PT89385A - Processo para a preparacao de novos anticorpos - Google Patents

Description

ΙΝΡ1 MOO '13 R F 18732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo O invento refere-se a novos anticorpos monoclonais com elevadas especificidade e afinidade em relação ao antigénio carcinoembriónico humano (CEA), seus derivados , processos para a preparação destes anticorpos e dos seus derivados, linhas celulares do hibridoma que segregam FRANZ BUCHEGGER e RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS ANTICORPOS"

os anticorpos e processos para a preparação das referidas linhas celulares.

Os anticorpos monoclonais do invento e os seus derivados são úteis para o diagnóstico e terapia do cancro e para a monitorização seriada dos doentes com can cro, relativamente a doenças recurrentes ou resposta à terapia. Constituem também objecto deste invento os equipamentos ("kits") de teste e as composições :farmacêuticas que cora têm os referidos anticorpos anti-CEA monoclonais. 0 processo de preparação dos referidos anticorpos consiste em se multiplicarem as células de hibri-doma que segregam o anticorpo, bn vitro ou i_n vivo , e, se de sejado, se converterem os anticorpos resultantes, nos seus derivados. i

Novos anticorpos ticorpos em rela-s deri-e dos segregam idas li-ti-CEA contendo as con- n ovos an f i niaade CEA ) , seu nt icor pos id orna que da s r e f er co r pos an e sto j os r m acêu tic monoc ç ão a vados seus os an nhage para os an tendo 0 invento refere-se a lonais com elevadas especificidade e a o antigénio carcinoembriónico humano ( , processos para a preparação destes a derivados, linhagens celulares do hibr ticorpos, processos para a preparação ns celulares , a utilização destes anti o diagnóstico e terapêutica do cancro, ticorpos monoclonais, e preparações fa os referidos anticorpos.

Fundamentos do invento a do hi-produ-icidade isolar O desenvolvimento da tecnologi bridoma tornou possível produzir linhagens celulares toras de anticorpos monoclonais (MAbs) com a especif desejada os quais podem ser usados para identificar, e caracterizar moléculas biologicamente importantes. inven-(CEA). um s dos ados

Os MAbs de que trata o presente to são dirigidas contra o antigénio carcinoembriónico CEA é um complexo de glicoproteinas imunoreactivas com peso molecular de 180.000 encontrado em adenocarcinoma epitélios do aparelho digestivo e do colon fetal deriv da endoderme . O papel desempenhado pelos ensaios imu nitários com CEA para o diagnóstico e monitorização seriada dos doentes com cancro em relação a doença recorrente ou res posta à terapêutica (Mach et al. , Imun . Today 2_, 239, 1981; Berche et al., Br. Med. J. 285, 1447, 1982) assim como a sua utilização em modelos experimentais de ratos rapados portadores de xenoimplantes de carcinoma de colon humano (Hedin -4-

et al . , Int. J. Câncer _30.( 547, 1982; Buchegger et al . , Int. J. Câncer 3_3_, 643, 1984 ) foram amplamente avaliados e documentados .

Um dos principais inconvenientes da utilização dos anticorpos anti-CEA com finalidades clinicas tem sido a reactividade-cruzada destes anticorpos com alguns tecidos adultos aparentemente normais.

Estudos prévios revelaram que a maior parte dos antisoros hiperimunes convencionais produzidos con tra diferentes formas imunogénicas de CEA apresentam reacção cruzada com muitos tipos diferentes de carcinomas assim como com antigénios relacionados com CEA encontrados na mucosa normal do colon, no baço, fígado, pulmão, glândulas sudorí-peras, leucócitos polimorfonucleares e monocitos de indivíduos aparentemente normais. A primeira das séries de antigénios identificadas com reacção cruzada com CEA foi chamada glico-proteina normal (NGP) ou antigénio de reacção cruzada não--especifico (NCA) por Mach and Pusztaszeri (Immunochemistry 9_, 1031, 1972) e por von Kleist et al . (Proc. Natl . Acad .

Sei. 6_9_, 2492, 1972 ), respectivamente . Aqui será mencionado como NCA^^, devido ao facto de ter sido verificado por ambos os grupos de pesquisa, possuir um peso molecular de cerca de 55KD.

Este antigénio também foi descrito por vár ios outros gr upos de pesquisa com nomes diferentes, in- clu indo CCEA-2 ( Tuberville et al. , Immunochemistry 10, 841, 197 3 ) , CCA-III ( Primus et al., J. Immunol. 118, 55 , 1977) e TEX (Kessler e t al. , Câncer Res. 38, 1041, 1978 ) . Buchegger et al. , (Int . J . Câncer 33, 643, 1984) identificou um anti- gén io de reacç ão cruzada de 95 KD <nca95). intimamente

CEA com

Um outro antigénio relacionado muito em termos de reactividade cruzada e de peso molecular (160 KD) foi descrito por Burtin et al., (in: Fishman & Sell, Onco-developmental expressão genética do desenvolvimento oncológico, N.Y. 1976, pp. 609-611) e foi designado como NCA-II. Este antigénio parece ser muito semelhante ao antigénio-2 fecal normal (NFA-2) descrito por Matsuoka et al. (Int . J. Câncer 21, 604, 1978). O mesmo grupo identificou em fezes de adulto normal uma glicoproteina relacionada com CEA de 20-30 KD chamada NFA-1 (Kuroki et al . , Mol . Immunol . 1_9 , 399, 1982) Finalmente, a glicoproteina-1 biliar (BGP-1) é um antigénio com reacção cruzada com CEA presente na bilis normal descrito por Svenberg (Int. J. Câncer _V7, 558, 1976).

Estes resultados como um todo demonstram que os antisoros reconhecem epítopos específicos para o CEA isolados assim como epítopos presentes em ambos os an-tigénios CEA e afins do CEA; sugerem ainda genes intimamente relacionados entre os antigénios CEA e afins do CEA assim como relações do produto percursor entre alguns deles. De acordo com Hammarstrõm et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 72, 1528, 1975) e Hedin et al. (Mol. Immunol. 23, 1053, 1986) os epítopos encontram-se predominantemente localizados nas metades peptídicas de CEA e parecem ser fortemente dependentes da conformação. A produção de anticorpos anti-CEA mono clonais é apresentada por vários grupos de pesquisa. Accolla et al . (Proc. Natl. Acad. Sei. _77, 563, 1980) referiram que anticorpos obtidos a partir de dois clones de hibridoma reagiam fortemente com CEA mas também fracamente com NGP. -6- ί

Λ

As reacções destes dois anticorpos com CEA não foram inibidas competitivamente um pelo outro indicando que reagiam com determinantes antigénicos diferentes na molécula de CEA. Os anticorpos descritos por Kupchik et al. , (Câncer Res. 41, 3306, 1981) e Primus et al . (Câncer Res. 43, 686, 693, 1983) revelaram ter pelo menos um certo grau de reactividade com leucócitos polimorfonucleares (PMNs).

Kuroki et al. (J. Immunol. 30, 2090, 1984) descreveram dois MABs contra CEA os quais, contudo, não i reagiram com preparações de CEA purificadas diferentes das usadas para imunização. Estes MABs ainda não foram caracte-rizados quanto ao grau de reactividade em relação ao tumor versus tecidos normais.

Objectivo do invento O objectivo do invento é constituído por MABs anti-CEA que possuem uma elevada afinidade em relação a CEA, que revelam uma elevada percentagem de ligação às células de carcinoma transportando CEA, tanto in vitro como in vivo, e que possuem elevadas taxas de ligação entre o tecido tumoral e o tecido normal (T/N).

Descrição do invento O invento refere-se a um anticorpo mo-no-clonal especifico em relação ao antigénio carcinoembrióni co (CEA) humano, e seus derivados, caracterizado pelo facto de reconhecer epítopos de CEA não presentes ou antigénio NCA,_ ç- ou NCA95 de reacção cruzada não específicos, na glico-proteina biliar, ou nos granulocitos, e que se liga ao CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 + 0,3) χ 10^ litros/mol. -7-

Em particular, 0 invent om a designação MAb CE2 refere-se ao e seus deri- anticorpo monoclonal vados.

Os derivados de um anticorpo monoclonal de acordo com o invento, especialmente de MAb CE25, são, por exemplo, fragmentos, tais como os fragmentos univalentes ,

Fab ou Fab' e os fragmentos divalentes F(ab')2 (Fab = ligação ao fragmento antigénio), que retem a sua especificidade em relação aos determinantes antigénicos de CEA, conjugados do anticorpo com enzimas, marcadores fluorescentes, quelatas de metal, substâncias citotóxicas ou citostáticas , avidin, biotin, etc., e anticorpos marcados radioactivamente. jugados do invent bravo, fosfatase se, glucoami1 ase, ma, malato deshid se . Os marcadore resceina, fluoroc

Os enzimas usados para anticorpos con-o são, por exemplo, peroxidase de rábano alcalina, O5 -D-galactosidase, glucose oxida carboanidrase, acetilcolinosterose, lisoz£ rogenase ou glucose-6-fosfato deshidrogena-s fluorescentes conjugados com MAb são fluo-romo, rodamina, etc.

Nesses conjugados o anticorpo está ligado aos enzimas ou marcadores fluorescentes directamente ou por meio de um grupo de espaçamento ou ligação. Exemplos para quelatores de metal são ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DPTA), 1,4,8,11--tetraazatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-1 , 4,8,11-tetraacético, ácido l-oxa-4,7,12,15-tetraazaheptadeca no-4,7,12,15-tetraacético, etc.

Os citostáticos, aplicáveis em ligação com os anticorpos do invento, são, inter alia, substâncias de alguilação, tais como meclorotamina, trietilenofosfarami- -8- Λ da, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, busulfan, melfa-lan ou triaziquone, também composto nitrosoureia, tais como carmustine, lomustine, ou semustine. São também usadas anti-metabolitos, tais como metotrexato, mercaptopurina, citarabi-na , fluorouracilo, floxuridina, ou ftorafur.

Um outro grupo de citostáticos inclui vinblastina e vincristina, assim como certos antibióticos, tais como actinomicina-D, daunorubicina (= daunomicina) , do-xorubicina, mitramicina, estreptonigrina, mitomicina e bleo-micina. Outros citostáticos apropriados são, inter alia, pro carbacina, hidroxiureia, L-asparaginase, dacarbazina, mitota-no , estramustina, ou podofilotoxina.

Outros agentes citostáticos são hormonas e antagonistas das hormonas, tais como corticosteroides, por exemplo prednisona, progestinas, por exemplo, hidroxipro gesterona ou medroprogesterona, estrogénios, por exemplo die tilestilbestrol, antiestrogénios, por exemplo tamoxifen, au-drogénios , por exemplo testosterona , e inibidores da aromata. se, por exemplo aminoglutetimida.

Derivados de um anticorpo monoclonal do invento conjugado com uma substância citostática contem ou a toxina intacta ou o seu derivado de cadeia-A. Toxinas apro priadas para ligação com anticorpo são, entre outras, várias lectinas , tais como ricina ou abrina, ou toxina A da difteria, etc .

Os anticorpos monoclonais marcados ra - 12 3 ~ dioactivamente contem por exemplo, iodo radioactivo ( I, 125 131 , ,90 , ,9 9m . I, I), yttnum ( Y), tecnetium ( Tc), etc. -9-

Um anticorpo monoclonal e os seus derivados de acordo com o invento são preparados por processos que são conhecidos per se, caracterizados pelo facto das células do hibridoma tal como são definidas a seguir segregando o anticorpo monoclonal sereno multiplicadas de acordo com métodos conhecidos ija vitro ou iri vivo. Se desejado, os anticorpos monoclonais resultantes são convertidos nos seus derivados. num me io de cul tur padrão habituai s , (dmem) ou me io RPM de mam if e ro , po r e vestig iai s e su ple pio cé lul as al i men toneal do ra tin ho dula ó s se a , etc . A multiplicação iri vitro é realizada !io de cultura apropriado, que são os meios de cultura A produção in_ vitro proporciona prepa^ rações de anticorpo relativamente puras e permite um aumento proporcional para dar origem a grandes quantidades dos anticorpos desejados. Técnicas para o cultivo de hibridoma em larga escala em condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem cultura em suspensão homogénea, por exemplo, num reactor de elevação de ar ou num reactor com agitação continua, ou cultura de células imobilizadas ou apa nhadas em armadilha, por exemplo em fibras ocas, microcápsu-las , em micro pérolas de agarose ou em cargas de cerâmica.

Para isolamento dos anticorpos raonoclo nais , as imunoglobulinas nas porções flutuantes das culturas são primeiramente concentradas por exemplo por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico tal como PEG, filtração através de membranas selectivas , etc.

Se anticor necessário e/ou desejado, os pos concentrados são purificados pelos métodos cr orna t ogr áf i -cos habituais, por exemplo filtração por gel, cromatografia de permuta iónica, cromatograf ia sobre celulose-DEAE , Protei_ na A ou cromatografia de imuno-afinidade . rpos mo-icando s são in_ as célu-aus ar

Grandes quantidades dos antico noclonais desejados podem também ser obtidos multipl as células do hibridoma iri vivo. Os clones celulare jectados a mamíferos que sejam histocompatíveis com las afins, por exemplo, ratinhos sinjeneicos, para c crescimento dos tumores produtores de anticorpos. r ad tai Apó s ão

Facultativamente, os animais são prepa os com um hidrocarbonato, especialmente óleos minerais s como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injecção. s uma a três semanas, os anticorpos monoclonais desejados recuperados dos fluidos do corpo do referido mamífero.

Como um exemplo, as células de híbrido ma derivados dos ratinhos Balb/c são injectadas intraperito-nealmente a ratinhos Balb/c pré-tratados facultativamente com um hidrocarboneto tal como pristano, e após uma a duas semanas são recolhidos os fluidos ascíticos destes ratinhos. Os anticorpos monoclonais desejados são isolados a partir dos fluidos corporais por métodos convencionais tal como foram atrás descritos.

Fragmentos de anticorpos monoclonais, por exemplo fragmentos Fab, Fab1 ou F(ab')2, que retêm a sua especificidade em relação ao CEA humano, podem ser obtidos a partir de compostos preparados tal como foi atrás descrito por métodos conhecidos per se, por exemplo, por digestão com enzimas tais como a pepsina ou a papaina e/ou clivagem das ligações di-sulfureto por redução química. 11

lona is técn i- pre - nzim a alde i - dobe n - )- mida ,

Os conjugados de anticorpos monoc do invento são preparados por métodos conhecidos nesta ca, por exemplo, por reacção de um anticorpo monoclonal parado tal como foi aqui anteriormente descrito com o e na presença de um agente de ligação, por exemplo glutar do, periodato, N,N'-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimi zoloxi)-succinimida, N-(3-/~2 ' -piridilditio 7-propionoxi -succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodii etc .

Os conjugados com avidina são preparados de um modo semelhante. Os conjugados com biotina são preparados por exemplo por reacção de anticorpos monoclonais com um éster activado da biotina tal como o N-hidroxisuccini mida éster de biotina. Os conjugados com marcadores fluores centes são preparados na presença de um agente de ligação, por exemplo os indicados atrás, ou por reacção com um isotio cianato, de preferência fluoresceina-isotiocianato. Os conjugados de anticorpo com quelatos de metal são preparados de um modo análogo.

Os anticorpos monoclonais marcados ra-dioactivamente com iodo ( I, I, I) sao obtidos a par tir de anticorpos monoclonais de acordo com o invento por io dinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou de potássio radioactivo e um agente químico de oxidação, tal como hipoclorito de sódio, cloramina T, etc, ou um agente de oxidação enzimático, tal como lactoperoxidase, glucose oxida se e glucose. por quela-

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento são ligados a yttrium (90 Y) por exemplo ção com ácido dietileno-triaminopentaacético (DPTA) 12-

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12- I

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Os anticorpos mar -99 m s ão preparados por processo de pe exem pio reduzindo pertechnate (TcO ) c cad os com Technet ium- rmu t a de li gandos por om so luç ão de est an ho , do nu ma col una Se ph a- na , o u por meio d e pl o i ncuban do per te - nCl 2 ' uma s olução t am- sód io -potás sio , e o fazendo a quelação do technetium reduzi dex e aplicando o anticorpo a esta colu técnicas de marcação directas , por exem chnate , um agente de redução tal como S pão tal como uma solução de ftalato de anticorpo. refere à linhagem ticorpo monoclonal rência a linhagem 0 invento também se 5, a qual foi deres de Microorganis croorganismos") do o, 19 8 7, sob o nulas do hibridoma regam anticorpos constante e podem ladas a temperatu- de células de hibridoma que segregam um an anti-CEA de acordo com o invento, de prefe celular do hibridoma com a designação CE 2 positada na "Collection Nationale de Cultu mes" ("Colecção Nacional de Culturas de Mi Instituto Pasteur, Paris, em 15 de Dezembr mero de acesso 1-719.

As linhagens de célu do invento são genéticamente estáveis, seg monoclonais do invento com especificidade ser reactivados a partir de culturas conge ras baixas por descongelação e reclonagem. 0 invento também se refere a um proces so para a preparação dessa linhagem celular de hibridoma, ca racterizado pelo facto de ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA humano purificado ou com um veiculo antigénico contendo CEA humano purificado, sendo as células produtoras de anticorpo dos ratinhos Balb/c imunizados fundidos com células do mieloma P3-NS2/lAg4, e sendo as células híbridas obti das na fusão clonadas, e sendo seleccionadas as células clo-nes segregando os anticorpos desejados. -13-

A imunização com CEA de elevada pureza, preparado pelos métodos que se seguem é preferida. 0 CEA é extraído das células que transportam CEA, por exemplo metas-tases de adenocarcinoma colorectal, ou do pulmão, ou adeno-carcinoma primário do pulmão, por precipitação com ácido per-clórico, ou por extração salina. O últ imo método é vantajoso visto que o CEA resultante ser menos desnaturado. Para o processo de extracção salina, o tecido que transporta CEA é homogenizado j em tampão com um pH variando entre 7,0-7,6 tal como tampão fosfato, tampão Tris, tampão TAPSO (ácido Γ3- ΓN-tris(hidro-ximetil)metilamino_7-2-hidroxipropanosulfónico ) , tampão POPSO (ácido piperazina-N,N'-bis- Γ2-hidroxi-propanossulfónico 7) , tampão EPPS (ácido N- Γ2-hidroxietil 7-piperazina-N1-3-propa-nossulfónico ) ,etc. A homogenização é alcançada por métodos conhecidos per se, por exemplo pela utilização de dispositivos mecânicos, por exemplo um batedor, misturador ou ultra-turrax, por ondas de ultra-som, pela adição de compostos ten-sio-activos tais como Tween, Triton ou Tergitol, etc. O CEA extraído é purificado por meio de métodos de cromatografia convencionais tais como cromato-grafia de permuta iónica, filtração por gel, cromatografia de afinidade, etc, e/ou poir aplicação a um imunoadsorvente consistindo numa combinação de anticorpos anti-CEA conhecidos conjugados com uma matriz tal como sefarose ou agarose , facultativamente activados, por exemplo com brometo de ciano-génio, cloroformato de nitrofenilo, hidrazida poliacrilamida ou outros. -14-

Especialmente preferido é um processo para a preparação das linhagens celulares de hibridoma do i_n vento e seus derivados, caracterizado pelo facto de ratinhos Balb/c serem imunizados injectando intraperitonealmente 15 pg de CEA purificado extraído por solução salina, sendo administrada intraperitonealmente após 4 meses uma série de in_ jecções intensificadoras (de reforço) com 15, 50 e 150 jjg de CEA purificado extraído com solução salina, sendo células de baço retiradas de animais imunizados 3 dias após a última infecção e fundidas com células de mieloma P3-NS2/lAg4 na presença de um promotor de fusão.

Os promotores de fusão considerados são por exemplo virus Sendai ou outros paramixovirus, facultativamente sob a forma inactivada-UV, iões de cálcio, lipi-dos tensio-activos tais como lisolecitina , ou polietileno glicol. rdo ture s ão e olu -gli- A fusão celular é realizada de aco com métodos descritos préviamente (Kóhler & Milstein, Na 256 , 495, 1975). De preferência, as células de mieloma fundidas com um excesso de três a vinte vezes superior d células do baço retiradas de mamíferos imunizados numa s ção contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietileno col , com um peso molecular variando entre 1.000 e 4.000.

Após a fusão, as células são suspensas de novo e expandidas, num meio de cultura apropriado tal como foi aqui anteriormente descrito, suplementada com um meio selectivo , por exemplo meio HAT, com intervalo de tempo regu lares a fim de evitar que as células de mieloma normais ultrapassem em número as células do hibridoma. -15- \

Os produtos flutuantes da cultura de células de hibridoma são testadas em relação ao anticorpo mo noclonal contra CEA com um imunoensaio, de preferência com um imunoensaio enzimático ou um imunoensaio com rádio. As linhagens de células de hibridoma que segregam MAbs anti-CEA monoclonais tal como foi anteriormente descrito, por exemplo a linhagem de células CE25 que segregam MAb CE25, são clona-das, por exemplo limitando a diluição em agar mole, de preferência duas vezes ou mais. hibr i -o rat i -te , o icas de ser con

Facultativamente, as células de doma são feitas passar através de animais, por exempl nhos, por injecção intraperitoneal e colheita da asei que estabiliza as hibridomas e melhora as caracterist crescimento. As linhagens de células clonadas podem geladas de um modo convencional.

Os anticorpos monoclonais e os seus dea rivados de acordo com o invento são úteis no diagnóstico do cancro. é constituído pe do antigénio car dos biológicos, rivados podem se nhecidos per se o antigénio e o noensaios (RIA) , imunofluorescênc

Um exemplo de la determinação qua cinoembriónico huma O anticorpo monocl r usados em qualque que utilizam as int anticorpo monoclona imunoensaios ligad ia, aglutinação do aglutinaç utiliza litativa no, espe onal do r um dos eraeções 1 , tais os ao en latex Ç c i c z ão e q ial nve imu de orno ima diagn uant i mente nto e noens ligaç os r , tes óst ica tat iva em flui_ seus de aios co-ão entre adioimu-tes de ou hemaglutinação. de acordo

Os anticorpos monoclonais com o invento podem ser usados como tal ou sob a forma de de rivados marcados radioactivamente num radioimunoensaio (RIA). Pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de RIA em fase homogénea, RIA de fase sólida ou RIA heterogénia, RIA simples ou RIA duplo (sandwich) com determinação directa ou indirecta (competitiva) de CEA. E preferido um RIA em sandwich em que um veiculo apropriado, por exemplo a superfície plástica de uma placa de microtitulação ou de um tubo de ensaio, por exem pio de poliestireno, cloreto de polipropileno ou de pilivini^ lo, vidro ou pérolas de plástico, papel de filtro, ou dextra no, folhas de acetato de celulose ou de nitrocelulose , etc, é revestido com um anticorpo monoclonal contra o CEA por sim pies adsorção ou facultativamente após activação do veiculo, por exemplo com glutaraldeido ou brometo de cianogénio, e incubado com a solução do teste e uma solução de um anticor- 12 5 po monoclonal marcado radioactivamente com I, o anticorpo monoclonal dissolvido reconhecendo um outro epítopo de CEA para além diferente do anticorpo monoclonal ligado ao veiculo, e a quantidade de CEA é determinada medindo a radioacti-vidade ligada ao veiculo. Um dos anticorpos utilizados no RIA em sandwich é um anticorpo anti-CEA monoclonal do invento .

Particularmente preferido é um radioimunoensaio em sandwich tal como foi aqui anteriormente descrito, em que um anticorpo monoclonal do invento é ligado a uma pérola, por exemplo uma pérola de polistireno, sendo esta pérola revestida incubada numa solução do teste ou padronizada contendo CEA e é finalmente desenvolvido com um anticorpo monoclonal marcado com rádio que reconhece um epítopo diferente. -17- \ \

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou sob a forma de de rivados formados por conjugados com enzima num ímunoensaio com enzima. Esses imunoensaios incluem processos de teste em que são usados os derivados de anticorpos monoclonais mar cados com enzima de acordo com o invento ou anticorpos marca dos com enzima conhecidas per se que reconhecem e se ligam com um epítopo dos anticorpos do invento. E preferido um ELISA (ensaio imunoabsor j vente ligado a enzima) em que um veículo tal como foi descrito anteriormente para RIA é revestido com um anticorpo mono-clonal de acordo com o invento, incubado com uma solução do teste contendo CEA e depois com um soro policlonal em relação ao CEA, por exemplo soro de carneiro, e, finalmente, os anticorpos ligados do soro policlonal são desenvolvidos por anticorpos marcados com enzima que os reconhecem e que se ligam com eles, e a quantidade da proteina ligada é determinada por uma reacção do substrato enzimático. Esse anticorpo marcado com enzima é, por exemplo, uma imunoglobulina de cabra contra carneiro marcada com fosfatase. veiculo re o invento ção de um ma, com o epítopo di anticorpo

Também se prefere um ELISA em que um vestido com um anticorpo monoclonal de acordo com é incubado com uma solução do teste e com uma solu-anticorpo monoclonal que é conjugado com um enzi-anticorpo monoclonal dissolvido reconhecendo um ferente de CEA em relação ao que é reconhecido pelo monoclonal ligado ao veiculo. -18-

Por meio de uma reacção do substrato enzimático que resulta, por exemplo, numa alteração da cor que pode ser observada a olho nú ou por meio de dispositivos de medição óptica, é medida a quantidade de enzima ligado, a qual é proporcional à quantidade de CEA na solução do teste.

Também se prefere um ELISA em que é usado um anticorpo monoclonal marcado com enzima do invento e o veiculo é revestido com um anticorpo monoclonal anti-CEA que reconhece um epítopo diferente daquele que o anticorpo monoclonal reconhece de acordo com o invento.

Particularmente preferido é um imunoen saio enzimático chamado análise immunodot, em que as soluções do teste ou padrão contendo CEA são localizadas num veiculo microporoso com uma elevada afinidade intrínseca em relação aos polipeptideos, por exemplo em nitrocelulose, sendo o vei culo que tem uma ou várias partes com as referidas amostras incubado numa solução de um anticorpo monoclonal do invento, em seguida numa solução de um segundo anticorpo marcado com enzima que reconhece e se liga com o anticorpo monoclonal do invento e finalmente uma solução de um substrato enzimático que leva a um sinal detectável, por exmplo uma substância corada.

Esse segundo anticorpo marcado com enzima é por exemplo imunoglobulina de coelho anti-ratinho conjugada com peroxidase de rábano bravo que pode ser desenvolvido com substractos enzimáticos apropriados tais como 4-cloro-1-naftol, etc.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal sob a forma de der vados de acordo com o invento conjugados com marcadores fluorescentes em testes de imunofluorescência. 1- -19-

Esses testes de imunofluorescência incluem processos em que são usados os derivados do anticorpo monoclonal de acordo com o invento, por exemplo derivados conjugados com fluoresceina, ou anticorpos marcados com marcadores fluorescentes conhecidos per se que reconhecem e se ligam com um epítopo do anticorpo monoclonal do invento. E preferido um teste de imunofluorescência em que um veiculo tal como foi atrás descrito para RIA é revestido de acordo com métodos padrão (normalizado) com células a serem testadas quanto à presença de CEA , sendo as células fixadas e permeabilizadas para permitir a interacção do material proteináceo no interior da célula com soluções aplicadas, sendo incubado com uma solução de um derivado de anticorpo monoclonal conjugado com um marcador fluorescente ou incubado com uma solução de um anticorpo monoclonal do in vento seguindo-se uma solução de um segundo anticorpo marcado com um marcador fluorescente que reconhece e se liga ao anticorpo monoclonal do invento, por exemplo uma imunoglobu-lina de coelho anti ratinhos marcada com fluoresceina. A presença de CEA é então detectada e localizada por micros-copia de fluorescência padrão ou por citometria de fluxo. A utilização de acordo com o invento de anticorpos monoclonais e seus derivados tal como foi aqui anteriormente descrito para a determinação qualitativa e quantitativa do CEA humano inclui também outros imunoensaios conhecidos per se, por exemplo aglutinação de latex com partículas de latex revestidos com anticorpo ou revestida com antigénio ou hemaglutinação com glóbulos vermelhos sanguíneos revestidos com anticorpo ou revestidos com antigénio, etc. ·\ -20

Ο invento relaciona-se também com esto jos para teste para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos monoclonais contendo CEA do invento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou adjuntos.

Os estojos do teste de acordo com o in vento para um radioimunoensaio contém, por exemplo, um veiculo apropriado , não revestido ou revestido com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente congelado pelo frio ou soluções concentradas de um anticorpo monoclonal ou policlonal em relação ao CEA e/ou um seu derivado marcado com radio, solução de CEA padrão (normalizadas), soluções tampão e, facultativamente, polipeptideos e detergentes para evitar adsorção não especifica e formação de agregados, pip£ tas, recipientes de reacção, curvas de calibração, manuais de instrução, etc.

Os estojos do teste de acordo com o invento para um imunoensaio enzimático, contém, por exemplo, um veiculo apropriado, por exemplo placas de monotitulação ou folhas de nitrocelulose, facultativamente soluções secas por congelação ou concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e de um anticorpo monoclonal ou policlonal marcado por enzima em relação ao CEA ou em relação a um primeiro anticorpo reconhecendo CEA, substratos enzimáticos sob uma for ma sólida ou dissolvida, soluções de CEA padrões, soluções de tampão e, facultativamente, polipeptideos e detergentes, pipetas, recipientes de reacção, curvas de calibração, quadros de escala de cores, manuais de instrução, etc.

Os estojos de teste de acordo com o in vento para um teste de imunofluorescência contem, por exemplo, um veiculo apropriado por exemplo, coberturas de plástico ou lâminas de vidro facultativamente secas por congela -21-

ção ou soluç invento e de na reconhece e , f acultati e detergente instrução , e ões concentradas de um anticorpo monoclonal do um anticorpo policlonal marcado com fluorescei-ndo o anticorpo monoclonal , soluções de tampão vamente, soluções de CEA padrão, polipepetideos s, pipetas, recipientes de reacção , manuais de tc .

Além disso, o anticorpo monoclonal do invento e seus derivados são usados para localização e forma ção de imagem in vivo de tumore s. Para a formação de imagem in vivo , o anticorpo monoclonal do i n ve nto é marcado com ra- dio ou conjugado com um quelato de meta 1 formando um comple- xo com um nucleto de radio, por exe mplo iodo, technet ium , rhenium, etc, e as técnicas de exploração por rádio são usadas para detectar tumores primários e metastáticos. o e e s

Com esta finalidade, o anticorpo radi activo é injectado, por exemplo, intravenosamente e o doent é explorado com um formador de imagens gama com intervalos regulares. Os tumores expressando CEA fixarão mais anticor pos radioactivos do que os outros tecidos e serão clarament reconhecidos pela câmara de imagens gama. De preferência o anticorpos monoclonais marcados com I ou I sao usados para a exploração com rádio em quantidades de 3 a 50 pg representando 15 a 30 ;jCI por kg de peso corporal. ocida no tratamen-usados como deri-cas ou citotóxicas por exemplo ricina inda administrados A dose terapeuti-nte 1 mg e 5 mg nticorpos monoclo-corporal para con

Para a actividade bi to do cancro, os anticorpos do invento são vados conjugados com substâncias citostáti tal como foi aqui anteriormente descrito, A, como derivados marcados com rádio, ou a em liposomas contendo reagentes biocidas. ca para mamíferos varia entre aproximadame por kg de peso corporal para os próprios a nais , e entre 0,1 mg e 5 mg por kg do peso jugados te e do com drogas citotóxicas, modo de aplicação. dependendo do estado do doen 0 invento também se relaciona com preparações farmacêuticas contendo o anticorpo monoclonal do invento e/ou seus derivados com uma especificidade elevada em relação ao CEA como foi aqui anteriormente indicado. As preparações farmacêuticas contêm, por exemplo, o anticorpo monoclonal do invento ou seus derivados numa quantidade eficaz juntamente ou em mistura com veículos inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos, farmaceuticamente aceitáveis. i -a- a - São preferidas preparações farmacêut cas para aplicação parentérica. As preparações para aplic ção intramuscular, subcutânea ou intravenosa são, por exem pio, soluções ou suspensões aquosas isotónicas , facultativ mente preparadas pouco antes da sua utilização a partir de preparações liofilizadas ou concentradas.

As preparações farmacêuticas podem ser est er il izada s e conter adjuvantes po r exemplo pa r a conse rva ção - es tabil ização, humidificaç ão , e mulsificaç ão ou solu bi- 1 i z aç ão dos ingredientes, sais para a regulaçã o da press ão osm ót ic a , ta mpão e/ou compostos que regulem a vi scosidad e , por e xe mplo carboxicelulose de sódio , dextrano , pol ivini Ipi r r o li do na ou gelatina. conhecidos ão ou liofi-0,01% a apro eparações ampolas ou ordo com mé São preparadas por métodos nesta técnica, por exemplo por mistura, dissoluç lização convencionais; e contêm aproximadamente ximadamente 50% dos ingredientes activos. As pr para injecções são processadas, introduzidas em frascos , e seladas em condições assépticas de ac todos conhecidos nesta técnica. -23-

Os exemplos que se seguem ilustram o invento mas não o limitam de qualquer modo.

Abreviaturas

BSA FCS ELISA meio HAT NCA PBS albumina do soro bovino soro de niteto fetal ensaio de imunoabsorção ligado a enzima meio hipoxantina/aminopterina/timidina antigénio de reacção cruzada não especifico solução salina tamponada com fosfato

Exemplo 1: Preparação da linhagem celular CE25 do hibridoma 1.1 Purificação do antigénio carcinoembriónico (CEA) São extraídas com solução salina metár; tase do figado do carcinoma do colon (nas 6 horas após a mor te). 1 volume de tecido é primeiro homogenizado em 3 volumes de tampão fosfato 0,02 M pH 7,4 a 42C durante 10 minutos, num Sorrall Omnimixer a 8.000 rpm. O homogenato crú é então centrifugado a 8.000 g durante 15 minutos a 49C. O produto flutuante transparente é aplicado a um imunoabsorvente consistindo numa reunião dos anticorpos monoclonais MAb 35 e MAb 115 anti CEA conhecidos Haskell et al . , Câncer Res. 4_3, 3857, 1983; Buchegger et al., J. Exp. Med. 158, 413, 1983) e MAb 73 (Buchegger et al., Immunol. Letters 5, 85, 1982) ligados com Sepharose activada com CnBr. 0 CEA e submetido a elui- ção com tiocianato de amónio 2M. Após uma cromatografia final com Sepharose 6B obtem-se CEA com uma pureza de 90%. 1.2 Imunização de ratinhos Balb/c

Ratinhos Balb/c com dois meses de idade são imunizados com CEA por injecção intraperitoneal de 15 pg de CEA purificado extraído com solução salina com adjuvante de Freund completo. Após 4 meses, é administrada uma série de injecções intensificadoras compreendendo 15, 50 e 150 pg da mesma preparação salina de CEA sem adjuvante de Freund administradas intraperitonealmente 5, 4 e 3 dias antes da fusão, respectivamente. 1.3. Fusão celular A fusão celular é realizada usando 1,5 8 7 x 10 células do baço de ratinhos imunizado e 1,5 x 10 células de mieloma P3-NS2/lAg4 de ratinho de acordo com métodos convencionais descritos previamente (Koehler & Milstein, Nature 256 , 495, 1975). Após lavagem, as células são de novo suspensas em 48 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco padrão Gibco No. 0422501). 3 x 10 células normais de rati nho do exsudado peritoneal são adicionadas com células ali-mentadoras.

As células são distribuídas por recipientes Costar 96 x 0,5 ml e alimentadas 3 vezes por semana com meio padrão de selecção HAT durante 3-6 semanas. Quando o crescimento das células de hibridoma se torna visível, os produtos flutuantes são testados tal como foi descrito no Exemplo 1.4. Os hibridomas positivos são reclonados e arma- -25-

1.4 Ensaio de detecção do anticorpo

Fluidos de cultura dos hibridomas em crescimento são testados quanto à presença de anticorpo anti- -CEA por meio de uma modificação do ensaio de Farr (J. Infect .

Dis. 103, 239, 1958) tal como foi previamente descrito Acco- 11a et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. TJ_, 563, 1980). Diluições 1:10 (v/v) dos produtos flutuantes da cultura de células são 125 incubadas em duplicado com CEA marcado com I em tampão HCl-Tris 0,02M, pH 7,4. A ligação do CEA aos anticorpos é precipitada a 4°C adicionando solução de sulfato de amónio saturada, fria , na presença de soro humano normal.

As linhagens de células de hibridoma segregando anticorpos anti-CEA que reconhecem epítopos de CEA não presentes ou antigênio NCA,-^ ou NCA^^ de reacção cru zada não especifico, em glicoproteina biliar ou em granuloei tos, e ligados a CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 í 0,3) x 1010 litros/mol, por exemplo linhagem celular CE25 segregando MAb CE25, são seleccionadas para outros estudos . 1.5 Armazenamento e processamento do hibridoma

As células de hibridoma seleccionadas podem ser feitas crescer em cultura, congeladas a -80°C ou em azoto liquido sendo então reactivadas. As células são clonadas pelo método de limitação de diluição e são expandidas formando ascite em ratinhos Balb/c preparada com prista-no. A linhagem celular CE25 foi depositado na "Coilection Nationale de Culturas de Microorganismos" ("Colecção Nacional de Microorganismos") do Instituto Pas-teur, Paris, em 15 de Dezembro, 1987, sob o numero de acesso 1-719 -26-

Exemplo 2: Isolamento e purificação do anticorpo monoclonal MAb CE 25 e preparação de derivados 2.1 Sintese in vivo

Ratinhos Balb/c com 8-10 semanas de idade são pré-tratados intraperitonealmente e com 0,5 ml de pristano (Aldrich). 1-3 semanas mais tarde, 2-5 x 10 células de hibridoma clonadas são inoculadas intraperitonealmen-te. Após 8-10 dias ò fluido da ascite é recolhido, centri-fugado a 800 x g e armazenado a -20°C ou a -80°C. O fluido da ascite descongelado é cen-trifugado a 50000 x g durante 60 minutos. E removida cuidadosamente numa camada de gordura flutuando à superfície , e a concentração da proteína é ajustada até uma concentração de 10-12 mg/ml. A imunoglobulina crua é precipitada por adição gota a gota de 0,9 equivalente por volume de sulfato de amónio saturado a 0°C, sendo então dissolvida em tampão fosfato 0,04 M pH 8 e submetido a diálise utilizando o mesmo tampão. Obtem-se uma fracção de imunoglobulina imunologica-mente activa por cromatografia em celulose DEAE-D52 (Whatman) onde MAb CE25 é eluido no vòlume vazio.

Essas preparações proporcionando entre 5 e 15 mg de anticorpo por ml de ascite podem ser usadas di_ rectamente ou podem ser preparados fragmentos de anticorpo para aplicação in vitro e in vivo (Exemplo 2.3). 2.2 Sintese in vitro -27-

E obtida uma pré-cultura da linhagem celular CE25 cultivando células de hibridoma a uma temperatu ra fisiológica (à volta de 37°C) em meio RPMI 1640, contendo 10% de FCS até uma densidade celular final de 5 x 10~* a 10^ células por ml. A totalidade da pré-cultura é introduzida em recipientes de cultura Bellco e ajustada até um volume to tal de 1.500 ml com meio RPMI 1640 recente/10% de FCS. A cultura é agitada a cerca de 37°c sob CC>2 a 5% a 30 rpm durante dois a três dias, sendo então diluída até um volume total de 3.000 ml com RPMI 1640/10% de FCS e agitada durante mais sete a dez dias. Após este pe riodo de tempo 95% das células estão mortas. O caldo de cul tura é centrifugado a 1.000 x g durante 20 minutos a 4°C. O produto flutuante é filtrado através de um filtro com um tamanho de poros de 0,2 um em condições de esterilidade. A imunoglobulina crua é precipitada por meio de adição lenta gota a gota de 0,9 equivalente de volume de sulfato de amónio saturado a 0°C. Este precipitado é purificado tal como foi descrito no Exemplo 2.1. 2.3 Preparação do fragmento

Os fragmentos F(ab')2 de MAb CE25 são preparados usando digestão por pepsina (2-4%, p/p) em tampão acetato 0,2M pH 4 durante 22 horas a 37°C (Lamyoi & Nisonoff J. Immunol. Methods 5_6, 235, 1983). F (ab' ) 2 fragmentos são purificados por cromatografia em Sephadex G150 onde os fragmentos F(ab')2 100 KD são eluidos sob a forma de um único pico e os pequenos produtos de digestão são bem separados. -28-

A IgGi e F(ab')2 dos ratinhos de contro lo são purificados por métodos idênticos a partir de ascite dos ratinhos injectados com células de mieloma P3 x 63 (Koehler & Milstein, Nature 256 , 495, 1975 ). A dextrose do gel poliacrilamida-SDS de acordo com Laemmli (Nature 227, 680, 1970) revela uma pureza superior a 95% das fracções IgG e F(AB')2. 2.4 Marcação com rádio de MAb CE 25 e dos seus fragmentos MAb CE25 ou fragmentos são marcados com 131 , ... I pelo método da cloramina-T a fim de proporcionar activi dades especificas de 8-9 pCi/pg de pròteina. Não se observou marcação preferencial dos MAbs intactas em comparação com os fragmentos. O iodo ligado à proteína é separado do iodo livre por cromatografia em Sephadex, a qual revela a presença 131 de menos de 1% de I ligado a proteínas agregadas. A ímu-noreactividade é controlada por incubação de CEA ligado a Sepharose activada com CnBr (Pharmacia).

Exemplo 3: Caracterização do anticorpo monoclonal MAb CE25 3.1. Determinação da classe e subclasse de MAb CE25 A classe e subclasse do anticorpo mono clonal MAb CE25 produzido por células de hibridoma clonadas é determinada pela conhecida técnica de Ouchterlony de imun£ difusão agar-gel usando classe e subclasse de anticorpos de coelho específicos (Bionetics). Os resultados são confirmados por um imunoensaio enzimático (ELISA) do modo que se segue: Placas de microtitulação são revestidas com 1 μg por re cipiente de uma preparação de imunoglobulina de coelho'de -29-

uma classe - ou sub-classe - especifica de soro (Bionetics) em 50 1 de PBS. A capacidade de ligação livre da placa é saturada com um tampão de 1% de albumina do soro bovino em PBS contendo 0,2% de NaN^ (p/v), pH 7,4.

Sondas de 100 μΐ contendo anticorpos monoclonais são incubados no recipiente a 37°C durante 1 hora. As placas são lavadas com PBS, sendo então incubadas a 37°C durante 1 hora com uma preparação de imunoglobulina de coelho conjugado com fosfatase com a mesma especificidade que foi usada para revestimento das placas. O enzima fixado é desenvolvido por in cubação (37°C, 30 minutos) com uma solução do substrato en-zimático fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em tampão dieta-nolamina a 10% contendo MgC^ 0,5 mM e NaN^ a 0,02% (p/v), pH 9,8) e medindo a densidade óptica a 405 nm. O anticorpo monoclonal MAb CE25 pertence à classe IgGl. 3.2 Reactividade cruzada com antigénios de tecido normal A linhagem de células de hibridoma CE25 flutuante é testada quanto a reactividade cruzada com granulocitos presentes em cortes congelados de baço, pancreas, pulmão e fígado normais; por meio de coloração indirecta com imunoperoxidase. Além disso, a ausência de reacção cruzada com glicoproteina biliar é determinada em cortes de tecido hepático humano normal.

Para coloração do antigénio com MAB anti-CEA usa-se uma técnica com três camadas de biotina-avi-dina-peroxidase (Guesdon et al. , J. Histochem. Cytochem. 27, 1131, 1979). Em resumo, cortes pelo criostato com 10 pm são fixados durante 10 minutos em acetona à temperatura ambiente lavada em PBS frio contendo Thimerosal 5 x 10-5 M e tratados 30-

com ^2°2 a 1% para aboli na. Os cor tes são então 25 μΐ de fl uido de cultu de células do hibridoma células do mieloma P3 x dase end nutos co da linha linhagem lo. óge- m gem de r a actividade da peroxi incubados durante 60 mi ra não diluído a partir anti-CEA ou a partir da 63Ag8 usadas como contro faz-se c seguindo jugado a CA, USA. ambiente A segunda incubação, de 15 minutos , om anticorpo IgG de cavalo anti-ratinho bioestanhado , -se uma terceira incubação , de 15 minutos , com o coii vidina-peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, Todas as incubações são realizadas à temperatura sendo seguidas por uma lavagem com PBS.

Finalmente, a actividade da peroxidase é revelada adicionando uma solução preparada recentemente contendo 0,4% de 3-amino-9-etil-carbazole e 0,015% de H2°2' e os tecidos são contra-corados com hematoxilina (Schreyer et al. , in: Sordat , 4th Int. Workshop sobre animais imunode-ficientes em pesquisa experimental, Basel 1984).

Os resultados são resumidos no quadro que se segue: -31-

imunoperoxidase em coloração resultante carcinoma do colon ++ pancreas normal (duetos pancreáticos) - figado normal (duetos biliares) - pulmão normal (células epiteliais) ( + ) granulocitos de baço - simbolos: ++ coloração fortemente positiva, (+) coloração ocasional de algumas células epiteliais alveolares, - nenhuma coloração A especificidade de MAb CE25 é ainda analisada por um radioimunoensaio usando antigénios NCA,-ç. e NCAg5 com reacção cruzada não específicos marcada com rádio purificados. 0 estudo é realizado tal como foi descrito no exemplo 1.4 para o ensaio Farr exceptuando o facto de CEA marcado com ser substituído por NCA marcado com ^25I. NCA é purificado a partir de extracto com ácido perclórico de pulmão normal por filtração sobre Sephadex G-200 seguindo-se imunoabsorção sobre uma coluna CNBr-Sepharose 4B contendo IgG de um antisoro anti-CEA de cabra com reacção cruzada conhecida com NCA (Heumann et al. , in: Lehmann, Carcino-embryonic piroteins , Vol. 11, Amsterdam 1979 ) . -32- -32-

\ NCAg^ e NCA^.^ são ainda purificados por colunas de imunoadsorção contendo MAbs cada um destes reconhecendo dois NCA (Buchegger et al . , Int. J. Câncer 3_3, 643, 125 1984). NCA-- e marcado com I pelo método com cloramina , 125 T, NCAj-j. e marcado com I com o reagente de Balton e Hunter (Amersham, Bucks., England).

Os resultados do teste são: radioimunoensaio em percentagem de antigénio marcado com radio precipitado 125 I CEA 5 4 125-r i nca55 0 125^ I nca95 1

Além disso, muda-se a ligação de MAb 125 CE25 marcado com I a CEA ligado a Sepharose activada com CNBr e as células de tumor de colon Co 112 fixadas com glu-taraldeido após incubação durante a noite a 25°C e ligação a leucócitos humanos recentemente preparados, embalados, após incubação durante 4 horas a 4°C.

Os resultados são indicados a seguir: -33-

125 I MAb ligando-se a percentagem do input de MAb marcados com radio CEA imobilizado em 75 CNBr Sepharose Células Co 112 fi- 60 xadas Granulocitos recentes C 1.7

Os resultados atrás referidos indicam que MAb CE 25 é um bom candidato para a localização óptima de tumor juntamente com acumulação mínima, não especifica na medula óssea e figado. 3.3 Determinação de constantes de afinidade A uma quantidade limitada de MAb CE25, são adicionados quantidâdes crescentes de CEA marcado com 1 oc I em PBS tal como foi descrito por Accolla et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 11_, 563, 1980). Após 16 horas, o soro humano normal é adicionado seguindo-se sulfato de amónio satu rado frio para precipitar CEA ligado a anticorpos. A radio-actividade da amostra total e do"precipitado é determinada por contagem de y .

Para calcular a constante de afinidade curvas de saturação obtidas em equilíbrio são transformados e analisadas pelo método de Scatchard (Ann.N.Y.Acad.Sei. 51, 660, 1949). -34-

MAb CE 25 liga-se a CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 t 0,3) x 10 litros/mol. 3.4 Determinação do epítopo reconhecido por MAb CE 25 A determinante antigénica (epítopo) de CEA reconhecida por MAb CE 25 é avaliada por meio de uma , 125

técnica de inibição cruzada em que MAb CE25 marcado com I é testado quanto à sua capacidade de ligação a CEA não marcado seguindo-se incubação com um excesso 1.000 vezes maior de outro MABs anti-CEA, tal como foi descrito anteriormente por Accolla et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. _77, 563, 1980) e Haskell et al. (câncer Res. 43_, 3857, 1983 ). Os resultados indicam que MAb CE25 tem uma especificidade única em relação a um epítopo de CEA nãó reconhecido por qualquer um dos MAb anti-CEA previamente publicados.

Comparado com a especificidade do epítopo de MAbs previamente descritos por Buchegger et al. (Int. J.Câncer 3_3, 643, 1984 ), o epítopo reconhecido por MAb CE25 está estericamente em relação intima com um epítopo reconhecido pelo conhecido MAb 202. A ligação de MAb CE25 é fortemente ini_ bida por MAb 202. Os dois epítopos são contudo claramente diferentes , visto que MAb 202 revela uma reacção cruzada for_ te com granulocitos facto completamente ausente do MAb CE25. 0 epítopo reconhecido por MAb CE25 na molécula de CEA ou é repetitivo ou é mais acessível ao anticorpo monoclonal do que os epítopos reconhecidos por outros MAbs anti-CEA. Isto é sugerido por ensaios de ligação em que MAb CE25 (1 ng) marcado com rádio é incubado com células vivas de carcinoma do colon (3 x 10^ células). -35-

Neste teste, MAb CE 25 liga-se até 36% enquanto que os MAbs anti-CEA e MAb 73 se ligam a um nível inferior a 16%.

Estes resultados são confirmados por outros ensaios de ligação em que quantidades crescentes de MAb CE25 e o MAb 35 altamente especifico e bem caracterizado são incubados ou com CEA purificado ligado a Sepharose acti-vada por CnBr ou a células vivas de carcinoma do colon tal como se descreve a seguir.

Para os ensaios de ligação à Sepharose -CEA, concentrações crescentes de dois anticorpos monoclonais marcados com rádio (0,15 - 40 jug) são incubados durante 16 horas a 25°C com 3 pg de CEA ligado a Sepharose -CnBr. A li_ gação não especifica é determinada por incubação com Sepharose - CnBr contendo proteína irrelevante e é subtraído. Os resultados demonstram que cerca de 4 vezes mais MAb CE25 se liga à Sepharose - ligada a CEA do que MAb 35.

Resultados muito semelhantes são obtidos num ensaio com células vivas de carcinoma do colon. As células do carcinoma de colon são feitas crescer em 96 placas de cultura de tecido após lavagem, quantidades crescentes de MAbs marcadas com rádio (2-450 ;ug) são então incubadas com as células aderentes durante 4 horas a 37°C num meio de cultura. A ligação não especifica é determinada usando quantidades elevadas de MAb não marcado para inibir a ligação especifica e é subtraída. Tal como no ensaio com Sepharose - CEA atrás descrito, obtem-se uma ligação 4 vezes maior de MAb CE 25 às células de carcinoma de colon em comparação com MAb 35. -36-

Assim, a ligação superior de MAb CE25 a células expressando CEA torna o anticorpo um candidato pro missor para o diagnóstico e aplicação da terapêutica.

Exemplo 4: Imunocintigrafia em ratinhos rapados 4.1 Modelos de tumor de ratinho rapado O carcinoma do colon humano T380 (Martin & Halpern, Câncer Res. 4£, 5475, 1984; Mach et al., Nature 248, 704, 1974) transplantados seriadamente subcutaneamente para ratinhos rapados (Iffa Credo, Arbesle, France), é usado como alvo para MAbs anti-CEA marcados com rádio e fragmentos. 0 tumor T380 revela relativamente poucas áreas (superfícies) necróticas até tamanhos de mais de 1 g devido a um elevado grau de vascularização. O tumor é moderadamente diferenciado e contêm numerosos pseudolumens que são ricos em CEA, rodeados por células epiteliais com um grau mais baixo de organização.

Foi descrita a produção de CEA e a libertação na corrente sanguínea. Podem ser extraídos 15 a 45 pg de CEA por grama de tumor, e 10 a 18 ng por hora são produzidos e libartados para o sangue a partir de 1 g de tumor (Martin & Halpern, Câncer Res. 4_4, 5475, 1984 ). 4.2 Injecção analítica a ratinhos rapados apresentando tumor MAb CE 25, MAB 35 e MAb D17, cada um deles reconhecendo diferentes epítopos da molécula CEA, e os seus fragmentos F (ab' ) 2 são marcados com rádio com pelo -37-

método da cloramina T, dando origem a uma actividade especifica final de 8-9 jjCi/jug da proteína, sendo injectados intra venosamente a grupos de 3-4 ratinhos nús apresentando tumores do colon T380 de 0,2 a 1,5 gramas. São usadas misturas de anticorpos e os seus fragmentos para se conseguir uma boa e rápida penetração dos nódulos, do tumor assim como libertação de elevadas quantidades de anticorpos durante um período de tempo mais longo. Anticorpos em fragmentos ou intactos marcados com 131* I podem também irradiar diferentes areas dos nódulos turno rais. A marcação com é também vantajosa tendo em vista uma boa penetração do tumor. Os ratinhos são dissecados 3 dias após a injecção de anticorpos intactos ou 2 dias após injecção de F(ab')2. As relações entre o tecido tumoral e o tecido normal (T/N) são calculadas assim como a relação entre tumor e peso total (média T/N). A "média T/N" expressa a relação da radioactividade do tumor/g em comparação com a radioactivi-dade do peso total/g incluindo todos os orgãos e a carcassa dissecada.

Os resultados são resumidos no quadro que se segue I -38-

Relações T/N em ratinhos dissecados após injecção de doses terapêuticas de MAbs anti-CEA e fragmentos rd E P 0 c o V •H u 0

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Para demonstrar a possibilidade de se obter regressão do tumor de carcinomas do colon humano por injecção de MAbs anti-CEA marcados com , são realizados as experiências que se seguem.

Com fins terapêuticos , anticorpos in-tactos são misturados com os seus fragmentos F(ab')2 numa relação 1:2. Um mg desta mistura é marcado por cloramina T com 10 mCi de até uma actividade especifica de 8 pCi/ pq de proteína. A ratinhos nús machos com 7 semanas de ida^ de são feitos transplantes de tumor do colon T380 e distribuem-se ao acaso 3-4 ratinhos por cada gaiola.

Os tumores são medidos três dias antes e no dia da injecção marcada com rádio, isot é, 10 dias após a transplantação quando os tumores estão bem estabelecidos e organizados e em crescimento exponencial. São escolhidos 4 grupos de ratinhos com tumores em crescimento de tamanhos variados. O primeiro grupo é injectado intraveno 131 samente com anticorpos marcados com 600 ^Ci I, o segundo 131 com IgG normal marcado com 600 juCi I (também intactos e F(ab')2 misturados). Um terceiro grupo é injectado com uma quantidade correspondente de 75 ^g de anticorpos anti-CEA não marcados, e um quarto grupo não recebe qualquer injecção . A tiroideia dos ratinhos injectados com proteínas marcados com ^^1 é protegida adicionando solução de Lugol a 5% a agua para beber (0,5 ml por 300 ml de água), carregando 3 dias antes da injecção e mantendo essa -40-

adição até às 6 semanas seguintes. Os ratinhos são mantidos em condições assépticas usando gaiolas cobertas com papel de filtro e com acesso limitado a 2 pessoas. Inicialmente, todos os 3 a 4 dias, e mais tarde uma vez por semana, são medidos os diâmetros do tumor em 3 dimensões.

Usando a fórmula volume = rl x r2 x r3 x 4/3 7T ( r = radius) são calculados os volumes do tumor. A precisão para as medi_ ções do tamanho de cada tumor é de cerca ±10% como se verificou por medições feitas por diferentes pessoas. A contagem da totalidade do corpo usando um RADX Assayer 1 (RADX Corporation, Houston, Texas) permite a determinação de duas meias vidas. A irradiação da totalidade do corpo é então calculada pelas fórmulas = 2.13 x T.eff x 1,44 x C x rads 1 31 (T.eff em horas, C em pCi/g, = 0,19 para I) e

N D =2,13xT.effxl,44xCxV* f. x E. x φ (u r). rads Y JLí í í en ι i=l (f = freguência de raios γ , E = energia de raios -y - φ = = coeficiente de absorção linear (u ) multiplicado pelo rá dio (r), ver Johns and Cunningham, in: Friedman , Monograph in the Bannerstane Division of American lectures on Radiation Therapy, Springfield 1978). A irradiação da totalidade do corpo pa ra os ratinhos é devida em 90% à radiação e em 10% à radiação γ . -41-

ados às 24 e às 72 h o com r ádi o em dose açõe s ( tax as ) T/N. a pa rti r d as relações stes an ima is tomando to e de di mi nuiç ão e no dia 7 a pós a inj terapêutica são anali Uma relação T/N média entre o turno r e a tot em consideração uma f putativa da radioacti

Os ratinhos dissec ecção do Mab marcad sados quanto às rei total é calculada alidade do corpo ne ase de enriquecimen vidade no tumor.

Uma dose no tumor devida apenas à radiação fb é calculada em comparação com a dose da totalidade do corpo. Os tumores são examinados histologicamente aos 1, 3 e 7 dias, e obtem-se autoradiografia a partir de tumores dissecados às 24 e 72 horas após a injecção. A coloração com imunoperoxidase usando MAbs anti-CEA de porco e conjugado de peroxidase-IgG anti--porco é realizada em 3 tumores desenvolvendo-se tarde após injecção com anticorpo marcado com rádio assim como do tumor T380 não tratado nos ratinhos nus. 0 sangue de 4-5 ratinhos injectados com MAb marcado com rádio ou de ratinhos não tratados apresentando tumores é obtido semanalmente após injecção com anticorpo e faz-se a contagem dos glóbulos brancos do sangue.

Finalmente, cinco ratinhos, que sobrevivem durante 1/2 ano após os protocolos de terapêutica preliminar, são examinados histologicamente e por coloração com imunoperoxidase quanto às restantes células tumorais viáveis e à sua expressão em CEA. A tiroideia , fígado, rim, pulmão e baço destes últimos ratinhos são analisados morfologicameri te quanto às lesões provocadas pela radiação. -42-

0 tamanho de enxertos de tumores bem estabelecidos aumenta até aos 6 dias após a injecção com anticorpo marcado com rádio mas nessa altura estabelece-se a regressão do tumor durante 4-12 semanas.

Isto deve corresponder quer a uma destruição de mais de 99% das células do tumor quer à destruição de uma percentagem inferior mas acompanhada por uma acen tuada inibição, da proliferação celular.

Um grupo principal de controlo de 13 ratinhos é injectado com a mesma quantidade de Iggl normal 131 intacta marcada com I e dos seus fragmentos F(ab')2. A progressão do tumor é retardada durante 1 a 3 semanas em com paração com os controlos não tratados , mas não se observa qualquer regressão do tumor.

Os resultados (evolução do tamanho do tumor em ratinhos tratados e controlos são resumidos no quadro que se segue. No dia da injecção os tamanhos médios do tumor variam entre 47-50 mm^ nos quatro grupos de ratinhos indicado no quadro. Observa-se um aumento rápido nos grupos (c) e (d) durante os 28 dias que se seguem. anticorpos um aumento 3 de 44 mm IgG normal ta mas cons- 3 449 mm no

Em ratinhos injectados com marcados com rádio o tamanho médio do tumor após , , , , 3 inicial ate 122 mm , diminui ate um valor mínimo no dia 28 (grupo a). No grupo (b) injectado com marcado com rádio observou-se uma progressão len tante do tumor com um tamanho médio do tumor de dia 28. -43- \

roo rHoρ pco u <D

Evolução dos tamanhos dos tumores em ratinhos tratados o O 00 tX) co o o CN «—1 CN o o + 1 + 1 i—1 (—1 σ\ Λ Λ ^r ςτ rH ro rH o o 0 c\j rH o o irO P 21 + 1 + 1 o rH o rH Ό o fs Λ ro LO o a CN o LO •H CN ro CP > O ΓΟ r- ON CP ro 0) iro a Ν' + 1 H-i + \ 4-1 Ό O t—1 LO N1 I--1 o r- ro co o •1—1 (—1 o co C rH ro H E E ro ro σ> CK in CO co E a 'tr co LO 0) ro 10 -H + 1 + 1 + 1 P E u0 ro o LO o 0 O ro •H co E 3 •—1 rH in LO 3 tn -P <D ro o ro i—1 CT\ CN Γ- O in iO CN ΡΟ Ό se LO + 1 + 1 + 1 4-1 O CN H CO ro •H 0) CN CN rr ro Ό 3 r—1 rH CN ro Ό σ E ro O rH o cr. 0 ro ro CN CN CN x: c •H Ό o + 1 + 1 4*1 4-1 rtj CN LO rH in E ro - - - - ro o O Γ- Ch Γ- Eh c o LO T5 tfl 0 0 sz ρ c ro ro rH o <u -H rH rH rH rH E 4-0 '3 m 2 μ H rH i—1 ro ro rH r—I H O -P < O < c ω rH w Φ u 0 o E 1 P 1 03 •H -P •H -P +J C 4-» 03 O XI O c P -p fO ϋ m 4-> c (D X) U X3 E E < CP < <D ro s H 2 co ρ ro -—s .—- P Cd X) O T3 E — —' ro ro ρ •H <U E -P P a ro ro c ro ro -H Ό <3· ro m ro Ό ro u ro c P ω • P ru X T3 <u •H 0 0 CP irt) cu a tf} -H Ό E Φ 0) E tn P 03 0 •H a n ro r~ o Ό ro ro xs H ro i—I U ro > 0) ro 0 o (ro iro ro a u ro (D ro •n P C o -H E 3 '03 -P P ro -rH 0 3 Ό a 0» ro ro o x: ro c ro ro E ro ro c -P ro E ro 0) O ro -44-

Novos resultados indicam que ratinhos nús em que se transplantou tumor podem ficar completamente curados dos seus tumores usando fragmentos F(ab')2 marcados 131 com I de tres MAbs. 8 de entre 10 ratinhos sobreviveram um ano sem reincidência do tumor.

Os tumores dissecados 24 e 72 horas após injecção de doses terapêuticas de misturas anticorpo/ 131 /fragmento marcados com I não revelam qualquer modificação histológica detectável por meio de -microscopia óptica. Em contraste, são observados superfícies desiguais de necrose e numerosas células picnóticas nos tumores dissecados 7 dias após a injecção. após a i gãos pel e baço t

Nos animais que sobreviveram 6 meses munoterapêutica com rádio, são analisados vários or-o microscópio óptico. As tiroideias, rins, pulmões êm um aspecto normal. A ausência de mortalidade entre os ra tinhos tratados indica que os efeitos da imunoterapêutica com rádio sobre a hematopoiese são insignificantes.

Exemplo 5: Ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) 5.1 Processo de ensaio

Placas de microtitulação de polipropi-leno (Dynatech) são revestidas durante um período de 2 horas a 37°C e durante a noite a 4°C com 150 pl de uma solução do anticorpo monoclonal MAb CE 25 (10 jjg/ml) num tampão pH 8,5 (solução salina a 0,9% tamponada com carbonato contendo 0,02% de azida de sódio). 45-

A s plac PBS , e loca is reacti vos à pro rados por i ncu bação dur ante 1 tampão pH 7 ,4 (0,2% de gelati placas re ve stidas de ste modo tampão durante algun s d ias . as s ão 1 avad as ci nco vezes com te in a ai nda prese nte s são s atu h or a a 3 7°C com 250 AJl de um na e 0 ,2 % de NaN3 em PBS ) . As pode m se r ma ntida s a 4 °C ne ste 5 soluç ão de t este ou de no pu r i f ic ad o , 50 μΐ de de an ti c or po MAb 35 ant se al ca 1 in a reconhec end 1: 100 c om ta mpão pH 7,4 va tór io s d as pl ac as de e dur an t e 30 mi nu tos a

Ο μΐ de uma série de diluições de uma uma solução padrão contendo CEA huma-tampão pH 7,4 e 50 μΐ de uma solução i-CEA monoclonal marcado com fosfata-o um epítopo de CEA diferente diluído são misturados e incubados nos reser microtitulação durante 2 horas a 37°C

As placas são lavadas cinco vezes com PBS, sendo então incubadas durante 30 minutos a 37°C com 150 μΐ de uma solução de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em 10% de tampão dietanolamina, MgC^ 0,5 mM, pH 9,8). Medindo a densidade óptica a 405 nm, é determinado a quantidade de p-nitrofenol libertado, a qual é proporcional à quantidade de fosfatase er.zimática ligado e desse modo proporcional à quantidade de CEA na solução do teste. monoclonal O ELISA pode também ser realizado usan do MAb CE 25 marcado com enzima e revestindo as placas de microtitulação com o anticorpo MAb 35 anti-CEA reconhecendo um epítopo de CEA diferente .

5.2 Estojo de teste para ELISA

Um estojo de teste para o ensaio descri_ to no Exemplo 5.1 contem: placas de microtitulação de polipropileno, 20 ml de anticorpo MAb CE25 monoclonal (10 pg/ml) em solução salina tamponada com carbonato (0,9% de NaCl, 0,42% de NaHCO^ 0,0072% de Na2CC>3 , 0,02% de NaN^ ) , 1 ml do anticorpo MAb 35 monoclonal ligado à fosfatase alcalina reconhecendo.^ um epítopo de CEA diferente (0,3 mg de anticorpo por ml) em tampão Tris (0,05 M, MgCl2 1 mM, BSA a 1%, 0,02% de NaN3, pH 8,0), 2 ml de solução padrão contendo 5 ^jg de CEA humano purificado, 300 ml de PBS , 300 ml de tampão pH 7,4 (0,2% de gelatina e 0,2% de NaN3 em PBS ) , 50 ml de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml) em tampão dietano lamina (1 mg/ml), (10% de MgCl2 0,5 mM, 0,02% de NaN3, ajustado para pH 8,9 com HC1), curva de calibração, escala de intensidade da cor, manual de instruções.

Exemplo 6: Preparação farmacêutica para aplicação parentéri- ca -47- -47-

\ 120 mg de anticorpo MAB CE 25 monoclo-nal preparado de acordo com o Exemplo são dissolvidos em 5 ml de solução salina fisiológica. A solução é feita passar através de um filtro bacteriológico, e o filtrado é introduzido numa ampola em condições assépticas. A ampola é preferencialmente armazenada no frio, por exemplo a -20°C.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais específicos em relação ao antigénio carcinoembriónico humano (CEA), e seus derivados, que reconhecem epitopos de CEA não presentes em antigénios NCA^^ ou NCAg5 de reacção cruzada não específicos, na glicoproteina biliar ou nos granulocitos e que se ligam ao CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 í 0,3) x 10"^ litros/mol, caracterizado pelas células do hibridoma que segregam o anticorpo serem multiplicados in vitro ou bn vivo , e, se desejado, os anticorpos resultantes serem convertidos nos seus derivados. o com a reivin-bridoma que se-tonealmente em nte pré-trata-o liquido asci- 2§. - Processo de acord dicação 1, caracterizado por as células do hi gregam o anticorpo serem injectadas intraperi ratinhos Balb/c que tenham sido facultativame dos com um hidrocarboneto, e após 8-10 dias, tico é colhido destes animais. 3 § . - Process o de dicação 1 , caracterizado por se pre parar nal com a designação de MAb CE25, e seus acordo com a o anticorpo derivados. reivin-monoclo 4i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal , caracterizado por o anticorpo monoclonal ser con jugado com um enzima, um marcador fluorescente, um quelato de metal, uma substância citostática, avidina , biotina, e substâncias afins. -49-

   5§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser mar cado radioactivamente. 6§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal , car acterizado por o anticorpo monoclonal ser cli_ vado enzimaticamente ou quimicamente dando origem a um fragmento . 7â. - Linha celular de hibridoma carac terizado por segregar um anticorpo monoclonal especifico em relação ao antigénio carcinoembriónico humano (CEA) reconhecendo epitopos de CEA não presentes no antigénio NCA^^ ou NCAg5 de reacção cruzada não-especificos na glicoproteina biliar ou nos granulocitos, e que se ligam ao CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 ± 0,3) x IO"1·0 litros/mol. 8â. - Linha celular do hibridoma de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ter a designação CE25 . 9-· - Processo para a preparação de uma linha celular de hibridoma de acordo com a reivindicação 7 ou 8 , caracterizado por ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA humano purificado ou com um CEA humano purificado conten do veiculo antigénico, por as células produtoras de anticorpo dos ratinhos Balb/c serem fundidas com células P3-NS2/lAg4, por as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas , e -50- por serem seleccionados os clones celulares que segregam os anticorpos desejados. lOâ. - Processo de acordo com a reivindicação 9 , caracterizado por os ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA purificado extraído com solução salina. composições far especifico em r parados por mei ção 1, caracter do com um veicu lli. - Processo para a preparação de macêuticas contendo um anticorpo monoclonal elação ao CEA humano e/ou seus derivados pre-o de um processo de acordo com a reivindica-izado por ò anticorpo monoclonal ser mistura-lo farmacêutico. em mamíferos , c seus derivados reivindicação 1 numa dosagem de 12ã. - Método para a terapia do cancro aracterizado por um anticorpo monoclonal e/ou preparados por um processo de acrodo com a , serem administrados ao referido mamífero 0,1 a 5 mg por kg do peso corporal. Lisboa, 3 de Janeiro de 1989

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