JPH0433935A - ロドプシン薄膜とその作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ロドプシンを光センサーや光情報認識素子等
として利用するのに有用なロドプシン薄膜に関するもの
で、ロドプシン薄膜を作製する方法を提供するものであ
る。

［従来の技術］ 生体の情報処理を担う物質として、アセチルコリンレセ
プターやロドプシン等の機能性蛋白質がある。これら機
能性蛋白質を用いて人工的に機能を発現させることで、
非常に有効なセンサーや情報処理素子等が得られる可能
性がある。このようなセンサーや素子等を得るには、蛋
白質の機能を損なわずに基板上に固定する必要がある。

ロドプシンは光情報認識のセンサーである視物質である
が、その中でもタコロドプシンは青色光を受けるとメタ
ロドブシンとロドプシンの混合物になり、吸収極大波長
が４７５ｎｍから５００ｎｍへ移動し１次に、赤色光、
特に５８０ｎｍ以上の光を受けるとメタロドプシンがロ
ドプシンに変わり、再生することができる。即ち、タコ
ロドプシンでは青及び赤色光を交互に照射することで、
ロドプシンとメタロドブシンという２つの状態を交互に
形成させるこができる。このようにタコロドプシンには
特異な性質があるので、機能を損なわずに固定できれば
、光センサーや光メモリー等として利用できると考えら
れる。

蛋白質を固定し薄膜化する方法としてラングミュア・プ
ルジェット法（以下ＬＢ法と略す）がある。これには牛
ロドプシンをＬＢ法でガラス基板上に積層して光化学反
応を分光光学的に測定した例がある（コレンプロト、ジ
ャーナル　オブ　メンブレン　バイオロジー、Ｖｏｌ、
３７゜ｐ２３５−２６２　（１９７７））。つまり、フ
ォスファチジルコリン膜内にロドプシンを取り込み、こ
れを水面上に展開してガラス基板上に移し取りロドプシ
ン薄膜を調製した。また、プランケンバーブら（アブス
トラクト　オブ　第４回　インターナショナル　カンフ
ァレンス　オン　ラングミュア・プロジェット　フィル
ムス、ｐ４９０−４９１　（１９８９）は長鎖アルキル
を結合したビオチンを気水界面に展開して単分子膜化し
、次いでストレプトアビジンを作用させたところ、ビオ
チンと結合し２次元膜を形成できた。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、上記した公知技術においては、蛋白質を
特定の方向に配列固定できないこと、蛋白質の機能を損
なわずに固定することが難しいこと、規則正しく配列す
ることができないこと等の問題があった。

本発明は、ロドプシンを配列固定して薄膜化するにおい
て、ロドプシンと薄膜構成分子とを同時に認識するハイ
ブリッド抗体を用いて、ロドプシンを該薄膜構成分子か
らなる薄膜上に固定するロドプシン薄膜の作製方法を提
供する点にある。

以下、本発明を詳述する。

本発明に用いるハイブリッド抗体は、ロドプシンまたは
薄膜構成分子を認識するモノクローナル抗体を利用して
作製するのであるが、まずこれらモノクローナル抗体の
造成方法について述べる。

モノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法により造成
されるハイブリドーマを培養することで生産できる。抗
体産生細胞と骨髄腫細胞との間でパイブリドーマを造成
し、抗ロドプシン抗体または抗薄膜構成分子抗体を産生
ずるものをクローン化することで抗ロドプシンモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマまたは抗薄膜構成分子モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立できる。こ
れをマウス腹腔または培養容器内で増殖させることで該
抗体を得ることができる。

抗体産生細胞は、ロドプシンまたは薄膜構成分子を抗原
として免疫されたマウス牌臓細胞を使用する。免疫抗原
は粗精製または精製標品が利用できる。ロドプシン粗精
製標品は、眼球網膜の視細胞盛祥分体や、ジギトニンや
シュガーエステルなどの膜蛋白質抽出剤で該盛祥分体よ
り抽出した蛋白質抽出液である。ロドプシン精製標品は
、該蛋白質抽出液をイオン交換クロマトグラフィー及び
アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製するこ
とにより得られる。

薄膜構成分子としては、免疫原性があり、マウス腹腔等
に注射することで該薄膜構成分子に対する抗体が作られ
るものであれば良い。また、リン脂質のように抗原性の
ない場合は、リン脂質にハプテンを結合させることで、
抗ハプテン抗体を造成させることができる。ハプテンと
は、蛋白質等に結合させると抗原性が生しる低分子物質
の総称である。本発明において、ハプテンとしてＤＮＰ
、ＴＮＰ　（トリニトロフェニル）及びｐ−アゾベンゾ
エイト等を用いることができるが、安定性が高いＤＮＰ
を用いるのが良い。そして、ロドプシンを配列固定する
ための基板となる有機薄膜には、ハプテンが結合されて
おればどのような薄膜でも良いが、特に単分子膜を形成
させ易いリン脂質を用いるのが良い。リン脂質の作製に
はＤＰＰＣ（ジパルミトイルフオスファチジルコリン）
やＤ　Ｍ　Ｐ　Ｃ（ジミリストイルフオスファチジルコ
リン）などを用いることができるが、特にＤＰＰＣを用
いて作製した膜は規則性のある構造を有し、かつ広い面
積で安定した膜になることから、本発明の目的に適して
いる。ＤＮＰに対する抗体を得るに際しては、抗原がリ
ンパ球に抗体産生を捉すには、大体１万以上の分子量が
必要であるため、Ｄ　Ｎ　ＰをＢＳＡ　（分子量６９，
０００蛋白質）と結合させたＢＳＡ−ＤＮＰを抗原とし
て用いる。

この抗原では、ＤＮＰやＢＳＡのみならずＤＮＰとＢＳ
Ａの一部を含んだ部位に対する抗体産生の可能性も考え
られるため、ＤＮＰのみに結合する抗体を選択する必要
がある。これら抗原とアジュバントとを混合してマウス
に注射して免疫する。

免疫は、皮下、静脈または腹腔に１回当り該抗原を蛋白
質量で４０〜１００μｇ、２〜３週間おきに２〜４回注
射することで行える。なお、ジギトニンやシュガーエス
テルなどの膜蛋白質抽出剤は、毒性を持つものもあるの
で、事前に検査して毒性があるものについては、生体許
容量を調べることが必要である。また、マウス個体に対
して毒性の強い該抽出剤が抗原に含有される場合は、生
体外免疫法を採用すると良い。

細胞融合は、ケラ−とミルシュタインらの方法に準じて
行える。融合パートナ−は、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の
Ｘ６３細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、Ｎ５−１細胞及びＳＰ２細
胞などのミエローマ細胞を利用できる。予め培養した該
ミエローマ細胞に対して該マウス牌臓のＢ細胞を２〜１
０倍混合して遠心分離後、上滑を吸引除去しミエローマ
細胞とＢ細胞との混合ペレットを得る。このペレットを
良くほぐして、予め３７℃で加温した３０〜５０％ポリ
エチレングリコール（分子量 １．０００〜４，０００）を加え３０−３７℃テ反応さ
せる。次いで、血清を含まない培地を滴下混合して反応
を止める。さらに血清を含まない培地を多量に添加した
後、遠心分離により細胞を回収する。該細胞をＨＡＴ培
地に懸濁し、９６穴プレートに分注して３７℃で培養す
る。培養３〜４日後より２日毎に培養液の半量を吸引除
去して新鮮なＨＡＴ培地を添加して、ハイブリドーマの
みを増殖させる。該ハイブリドーマが充分に増殖した後
に、エライザ（以下ＥＬＩＳＡと記載する）により該抗
原に対する抗体を産生ずるものを選抜する。そして限界
希釈法によってクローニングし。

抗体産生クローンを得る。該クローンを予めブリスタン
を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔へ移植し、１０〜１
４日後に腹水を採取することで抗体が得られる。また、
該クローンを動物細胞培養装置などで培養することでも
抗体を生産できる。そして、抗体は、腹水または培養液
から硫安分画。

イオン交換クロマトグラフィーなどの工程を経て精製さ
れる。

ロドプシンと薄膜構成分子の両方に結合するハイブリッ
ド抗体を産生ずる細胞は次のように作製する。抗ロドプ
シン抗体を産生ずるハイブリドーマと抗原膜構成分子抗
体を産生ずるハイブリトーマを融合し、両細胞の抗体遺
伝子を併せ持つ融合細胞、即ちハイブリッドハイブリド
ーマを造成する。このためには、ＨＡＴ選択のためにそ
れぞれ酸素欠損細胞を作製する必要がある。ハイブリド
ーマをある種の薬剤で処理して薬剤耐性にすると、ＨＧ
ＰＲＴ　（ヒボキサンチン　グアニン　フォスフォリボ
シル　トランスフェラーゼ）あるいはＴＫ（チミジン　
キナーゼ）を欠損させることができる。一方をＨＧＰＲ
Ｔ欠損、他方をＴＫ欠損とすれば、異なる細胞同士が融
合したハイブリッドハイブリドーマのみが２つの酵素を
獲得し、ＨＡＴ培地中で増殖するため、ＨＡＴ選択がで
きる。ＨＡＴ選択で得た細胞すへてか、それぞれのハイ
ブリドーマの抗体遺伝子を獲得しているわけではない。

そこでこれらの細胞に対し、ＥＬＩＳＡによる一次選抜
、クローニング、更にＥＬＩＳＡによる二次選抜を行う
ことで、目的のハイブリッドハイブリドーマが得られる
。このハイブリッドハイブリドーマは、２種のハイブリ
ドーマの抗体遺伝子を獲得しているため、１０通りの組
み合わせの抗体を産生ずる。その中から、ハイブリッド
抗体を得るためにアファニティークロマトグラフィー等
を用いて単離精製する必要がある。

ハイブリッド抗体は化学的な方法でも作製することがで
きる。抗体のヒンジ領域にあるＳ−８結合は還元剤を用
いることにより切断することができる。そこで、抗ロド
プシン抗体及び抗薄膜構成分子抗体をそれぞれジチオト
レイトール（ＤＴＴ）やメルカプトエタノール等の還元
剤で処理した後、それぞれの抗体の半分ずつを組み合わ
せることで。

ロドプシンと薄膜構成分子を同時に認識するハイブリッ
ド抗体を得ることができるのである。ハイブリッド抗体
の作製には、このような化学的な方法を使用しても、上
記した生物学的な方法のどちらかを使用しても良い。

本発明はロドプシンと薄膜構成分子とを同時に認識する
ハイブリッド抗体を用いて、ロドプシンを該薄膜構成分
子からなる薄膜上に固定するものであるが、ハイブリッ
ド抗体をそのまま配列固定に用いても良いし、ペプシン
処理によりハイブリッド抗体のＦｃ部分を切離し、Ｆ（
ａｂ’）２のみにして配列固定に用いても良い。

ロドプシンと薄膜構成分子とを同時に認識するハイブリ
ッド抗体だけでなく、さらに、ロドプシン分子の異なっ
た部位を認識するハイブリッド抗体を用いれば、該薄膜
構成分子からなる薄膜上に配列固定したロドプシンの上
に、該ハイブリッド抗体によりさらにロドプシンを積層
することができる。つまり、この方法によればロドプシ
ンを３次元的に規則正しく配列することが可能になる。

［発明の効果コ 本発明においては、ロドプシンと薄膜構成分子とを同時
に認識するハイブリッド抗体を用いることにより、ロド
プシンを該薄膜構成分子からなる薄膜上に薄膜成分の配
列と同程度に規則正しく配列固定することができること
から、精密な光センサーや超高密度の光メモリー等の開
発が可能になる。

［実施例コ 以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものでない。

〔１〕抗タコロドプシン抗体の調製 １）抗原の精製 ミズダコ（Ｐａｒｏｃｔｏｐｕｓ　ｄｅｆｌｅｉｎｉ　
）眼球から剥離した網膜から視細胞の各節を回収し、シ
ョ糖浮遊遠心分離により盛祥分体を得た。次いで、該盛
祥分体ペレットを緩衝液に懸濁し、遠心分離する操作を
繰り返して洗浄した。そして該盛祥分体を２％ジギトニ
ン溶液に懸濁し１時間振盪してロドプシンを抽出し、遠
心分離により残渣を除去して抽出液得た。

ジギトニン抽出液からＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｃ
ｅｌ　（ファルマシア社製）によるイオン交換クロマト
グラフィー及びＣｏｎ　Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（フ
ァルマシア社製）を用いたアフィニティクロマトグラフ
ィーによりロドプシンを単離した。

該請製溶液を０．１％ジギトニン含有リン酸緩衝食塩水
で希釈して、まず赤色光を照射してロドプシン溶液を調
製した。スライドオブジェクターにセットした赤色光フ
ィルター（東芝製ガラスフィルター；　Ｒ−６２）から
１ｃｌｌの距離に該希釈液を置き、赤色光を照射し、該
希釈液の吸収極大値が４７５ｎｍ付近であることを分光
光度計（日立製）で確認しロドプシン溶液とした。

２）マウスの免疫 該ロドプシン溶液のジギトニン濃度をセントリコン−３
０（アミコン社製）にて０．１％以下にし、さらにリン
酸緩衝食塩水で希釈して蛋白質濃度を２００μｇ／ｍｌ
とした。これを希釈して下記方法でＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃマウスの腹腔に注射し、タコロドプシンを感作した
。

表１　感作方法 回数　蛋白質量　アジュバント量　注入容量１回目　　
　１００μｇ　　　　　１５μｇ　　　　　０．５ｍ１
２〜３回目　　２０μｇ　　　　　１５μｇ　　　　　
０．５＋ａｌ最終回　　４０μｇ　　　　３０μｇ　　
　　０．５ｍ１間隔 １回目〈−２週間−〉２回目〈−２週間−〉３回目〈−
２週間−〉最終回 アジュバント：　Ｎ　−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−
Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ　（
シグマ社製）３）細胞融合 最終免疫から３日後、該マウスから肺臓を摘出しｎｌ！
細胞とミエローマ細胞を以下の操作により融合した。

肺臓細胞２　Ｘ　１０８個、ミエローマ細胞４×１０７
個となるよう両細胞懸濁液を混合して、遠心分離（１８
００ｒｐｍ、５分）により混合ペレットを得た。上清を
除いた後、該ペレットを混合した。これに予め３７℃で
加温した５０％ポリエチレングリコール１５００　（ベ
ーリンガーマンハイム製）１ｍｌを１分かけて滴下した
。そして１分間撹拌した後、該培地１ｍｌを３分かけて
滴下した６さらに該培地８ｍｌを３分かけて滴下した後
、遠心分離（１０００ｒ　ｐ　ｍ、　５分）により細胞
を回収した。

該ペレットを牛血清２０％を含有するＨＡＴ培地４０ｍ
１に懸濁して、９６穴マイクロプレート（コーニング社
製）の各ウェルに１００μｍ分注した。４日後、ＨＡＴ
培地を１００μｍ添加し、それ以後２日ごとに５０％の
割合で新鮮なＨＡＴ培地と交換した。培養１０日口重後
、２日毎に牛血清１０％を含有するＨＴ培地で５０％の
割合で培地交換した。

４）ハイブリドーマの選抜 ハイブリドーマが増殖して大きいコロニーを形成したウ
ェルについて上清をサンプリングして、ＥＬＩＳＡによ
りロドプシンに対する抗体を産生ずるハイブリドーマを
選抜した。

予めポリＬ−リジンでコートしたマイクロタイタープレ
ートの各ウェルにロドプシン抗ＪｊＫ（蛋白質濃度０．
０１ｍｇ／ｍ１）５０μｍを分注し。

４℃で約１８時間静置した。そして１％グルタルアルデ
ヒドを５０μｍ分注して１分後、リン酸緩衝食塩水で３
回洗浄した。さらにブロッキング液（リン酸緩衝食塩水
で四分の−に希釈したブロックエース（大日本製薬製）
２００μｍを加えて、３７℃で１時間静置し、各ウェル
の未吸着部分をブロックした。リン酸緩衝食塩水で３回
洗浄して該上清１００μｌを加え、３７℃で１時間静置
した。０．１％ツイーン２０を含有するリン酸緩衝食塩
水で３回洗浄後、ビオチン化抗マウスイムノグロブリン
抗体（ベクタースティン社製ＡＢＣキット）溶液１００
μｍを添加して３７°Ｃで１時間静置した。リン酸緩衝
食塩水で３回洗浄後、ビオチン化ペルオキシダーゼとア
ビジン混合溶液を１００μｍ添加して３７℃で３０分静
置した。そしてリン酸緩衝食塩水で３回洗浄後、０．０
０１％過酸化水素水含有オルトフェニレンジアミンの０
．１Ｍ＜えん酸緩衝（ｐＨ５，４）を加えて波長４１２
ｎｍの吸光度を測定した。なお、並行して０．１％ジギ
トニン溶液でＥＬＩＳＡを行った。

この結果、４０５検体の中で、タコロドプシン認識する
検体が３５個であった。次いで、該検体について限界希
釈法によりクローニングして８株のクローンを得た。

５）モノクローナル抗体の調製 抗体精製を容易にするため該クローンを無血清培地（Ｅ
ＲＤＦ培地、極東製薬製）で３日毎に継代培養を行った
。８株のクローンの内６株が安定して抗体を生産した。

各細胞株についてタッピング培養フラスコ（池水理化製
）を用いて浮遊培養した。フラスコ容量は２００ｍ１で
仕込み容量は７０ｒｎｌとした。そして温度を３７℃、
タッピング撹拌子の振１数を毎分３５０回とし、フラス
コの気相を５％Ｃ○２空気で置換した。そして、１日毎
に新鮮培地と交換した。

各培養液を限外濾過膜（分画分子量 ２００．０００；東洋アトパンティク社製）により約五
分の−に濃縮後、硫酸アンモニウムによる塩析及びリン
酸緩衝食塩水に対する透析により粗抗体液を得た。次い
でモノクローナル抗体分取装置（バイオランド社製）に
て精製した。

［１１）抗ＤＮＰ抗体の調製 （１）と同様な方法により抗ＤＮＰ抗体を調製した。こ
の際、ＤＮＰはＢＳＡと結合させて、ＢＳＡ−ＤＮＰを
抗原として４頭のマウスを免疫した。この抗原では、Ｄ
ＮＰやＢＳＡのみならずＤＮＰとＢＳＡの一部を含んだ
部位に対する抗体産生の可能性もあるため、ＤＮＰのみ
に結合する抗体を選択する方法を工夫した。即ち。

ＥＬＩＳＡにおいて、ＢＳＡ及びＢＳＡ−ＤＮＰの他に
、ポリーＬ−リジン（Ｐ　Ｌ　Ｌ）にＤＮＰを結合させ
たＰＬＬ−ＤＮＰに対する反応も検定し、ＤＮＰのみに
結合する抗体を選抜した。その結果、７６８サンプルの
うち、ＤＮＰのみに結合する抗体を産生じていると考え
られものは１３あった。

このうちの任意の２つをクローニングし、抗ＤＮＰ抗体
を安定して産生する単一のパイブリドーマを５株得た。

このうちの任意の１株を培養し、培養液中に分泌された
抗体を、限外濾過、塩析及び透析といった方法により精
製した。

ここで得られた抗体が、ＤＮＰを結合したリン脂質ＬＢ
膜（ＤＮＰ−リン脂質ＬＢ膜）に結合するかどうかを検
討した。石英ガラス板上にＤＮＰ−リン脂質ＬＢ膜を構
築し、該抗ＤＮＰ抗体を反応させてＥＬＩＳＡを行った
。この反応が、抗原抗体反応による結合であることを示
すために、コントロールとして抗ロドプシン抗体を反応
させてＥＬＩＳＡを行った。また、発色が抗体とは無関
係な反応でないことを確認するために、抗体を加えない
試料についてもＥＬＩＳＡを行った。その結果、抗ＤＮ
Ｐ抗体を加えた試料のみが発色し、抗ロドプシン抗体を
加えた試料と抗体を加えなかった試料は発色しなかった
。即ち、得られた抗ＤＮＰ抗体がＤＮＰ−リン脂質膜に
結合したことから、ここで得られた抗体は抗ＤＮＰ抗体
に間違いないことが分った。

（ＩＩ［）ハイブリッド抗体の造成 １）薬剤耐性細胞株の作製 ＨＡＴ選択によりハイブリッドハイブリドーマを作製す
るために、まず融合させるハイブリドーマを薬剤処理し
て薬剤耐性株を造成した。抗ロドプシン抗体産生ハイブ
リドーマに対しては、８−アザグアニン（８−ＡＧ）処
理をしてＨＧＰＲＴ欠損株とし、抗ＤＮＰ抗体産生ハイ
ブリドーマに対しては、５−ブロモデオキシウリジン（
５−ＢＤＵ）処理をしてＴＫ欠損株とした。まず、処理
濃度を段階的に設定し、増殖を抑制する限界濃度を選定
した。そして、同濃度で培養を続け、薬剤耐性株を出現
させた。

ａ）８−ＡＧ耐性ハイブリトーマの作製抗ロドプシン抗
体産生ハイブリドーマを０．９４−３０μｇ／ｍｌの６
段階の濃度の８−ＡＧを含む培地で培養した。培養４日
目まで、３０μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で増殖抑制効果が
顕著であったため、更に培養を続けたところ、１８８日
目耐性を獲得したと思われる細胞の増殖が見られた。

この細胞の一部をＨＡＴ培地で培養したところ細胞が死
滅し、ＨＧＰＲＴ欠損が確認された。次いでこれをクロ
ーニングし、抗ロドプシン抗体産生能を保持し、かっ８
−ＡＧ耐性を獲得したハイブリトーマ１６株を得た。

ｂ＞　５−ＢＤＵ耐性ハイブリトーマの作製抗Ｄ　Ｎ　
Ｐ抗体産生ハイブリトーマを３〜６０μｇ　／　ｍ　ｌ
の６段階の５−ＢＤＵを含む培地で培養した。３日目ま
で各濃度で増殖が見られたが、６日目には７．５〜６０
μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で細胞が死滅した。５−ＢＤＴ
Ｊは８−ＡＧに比へ、低濃度で増殖抑制効果があった。

そこで、３及び６μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で増殖が認め
られた細胞を、１〜２日ごと段階的に高濃度に馴致する
こととした。

その結果、１１日後に６０μｇ　／　ｍ　１で増殖でき
る細胞が出現した。更にこの濃度で培養を続けて、ＨＡ
Ｔ培地によるＴＫ欠損の確認とＥＬＩＳへによる抗体産
生能の検定を行い、２個のハイブリドーマを得た。

２）細胞融合 抗ロドプシン抗体産生ハイブリトーマ （ＨＧＰＲＴ欠損ンと抗ＤＮＰ抗体産生ハイブリトーマ
（ＴＫ欠損）を融合しＨＡＴ選択を行い、ハイブリッド
ハイブリトーマを得た。これに対しＥＬＩ　ＳＡを行い
、ロドプシンとＤＮＰの両方に結合する抗体の産生細胞
１２６個を選別した。そのうち任意の３個をクローニン
グし、抗体産生能の安定した細胞を２７株得た。このう
ち、抗体産生能の高い細胞を１株選び、ハイブリッド抗
体を調製した。

３）ハイブリッド抗体の調製 ハイブリッドハイブリドーマを培養し、培養液中に分泌
された抗体を、限外濾過、塩析及び透析により精製した
。この抗体サンプル中に含まれる１０種類の抗体から、
２段階のアフィニティークロマトグラフィーによるハイ
ブリッド抗体の精製を行った。まず、精製サンプルをリ
ジン−セファロース４Ｂ−ＤＮＰに反応させ、洗浄した
後、０、ＩＮ塩酸を用いて溶出液を得た。ＥＬＩＳＡの
結果、洗浄液中の抗ＤＮＰ抗体量は精製サンプルに比べ
て減少しており、担体に結合したと考えられた。次に、
ロドプシンを担体としたアフィニティークロマトグラフ
ィーを行えば、ハイブリッド抗体を回収できる。しかし
、これにはロドプシンが大量に必要であるため、次のよ
うな方法を行った。抗ロドプシン抗体のし鎖はに型、抗
ＤＮＰ抗体はλ型であるので、この違いを利用して、抗
に鎖抗体の担体（アガロース−アビジンＤ−ビオチン化
抗に鎖抗体）にハイブリッド抗体を結合させて、０．Ｉ
Ｎ液酸で溶出させることにより、ＤＮＰを認識するがロ
ドプシン認識能の無い抗体とハイブリッド抗体の２種混
合の抗体を得ることができた。即ち、上記２段階のアフ
ィニティークロマトグラフィーを用いた方法により、ハ
イブリッド抗体を得ることができた。

〔ｌＶ）ロドプシン薄膜の作成 ロドプシンとＤＮＰとを同時に認識するハイブリッド抗
体を用いて、ロドプシンを以下のようにして固定した。

これを第１図によって説明する。

第１図（ａ）の模式図に示すように石英ガラス基板１上
にＤＮＰ−リン脂質膜２をＬＢ法を用いて構築した。こ
れにハイブリッド抗体３を作用させた後、次にロドプシ
ン４を添加して反応させた。

これで目的とする薄膜ができていることを確認するため
第１図（ｂ）に示すように、洗浄浄後に、パーオキシダ
ーゼを標識した抗ロドプシン抗体５（ハイブリッド抗体
とロドプシンに対する認識部位が異なる抗体）を作用さ
せた。そして洗浄後に、オルトフェニレンジアミン溶液
を添加して呈色の有無を調べた。第１図（ｂ）の模式図
に示すようにハイブリッド抗体によりロドプシンがリン
脂質膜上に固定されているので、上記Ｉｉ！！識抗体に
結合した酸素により溶液が黄色になり、実施例で目的を
果せたことが確認できた。その結果を第１図（Ｃ）の写
真に示す。第２図は、本発明の有用性を確認するための
比較実験の結果を示すものである。第２図の例では、ハ
イブリッド抗体３に代えて抗 ＤＮＰ抗体６を使用して、第１図と同様に処理を施こし
た。この場合、抗ＤＮＰ抗体はＤＮＰ−リン脂質膜上に
結合するが、ロドプシンの認識能がなく、第２図（ａ）
の模式図に示すようにロドプシンが固定されないため、
洗浄により流出し、酵素標識抗体が結合しなかった。そ
の結果第２図（ｂ）に示すように発色しなった。

以上の結果から、ロドプシンとＤＮＰとを同時に認識す
るハイブリッド抗体を用いて、ロドプシンをリン脂質膜
上に配列固定でき、リン脂質膜と同程度の規則性のある
配列を持ったロドプシン薄膜を作製できることが明らか
になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によってロドプシンをリン脂質膜上に配
列固定できることを説明する図、第２図は本発明の詳細
な説明するための図である寥２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ロドプシンと薄膜構成分子とを同時に認識するハイ
   ブリッド抗体を用いて、ロドプシンを該薄膜構成分子か
   らなる薄膜上に固定することを特徴とするロドプシン薄
   膜の作製方法。 ２、上記ハイブリッド抗体が、ロドブシンを認識する１
   本のＨ鎖と１本のＬ鎖及び薄膜構成分子を認識する１本
   のＨ鎖と１本のＬ鎖により構成される抗体であることを
   特徴とする特許請求範囲第１項記載のロドプシン薄膜の
   作製方法。 ３、上記ロドプシンが頭足類のロドプシン、特にタコロ
   ドプシンであることを特徴とする特許請求範囲第１項記
   載のロドプシン薄膜の作製方法。 ４、上記薄膜構成分子がジニトロフェニル （ＤＮＰ）を結合したリン脂質であることを特徴とする
   特許請求範囲第１項記載のロドプシン薄膜の作製方法。