JPH01168299A - モノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、脂質生化学、細胞生物学、薬理学、癌研究等
の分野での基礎研究のみならず、心臓循環器側薬、抗動
脈硬化薬、向精神薬、向神経薬、抗アレルギー剤、免疫
調節剤、抗癌剤等の探索において有用な、リン脂質類、
特にイノシトールリン脂質の代謝あるいはその代謝産物
の動態を調節する能力のある薬剤およびその調製方法に
関する。より詳しくは、本発明の場合、該薬剤は、イノ
シトールリン酸化合物に対するモノクローナル抗体であ
り、本発明は該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを包含する。

従来の技術 発明が解決しようとする問題点 細胞内情報伝達におけるイノシトールリン脂質の役割の
重要性が明らかにされ、広範な研究が世界的に進められ
ている。Ｃａ”を細胞内情報伝達因子とするホルモンや
刺激は、イノシトールリン脂質の代謝亢進を介して作用
発現を行っている。そのさいの受容体活性化のトリツガ
−反応は、ホスファチジルイノシトール４．５−二リン
酸のホスフォリパーゼＣによる分解である。そのとき生
じたシアシリグリセロールは、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎ
ａｓｅＣのａｃｔ−ｉｖａｔｏｒとして働き、イノシト
ールｌ、　４．５−三リン酸（以下ＩＰ３と略記する。

）は細胞内Ｃａ”　５ｔｏｒｅからＣａ”の遊離を促す
。その結果、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅＣ，Ｃａ”
／ｃａ１ｍｏｄｕｌｉｎ　ｋｉｎａｓｅが活性化され、
ホルモン作用が発現する。ホルモンや化学伝達物質など
の受容体が細胞膜上にある場合、細胞膜を横切って情報
を細胞内に伝える必要がある。これらの受容体活性化に
よる情報伝達機序を大別すると１〜■に分けられる。■
、■はともにｃＡＭＰを細胞内情報伝達の効果因子とす
る系であるが、■はｃＡＭＰ上界させることでその作用
を発揮し、■はｃＡＭＰ産生を抑制することでその作用
を発現する。■はＣａ２＋を細胞内情報伝達の効果因子
とする系である。即ち、Ｃａ”によって活性化される反
応、とくにＣａ”／　ｃａ１ｍｏｄｕｌｉｎ依存性のｋ
　１ｎａｓｅ　（Ｃａ／ＣａＭ−ｋｉｎａｓｅ）　　と
Ｃａ”／ｄｉａｃｙ１ｇｌｙｃｅｒｏｌ／ｐｈｏｓｐｈ
ｏｌｉｐｉｄ依存性のｋｉｎａｓｅ（ｐｒｏｔｅｉｎ　
ｋｉｎａｓｅ　Ｃ）の活性化を介してその作用が発現す
る系である。この系の特徴は、膜中の微量リン脂質であ
るイノシトールリン脂質の代謝促進が作用発現に重要な
役割を果たしている乙とである。■の系は、成長因子の
作用に密接に関係している系であり、受容体がリン酸化
を受け、また受容体そのものがｋｉｎａｓｅ活性をもつ
（竹縄忠臣・医学のあゆみ、１３１　（ｌＩ＆１２）、
　７１５−７２３．　＋ｑａ４参照）。「細胞内Ｃａ”
５ｔｏｒｅからＣａ”の遊離を促す、ＩＦ５はｃＡＭＰ
と同様、細胞内の情報伝達系のセカンドメツセンジャー
と言われている。ｃＡＭＰの細胞内濃度の測定方法は既
に種々の方法が確立され、測定キットも市販されており
、ｃＡＭＰの量と情報伝達系の各々の代謝産物の動態と
の関連性、各種ホルモン作用との関連性および疾患との
因果関係などが明らかにされている。それに対して、Ｉ
Ｐ３の研究の歴史は、ｃＡＭＰのそれに比へてまだ浅い
ことにもよるが、ＩＰ３の細胞内濃度を測定する簡便な
方法ならびに測定キットは今だ開発されていない。ＩＰ
３は上記のように、細胞内情報伝達系の鍵である産物で
あり、ＩＰ３の各組繊細胞内濃度と各種の生命現象、各
種の疾患との関連性の究明が、現在の医学・生物科学領
域の大きな課題であることから、ＩＰ３の簡便な測定系
への需要はきわめて大きく、その開発が要請・期待され
ているところである。

そこで多くのイノシトールリン酸化合物が自然界に存在
する中で、ＩＰ３はその化学構造及び代謝上の位置から
して、多くのｉｓｏｍｅｒおよび近似構造の代謝産物が
存在し、それらを別々に分離したりある別々に識別する
ことには、大きな困難さが予想される。

イノシトールリン酸化合物類の高速液体クロマトグラフ
ィーなどによる分離・適量方法の確立も重要ではあるが
、操作の煩雑な点がある。ＩＰ３、イノシトールｌ、　
３．４．５−四リン酸（以下ＩＰ、ｔと略記する。）等
は生体中では微量成分でもあり、やはり免疫学的適量方
法の確立が最も期待されているところである。そのため
にはＩＰ３、　ＩＰ　４などの生理学的機能が明確にな
っていたり、なりつつあるイノシトールリン酸化合物に
対するポリクローナル抗体、望むらくはモノクローナル
抗体の調製が焦眉の急である。

問題点を解決するための手段 本発明は、このように細胞生物学研究、あるいは各種疾
患の診断、病因の解明などの実用上も大きな要請のある
イノシトールリン酸化合物、特にＩＰ３、ＩＰ４の各組
織、細胞中、体液中での絶対量の測定に必須なモノクロ
ーナル抗体、しかも他のイノシトールリン酸化合物たと
えば代謝上の生合成中間物または分解物であるＩＰ、　
ＩＰ２　、ＩＰ３、ＩＰ４のｉｓｏｍｅｒ、イノシトー
ル−五リン酸、イノシトール−六リン酸とは反応しない
か（親和性がないか）あるいは交差反応の少ない、極め
て特異性の高い抗体を提供するものである。さらにまた
本発明は該抗体を産生ずるハイブリドーマおよびその調
製方法、該抗体の大皿の製造方法、該抗体を用いたＩＰ
３．　ＩＰ４等の免疫定量法および抗ＩＰ３モノクロー
ナル抗体を含む抗癌剤を提供するものである。

本発明のイノシトールリン酸化合物に対するモノクロー
ナル抗体は以下の７つの工程の実施により製造された。

１、免疫原性コンジュゲート（抗原）の製造２、動物の
免疫 ３、抗体価測定系の調製と抗体価の測定４、骨髄腫細胞
の調製 ５、細胞融合 ６、ハイブリドーマの選択およびモノクローン化７、モ
ノクローナル抗体の製造方法 各工程につき説明する。

ｌ、　免疫原性コンジュゲート（抗原）の製造ＩＰ３　
、　ＩＰ４などはそれ自身殆んど免疫原性がないため、
ＩＰ３．　ｒＰａなどと適当な縮合剤を介して種々の担
体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如
き免疫原性コンジュゲートを、調製する必要がある。他
方本来の目的の抗原に対しては比較的低い特異性を有し
、コンジュゲートの担体タンパク質類あるいは縮合試薬
に対して特異的ないし高度に交差反応性のあるモノクロ
ーナル抗体の産生な少なくさせる工夫も必要である。ま
た往々ある１ｇＭ型のモノクローナル抗体のみ産生され
たというような事態にならないような、免疫原性コンジ
ュゲートの製造が期待される。

（１）担体タンパク質類の活性化 本発明ではタンパク質類の活性化のために、活性化結合
基を導入した。活性化結合基としては、■活性化エステ
ルまたは活性化カルボキシ基、即ち式、　−ＣＤ−ＯＸ
　（式中、Ｚは、０−またハル−ニトロフェニル、ペン
タフルオロフェニル、ｌ−ベンゾトリアゾールまたはＮ
−サクシイミドのようなカルボキシ活性化基である）で
示される基、■活性化ジチオ基、即ち式：　−５−Ｓ−
Ｘ　（式中、Ｘは２−ピリジルのようなジチオ活性化基
である）で示される基、および■エポキシ基が含まれる
。

活性化結合基含有担体として本発明では、ＩＦ５　、　
ＩＦ５に対して、エポキシ基を有する適当な免疫原性コ
ンジュゲート用の担体分子が好んで用いられ、たとえば
ラウンジら（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、
　２６（４）、　４０７〜４１０　（１９８５））の方
法により製造した。活性化試薬としては、１．４−ブタ
ンジオール・ジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａ
ｎｅｄｉｏｌ　ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ　ｅｔｈｅｒ　、
以下ＢＤＥと略記する。）などが用いられた。

また担体として用いられるタンパク質類として、キーホ
ール・リンペット、ヘモシアニン（以下ＫＬＨと略記す
る）、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）、オ
バルブミン（以下ＯＶＡと略記する）、グロブリン、ポ
リリジンなどのポリペプチドおよびＢＣＧ菌などが選択
された。

タンパク質類とＢＤＥとの結合は、まずタンパク質類を
、水酸化ナトリウムのようなアルカリ水溶液に溶解し、
次にタンパク質のアミノ基数に対し２０〜３００倍モル
四のＢＤＥを加え、室温で１０時間〜２４時間放置して
行った。その後塩酸などの酸で冷却下中和し、−夜蒸留
水中で透析し、凍結乾燥し活性化タンパク質類原末を得
た。

（２）イノシトールリン酸化合物と活性化タンパク質類
との結合 （１）で得た活性化タンパク質類を蒸留水中に懸濁し、
そこにアルカリ水溶液中に溶かしたイノシトールリン酸
化合物を加え室温〜４０℃で２４〜７２時間反応させた
。イノシトールリン酸化合物とタンパク質類との量比は
特に制限はないが、通常タンパク質類に対してイノシト
ールリン酸化合物を過剰に用いるのが好ましく、イノシ
トールリン酸化合物の量を多くすることにより、タンパ
ク質に結合するイノシトールリン酸化合物の量を多くす
ることができる。次に、エタノールアミン原液を１滴加
え、３７℃で２〜６時間反応させ、次に冷却下塩酸など
のような酸で中和し、その後この反応液を４℃で一夜蒸
留水中で透析し、しかる後凍結乾燥し各々の免疫原性コ
ンジュゲートを得た。この他、免疫原性コンジュゲート
を単離するには、通常タンパク質の精製に用いられる方
法、たとえばゲル口過、イオン交換クロマトグラフィー
、限外口過、塩析などの方法を用いることもできる。

ＩＦ５　、　ＩＦ５などのイノシトールリン酸化合物と
担体タンパク質の結合による免疫原性コンジュゲートの
製造には、ＩＦ５　、　ＩＦ５の如きパブテンと担体タ
ンパク質とを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド・２８Ｃβ（ＥＤＣＩ）ま
たは［Ｎ−シクロへキシル−Ｎ“−［β−（Ｎ−メチル
モルホリノ）エチル］−カルボジイミド・ｐ−トルエン
スルホナート（ＭＣＤＩ）なとのカルボジイミド類ある
いは無水グルタル酸など、各種縮合剤を用いて、行うこ
ともできる。

２、動物の免疫 １、で得られた免疫原性コンジュゲートを、通常、フロ
インド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製、以下ＦＣＡ
と略記する。）、リビ（Ｒ４ｂｉ）アジュバンｌ−（Ｒ
ｉｂｉ社製）、百日咳ワクチン（千葉血清社ｉ）、ＢＣ
Ｇ　（日本ＢＣＧ製造社製）、リビドＡ　（Ｒｉｂｉ社
製）、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどの
アジュバントと混合した後、たとえばＢａ１ｂ／Ｃなど
のマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ
などの宿主動物に免疫する。免疫原性コンジュゲートの
投与量はたとえばマウスに対して１〜４００μｇ／動物
で、一般に宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜
４週問おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮
下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜ＩＯ回程度
反復して行った。免疫用のマウスとしてはＢａ１ｂ／Ｃ
系マウスの他、Ｂａ１ｂ／Ｃ系マウスと他系マウスとの
Ｆ１マウスなども用いることができる。ＢＣＧコンジュ
ゲートを用いる場合は、ＦＣＡもフロインド不完全アジ
ュバント（Ｆ　Ｉ　Ａ）も用いなかったが初回免疫より
リビドＡ、リポソーム、Ｒ４ｂｉアジュバントを混合し
て免疫する動物群もつくった。他の担体タンパク質を用
いる場合は、初回免疫時はＦＣＡと混合したが、追加免
疫時にはＦＩＡと混合した。

３、　抗体価測定系の調製と抗体価の測定初回免疫後２
週間ごとに、マウスの場合眼底静脈より採血し、血清中
の抗イノシトールリン酸化合物抗体価を以下に示す固相
法の酵素免疫測定法（ＥＩＡと略記する。）あるいは放
射免疫測定法（ＲＩＡと略記する。）等で測定した。

抗イノシトールリン酸化合物抗体の測定系について、代
表例として抗ＩＰ３抗体のＥＩＡにつき説明する。

９６穴のＥＩＡ用プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ社製）に５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
９，６であるコーティング緩衝液にＩＯμｇ／爪１とな
るように溶かしたＩＰ３−ＢＳＡコンジュゲート溶液を
５０μ／ウェルずつ各ウェルに分注し、４°Ｃで一夜イ
ンキユベートして、プレート穴底面に抗原をコートした
。交差反応を見る場合には、ＩＰ３−ＢＳＡのかわりに
、ＩＰ−ＢＳＡ、ＩＰ２−ＢＳＡあるいはＩＰ４−ＢＳ
Ａなどのコンジュゲートをプレートにコートした。次に
０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有のｐ）１７．４のリン
酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔと略記する。）で３
回以上洗浄した。次に０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０と１
％ＢＳＡあるいは１％ＯＶＡを含むＰＢＳ−Ｔを加え、
室温で２時間以上インキュベートして、プレート底面上
の蛋白質結合性残基をＢＳＡあるいはＯＶＡでコートし
た。次にこのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回以上洗浄し、
０．０１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ−Ｔ２００ＪＩＪを加
えて、プレートをシールし使用時まで４℃で保存した。

抗体価測定用試料、即ち段階希釈したマウス血清、下記
のハイブリドーマ培養上清、粗精製モノクローナル抗体
などの抗体価の測定に先立ち、プレートをＰＢＳ−Ｔで
充分洗浄した後、第一抗体としてこれら試料を５０μ／
ウェル分注し、４℃で一晩、あるいは室温〜３７℃で２
〜３時間インキュベートした。次にＰＢＳ−Ｔで３回洗
浄した後、第２抗体として、ウサギの抗マウス免疫グロ
ブリン−ペルオキシダーゼ結合物（Ｄａｋｏ社製、以下
ａ−マウスＩｇ−Ｐｏｘと略記する。）をＰＢＳ−Ｔ　
−０，１％ＢＳＡ溶液で２００倍に希釈し、５０μ／ウ
ェルをプレートに加えた。室温で２時間インキュベート
後、ＰＢＳ−Ｔで４回以上洗浄し、次にＡＢＴＳ基質液
［２，２“−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）ニアンモニウムがｐＨ４，０の５０
ｍＭクエン酸緩衝液中に０．２５ｍｇ／　ｒｒｄ溶解さ
れており、使用直前に１．５％の過酸化水素を１０〜１
００μ／　ｍｌ添加した容器］を１００１ＪＪ／ウェル
加え、室温で１５分インキュベートした後、吸光度ＯＤ
４１４ｎｍを測定した。これらコンジュゲートのうち、
ＩＰ３−ＢＣＧ及びＩＰ３−ＢＣＧ　＋Ｒｊｂｉ　Ａｄ
ｊｕｖａｎｔで免疫した群のマウスの抗■Ｐ３抗体価の
立ち上りが最も早く、かつ抗体価も大きかった。多くの
マウスで抗体価は免疫後６〜８週間で最高値に達した。

中には１４〜２０週目で最高値に達するマウスもいた。

４、骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては免疫グロブリ
ンを産生しないＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１　（ＭＳ
−１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、　　６　、５１１〜５１９（１９７６））　、　
ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ−２）　　（Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２７６゜２６９−２７０　（１９７８））　、マ
ウスミエローマＭＯＰＣ−２１ライン由来のＰ３−Ｘ６
３−Ａｇ８−υＩ　（Ｐ３−１１１）　　（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔｔｏｐｉｏｓ　ｉｎ　ＭｉｃｒｏＨｏｌｏｇｙ　ａ
ｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　８１　。

１−７　　（＋９７８））　、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
　　（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６゜４９５−
４９７　　（＋９７５））　　、　　Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８−６．５．３　　（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　１２３．１５４８−１５５
０　　（１９７９））、ＭＰＣＩＩ−４５，６ＴＧ１．
７　、　ＦＯ１ＳＩ９４１５ＸＸＯ，ＢＵ、１などを用
イルことができる。これら８−アザグアニン耐性のマウ
ス骨髄腫細胞株は８−アザグアニン培地（ダルベツコ−
のＭＥＭ培地（以下ＤＭＥＭと略記する。））あるいは
ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン　（１，５ｍＭ）
、２−メルカプトエタノール（５Ｘ１０’Ｍ）、ゲンタ
マイシン（１０μｇ／ｍＡ）およびｌＯ％牛脂児血清（
ＦＣ８）を加えた正常培地に、更に８−アザグアニン（
１５μｇ／ｍｌを加えた培地）で継代するが、細胞融合
の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日ｌ×１０７
以上の細胞を用意した。あるいは凍結保存しておいた細
胞株は３７℃で解凍後完全ＤＭＥＭで３回以上洗浄後、
１０ｍｆの完全ＤＭＥＭに懸濁し、５０ｍ１のフラスコ
中で培養を開始し、１日後に培地を全量交換し、その後
順次、２５０ｍ１フラスコ、６００ＩｎＪフラスコと大
きな容器に入れかえ、必要な細胞数を確保する。ミエロ
ーマ細胞株の中にはＨ（重）鎖やＬ（軽）鎖を合成する
ものがあるが、このような細胞株を使用すると、抗体産
生細胞の合成するＨ鎖やＬ鎖とまじりあったバイブリド
抗体分子ができるのでＨ鎖やＬ鎖を合成しないものが望
ましい。

ヒトの抗体非産生の骨髄腫細胞系として５１９４１５、
ＸＸＯ、ＢＵ、　１ｔ、Ｋ　トカ使用テキル。

５、　細胞融合 ２、で免疫したマウスにＩＦ５−ＢＣＧコンジュゲート
１００μｇ／生食を腹腔内に追加免疫し、３〜４日後に
肺臓を摘出し、肺細胞を調製した。肺細胞の他、各所属
リンパ節細胞も収集することができる。この肺細胞と４
．で調製した骨髄腫細胞株をＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地
（田水製薬社製）、ＲＰＭＩ　１６４０培地あるいは生
食、ＰＢＳでよく洗浄後、細胞数で肺細胞（リンパ球）
：骨髄腫細胞が５〜２０；１となるように細胞を混合し
、遠心操作を行った。上清を捨て、沈殿したペレットを
ほぐした後、融合促進剤として３７℃に加温した平均分
子−川が１．０００〜８．０００の３０〜６０％のポリ
エチレングリコール（以下ＰＥＧと略記する。）溶液を
０．５〜２ｍｌ加えた。融合促進剤としてＰＥＧ添加時
にジメチルスルホキシドなどを少量加えることも有効で
ある。ＰＥＧ溶液を細胞に添加し、融合反応１〜ｌＯ分
間行った後、ＤＭＥＭ培地あるいはＲＰＭｌ　１６４０
培地などを１０〜５０社徐々に加え反応を停止した。融
合反応停止後、直ちに遠心し、上清を除去した。Ｆｅ２
を５〜２０％含むＤＭＥＭ培地あるいはＲＰＭｌ　１６
４０培地に細胞を懸濁し、マイクロタイタープレートに
１ｘ１０５〜５　Ｘ　１０６個／ウェルとなるように細
胞遊離液を分注した。次にヒボキサンチン（ＩＸｌＯ’
Ｍ）、アミノプテリン（４Ｘ　１０−７　Ｍ）　、チミ
ジン（＋、６　ｘ　１０−５Ｍ　）を含むＤＭＥＭ培地
あるいはＲＰＭＩ　１６４０培地、即ちＨＡＴ培地に換
えてゆく。ＨＡＴ培地交換の方法は、一般には翌日、プ
レートに初めに分注した容量と当容量加え、その後、２
〜３日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換した。融合後１
０〜１４日目に、日月ノプテリンを除いたＨＴ培地で２
〜３日ごとに培地交換を続けた。更に１４日日月降は１
０〜２０％のＦｅ２を含むＤＭＥＭ培地あるいはＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地に交換し培養を継続した。融合細胞（
ハイブリドーマ）の増殖のさかんなウェルの培養上清を
ＲｒＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡなどの測定系で、抗体価測定し
、目的の抗ＩＰ３抗体産生ハイブリドーマを選択する。

６、　ハイブリドーマの選択およびモノクローン化５、
で得られた抗■Ｐ３抗体価の高い抗体を産生ずるハイブ
リドーマをクローニングする。クローニングには、寒天
培地中でコロニーをピックアップする方法と限界希釈法
とがある。どちらの方法によるクローニングにおいても
２回以上繰り返し行い、完全に単一なりローンを得る。

バイブリドーマのスクリーニングは常法により行えばよ
く、たとえばハイブリドーマの生育したウェルの上清の
一部を採取し、目的とする抗ＩＰ３抗体と放射能標識し
たＩＦ５　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とをインキュベー
トし、その結合能をＲＩＡにより測定し、抗ＩＰ３抗体
を分泌しているウェルな検索することができる。またＥ
ＩＡ、ＦＩＡなどによっても抗体価の高い抗体を産生ず
るバイプリドーマを検出することができる。限界希釈法
によるクローニングを２〜４回操り返し、ＩＦ５に特異
的な抗体を産生じているバイプリドーマを数株取得する
ことができＡＢ＝１、ＡＤ−２、ＡＢ−３、ＡＢ−４、
ＡＤ−５、ＡＢ−６と命名した。

一方ＩＰ４に特異的な抗体を産生しているハイブリトー
マも数株取得することができＡＢ−１１、ＡＤ−１２、
ＡＢ−１３、ＡＢ−１４と命名した。

７、　モノクローナル抗体の製造方法 抗■Ｐ３モノクローナル抗体あるいは抗■Ｐ４モノクロ
ーナル抗体を産生ずる各々のバイプリドーマを１０〜２
０％のＦｅ２を含むＤＭＥＭ、　ＲＰＭＩ　１６４０培
地などの適当な培養液中で培養し、その培地上清から得
ることができる。一方更に大量の抗体を得るためには、
骨髄腫細胞の由来動物と同系の組織適合性動物の腹腔内
に各々のハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の
腹水中に産生されたモノクローナル抗体を精製回収する
こともできる。上記のハイブリドーマの１〜ｌＯ×１０
６個の移植に先立ち、ブリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルベンチデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａ１社製）などの鉱物油を腹腔内投与し、ハイブ
リドーマを大量に増殖させ、腹水または血清を採取すれ
ば良い。この場合ハイブリドーマは１０−１８日目位で
腹水腫瘍を形成し、腹水中、血清中に高濃度の抗体を産
生できる。得られた培地上清、または血清または腹水か
ら抗ＩＰ３モノクローナル抗体、抗ＩＰ、モノクローナ
ル抗体を精製するには、塩析、イオン交換クロマトグラ
フィー等の通常の精製操作により行うことができる。腹
水の場合は最初に遠心分離（３０００ｒｐｍ　、　５分
）して固形分を除去しておくとよい。

本発明の抗ＩＰ３、抗ＩＰ４モノクローナル抗体はＥ　
Ｉ　Ａ、ゲル内沈降反応によると分子ｆｉ　１５０，０
００〜２００．０００のＩｇＧクラスに属し、重鎖はγ
ｌ。

γ２ａ、　γ２ｂ、　γ３．γ４．α、軽鎖はｋのサブ
クラスに属し、またスキャッチャードプロット法による
ＩＰ３に対する親和力、Ｋａ値は１．　ｌｘ　１０”　
〜３．１ｘ１０９℃／ｍｏｌｅと極めて高い数値を示し
た。また本発明の抗ＩＰ３モノクローナル抗体、抗ＩＰ
４モノクローナル抗体はＩＰ２　、　ＩＰ、　ＩＰ５　
、ＩＰ６などとは交差反応性は殆んど示さなかった。

以上から明らかなように本発明の抗イノシトールリン酸
化合物抗体は、ＩＰ３　、ＩＰ、などに対してきわめて
高い親和性を有し、ＩＰａ　％　ＩＰ４以外のＩＰ２、
ＩＰ、　ＩＰ５、ＩＰ６などに対して親和性は殆んど示
さなかった。従って本発明の抗ＩＰ３抗体、抗ＩＰ４抗
体はＩＰ３、ＩＰ４に対して極めて特異性の高い抗体で
あることが明らかにされた。

次に上記の操作で製造された抗イノシトールリン酸化合
物モノクローナル抗体を用いて、イノシトールリン酸化
合物の定量のためのＲＩＡ、　ＥＩＡ。

ＦＩＡキットが作成される。

［実施例］ 本発明を以下に、実施例等をもってより詳細に説明する
が、本発明はそれらに限定されない。

実施例１　　免疫原性コンジュゲートの製造Ａ、エポキ
シ−ＫＬＨの調製 Ｋ　Ｌ　Ｈ（Ｓｉｇｍａ社製）　２５ｍｇをビーカー内
で、０．２Ｎの水酸化ナトリウム溶液２ｍＪに溶解し、
直ちにＫＬＨタンパク質のアミノ基残基数の１００イ音
当量の１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（
ＢＤＥ）８６ｄを加え、室温で２０時間放置した。次に
６Ｎｌ（Ｃｌ３を冷却下等量加え、中和した。直ちに蒸
留水に対して透析を開始し、−夜透析を続けた。透析チ
ューブ内より溶液を回収し凍結乾燥して粉末２３．０ｍ
ｇを得た。

Ｂ、エポキシ−ＢＳＡの調製 Ｂ　Ｓ　Ａ　　（Ｓｉｇｍａ社製ＲＩＡｇｒａｄｅ）　
１　ｇをビーカー内で蒸留水２０ｆｆｉ１に溶解した。

次に０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍ１を加えた
。直ちにＢＤ　Ｅ　１．４１ｍ１を加え以下Ａと同様の
処理を行った。凍結乾燥粉末１．３６１ｇを得た。

Ｃ，エポキシ−０ｖＡの調製 ＯＶＡ　　（Ｓｉｇｍａ社製）ＩｇをＢと同様にＢＤＥ
ｌ、４１＋Ｊと反応させ、Ｂと全く同様にして凍結乾燥
粉末１．２１７ｇを得た。

Ｄ、エポキシ−ＢＣＧの調製 オートクレーブしたＢＣＧ懸濁液（ｌｏｍｇ／ｒａｌ生
食）　ｌＧｍ１　（ＢＣＧとしてｌｏＯｍｇ）と６Ｎ−
水酸化ナトリウム水溶液３３３μ（最終濃度、０．２Ｎ
ＮａＯＩＩ）およびＢＤＥ３４３μをビーカー内で混合
した。超音波をかけながら室温で２００時間反応せた。

以下Ａと同様の処理を行い、凍結乾燥粉末１０８．７ｍ
ｇを得た。

Ｅ、ＩＰ３−ＫＬＨコンジュゲートの調製Ａで得たエポ
キシ−ＫＬＨ４ｍｇをｌ　ｍＡの蒸留水に懸濁し、次に
０．４Ｎ　ＮａＯＨ溶液１　ｍｌにＩＰ３３００μｇを
加えた溶液を加え、エポキシ−Ｋ　Ｌ　Ｈを溶解させ、
３７℃で４８時間反応させた。次にエタノールアミン原
液１滴を加え、３７℃で４時間反応させた。次にまた、
冷却下６Ｎ＋ＩＣβ　６７μを加え中和した。そして４
℃で蒸留水中、−夜透析した。透析内液を凍結乾燥し、
粉末３．８０ｍｇを得た。

Ｆ、ＩＰ３−ＢＳＡコンジュゲートの調製Ｂで得たエポ
キシ−Ｂ　Ｓ　Ａ　９．６６ｍｇ　（１４４ｎｍｏｌｅ
）を２　ｍｌの蒸留水に懸濁し、次に０．４ＮＮａＯＩ
Ｉ溶液１　ｍｌにＩ　Ｐ３　３００μｇ　（７２０ｎ　
ｍｏｌｅ）を加えた溶液を加え、エポキシ−ＢＳＡを溶
解させ、３７℃で４８時間反応させた。以下Ｅと同様に
して凍結乾燥粉末８．５０ｍｇを得た。

Ｇ、ＩＦ５−ＯＶＡコンジュゲートの調製Ｃで得たエポ
キシ−０ＶＡ６．４ｍｇを、Ｆと全く同様にしてＩＰ３
３００μｇと反応させ後処理を行い、５．６３ｍｇの凍
結乾燥粉末を得た。

Ｈ，ＩＦ５−ＢＣＧコンジュゲートの調製りで得たエポ
キシ−ＢＣＧ４．０ｍｇを、Ｆと全く同様にしてＩＰ３
３００μｇと反応させ、後処理を行い、２．８０ｍｇの
凍結乾燥粉末を得た。

１．１Ｐ４−ＢＣＧコンジュゲートの調製りおよびＨと
同様にして、ＩＦ５　　（愛媛大学尾崎庄一部教授合成
）とＢＣＧとのコンジュゲートを凍結乾燥品として２．
０４ｍｇの粉末を得た。

実施例２　　動物の免疫 ８週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス各群計匹ずつに、Ｉ　Ｐ
３　　ＢＣＧ、ｒ　Ｐ４−ＢＣＧを除く各免疫原性コン
ジュゲート　１００μｇを生理食塩水に溶解し、当ｍの
フロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）とともによくま
ぜ合せ、乳化させたものを腹腔的投与した（初回免疫）
。１週あるいは２週間後、置皿のコンジュゲートをＦＩ
Ａとまぜ合わせ、腹腔的注射した（第２回免疫）。以後
１週あるいは２週間ごとに同様に、追加免疫を続けた。

ＩＦ５−ＢＣＧおよびＩ　Ｐ、−ＢＣＧコンジュゲート
の場合、初回免疫後毎週１００μｇのコンジュゲートを
ＦＩＡあるいはリビドＡ　（Ｒｉｂｉ社製）５μｇ、リ
ビドＡ　５μｇ＋リポソーム　あるいはＲｉｂｉアジュ
バント（モノリン酸リビドＡ２０μｇ＋トレハロースシ
ミコール酸　５０μｇ　含有）２００μとそれぞれまぜ
合わせ、追加免疫していった。初回の免疫後２週間ごと
に、マウスの眼底静脈より採血し、実施例３に記すよう
にして、血清中の抗イノシトールリン酸化合物抗体価を
測定した。

実施例３　　抗体価測定系の調製と抗体価の測定実施例
ＩＦで得たＩＦ５　　ＢＳＡコンジュゲートを１０μｇ
７ｍｌとなるよう、５０ｍＭ重炭酸緩衝液ｐＨ９，６で
希釈し、イムノアッセイ用９６穴マイクロタイタープレ
ート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｌ　に５０１１Ｊ／ウェル分注
し、４℃　１８時間静置した。次にＰＴで各ウェルな３
回洗浄し、１％ＯＢＡを含むＰＴを１００μ／ウエル分
注して室温で６時間静置した。

ついでＰＴで３回洗浄した。実施例２に示した免疫中の
マウスより得た抗血清を０．１％ＯＶＡを含むＰＴで１
００倍に希釈したものを被験抗血清として５０ＩＩＪ／
ウェル加えた６抗血清の力価が充分に上昇したものにつ
いては１．０００倍希釈抗血清、１０、０００倍抗血清
などを必要に応じて使用した。

次に、ＰＴで３回洗浄した後、０．１％ＯＶＡを含むＰ
Ｔで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスイムノグロブリンを５０μ／ウェル加え室温で２
時間静置した。そのあとＰＴで５回洗浄し、０．２５ｍ
ｇ／ｍＡの２，２°−アジノビス（３−エチルベンゾチ
アゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩及び０．
１５％過酸化水素を含む、５０ｍＭクエン酸緩衝液１０
０μを各ウェルに加え室温で１５分間、プレートを振と
うした。　４１４ｎｍにおける吸先度なイムノリーダー
ＮＪ−２０００（ＮｉｐｐｏｎＩｎｔｅｒＭｅｄ）を使
用し、測定した。

抗血清の力価を定めるために、抗血清を１００倍より順
次２倍希釈したものを本測定系に供し、滴定曲線を求め
た。力価算定の基準として、４１４ｎｍにおける吸先度
が１．０となった抗血清の希釈率をもって、その抗血清
の力価とした。ＩＦ５−ＢＣＧコンジュゲート＋Ｒｉｂ
ｉアジュバントで免疫をくりかえした免疫動物群３匹の
血清抗体価の推移を表１に示す。

ローナル抗体価 実施例４　　骨髄腫細胞の調製 前記したように各種のマウスミエローマ細胞を、細胞融
合のために培養し用意した。液体窒素中に保存したＮＳ
−１培地（ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、ペニシリンＧ
カリウム１００単位／　ｍｊ、硫酸ストレプトマイシン
１００μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナト
リウム　１ｍＭ、２−メルカプトエタノール　５　Ｘ　
１０−’Ｍ　）　１０ｍ１を加えた。

１１０００ｒｐで５分間室温で遠沈し上清を除いた。こ
の洗浄操作を３回くり返した。ＮＳ−１培地に細胞を懸
濁し濃度を約１０’個／　ｍＡとして３７℃で培養した
。２〜３日毎に培地を交換すると共に細胞濃度を約１０
’個／　ｍＡに調整して、培養を継続し細胞数を増やし
た。ヒトのガン治療のための抗ＩＰ３モノクローマル抗
体の試験的調製のためには、抗体非産生の骨髄腫細胞と
してＳ　　１９４１５．　ＸＸＯ。

Ｂ１１．１などを用意した。

実施例５ 細胞融合の当日に、細胞を集め、ＤＭＥＭ培地（Ｆｅ２
を含まないＮＳ−１培地）で、遠沈（＋０００ｒｐｍ　
、５分間、室温）による洗浄を３回行った。ＤＭＥＭ培
地２５ｍ１に再懸濁し、細胞濃度を計測した。一方、最
後の免疫より３日目のＢａ１ｂ／Ｃマウスより肺臓を無
菌的に摘出し、ＮＳ−１培地中でビンセットでもみほぐ
して牌細胞のＷＪ　ｔＦＡ液を調製した。次に、このｇ
濁液を、ステンレスメツシュで濾過して組織のかたまり
を除いた。

１１０００ｒｐで５分間室温で遠沈して上清を除き、次
にＤＭＥＭ培地で遠沈（１０００ｒｐｍ　、分間、室温
）による洗浄操作を３回行った。牌細胞をＤＭＥＭ培地
２５ｍ１に懸濁し細胞濃度を計測した。次に牌細胞及び
ＮＳ−１の懸濁液よりそれぞれ１．２Ｘ１０’個及び２
．４ＸＩＯ’個の細胞をとり混合した。　１１０００ｒ
ｐで５分間、室温で遠沈して、上清を捨てた。

細胞をよくほぐし、３７℃に加温した４５％ポリエチレ
ングリコール（ＭＷ４，０００　、１５％　ＤＭＳＯ含
有）　　０．３＋ａｊを１分間かけて徐々に加え、細胞
とよくこんごつした。さら、に１分間、容器を回転させ
て混合した後、３７℃に加温したＤＭＥＭ培地１０＋ａ
ｊをゆっくり加え、１分間放置した。さらに、ＤＭＥＭ
培地１５ｆｆｉ１を加えて１１０００ｒｐで５分間室温
で遠沈した。上清を捨てて、細胞をほぐし、ＮＳ−１培
地１００ｍ１に懸濁した。この懸濁液の２００ｄずつを
９６穴培養プレートの各ウェルに分注し３７℃で培養し
た。培養開始後、１日目、２日目、３日目、約半量の培
地をＨＡ　Ｔ培地（ＮＳ−１培地に１００μＭヒボキサ
ンチン、　０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジ
ンを含有する）で交換した。さらに２〜３日毎に培地の
半量をＨＡＴ培地で交換した。２週間後に、交換する培
地をＨＴ培地（ＨＡＴ培地よりアミノプリテンを除いた
）に換えた。

細胞融合後、約２〜３週間でほぼ全てのウェルにバイブ
リドーマの生育が認められた。充分な大きさのハイブリ
ドーマのコロニーを得た時に、その培養上清を、抗体分
析に供し、抗体産生ハイブリドーマを検索した。

実施例６　　ハイブリドーマの選択およびモノクローン
化 実施例５で行った細胞融合後１０日から２０日にかけて
ハイブリドーマが充分に生育した頃に、その培養上清を
実施例３に記したＥＩＡにより抗体価を測定した。　　
４１４ｎｍでの吸光度が０．１以上を示すものを陽性ウ
ェルと判定し、限界希釈法によるクローニングを行った
。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスより無菌的に摘出した肺臓を
ほぐして、肺細胞懸濁液を得た。１１０００ｒｐで１０
分間遠沈して細胞を洗浄し、ＨＴ培地に懸濁して細胞濃
度が約１０’個／ｍｌとなるよう調製した。この２００
μを９６穴のプレートに分注し、１〜３日培養したもの
をフィーダーレイヤーとして使用した。

一方、陽性ウェルのハイブリドーマをＨＴ培地に懸濁し
、細胞の濃度を３個／ＩＬ１とした。この２００μを、
培地を吸引除去したフィーダーレイヤーに分注し、３７
℃で培養した。１０日前後から、コロニーを確認できる
ようになった。バイプリドーマが充分に生育するのを待
ち、その上清を再び分析して陽性ウェルを検索した。陽
性ウェルは、再び同じ手法により、限界希釈を行った。

少くとも３回の限界希釈をくり返し、抗ＩＰ３モノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマＡＢ−１゜ＡＢ−
２，ＡＢ−３，ＡＢ−４，ＡＢ−５，ＡＢ−６を得た。

また全く同じようにして抗ＩＰ、モノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマＡＢ−１１，ＡＢ−１２，ＡＢ
−１３゜ＡＢ−１４を得た。

実施例７　　モノクローナル抗体の製造方法モノクロー
ナル抗体は実施例６で得られたモノクローナルハイブリ
ドーマＡＢ−１，ＡＢ−２等をＲＰＭ１１６４０、　Ｄ
ＭＥＭなどの適当な培養液で培養し、その培養上清から
蛋白濃度１０〜２００μｇ／ｍＡとして１ｎｖｉｔｒｏ
で得た。

一方大世に抗体を得るためには、Ｂａ１ｂ／ｃ雌マウス
に腫瘍形成促進剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、社製）をマウス−匹
あたり　０．５ｍｌｍｌ的投与した。１〜３週間後にＡ
Ｂ−１，ＡＢ−２等のハイブリドーマｌＸｌ０’を腹腔
的投与することにより、１〜２週間後に蛋白濃度３〜１
５ｍｇ／ｍＡのモノクローナル抗体を得た。モノクロー
ナル抗体の重鎮、軽鎖のアイソタイプを固定するために
前記のＡＢＴＳ基質液および過酸化水素を用いて試験を
行った。モノクローナル抗体の精製は、必要に応じて腹
水を硫安分画（４０％飽和）後、ＤＥＡＥ−３ａｐｈａ
ｃｅｌ　　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）によるイオン交換カラムクロマトグラ
フィー法により、あるいは５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３
００５ｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に
よるゲル口過法との組み合わせにより行った。得られた
抗体の免疫グログリンのクラスはＩｇＧ、　ｒｇＡ、　
ＩｇＭで、また重鎮、軽鎖のアイソタイプはγ１／に、
γ２ａ／に、γ２ｂ／に。

γ３／に、γ４／に、α／にであった。

実施例８　　　ＲＩＡによるＩＰ、測定８−ＩＩＰ３測
定の検量線作成 プラスチックまたはガラス製試験管に、ＩＰ、（アマジ
ャムジャパン）を含む、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水
、ｐＨ７，５（ＢＳＡ　　１％、アジ化ナトリウム０．
１％含有、以下ＢＳＡ−ＰＢＳ　）１００μを加えた。

次に、上記の抗ＩＰｓモノクローナル抗体（ＡＢ−１由
来）を含む、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐ）１７．
５　　（５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸及び１％正常
マウス血清含有、以下ＮＭＳ−ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）　　
２００１１Ｊを加え、よく攪拌して４℃２４時間静置し
た。次にトリチウムでラベルされたＩＰ３（アマジャム
ジャパン）を含むＢＳＡ−ＰＢＳ　　１００μを加えて
、よく攪拌し再び４℃　２４時間静置した。次にウサギ
抗マウスＩｇＧ　　（Ｄａｋ。

社）を食上ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μ加え、よく攪拌し
て４℃、２４時間静置した。次に３０００ｒｐｍで４℃
１５分間遠沈し、上清を吸引除去して沈殿の放射能を測
定した。

この実験系によりＩＰ、の濃度によく対応した標準曲線
を得た。本実験系のＩＰ３、モノクローナル抗体、正常
マウス血清、ウサギ抗マウスＩｇＧのそれぞれの量を変
化させる事により試験管あたり１フ工ントモルから１マ
イクロモルまでのＩＰ’＋が測定可能であった。

８−２　リンパ球中のＩ　Ｐ　ｓの抽出およびＩＰ３濃
度測定 ヒト、マウス、及びラットから得た末梢血よりリンパ球
を分離し、１０％ＦＣＳを含むＦＰＭＩ−１６４０培地
に懸濁して、細胞濃度を２　Ｘ　１０’／爪１に調製し
た。この細胞ｐＪ　ｉｆ４液にフィトヘマグルチニン（
Ｐ　ＨＡ　、　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ社製）又はコンカナバ
リンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ、　　カルビオケム社）を最終濃
度がそれぞれ２．５μｇ７ｍＡ及び１０μｇ７ｍＡとな
るように加え、３７℃で２４〜４８時間培養した。これ
らのマイトゲンを含まない対照群も同時に培養した。培
養後、細胞を集めＲＰＭＩ　１６４０培地で３回洗浄し
た。得た細胞のベレットを直ちに液体窒素で凍結し、６
％トリクロル酢酸を加えてホモジナイズした。次に３０
００ｒｐｍで４℃　１０時間遠沈して変性タンパクを除
去し、上清をエーテル抽出してトリクロル酢酸も除き、
試料液とした。８−１で示した方法に従って測定した結
果、マイトゲン刺激を受けたリンパ球の細胞内ＩＰ’３
濃度が対照群に比較して明らかに高いことが示された。

８−３　固相法によるＲＩＡキットの作製ＡＢ−１由来
の抗ＩＰ３モノクローン抗体を含む５０ｍＭ重炭酸緩衝
液ｐＨ９，６を１００μずつイムノアッセイ用マイクロ
タイタープレート（ＦｌｏｗＬａｂ社製）のウェルに加
え４℃　１８時間静置した。次にＰＴで３回洗浄し、１
％ＯＶＡを含むＰＴ２０ｈｊを加え、室温で６時間静置
した。ＰＴで３回洗浄し、　０．１％ＯＶＡを含むＰＴ
で希釈したトリチウムラベルＩＰ３及びＩＰ３を含む試
料液をそれぞれ５０μずつウェルに加え、よく混合した
後４℃で２４〜４８時間静置した。ＰＴで５回洗浄した
後、各ウェルを切り離し放射能を測定した。

８−４　がん細胞、マクロファージ、肥満細胞中のＩＰ
３濃度測定 ８−２のリンパ球のかわりに、各種がん細胞、マクロフ
ァージ、肥満細胞を用いＩＰ３を抽出し、８−３で作製
したＲＩＡキットを用いて細胞内のＩＰ、濃度を測定し
た。

実施例９ ＡＢ−１ハイブリドーマ由来の抗ＩＰ３モノクロナル抗
体を濾過法により濃縮し２ｍｇ／ｍＡとし、Ｋ−ｒａｓ
、　）Ｉ−ｒａｓ、　Ｎ−ｒａｓ、　ｅｒｂＢ、　ｓｒ
ｃ等でトランスフオームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞約３００
０個に、１個の細胞あたり２Ｘ１０−１３１２マイクロ
インジエクシヨンを常法により行った。３Ｈ−チミジン
を加え各細胞のオートラジオグラフィーを行い、対照と
して免疫グロブリンＧ分画をマイクロインジェクション
した細胞集団と比較したところ、明らかに抗ＩＰ３モノ
クローナル抗体を注入した細胞集団の増殖は抑えられた
。一方Ｎ１）１３Ｔ３細胞を血清を加えずに培養を開始
し、ＰＤＧＦ、　Ｂｏｍｂｅｓｉｎなどの増殖因子を加
えるとＤＮＡ合成が開始されるが、抗ＩＰ３モノクロー
ナル抗体をマイクロインジェクションした細胞集団は増
殖が止った。本発明の抗ＩＰ３モノクローナル抗体が情
報伝達系の伝達を阻止することが明らかにされた。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社 三井製薬工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イノシトールリン酸化合物、即ちイノシトール１−
   リン酸、イノシトール４−リン酸、イノシトール５−リ
   ン酸、イノシトール１，４−二リン酸、イノシトール１
   ，４，５−三リン酸、イノシトール１，３，４−三リン
   酸、イノシトール２，４，５−三リン酸、イノシトール
   １，３，４，５−四リン酸、イノシトール１，２，４，
   ５−四リン酸、イノシトール−五リン酸、イノシトール
   −六リン酸（フィチン酸）から選ばれ、それぞれを識別
   することのできるモノクローナル抗体。 ２、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ。 ３、イノシトール１−リン酸、イノシトール４−リン酸
   、イノシトール５−リン酸、イノシトール１，４−二リ
   ン酸、イノシトール１，３，４−三リン酸、イノシトー
   ル２，４，５−三リン酸、イノシトール１，４，５−三
   リン酸、イノシトール１，３，４，５−四リン酸、イノ
   シトール１，２，４，５−四リン酸、イノシトール−五
   リン酸およびイノシトール−六リン酸の中から選ばれる
   イノシトールリン酸化合物をハプテンとして、縮合剤に
   より活性化された、キーホール・リンペット・ヘモシア
   ニン（以下ＫＬＨと略記する）、牛血清アルブミン（以
   下ＢＳＡと略記する）、オバルブミン（以下ＯＶＡと略
   記する）およびＢＣＧ菌の中から選ばれるタンパク質類
   を担体として結合させた免疫原性コンジュゲート。 ４、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体産
   生において使用可能な特許請求の範囲第３項記載の免疫
   原性コンジュゲート。 ５、特許請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体産
   生において、動物に免疫原性コンジュゲートを免疫する
   際、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全ア
   ジュバントおよびリビーアジュバント（Ｒｉｂｉ　Ａｄ
   ｊｕｖａｎｔ）、百日咳菌アジュバントの中から選ばれ
   るアジュバントとともに接種することを特徴とするモノ
   クローナル抗体の製造方法。 ６、特許請求の範囲第２項記載のハイブリドーマが、特
   許請求の範囲第５項記載の動物がマウスであり、該マウ
   スの脾臓細胞あるいはリンパ節細胞とマウス骨髄腫細胞
   （ミエローマ細胞）とを融合することにより得られたハ
   イブリドーマ。 ７、特許請求の範囲第６項記載のマウスハイブリドーマ
   を培地中で培養するかまたはマウスの腹腔内で培養し、
   得られる培養物から抗イノシトールリン酸化合物抗体を
   分離することを特徴とする抗イノシトールリン酸化合物
   抗体の製造方法。 ８、抗イノシトールリン酸化合物抗体を使用することを
   特徴とする、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光
   免疫測定法等より選ばれる免疫定量法（キットまたはシ
   ステム）。９、免疫定量法がマイクロタイタープレート
   を使用することを特徴とする免疫定量法である特許請求
   の範囲第８項記載の免疫定量法（キットまたはシステム
   ）。 １０、以上に記載した各々のそしてすべての新規な工程
   、方法、生成物、製造方法あるいはその他の態様、また
   はこれらの任意の組み合わせ。 １１、イノシトール１，４，５−三リン酸に対するモノ
   クローナル抗体を含む抗癌剤。