JPH03271235A - 抗カンジダ菌抗体分泌ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１］ 本発明はカンジダ菌菌体表面抗原に対する特異性の優れ
た、高力価の、しかも生産段階における再現性に優れた
抗体を分泌する融合細胞（以下ハイブリドーマと称する
）に関する。 ［０００２］ 近年、細菌による感染症は予防医学の発達と抗生物質の
普及によって著しく微少しできたが、真菌による疾患は
世界的にかえって増加の傾向にある。これら感染症の原
因である真菌の多くは通常の環境下で常在している菌で
あり、健康者の口腔、消化管、咽頭、皮膚、膣などに存
在している。真菌症としては、心内膜炎肺炎、尿路疾患
、髄膜炎、骨および関節疾患、皮膚疾患等が報告されて
いる。 真菌症はまた、結核や癌など、慢性消耗性疾患に併発し
て著しく症状を悪化させることも知られている。一方、
真菌症に有効な抗生物質等による治療法は少なく副作用
が強く現われる場合が多い。従って、真菌の迅速な検出
とその正確な同定は臨床上重要な意味を持っていると共
に、真菌症に対する有効な治療法が切望されている。こ
のほか発酵醸造工程において、有害な真菌類と醸造酵母
とを迅速かつ正確に識別することが求められている。カ
ンジダ菌はこのような問題をかかえた真菌の中でも代表
的なものの１つである。本発明のハイブリドーマによる
抗体は、カンジダ属の分類、同定およびカンジダ症の治
療に極めて有効な手段を提供するものである。 ［０００３］ 従来、カンジダ菌の分類、同定は形態学的および生化学
的性状をもとに行なわれていたが、これらは迅速性に欠
けている上に熟練を必要とした。一方、ウサギ等の動物
に免疫を行ない、免疫に用いたのとは異なる種の菌体で
吸収して得た因子血清を用いた血清学的同定法も行なわ
れている。しかし、この因子血清は、動物を免疫して得
られる血清であり、多種類の特異性をもつ抗体の混合物
である。 従って、その特異性や力価がロット毎にある程度のバラ
ツキをもつことは避けられない。加えて、同一の属に属
する真菌は、抗原的に互いに似かよっているため、得ら
れる因子血清の力価は一般に低い。また、因子血清を得
る為の吸収操作も繁雑である。 ［０００４］ 本発明者等は、特異性に優れ、不純物が少なく、高い力
価をもった抗カンジダ菌抗体を安定に製造する方法につ
いて研究を重ねた結果、カンジダ菌に対する抗体産生細
胞とインビトロにおいて長期継代培養可能な細胞を融合
せしめることにより、カンジダ菌に対する抗体を産生じ
しかも長期継代培養可能なハイブリドーマが得られ、該
ハイブリドーマにより分泌される抗体を採取することに
よって、特異性が高く、夾雑物が少なく、高い力価をも
った抗カンジダ菌抗体が得られることを見出し、本発明
を完成するに至った。 ［０００５］ 本発明のハイブリドーマは、継代培養可能で、生体外お
よび生体内において、実質的に無限に増殖を続け、特定
の抗原決定基に対する抗体を産生じ続ける性質を有して
いる。従って、この製造方法によって製造される抗体は
、事実上、単一の特異性を有し、また単一の分子種から
なる抗カンジダ菌抗体である。更に、需要に応じて容易
に必要な量の生産ができ、ロフト間のバラツキをほとん
どなくすことが可能であり、しかも極めて高力価の抗体
含有液を得ることができる。また吸収操作を必要とせず
、カンジダ菌菌体のような非精製免疫原を用いても高度
に特異的な抗体が生産される点も優れている。本発明の
ハイブリドーマによる抗体を用いると、抗原に対する高
度に特異的な反応性のために、従来法に比べて、繁雑な
手順をふくむことなく、迅速でしかも信頼性の高い同定
が可能になる。また、物質としての純度の高さの故に、
従来の血清療法にありがちであった夾雑物質に由来する
アレルギー反応等の出現頻度が低下し、カンジダ症治療
剤として使用する可能性が開けた。 ［０００６］ 抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によって特定の抗体
を産生ずるハイブリドーマが得られる場合があることは
、Ｋｏｈｌｅｒらの報告（Ｎａｔｕｒｅ　、　　２５６
巻、　４９５−４９７頁（１９７５）およびＥｕｒ、　
　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６巻、　　５１１−５
１９頁（１９７６）　）をはじめとして既に知られてい
る。しかし、本発明以前には、カンジダ菌なとの真菌類
に対する抗体を産生ずるハイブリドーマが形成されうる
か否か、また、そうして形成されたハイブリドーマの中
に、真菌類の分類、同定や真菌症の治療剤に用い得る優
れた特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマが含
まれているか否かについては知られていなかった。カン
ジダ菌に対する抗体の製造に本発明の製造法を適用し、
従来法では得られなかったＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ
ａｎｓに反応する抗体を得たことは、本発明者等の創意
である。 ［０００７］ 以下、本発明のハイブリドーマを製造する方法を説明す
る。 ［０００８］ Ａ、抗体産生細胞Ω■製 本発明のハイブリドーマを得る為には、カンジダ菌に対
する抗体産生細胞とインビトロにおける長期継代培養可
能な細胞を必要とする。両者の融合により、カンジダ菌
に対する抗体を産生じ、しかもインビトロにおいて長期
継代培養可能なハイブリドーマを得ることができるわけ
である。 ［０００９］ カンジダ菌に対する抗体産生細胞は、ヒトを含めたいず
れの動物種から得てもよく、また、あらかじめ免疫を行
なうことは必須ではないが、これを行なうことによって
目的とするハイブリドーマの採取効率を著しく上げるこ
とができる。 ［００１０］ ヒトの細胞を用いる場合には、カンジダ感染症の病歴の
ある者や、血清中のカンジダ菌に対する抗体価が高い者
を選ぶことができる。人為的に免疫した生体から得よう
とする場合、免疫原としては、生菌またはグルタルアル
デヒド処理、マイトマイシン処理もしくは加熱処理など
によって増殖性を失わぜな菌体を用いてもよく、また菌
体より表面抗原を酵素処理などの適当な方法で分離精製
したものを用いてもよい。また菌種としては次に挙げる
菌種の中から選ぶことができる。 菌糸、酵母、厚膜胞子などその形態はいずれでもよい。 ［００１１］ Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　５ｅｒｏｔｙｐｅ
　ＡＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　５ｅｒｏｔｙ
ｐｅ　ＢＣａｎｄｉｄａ　ｔｒｏ　１ｃａｌｉｓＣａｎ
ｄｉｄａ　　ｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＣａｎｄｉｄａ
　ｋｒｕｓｅｉ Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｒ　　５ｉｌｏｓｉｓＣａｎｄｉ
ｄａ　　５ｅｕｄｏｔｒ　　１ｃａｌｉｓ免疫に際し、
フロイント完全または不完全アジュバントのような助剤
を免疫原に混合して用いることができる。免疫の際の免
疫原投与法は皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内
注射、筋肉的注射等いずれでもよいが、皮下注射または
腹腔内注射が好ましい。免疫は１回、または適当な間隔
、好ましくは１週乃至５週をおいて繰り返し行なっても
よい。免疫した動物の血清中のカンジダ菌に対する抗体
価を測定し抗体価が充分高くなった動物から抗体産生細
胞を得れば、その後の操作の効率を上げることができる
。融合には最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生
細胞を用いるのが好ましい。該抗体産生細胞は形質細胞
およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体
のいずれの部位から得てもよいが、−般には牌臓、リン
パ節、末梢血またはそれらの組み合わせから得ることが
できる［００１２］ Ｂ、預胞融金 インビトロにおいて長期継代培養可能な細胞は、抗体産
生細胞と融合して目的にかなったハイブリドーマを生ず
るものであればいずれでもよいが、その確率の高いのは
骨髄腫等の白血病細胞である。由来の種もヒト、ラット
、マウス等いずれでもよい。後述するように、融合後混
在する親細胞を除くためにはヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ欠損株細胞またはチミ
ジンキナーゼ欠損株細胞を用いるのが好ましい。 ［００１３］ 例えば、ヒト由来のＧＭ−１５００６ＴＧ−Ａｌ−２，
ＲＰＭＩ８２２６、マウス由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８
．　Ｐ３−ＮＳ　Ｉ　／１−Ａｇ４−１．　Ｓｐ２１０
−Ａｇ１４．　Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３などを用いる
ことができる。 ［００１４］ 上述の抗体産生細胞の由来する種と長期継代培養可能な
細胞の由来する種は同一であることが不可欠ではないが
、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、生体内で
培養する際の簡便さなどの点から一般には同一のものを
用いる方が有利である場合が多い。特に長期継代培養可
能な細胞としてマウス由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．　
Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４−１．　Ｓｐ２１０−Ａｇ
１４またはＸ　６３−　Ａ　ｇ８．６５３を用いる場合
には、同系マウスであるＢＡＬＢ／ｃまたはその交雑マ
ウスを用いるのが有利である。 ［００１５］ 融合に際してはセンダイウィルス、ポリエチレングリコ
ール等の融合促進剤を用いるのがよく、特にポリエチレ
ングリコール１０００．１５４０．２０００．４０００
まなは６０００などを用いるのが好ましい。これを約３
０〜５５％含む溶液中で融合を行なわせる。助剤として
更にジメチルスルホキシドを添加してもよい。 ［００１６］ Ｃ，ハイブリドーマの、・立 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの他、親細胞で
ある抗体産生細胞とインビトロで長期継代培養可能な細
胞等が残存している。前者は通常長期間のインビトロの
培養に耐えられないので問題はないが、後者は目的とす
るハイブリドーマと共に増殖する可能性があるのでこれ
を除くことが望ましい。このため後者として、ヒポキサ
ンチングアニンホスホリホ゛ジルトランスフェラーゼま
たはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用い、融合させた後
、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含
む培地中で培養する。これによりハイブリドーマのみを
選択的に生育させることができる。親細胞としてヒポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼま
たはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いない場合には融
合に先だって該細胞をエメチンおよびアクチノマイシン
Ｄで処理して細胞の増殖性を失わせておくことにより、
ハイブリドーマを親細胞との混合物から選択してもよい
。 ［００１７］ このようにして得たハイブリドーマ群は、一般には２個
以上のクローンを含むコトカ多く、完全に同一の性質を
有する細胞の集団ではない。個々のクローンを分離しな
い場合には、クローン化を行なうことが必要である。ク
ローン化は、単一の特異性をもつ抗体を製造する為には
勿論であるが、多種類のクローンが混在する系において
長期間培養を行なっている間にしばしば起こるポピユレ
ーションの変化を防ぐ意味からも有効であり、行なうこ
とが望ましい。クローン化の方法としては、限界希釈法
、軟寒天法、フィブリンゲル法等を用いることができる
。 また螢光活性化細胞選別装置を用いてクローン化の際の
細胞の分離を行なうことも可能である。また、長期間培
養の間に起こる変異株の出現に対し、時々クローン化を
行なうことで元の細胞の性質をもった細胞を保存するこ
とができる。 ［００１８］ 以上のような製造法に従って作製したカンジダ菌に対す
る抗体を産生ずるハイブリドーマの例として、後述の実
施例にも示すように、ＣＤ−１，ＣＤ−２，ＣＤ−３Ｃ
Ｄ−４，ＣＤ−５，ＣＤ−６，ＣＤ−７，ＣＤ−８およ
びＣＤ−９が挙げられる。 ［００１９］ ハイブリドーマの維持法としては、インビトロおよびイ
ンビボで継代する他に常法に従って凍結保存することが
できる。 ［００２０１ Ｄ、扱体Ω製過（本発明のハイブリドーマの利用）　抗
体の製造にあたっては、カンジダ菌に対する抗体を産生
ずるハイブリドーマをインビトロまたは生体内で培養す
る。 ［００２１］ インビトロの培養の場合には、本発明のハイブリドーマ
のために適当な栄養培地、例えば１０％（Ｖ／Ｖ）の牛
胎児血清、５Ｘ１０”Ｍのβ−メルカプトニタノール、
１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質を含有し
たＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培地を用いることができる。 ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に代えて、４．５ｇ／　Ｌの
グルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　　ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ＭＥＭ　（以下、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’　ｓ　ＭＥＭと略す）培地を用いてもよい
。細胞を増殖させる時適当な初期濃度は、各々のハイブ
リドーマによって異なるが、一般に約１０５個／ｍｌで
あり、培養中の細胞濃度は２×１０６個／ｍｌを超えな
いことが盟ましい。 ［００２２］ 本発明のハイブリドーマを生体に移植して、固型または
腹水型で増殖させ、その生体より体液、望ましくは血清
または腹水を採取することにより、該ハイブリドーマが
分泌する抗体を製造することもできる。この方法によっ
て得られる粗製抗体液は、不純物として宿主となった生
体由来の種々の物質を含むという欠点をもつ一方、生体
外の培養によって得られる抗体液に比べて著しく高濃度
の目的抗体を含むという点で優れている。ハイブリドー
マを腹腔に移植して増殖させる場合においては移植の前
、好ましくは３〜９週間前にプリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与し
ておくことにより、粗製抗体液の収量を高めることがで
きるが、この処置は必須ではない。なお、宿主として用
いる生体は、移植するハイブリドーマの親細胞と同種同
系の動物が望ましい。この場合には通常特別の処置をし
なくてもハイブリドーマはその生体内で増殖するが、ハ
イブリドーマと宿主の組織適合性抗原型が一致しない場
合、一般に宿主生体に抗リンパ球抗体投与、Ｘ線照射等
の処置をあらかじめ施しておくことが必要である。移植
後、細胞が成長してくるまでに通常１週間から３週間を
要する。 ［００２３］ 以上のような製造法に従って作製したＣａｎｄｉｄａ　
ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗体の例として、後述の実施
例に示すように、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓと
反応する抗体、Ｃａｎｄｉ迦属のＣａｎｄｉｄａ　ｔｒ
ｏ　１ｃａｌｉｓ　、　　Ｃａｎｄｉｄａ　　ｉｌｌｉ
ｅｒｍｏｎｄｉｉ　、　　Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅ
ｉＣａｎｄｉｄａ　　ａｒ　　５ｉｌｏｓｉｓおよびＣ
ａｎｄｉｄａ　　５ｅｕｄｏｔｒｏ　１ｃａｌｉｓとも
反応する抗体、および他の真菌類とも反応する抗体が挙
げられる。その特異性と免疫グロブリンのクラスは後記
衣−１に示す通りである。 ［００２４］ なお、従来法により、ウサギをＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂ
ｉｃａｎｓで免疫して得られた抗血清をＣａｎｄｉｄａ
　ｔｒｏ　１ｃａｌｉｓで吸収して得られた抗体は、Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのみならず他のＣａｎ
ｄｉｄａ属の種（Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｒ　　５ｉｌｏ
ｓｉｓ　）とも反応した。また、Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒ
ｏ　１ｃａｌｉｓ　、　Ｃａｎｄｉｄａ　　ｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ　、　Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ　
、　Ｃａｎｄｉｄａ匪旧狙５ｉｌｏｓｉｓおよびＣａｎ
ｄｉｄａ　　５ｅｕｄｏｔｒ　　１ｃａｌｉｓで吸収し
て得られた抗体は、力価が極めて低く　Ｃａｎｄｉｄａ
　ａｌｂｉｃａｎｓとほとんど反応しなかった。 ［００２５］ 抗体は、粗製抗体液のまま使用してもよいが、硫酸アン
モニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィーなと免
疫グロブリン精製の常法に従って、或いはＰｒ。 ｔｅｉｎ　　Ａや抗原によるアフイニテイクロマトグラ
フイー法等により、精製して用いることができる。 ［００２６］ また、得られた抗体は、前述の如く、Ｃａｎｄｉｄａ　
ａｌｂｉｃａｎｓの分類・同定およびカンジダ症の治療
や予防に有効であり、アフイニテイクロマトグラフイー
等によって抗原物質の精製を行なう場合など、広範囲に
使用できる。 ［００２７］ また、必要に応じて上記抗体を混合して用いても差し支
えない。 ［００２８］ 以下、具体的な実施例を述べる。 ［００２９］

【実施例】

実施炎上 （１）免疫凰装置製： Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＡＴＣＣ７５２株
をサブロー培地を含む斜面寒天に接種し、３７℃のふ卵
器で３日間培養を行なった。培養終了後、リン酸緩衝生
理食塩水（以下、ＰＢＳと略、ｐＨ７，２）を入れ、ピ
ペッティングによって菌を浮遊せしめ、遠心分離（１０
００Ｘｇ　、　　４℃、１０分間）を行ない、沈渣（菌
体）を得た。この洗浄操作を３回繰り返した後の菌体に
１．０％グルタルアルデヒドを加え、０℃で３０分間処
理した。次に、菌体をＰＢＳで５回洗浄した後、ＰＢＳ
で２×１０７個／ｍｌの濃度に調整し、免疫原懸濁液と
して以下の実験に用いた。 ［００３０］ （２）抗体主虫紀胞二旧製： ８週令の雌性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ｃマウス印本チャール
ズリバー）に、上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを腹腔内投
与することにより免疫を行なった。さらに、１０日間隔
で免疫を繰り返し、免疫開始後１００日目に、上記免疫
原懸濁液０．２ｍｌを静脈内投与することによりブース
ターを行ない、３日後にマウスを脱血化せしめ、クリー
ンベンチ（日立製作所）内で牌を無菌的に摘出した。次
に、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地を含むシャーレに牌を入
れ、ピンセットにて細片にほぐし、おだやかにピペッテ
ィングを行なった後、上記牌懸濁液をステンレス製金網
で濾過して、牌細胞懸濁液を得た。この懸濁液を遠心分
離（５００Ｘｇ　、　１０分間）して得た細胞ペレット
に対して０、　’／４’／％の塩化アンモニウムを含む
１．７ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，６５）を加え
、懸濁することにより赤血球を破壊・除去した。そして
、この牌細胞懸濁液を遠心分離（５００Ｘｇ、　３分間
）して得た細胞ペレットを、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地
で３回洗浄し、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地で１０８個／
ｍｌの濃度に調整した。 ［００３１］ （３）細　融ムおよびハイブリドーマの調１ｉ１Ｊ　：
前もってインビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２
１０−Ａｇ１４　１ＸＩＯ７個と上記牌細胞懸濁液（１
×１０８個）とを混合し、遠心分離（５００Ｘｇ、　５
分間）を行ない、上清を除去して細胞ペレットを得た。 容器の底をおだやかにたたくことによりペレットをほぐ
した後、３７℃に保温した５０％（Ｖ／Ｖ）のポリエチ
レングリコール４０００を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培
地１ｍｌを添加し、　１分間放置した。次に、３７℃の
恒温槽に入れ、１分間容器をおだやかにまわすことによ
り、ポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合
させた。次に３７℃に保温したＲＰＭ１１６４０培地を
、１ｍ１７３０秒の速度で合計１０ｍ１加えた後、遠心
分離（５００Ｘｇ、　５分間）を行なった。上溝を除去
した後、細胞ペレットをＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に懸
濁させ、遠心分離（５００Ｘｇ、　５分間）を行ない、
細胞ペレットを得た。この洗浄操作を再度繰り返した後
、細胞ペレットに、３７℃に保温したＨＡＴ培地、すな
わち２０％牛脂児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピル
ビン酸、　４．５ｇ／Ｌのグルコース、５Ｘ１０−５Ｍ
のβ−メルカプトエタノール、　　ｌＸ１０−４Ｍヒポ
キサンチン、　　４Ｘ１０−７Ｍアミノプテリン、１．
６Ｘ１０”Ｍチミジンおよび５伽ｇ／Ｌの硫酸カナマイ
シンを含むＲＰＭ１１６４０培地２０ｍ　ｌを加え、よ
く懸濁させた。この細胞懸濁液を９６ウエルの組織培養
用プレート（Ｎｕｎｃ　１６７００８．　Ｎｕｎｃ社、
デンマーク）の各ウェルに１００μｍずつ分注し、３７
℃で、５％の炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を
開始した。培養開始２４時間後に、ＨＡＴ培地を１００
μｌずつ添加した。その後、２〜３日間隔で各ウェル中
の培地１００μｌを除き、新たにＨＡＴ培地１００μｌ
を加えることにより培養を行ない、ＨＡＴ培地中で増殖
能力を有するハイブリドーマを選択した。 ［００３２］ 培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各ウェル中の培養上溝中の産生抗体の有無を下
記（佃に記載の方法で検査した。

【○０３３］ （４）″　産生ハイブリドーマの、・立：上記により得
られた培養上溝中の抗体産生の有無は酵素免疫測定法に
より調べな。すなわち、９６ウ工ル組織培養用プレート
（Ｎｕｎｃ　１６７００８．　Ｎｕｎｃ社、デンマーク
）の各ウェルに、抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ
抗体（１００℃で２．５時間加熱処理したＣａｎｄｉｄ
ａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　　２Ｘ１０７個をウサギに５回
静脈内免疫して得られた血清を硫安塩析法により分画し
たＩｇＧ画分）を０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムで３０
μｇ／ｍｌの蛋白質濃度に調整した溶液を、５０μｍず
つ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、蒸溜水で充
分に各ウェルを洗浄した後、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
ｃａｎｓ　Ａ　Ｔ　ＣＣ７５２菌体液（２×１０７個／
ｍ１）３０μｌを分注し、室温で反応させた。更に、７
０℃３時間の処理によりプレートウェルを乾燥させた。 このプレートは使用時まで一２０℃で保存した。次に、
このプレートの各ウェルに、０．５％グルタルアルデヒ
ドを含むＰＢ３５０μｌを分注し、室温で３０分間放置
後、各ウェルを０．０５％ツイーン２０（登録商標）を
含むＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後の各ウェルに、被検
体（各ウェルの培養上清）を１００μｌ加え、３７℃で
１時間反応させた。そして０．０５％ツイーン２０　（
登録商標）を含むＰＢＳで３回洗浄後、西洋ワサビ由来
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
（カッベル社、アメリカ）を馬血清で１０００倍に希釈
した溶液５０μｍを、各ウェルに分注し、３７℃で１時
間反応させた。反応終了後、０．０５％ツイーン２０（
登録商標）を含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、１ｍ
ｇ／ｍｌの０−フェニレンジアミンおよび０．０４％（
Ｖ／Ｖ）の３１％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ４，５）　　１００μｌを、各ウェルに加
え、室温で３０分間反応させた。各ウェルに１２．５％
硫酸を５０μｌ加えることにより酵素反応を停止させ、
４９２　ｎｍにおける吸光度測定により同定を行なった
。その結果、１９２ウ工ル中２２個のウェルで抗体産生
が認められた。 ［００３４］ 次いで、抗体産生が認められたウェル中のハイブリドー
マのクローン化を行なった。すなわち、栄養供給細胞（
ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）として無処置の８週令雌性
ＢＡＬＢ／ｃマウスから牌を摘出し、上記（２）と同様
の方法で牌細胞を得、ＨＡＴ培地で５×１０６個／ｍｌ
の濃度に調整した。そして、この牌細胞懸濁液に上記ハ
イブリドーマを２個／ｍｌになるように加え、よく攪拌
した後、９６ウエルの組織培養用プレー）　（Ｎｕｎｃ
　１６７００８．　Ｎｕｎｃ社、デンマーク）の各ウェ
ルに１００Ａｌｌずつ分注した。２４時間後に、各ウェ
ルにＨＡＴ培地を１００μｍずつ分注し、３７℃で、５
％の炭酸ガスを含む培養器中で培養を行なった。 ［００３５］ クローン化２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察す
ると共に、各ウェル中の培養上溝中の抗体の有無を上記
の方法で検査した。その結果、各ウェルのクローン化に
つき、２個から８０個の抗体産生クローンが得られた。 これらクローンの中から、抗体分泌能が高く、増殖性に
優れ、しかも安定な細胞であるクローンを選び、上と同
様の方法で再度クローン化を行ない、抗体産生ハイブリ
ドーマＣＤ−１，ＣＤ−２およびＣＤ−３を樹立した。 ［００３６］ （５）抗有ゴΣＬ１： （インビトロ声　による生　）；ハイブリドーマＣＤ−
１，ＣＤ−２またはＣＤ−３を、２０％牛脂児血清、２
ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、　　４．５ｇ／Ｌ
のグルコース、５Ｘ１０’Ｍのβ−メルカプトエタノー
ルおよび５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンを含むＲＰＭ
　Ｉ　１６４０培地に、１×１０５個／ｍｌになるよう
に懸濁させ、この細胞懸濁液２５ｍ１を７５℃ｍ２組織
培養用フラスコ（コーニング社、アメリカ）に分注し、
３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を
行なった。増殖がほぼ定常に達した４日目に、培養上清
を採取した。この時の細胞数は約２刈０６個／ｍｌであ
り、上清の抗体含量は各々３．０μｇ　／ｍｌ、　　２
．３μｇ　／ｍｌ、　　２．８μｇ　／ｍｌであった［
００３７］ （インビボ立〜による生　）；ブリスタン（２，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与後１０日から３００日目ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、インビトロで増殖させたハイブリドー
マＣＤ−１，ＣＤ−２またはＣＤ−３を５　Ｘ　１０”
個接種した。接種後２ないし３週目に腹水を採取し、遠
心分離（１０００Ｘｇ、　４℃。 １５分間）により腹水上清を得た。各ハイブリドーマに
つき１０匹のマウスから約３０ｍ１の腹水上清が得られ
、その抗体含量は各々１．５ｍｇ／ｍｌ、　　２．３ｍ
ｇ／ｍｌ、　　１．８ｍｇ／ｍｌであった。 ［００３８］ （６）−の　　および状： （（７’）　　ｔ　）　　：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂ
ｉｃａｎｓ　ＡＴＣＣ７５２（７）他、同種真珠の抗原
細胞としてＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　　Ｉ　
Ｆ　００５８８．　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
ｓ　　Ｉ　Ｆ　０１３８５．　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌ
ｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ○１３８９．　　Ｃａｎｄｉｄａ
　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　ＦＯ１５９４およびＣａｎｄ
ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　ＦＯ１２６９を、同属
異種の抗原細胞としてＣａｎｄｉｄａ　ｔｒｏ　１ｃａ
ｌｉｓ　ＡＴ　ＣＣ７５０、Ｃａｎｄｉｄａ　　ｉｌｌ
ｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　Ｉ　ＦＯＯ６７９，Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ｋｒｕｓｅｉ　Ｉ　ＦＯ１３９５，Ｃａｎｄｉｄａ
　　ａｒａ　５ｉｌｏｓｉｓ　Ｉ　Ｆ　０１３９６およ
びＣａｎｄｉｄａ　　５ｅｕｄｏｔｒ　　１ｃａｌｉｓ
　ＩＦＯＯ４３２株を上記（１）と同様の方法で培養し
、ホルマリン処理を行ない、０．０５％ツイーン２０（
登録商標）を含むＰＢＳで１×１０８個／ｍｌに調整し
た。この抗原細胞懸濁液０．３ｍｌを、直径１．２ｃｍ
のシリコン化処理した試験管に分注し、遠心分離（１０
００×ｇ、５分間）して上溝を除いた後、上記（５）で
得たハイブリドーマＣＤ−１゜ＣＤ−２またはＣＤ−３
のインビトロ培養液上清を０．５ｍｌ加え、３７℃で１
時間反応させた。反応終了後、０．０５％ツイーン２０
（登録商標）を含むＰＢＳで３回洗浄し、次いで西洋ワ
サビ由来ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン
抗体（カッベル社、アメリカ）を馬血清で１０００倍に
希釈した溶液を０．５ｍｌ加え、３７℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、０．０５％ツイーン２０（登録商標
）を含むＰＢＳで５回洗浄し、次いで、１ｍｇ／ｍｌの
０−フェニレンジアミンおよび０．０４％（Ｖ／Ｖ）の
３１％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液１ｍ
ｌを加え、室温で３０分間反応さぜな。そして、反応停
止剤として１２．５％硫酸を０．５ｍｌ加え、４９２ｎ
ｍにおける吸光度測定により同定を行なった。その結果
を後記表−１に示した。 ［００３９］ （性状Ω検討）；抗マウスＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＡ
抗体および抗マウスＩｇＭ抗体（マイルス社、アメリカ
）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムで１００倍希釈した溶
液５０μｌを、９６ウ工ル平底組織培養用プレート（Ｎ
ｕｎｃ　１６７００８．　Ｎｕｎｃ社、デンマーク）に
分注し、４℃で２４時間放置した。０．０５％ツイーン
２０（登録商標）を含むＰＢＳで各ウェルを充分に洗浄
後、上記（５）で得たハイブリドーマＣＤ−ｌＣＤ−２
またはＣＤ−３の培養上清を１００μｍ添加し、３７℃
で１時間反応させた。 反応終了後、０．０５％ツイーン２０（登録商標）を含
むＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダー
ゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体（カッベル社、アメ
リカ）を馬血清で１０００倍に希釈した溶液５０Ａ１１
を、各ウェルに分注し、３７℃で１時間反応させた。反
応終了後、０．０５％ツイーン２０　（登録商標）を含
むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの０−
フェニレンジアミンおよび０．０４％（Ｖ／Ｖ）の３１
％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４
，５）　　１００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分
間反応させた。各ウェルに１２．５％硫酸を加えること
により酵素反応を停止させ、４９２ｎｍにおける吸光度
の測定により同定を行なった。 ［００４０］ その結果を後記表−１に示す。 ［００４１］ 実施例裟 （１）免疫凰Ω隈裂： Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ○１５９４
株をサブロー培地を含む斜面寒天に接種し、３７℃のふ
卵器で３日間培養を行なった。培養終了後、ＰＢＳ　（
ｐＨ７，２）を入れ、ピペッティングによって菌を浮遊
せしめ、遠心分離（１０００Ｘｇ　、　　４℃、１０分
間）を行ない、沈渣（菌体）を得た。この洗浄操作を３
回繰り返しな後、ＰＢＳで５×１０５個／ｍｌの濃度に
調整し、免疫原懸濁液として以下の実験に用いた。 ［００４２］ （２）択生産生細胞二旧裂： ８週令の雌性ＣＤＦ１マウス印本タレア）に上記免疫原
懸濁液０．２ｍｌを静脈内投与することにより免疫を行
なった。さらに、１４日間隔で免疫を繰り返し、免疫開
始後７０日目に、上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを静脈内
投与することによりブースターを行ない、３日後にマウ
スを脱血死せしめ、クリーンベンチ（日立製作所）内で
牌を無菌的に摘出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　　ｓ
　ＭＥＭ培地を含むシャーレに牌を入れ、実施例１　（
２）と同様の方法により１×１０８個／ｍｌの牌細胞懸
濁液を得た。 ［００４３］ （３）細　融合およびハイブリドーマの調制：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８１ＸＩＯ７個と上記牌細胞懸濁液（１×１０８個
）とを混合し、遠心分離（５００Ｘｇ、　５分間）を行
ない、上滑を除去して細胞ペレットを得た。容器の底を
おだやかにたたくことによりペレットをほぐした後、３
７℃に保温した。これに、３７℃に保温した４５％ポリ
エチレングリコール４０００を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’
　ｓ　ＭＥＭ培地培地１全ｌ約１分間かけて徐々に加え
た。３７℃に７分間保った後、容器をゆっくりと回転さ
せながら、３７℃に保温したＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　
ＭＥＭ培地１５ｍ１を、容器壁面に伝わらせながら約５
分間かけて加えた。更に約２５ｍ　ｌのＤｕｌｂｅｃｃ
ｏ’　ｓ　ＭＥＭ培地を加えた後、遠心分離（５００Ｘ
ｇ、　５分間）を行ない、上溝を除いた。 ［００４４］ 細胞ペレットに、３７℃に保温した１０％牛脂児血清を
含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ＭＥＭ培地を加え、１×
１０６個／ｍｌに調整し、おだやかにピペットで混和し
た後、２４ウエルの組織培養用プレー）　（Ｎｕｎｃｌ
ｏｎ、　Ｎｕｎｃ社、デンマーク）の各ウェルに１×１
０６個分注し、３７℃で５％の炭酸ガスを含む炭酸ガス
培養器中で培養を開始した。培養開始２４時間後に、Ｈ
ＡＴ培地を１ｍｌずつ添加した。その後、２〜３日間日
間者ウェル中の培地１ｍｌを除き、新たにＨＡＴ培地培
地１加ｌ加ことにより培養を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖能力を有するハイブリドーマを選択した。 ［００４５］ 培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各ウェル中の培養上溝中の産生抗体を実施例１
　（４）に記載の方法で検査した。その結果、４８ウ工
ル中１０個のウェルで抗体産生が認められた。 ［００４６］ （４）−生ハイブリドーマの・立： 次いで、抗体産生が認められたウェル中のハイブリドー
マのクローン化を、軟寒天法により行なった。すなわち
、４５℃に保温した２、５％寒天（Ｄｉｆｃｏ、　　ド
イツ）　３０ｍ１と１０倍濃度のＤｕｌｂｅｃｃｏ’　
ｓ　ＭＥＭ培地培地３全ｌ合し、これに４５℃保温のＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ＭＥＭ培地１１７ｍ１を加えた
。この寒天溶液に栄養供給細胞げｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ
）として無処置の８週令雌性ＣＤＦ１マウス牌細胞を５
刈０５個／ｍｌになるように加えた後、直径１０ｃｍの
ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ　３００３．　Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ）に１０ｍＪずつ分注し
、室温で１５分間放置することによりゲル化させた。そ
して、抗体産生陽性のウェル中のハイプリドーマ懸濁液
的２ｍｌと、等量の０．５％寒天を含むＤｕｌｂｅｃｃ
ｏ’　ｓ　ＭＥＭ培地を混合し、２ｍｌずつ上記ゲル化
層上に細胞が均一に分布するように分注しな。３７℃で
５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった
。培養開始後１０日目以降、軟寒天上に生じた細胞のコ
ロニーをパスツールピペットにて採取し、９６ウエルの
組織培養用平底プレートに移し、さらにＤｕｌｂｅｃｃ
ｏ’　Ｓ　ＭＥＭ培地を０．２ｍｌ加え、３７℃で５％
炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった。そ
して、ハイブリドーマの増殖を観察すると共に、各ウェ
ル中の培養上溝中の抗体の有無を実施例１　（４）に記
載の方法で検査した。 ［００４７］ 抗体産生が陽性のハイブリドーマの中から、抗体分泌能
が高く、増殖性に優れしかも安定なりローンを選び、上
述と同様の方法で再度クローン化を行ない、抗体産生ハ
イブリドーマＣＤ−４およびＣＤ−５を樹立した。 ［００４８］ （５）折体Ω生産： （インビトロ坪　による生　）；実施例１　（５）に記
載の方法によりハイブリドーマＣＤ−４およびＣＤ−５
の培養を行ない、培養上清を得た。 ［００４９］ （インビボ声へによる生　）；実施例１　（５）に記載
の方法により、ＣＤＦ１マウス腹腔内にハイブリドーマ
ＣＤ−４およびＣＤ−５を移植し、２ないし３週目に腹
水を採取し、腹水上清を得た。１０匹のマウスから約３
０ｍ１の上清が得られた。 ［００５０１ （６）″　の　　および　゛（： 実施例１　（６）に記載の方法でハイブリドーマＣＤ−
４およびＣＤ−５の培養上溝中に含まれる抗体の特異性
および免疫グロブリンのクラスを調べた。その結果を後
記表−１に示す。 ［００５１］ 実施伍立 （１）免疫原Ω２製： Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ○０５８８
株をサブロー培地を含む斜面寒天に接種し、３７℃のふ
卵器で３日間培養を行なった。培養終了後、白金耳にて
菌を回収し、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）に懸濁せしめ、遠
心分離（１０００Ｘｇ、　４℃、１０分間）を行ない、
沈渣（菌体）を得た。この洗浄操作を３回繰り返した後
の菌体を１００℃で２．５時間加熱処理した。 ［００５２］ 菌体をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで２×１０７個
／ｍｌの濃度に調整し、免疫原懸濁液として以下の実験
に用いた。 ［００５３］ （２）抗体主生胆胞Ω四裂： ８週令の雌性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ｃマウス印本チャール
ズリバー）に上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを腹腔内投与
することにより免疫を行なった。さらに２週間隔で免疫
を繰り返し、免疫開始後１０週目に上記免疫原懸濁液０
．２ｍｌを静脈内投与することによりブースターを行な
い、３日後にマウスを脱血死せしめ、クリーンベンチ（
日立製作所）内で牌を無菌的に摘出した。次に、ＲＰＭ
　Ｉ　１６４０培地を含むシャーレに牌を入れ、実施例
１　（２）と同様の方法により、５×１０７個／ｍｌの
濃度の牌細胞懸濁液を得た。 ［００５４］ （３）細　−合およびハイブリドーマの調制：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｎ　Ｓ　
Ｉ　／　１−Ａｇ４−１０．５Ｘ１０　　個と、上託牌
細胞懸濁液（５Ｘ１０７個）とを混合し、遠心分離（５
００Ｘｇ、　５分間）を行ない、上滑を除去して細胞ペ
レットを得た。容器の底をおだやかにたたくことにより
ペレットをほぐした後、３７℃に保温した４２．５％ポ
リエチレングリコール１５４０および１５％ジメチルス
ルホキシドを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地０．５ｍｌ
を添加し、１分間反応させた。この際、容器をゆっくり
指でまわしておだやかに回転させることにより、ポリエ
チレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。 １分後より同様にゆっくりと容器を回転させながら、３
７℃に保温したＲＰＭ１１６４０培地を１ｍｌ／３０秒
の速度で合計１０ｍ１加えた後、遠心分離（５００Ｘｇ
、　５分間）を行なった。上清を除去した後、細胞ペレ
ットをＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に懸濁させ、遠心分離
（５００Ｘｇ、　５分間）を行ない、細胞ペレットを得
た。この洗浄操作を再度繰り返しな後、細胞ペレットに
３７℃に保温した培養用培地、すなわち１０％牛脂児血
清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、　４．５ｇ
／Ｌノグルコース、５×１０−５Ｍのβ−メルカプトエ
タノールおよび５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンを含む
ＲＰＭ１１６４０培地１０ｍ１を加え、よく懸濁させた
。この細胞懸濁液を９６ウエルの組織培養用プレート（
Ｎｕｎｃ　１６７００８．　Ｎｕｎｃ社、デンマーク）
の各ウェルに２００μｌずつ分注し、３７℃で５％の炭
酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を開始した。培養
開始２４時間後に、上溝を半分すて、３７℃に保温した
ＨＡＴ培地、すなわち上記培養用培地に１ｘｌＯＭヒフ
−ζキサンチン、４Ｘ１０　　Ｍアミノプテリン、　　
１．６Ｘ１０−５Ｍチー４　　よ　　　　　　　　　　
　−７ミジンを添加したものを１００μｌ加えた。以後
、２〜３日間隔で各ウェル中の培地１００μｌを除き、
新たにＨＡＴ培地１００μｌを加えることにより培養を
行ないＨＡＴ培地中で増殖能力を有するハイブリドーマ
を選択した。 ［００５５］ 培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各ウェル中の培養上溝中の産生抗体を実施例１
　（４）に記載の方法で検査した。ただしプレートに結
合させる菌体としてはＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
ｓ　Ｉ　Ｆ　００５８８株を用いた。その結果、４８ウ
工ル中３個のウェルで抗体産生が認められた。 ［００５６］ （４）″　　生ハイブリドーマの・立：次いで、抗体産
生が認められたウェル中のハイブリドーマのクローン化
を、実施例１　（４）に記載の方法により行ない、抗体
産生ハイブリドーマＣＤ−６およびＣＤ−７を樹立した
。 ［００５７］ ハイブリドーマは培地交換または継代に際し、ＨＡＴ培
地に代えてＨＴ培地（−４。 培養用培地にｌＸｌ０　　Ｍヒポキサンチンおよび１．
６Ｘ１０’Ｍチミジンを添加したもの）を用いることに
より、徐々に培地をＨＴ培地に交換し、ＨＴ培地にて２
週間以上培養した後、更にＨＴ培地に代えてヒポキサン
チンやチミジンを含まない培養用培地を用いることによ
り、徐々に選択培地中での培養から通常の培養用培地中
での培養に適合させた。 ［００５８］ （５）抗体Ω生産： （インビトロ終　による生　）；実施例１　（５）に記
載の方法により、ハイブリドーマＣＤ−６およびＣＤ−
７の培養を行ない、培養上清を得た。ただし、培養開始
時の細胞濃度は２×１０５個／ｍｌであり、４日後の培
養上清の抗体含量は各々２．５μｇ　／ｍｌ、　　３．
０μｇ　／ｍｌであった。 ［００５９］ （インビボ声　による生　）；実施例１　（５）に記載
の方法により、ＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内にハイブリド
ーマＣＤ−６またはＣＤ−７を各々１×１０７個接種し
、接種後２ないし３週目に腹水を採取して腹水上清を得
た。１０匹のマウスから各々約３０ｍ１の上清が得られ
た。 ［００６０１ （６）″　の　８生および　゛２： 実施例１　（６）に記載の方法でハイブリドーマＣＤ−
６およびＣＤ−７の培養上溝中に含まれる抗体の特異性
および免疫グロブリンのクラスを調べた。その結果を後
記衣−１に示す。 ［００６１］ 実施伍土 （１）免疫里Ω糎製： Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＡＴＣＣ７５２株
をコーンミール印水製薬）を含む平板寒天に接種し、２
５℃のふ卵器で１０日間培養を行なった。培養終了後、
薬匙にて菌糸体および厚膜胞子に富む部分を回収し、Ｐ
ＢＳ　（ｐＨ７，２）に懸濁せしめ、ホモゲナイズした
。そして遠心分離（１０００Ｘｇ、　４℃、１０分間）
を行ない、沈渣（菌体）を得た。この洗浄操作を３回繰
り返した後、ＰＢＳで１％容積に調整し、免疫原懸濁液
として以下の実験に用いた。 ［００６２］ （２）抗体産虫糎胞ｏｍ製： ８週令の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバ
ー）に上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを腹腔内投与するこ
とにより免疫を行なった。さらに１４日間隔で免疫を繰
り返し、免疫開始後７０日ロー上記免疫原懸濁液０．２
ｍｌを腹腔内投与することによりブースターを行ない、
３日後にマウスを脱血孔せしめ、クリーンベンチ印立製
作所）内で牌及び腸間膜リンパ節を無菌的に摘出した。 以下、実施例１（２）に記載の方法に従い１０８個／ｍ
ｌの牌細胞懸濁液を得た。 ［００６３］ （３）細　融合およびハイブリドーマの調制：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ３
．６５３１ＸＩＯ７個と上記牌細胞懸濁液（１×１０８
個）とを混合し、実施例２（３）に記載の方法で細胞融
合を行ない、ハイブリドーマを調製した。その結果、４
８ウエル中１０ウエルで抗体産生が認められた。 ［００６４］ （４）　　　生ハイブリドーマの・立：次いで、抗体産
生が認められたウェル中のハイブリドーマのクローン化
をフィブリンゲル法により行なった。すなわち、２．５
ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（マイルス社、アメリカ
）　　　８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、０．５　ｍｇ
／ｍｌの塩化カリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む
溶液１ｍｌをシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ　３００２．　Ｂ
ｅｃｋｔｏｎ　−Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ）
に分注し、底にまんべんなく広げた後、１０ｍＵ／ｍｌ
のトロンビン（マイルス社、アメリカ）および２０％の
牛胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭＥＭ培地４ｍ
ｌを加え、３７℃培地４量ｌ置してゲル化させた。次に
ハイブリドーマ１×１０４個／ｍｌを１００μｍずつゲ
ルに加えて細胞が均一に広がるようにして３７℃で５％
炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった。培
養開始１０日ロー降、ゲル上に生じた細胞コロニーをパ
スツールピペットにて採取し、９６ウエルの組織培養用
平底プレートに移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ＭＥＭ
培地０．２ｍｌをさらに加え、３７℃で５％炭酸ガスを
含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった。そしてハイブ
リドーマの増殖を観察すると共に、各ウェル中の培養上
溝中の抗体の有無を実施例１（４）に記載の方法で検査
した。抗体産生が陽性のハイブリドーマの中から、抗体
分泌能が高く、増殖性に優れ、しかも安定なりローンを
選び、上述と同様の方法で再度クローン化を行ない、抗
体産生ハイブリドーマＣＤ−８およびＣＤ−９を樹立し
た。 ［００６５］ （５）抗伴Ω目産： 実施例１　（５）に記載の方法により、上記ハイブリド
ーマＣＤ−８およびＣＤ−９のインビトロおよびインビ
ボ培養を行ない、培養上清および腹水上清を得た。 ［００６６］ （６）″　の　　生および　状： 実施例１　（６）に記載の方法によりハイブリドーマＣ
Ｄ−８およびＣＤ−９の培養上清中に含まれる抗体の特
異性および免疫グロブリンクラスを調べた。その結果を
表−１に示す。 ［００６７］ 【表１】 ［００６８］ 実施倒立 実施例１乃至４で得られた抗体を、１群１０匹のＩＣＲ
マウスに２ｇ／ｋｇ経口、４００　ｍｇ／ｋｇ腹腔内ま
たは２００ｍｇ／ｋｇ静脈内投与し、１４日間観察した
ところ、これら抗体による死亡は全く認められなかった
。 ［００６９］ また、実施例１乃至４で得られたハイブリドーマＣＤ−
１乃至ＣＤ−９の形状、大きさ、性状を表−２に示す。 ［００７０】

【表２】 表

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗カンジダ菌抗体産生細胞とインビトロに
   おいて長期継代培養可能な細胞とから作製されるカンジ
   ダ菌菌体表面抗原に対する抗体を分泌するハイブリドー
   マ。
2. 【請求項２】ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４
   、ＣＤ−５、ＣＤ−６、ＣＤ−７、ＣＤ−８またはＣＤ
   −９であることを特徴とする請求項１に記載のハイブリ
   ドーマ。