＨＭ−５と胃
癌患者のリンパ節由来のリンパ球とを融合して得られる
（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマ７１−５．２Ｆ
９。
（６）ヒト繊維芽正常細胞およびヒト胎児組織と反応せ
ず、ヒト固形癌細胞に結合する抗ヒト固形癌ヒトモノク
ローナル抗体。
（７）以下の特性をもつ請求項６記載の抗体。［１］認識抗原タイプ：癌細胞膜表在型［２］ヒト癌細胞との反応性：胃癌（ＮＵＧＣ−４、Ｋ
ＡＴＯ−III）、大腸癌（ＳＷ−１２２２）、肺癌（Ａ
ＤＬＣ−ＤＡ）に対して陽性［３］ヒト正常細胞との反応性：繊維芽細胞（ＬＯＶＥ
ｓｋｉｎ、ＷＩ−３８）に対して陰性。［４］ヒト胎児組織（胃、小腸、肺、肝、腎、胸腺、脾
）と反応しない。
（８）抗ヒト固形癌ヒトモノクローナル抗体７１−５．
２Ｆ９。
（９）請求項１記載のハイブリドーマを液体培地中また
はヌードマウスの腹腔内で培養し、抗ヒト固形癌ヒトモ
ノクローナル抗体を取得することを特徴とする該抗体の
製造法。
（１０）培養するハイブリドーマが請求項５記載のハイ
ブリドーマである請求項９記載の製造法。