JPS625999A - フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体Info
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- JPS625999A JPS625999A JP60143850A JP14385085A JPS625999A JP S625999 A JPS625999 A JP S625999A JP 60143850 A JP60143850 A JP 60143850A JP 14385085 A JP14385085 A JP 14385085A JP S625999 A JPS625999 A JP S625999A
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- Japan
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- ferritin
- monoclonal antibody
- iron
- serum
- antibody
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
フェリチンは、すべての真核細胞に見出される分子量約
４５万の蛋白部分と鉄コロイドからなる鉄結合蛋白とさ
れている。
４５万の蛋白部分と鉄コロイドからなる鉄結合蛋白とさ
れている。
組織フェリチンは組織別にサブユニット組成（Ｈ鎖、Ｌ
鎖）が異なり、例えば癌化した肝フェリチンでは、正常
な肝フェリチンにくらべＨ鎖の一占める割合が増大し、
また癌患者血中にもフェリチンが多く出現すると云われ
たことから、血清フェリチン測定の意義が重視されるよ
うになった。
鎖）が異なり、例えば癌化した肝フェリチンでは、正常
な肝フェリチンにくらべＨ鎖の一占める割合が増大し、
また癌患者血中にもフェリチンが多く出現すると云われ
たことから、血清フェリチン測定の意義が重視されるよ
うになった。
血清フェリチンを上昇させる要因として、鉄過剰（貯蔵
鉄としてのフェリチンの増加）、ヘモグロビン鉄の貯蔵
鉄化（鉄欠乏性貧血以外の貧血）、細胞破壊の光通（細
胞内フェリチンの血中放出量増加）、血清フェリチン除
去能の低下（肝、膵障害などによる組織破壊）などがあ
げられている。
鉄としてのフェリチンの増加）、ヘモグロビン鉄の貯蔵
鉄化（鉄欠乏性貧血以外の貧血）、細胞破壊の光通（細
胞内フェリチンの血中放出量増加）、血清フェリチン除
去能の低下（肝、膵障害などによる組織破壊）などがあ
げられている。
したがって、フェリチン内鉄貯蔵状態を鋭敏に検出でき
れば、鉄欠乏状態の直接的指標となり、また肝疾患、悪
性腫瘍、鉄過剰症などの病態を反映する手段となること
が期待される。
れば、鉄欠乏状態の直接的指標となり、また肝疾患、悪
性腫瘍、鉄過剰症などの病態を反映する手段となること
が期待される。
本発明はこのようなフェリチンの検査に有用なモノクロ
ーナル抗体に関するものである。
ーナル抗体に関するものである。
現在既に、フェリチン測定用キットがいくつか市販され
ているが、このキットにはポリクローナル抗体が使用さ
れていた。
ているが、このキットにはポリクローナル抗体が使用さ
れていた。
一方、モノクローナル抗体に関して、了ロージオら（Ｃ
’１ｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １３４巻
、３４７頁、１９８３年）はヒト心臓フェリチンに特異
的に反応する抗体を作製している。また、ヒト膵臓フェ
リチンを抗原とし、心臓、胎盤、膵臓に反応するモノク
ローナル抗体も製造されている。
’１ｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １３４巻
、３４７頁、１９８３年）はヒト心臓フェリチンに特異
的に反応する抗体を作製している。また、ヒト膵臓フェ
リチンを抗原とし、心臓、胎盤、膵臓に反応するモノク
ローナル抗体も製造されている。
ポリクローナル抗体は前記の測定目的で使用するには不
十分なものであった。また、アロージオらのモノクロー
ナル抗体はヒト肝臓、胎盤、膵臓フェリチンとは全く反
応せず、組織内鉄貯蔵状態に対する特異性も明らかでな
い。
十分なものであった。また、アロージオらのモノクロー
ナル抗体はヒト肝臓、胎盤、膵臓フェリチンとは全く反
応せず、組織内鉄貯蔵状態に対する特異性も明らかでな
い。
本発明は前記の背景のもとになされたものであり、とく
に組織別および血清フェリチンの鉄貯蔵状態を的確に反
映するためのモノクローナル抗体を提供することを目的
とするものである。
に組織別および血清フェリチンの鉄貯蔵状態を的確に反
映するためのモノクローナル抗体を提供することを目的
とするものである。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト胎盤フェリチンを
免疫源七し、肝臓、胎盤、膵臓の各組織フェリチンおよ
び血清フェリチンに対し反応性を有し、かつ鉄代謝挙動
を有するととにより特徴づけられるものである。このモ
ノクローナル抗体に、具体的には、肝臓、胎盤、膵臓フ
ェリチンに対し、臓器別に異なる特異性を有１７、かつ
フエＩＪチン内鉄貯蔵状態を識別できることを特徴とす
るモノクローナル抗体とその細胞系（ＩＦ３ ）および
上記の組織フェリチンに対し同じレベルの反応性をもち
、かつ組織内鉄貯蔵状態を反映しないことを特徴とする
モノクローナル抗体とその細胞系（３Ｆ１１ ）を含む
Ｏ 次に、本発明のモノクローナル抗体の性質を示す。
免疫源七し、肝臓、胎盤、膵臓の各組織フェリチンおよ
び血清フェリチンに対し反応性を有し、かつ鉄代謝挙動
を有するととにより特徴づけられるものである。このモ
ノクローナル抗体に、具体的には、肝臓、胎盤、膵臓フ
ェリチンに対し、臓器別に異なる特異性を有１７、かつ
フエＩＪチン内鉄貯蔵状態を識別できることを特徴とす
るモノクローナル抗体とその細胞系（ＩＦ３ ）および
上記の組織フェリチンに対し同じレベルの反応性をもち
、かつ組織内鉄貯蔵状態を反映しないことを特徴とする
モノクローナル抗体とその細胞系（３Ｆ１１ ）を含む
Ｏ 次に、本発明のモノクローナル抗体の性質を示す。
■ 各組織フェリチンとの反応性
モノクローナル抗体ＩＦ３では、肝臓フェリチンに対し
て最も強く、以下順次胎盤フェリチン、膵臓フェリチン
に反応し、各々異なる反応性を示した。一方モツクロー
ナル抗体３Ｆ１１では、上記組織フェリチンに対しては
ほぼ同程度の反応性を示すことから明らかなように、こ
の２種類の抗体が差別されるとともに従来”のモノクロ
ーナル抗体と異なる特徴でもある。
て最も強く、以下順次胎盤フェリチン、膵臓フェリチン
に反応し、各々異なる反応性を示した。一方モツクロー
ナル抗体３Ｆ１１では、上記組織フェリチンに対しては
ほぼ同程度の反応性を示すことから明らかなように、こ
の２種類の抗体が差別されるとともに従来”のモノクロ
ーナル抗体と異なる特徴でもある。
この反応性は、後述するサンｐワイッチ酵累免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ ）で測定して求めたものである。
（ＥＬＩＳＡ ）で測定して求めたものである。
■ 本発明の抗体による鉄代謝試験
フェリチンおよびアポフェリチンの作製および、これら
を用いた鉄代謝試験は、イアンら（ＢｉｏｃｈｅｍＪ、
１３５巻、１３６頁、１９７３年）およびホーリンら（
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、 １４３巻、４４５頁、１９７４
年）の方法に従った。
を用いた鉄代謝試験は、イアンら（ＢｉｏｃｈｅｍＪ、
１３５巻、１３６頁、１９７３年）およびホーリンら（
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、 １４３巻、４４５頁、１９７４
年）の方法に従った。
（、） 胎盤フェリチン内の鉄の放出法は、胎盤フェ
リチｙ （’ ０．１ ”ｍｅ／ｍｌ ） １ ｍｌ
ヲ３”ｌｒ ２ ｆ オｙ Ｍ’ｆ゛トリウム含有酢酸
ナトリウム緩衝液（Ｉ Ｍ 、 ｐＨ４，８）２１中に
加え、室温で胎盤フェリチン内鉄を放出処理した。この
操作により胎盤フエ’ ＩＪチン内鉄量は、処理時間２
ｈｒから６ｈｒＯものでは、未処理（１，０）に対す
る比とし、０．０６から０１０４と著しく減少していた
。これら鉄量を異にする、各フェリチンに対するモノク
ローナｌ Ｉ： Ｘ ル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、モノク
ローナル抗体ＩＦ３では未処理（１００）に対し処理時
間２〜６ ｈｒのフェリチンに対し約７５〜５５であシ
、フェリチン内鉄量とよく対応していた。しかし、モノ
クローナル抗体３Ｆ１１ではこのような対応は認められ
ず、フェリチン内鉄量に依存しなかった。
リチｙ （’ ０．１ ”ｍｅ／ｍｌ ） １ ｍｌ
ヲ３”ｌｒ ２ ｆ オｙ Ｍ’ｆ゛トリウム含有酢酸
ナトリウム緩衝液（Ｉ Ｍ 、 ｐＨ４，８）２１中に
加え、室温で胎盤フェリチン内鉄を放出処理した。この
操作により胎盤フエ’ ＩＪチン内鉄量は、処理時間２
ｈｒから６ｈｒＯものでは、未処理（１，０）に対す
る比とし、０．０６から０１０４と著しく減少していた
。これら鉄量を異にする、各フェリチンに対するモノク
ローナｌ Ｉ： Ｘ ル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、モノク
ローナル抗体ＩＦ３では未処理（１００）に対し処理時
間２〜６ ｈｒのフェリチンに対し約７５〜５５であシ
、フェリチン内鉄量とよく対応していた。しかし、モノ
クローナル抗体３Ｆ１１ではこのような対応は認められ
ず、フェリチン内鉄量に依存しなかった。
（ｂ） 胎盤フェリチン内への鉄の取り込み法は、胎
盤アポフェリチン（０，Ｉ Ｑ／ｍｌ ）に各種濃度の
硫酸第一鉄アンモニウム溶液および酸化剤含有緩衝溶液
等を加え、５分間反応することにより、フェリチン内鉄
量を異にするフェリチンを作製した。このもののフェリ
チン内鉄量は、硫酸第一鉄アンモニウム濃度７．４ ｍ
Ｍにおいて、邑初のアポフェリチン内鉄量に対する比と
して約２０倍量に達していた。この試別に対するＥＬＩ
ＳＡ法によるモノクローナル抗体ＩＦ３の反応性は未処
理アポフェリチン（”’１００ ）に比し約１２０〜１
４０チであり、フェリチン内鉄量とよく対応した結果で
あった。一方モツクローナル抗体３Ｆ１１では、フェリ
チン内鉄量に依存しなかった。
盤アポフェリチン（０，Ｉ Ｑ／ｍｌ ）に各種濃度の
硫酸第一鉄アンモニウム溶液および酸化剤含有緩衝溶液
等を加え、５分間反応することにより、フェリチン内鉄
量を異にするフェリチンを作製した。このもののフェリ
チン内鉄量は、硫酸第一鉄アンモニウム濃度７．４ ｍ
Ｍにおいて、邑初のアポフェリチン内鉄量に対する比と
して約２０倍量に達していた。この試別に対するＥＬＩ
ＳＡ法によるモノクローナル抗体ＩＦ３の反応性は未処
理アポフェリチン（”’１００ ）に比し約１２０〜１
４０チであり、フェリチン内鉄量とよく対応した結果で
あった。一方モツクローナル抗体３Ｆ１１では、フェリ
チン内鉄量に依存しなかった。
このように本発明のモノクローナル抗体は、フェリチン
鉄代謝挙ｖ１を捕える神聖的、特異的なものである。
鉄代謝挙ｖ１を捕える神聖的、特異的なものである。
■ 血清フェリチンとの反応性
本発明のモノクローナル抗体の実用的有効性を明らかに
するため、患者血清を対象に、ＥＬ Ｉ ＳＡ法による
血清フェリチン値を測定した。
するため、患者血清を対象に、ＥＬ Ｉ ＳＡ法による
血清フェリチン値を測定した。
（ａ） 健常者の血清鉄値（５０〜１６０μＥ／ｄＡ
）の範囲に血清鉄値を示す貧血症患者においても、モ
ノクローナル抗体ＩＦ３に対して極めて低い反応性を示
した。
）の範囲に血清鉄値を示す貧血症患者においても、モ
ノクローナル抗体ＩＦ３に対して極めて低い反応性を示
した。
（ｂ）血清フェリチン値が増大すると予想される肝癌、
急性肝炎および肝硬変患者の血清フェリチン値はモノク
ローナル抗体ＩＦ３を用いて測定すると３Ｆ１１を用い
た際に比し高値を示す。しかし、慢性肝炎患者血清では
、両抗体に対して同和の反応性を示した。
急性肝炎および肝硬変患者の血清フェリチン値はモノク
ローナル抗体ＩＦ３を用いて測定すると３Ｆ１１を用い
た際に比し高値を示す。しかし、慢性肝炎患者血清では
、両抗体に対して同和の反応性を示した。
これらの結果は、鉄代謝挙動とよく対応し、また、従来
の臨床的所見とよく対応するものである。
の臨床的所見とよく対応するものである。
なおオフテロニー法による本発明のモノクローナル抗体
のサブクラスはＩＦ３抗体ではＩｇＧ２０ 。
のサブクラスはＩＦ３抗体ではＩｇＧ２０ 。
３Ｆ１１抗体ではＩ ｇＧｌであった。
このような抗体を前述のアロージオらのモノクローナル
抗体と比較すると、アロージオらの抗体はヒト肝臓、胎
盤及び膵臓フェリチンと全く反応しないのに対し、本発
明の抗体はこれらと反応する点で相違している。また、
ヒト牌臓フェリチンを抗原とするモノクローナル抗体に
ついては、この抗体と本発明のモノクローナル抗体を組
み合わせた抑制試験結果から各々異なった抗原部位を認
識していることが明かになった。そこで、本発明者はこ
の抗体を新規なものであると判断するに至った。
抗体と比較すると、アロージオらの抗体はヒト肝臓、胎
盤及び膵臓フェリチンと全く反応しないのに対し、本発
明の抗体はこれらと反応する点で相違している。また、
ヒト牌臓フェリチンを抗原とするモノクローナル抗体に
ついては、この抗体と本発明のモノクローナル抗体を組
み合わせた抑制試験結果から各々異なった抗原部位を認
識していることが明かになった。そこで、本発明者はこ
の抗体を新規なものであると判断するに至った。
本発明のモノクローナル抗体は次のようにして取得する
ことができる。まず、ヒト胎盤フェリチンで免疫したマ
ウス牌臓のリンパ球と、マウス骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ
８−６．５．３ （本細胞は例えば大日本製薬■から販
売されている。）とを細胞融合させることによって、フ
ェリチンに特異性を有するモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドマＩＦ３株と、３Ｆ１１株を取得する。引
き続き該バイブリド１７をシリスタン投与したＢＡＬＢ
／Ｃマウス腹腔内に投与し、目的の抗体を大量に含む腹
水を採取し、さらにこれら腹水を精製すると・とによっ
て本発明のモノクローナル抗体（ＩＦ３ 、３Ｆ１１）
を獲得することができる。
ことができる。まず、ヒト胎盤フェリチンで免疫したマ
ウス牌臓のリンパ球と、マウス骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ
８−６．５．３ （本細胞は例えば大日本製薬■から販
売されている。）とを細胞融合させることによって、フ
ェリチンに特異性を有するモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドマＩＦ３株と、３Ｆ１１株を取得する。引
き続き該バイブリド１７をシリスタン投与したＢＡＬＢ
／Ｃマウス腹腔内に投与し、目的の抗体を大量に含む腹
水を採取し、さらにこれら腹水を精製すると・とによっ
て本発明のモノクローナル抗体（ＩＦ３ 、３Ｆ１１）
を獲得することができる。
本発明のモノクロ−ナノし抗体を用いてフェリチンを測
定するに際しての該抗体への標識物質としては、放射免
疫測定法（ＲＩＡ ）では各種放射性同位元系をそして
螢光免疫測定法では螢光物質を用いることが出来る。ま
た発色団物質を用いる代表 −的例として酵素免疫法が
特にサンドウィッチ酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ ）が有用
である。酵素免疫法の場合のモノクローナル抗体と標識
用酵素との結合法は、中板ら（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ２２巻、１０８４頁、１９７４年
）の方法に準じればよく、標識用酵素としてはノ＜’−
オキシターゼ、アルカリホスファターゼ、アシドホスフ
ァターゼあるいはβ−ガラフトシターゼなどをあげるこ
とができる。また特に組織染色用として用いるときには
、パーオキシターゼが、その個使用試薬との関係で一つ
の好ましい酵素である。
定するに際しての該抗体への標識物質としては、放射免
疫測定法（ＲＩＡ ）では各種放射性同位元系をそして
螢光免疫測定法では螢光物質を用いることが出来る。ま
た発色団物質を用いる代表 −的例として酵素免疫法が
特にサンドウィッチ酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ ）が有用
である。酵素免疫法の場合のモノクローナル抗体と標識
用酵素との結合法は、中板ら（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ２２巻、１０８４頁、１９７４年
）の方法に準じればよく、標識用酵素としてはノ＜’−
オキシターゼ、アルカリホスファターゼ、アシドホスフ
ァターゼあるいはβ−ガラフトシターゼなどをあげるこ
とができる。また特に組織染色用として用いるときには
、パーオキシターゼが、その個使用試薬との関係で一つ
の好ましい酵素である。
本発明のモノクローナル抗体はヒト肝臓、胎盤及び膵臓
の各組織フェリチン並びに血清フェリチンに対して反応
するとともに鉄代謝挙動を有する。
の各組織フェリチン並びに血清フェリチンに対して反応
するとともに鉄代謝挙動を有する。
■ −・イブリッドマの調製
ヒト胎盤フェリチン（１００μ、’７．／ｌ１ｄ）ｔ−
生理食塩水に溶解させ、完全フロイントアジ−パントと
等量混合しエマルジョンとした。これを、ＢＡＬＢ／Ｃ
マウス（雌、８〜１０週令）に１０〜１４日間隔で３回
腹腔内投与し、最後にヒト胎盤フェリチン７５μｇを静
注した。最終免疫から３日後にマウス牌細胞を採取し、
ＲＰＭＩ １６４０培地で３回遠心洗浄を行ったＯ マウスミエローマＸ６３Ａｇ８−６・５・３細７１１Ｒ
ＰＭ１１６４０培地で３回遠心洗浄し、マウス牌細胞と
Ｘ６３Ａｇ８−６・５・３細胞を１０：１で混合して遠
心しく１０） た。沈査の細胞をよくほぐしてから４５チポリエチレン
グリコール３３５０ ＲＰＭＩ溶液１１ｎｌを細胞とよ
く混合しなからゆっ〈シ加えて細胞融合を行わせた。
生理食塩水に溶解させ、完全フロイントアジ−パントと
等量混合しエマルジョンとした。これを、ＢＡＬＢ／Ｃ
マウス（雌、８〜１０週令）に１０〜１４日間隔で３回
腹腔内投与し、最後にヒト胎盤フェリチン７５μｇを静
注した。最終免疫から３日後にマウス牌細胞を採取し、
ＲＰＭＩ １６４０培地で３回遠心洗浄を行ったＯ マウスミエローマＸ６３Ａｇ８−６・５・３細７１１Ｒ
ＰＭ１１６４０培地で３回遠心洗浄し、マウス牌細胞と
Ｘ６３Ａｇ８−６・５・３細胞を１０：１で混合して遠
心しく１０） た。沈査の細胞をよくほぐしてから４５チポリエチレン
グリコール３３５０ ＲＰＭＩ溶液１１ｎｌを細胞とよ
く混合しなからゆっ〈シ加えて細胞融合を行わせた。
さらに、ＲＰＭ１１６４０溶液１５ｍ１を細胞に拳ッ〈
シ滴下して反応を停止させた。遠心後、上清をきれいに
取シ除き、１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ溶液に牌細
胞としてＩ Ｘ １０１０．１ｍｌになるように懸濁さ
せ、９６穴マイクロプレートにＱ、 ｌ ｍｌずつ分注
した。細胞融合の翌日よシ、）ＬＡＴ （ピポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）選択培地を０．１−ず
つ各ウェルに添加し、その後１日毎に培地の半分ｌを新
しい１（ＡＩＮ！培地にて変換した。培養開始７〜１０
日目にいくつかのウェルにハイブリッドマの生育が確認
された。
シ滴下して反応を停止させた。遠心後、上清をきれいに
取シ除き、１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ溶液に牌細
胞としてＩ Ｘ １０１０．１ｍｌになるように懸濁さ
せ、９６穴マイクロプレートにＱ、 ｌ ｍｌずつ分注
した。細胞融合の翌日よシ、）ＬＡＴ （ピポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）選択培地を０．１−ず
つ各ウェルに添加し、その後１日毎に培地の半分ｌを新
しい１（ＡＩＮ！培地にて変換した。培養開始７〜１０
日目にいくつかのウェルにハイブリッドマの生育が確認
された。
ハイブリッドマが十分増殖した時点で、ＲＩＡにより、
目的とするハイブリッドマを検索した。）・イプリッＰ
マが生育しているウェルの上清１００μノを取シテスト
チーーブにそれぞれ分注した。
目的とするハイブリッドマを検索した。）・イプリッＰ
マが生育しているウェルの上清１００μノを取シテスト
チーーブにそれぞれ分注した。
次に、 ■標識胎盤フェリスチン（５０００ａｐｍ／
１チー−プ）１００μノを加え、３７℃、２時間−次
反応させた。反応後、さらに１チマウス正常血清１００
ｐｌＪと抗マウスイムノグロブリン（２次抗体）１０
０μノとを加えて、３７℃、２時間２次反応させた。２
次反応後、各チーーブは３０００回転で１５分間遠心し
て上清を除去し、γ−カウンターにて測定した。
１チー−プ）１００μノを加え、３７℃、２時間−次
反応させた。反応後、さらに１チマウス正常血清１００
ｐｌＪと抗マウスイムノグロブリン（２次抗体）１０
０μノとを加えて、３７℃、２時間２次反応させた。２
次反応後、各チーーブは３０００回転で１５分間遠心し
て上清を除去し、γ−カウンターにて測定した。
抗原と結合力のある抗体を産生じている培養上清を加え
たウェルは、以上の操作で容易に判別でき、ハイブリッ
ドマの検索を行うことができる。
たウェルは、以上の操作で容易に判別でき、ハイブリッ
ドマの検索を行うことができる。
上記ＲＩＡ法により、胎盤フェリチンと反応するノ・イ
ブリッドマを選択し、限界希釈法を用い３回クローニン
グを行うことにより単一クローン抗体産生ハイブリッド
マを取得した。この結果、胎盤フェリチンに特異性を有
する抗体を産生ずるノ・イブリッドマＩＦ３株と３Ｆ１
１株を取得した〇■ モノクローナル抗体の生産 ハイブリッドマＩＦ３株と３Ｆ１１株は、１０チウシ胎
児血清誉有ＲＰＭ１１６４０培地で９６ウエルグレート
、１２ウエルグレート、７５ｃＩｎフラスコとスケール
アップしながら培養し、そのノ・イブリッドマをプリス
タン（２・６・１０・１４−テトラメチル被ンタデカン
）投与したＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内に投与して大量に
抗体を生産させた。ハイブリッドマは１０〜１４日間で
腹水腫瘍を形成し、腹水中に高濃度の抗体が生産された
。腹水は５０％硫安分画後、ＤＥＡＥセルロースイオン
交換クロマトグラフィーによって精製することにより高
純度のモノクローナル抗体ＩＦ３および３Ｆ１１をえた
。
ブリッドマを選択し、限界希釈法を用い３回クローニン
グを行うことにより単一クローン抗体産生ハイブリッド
マを取得した。この結果、胎盤フェリチンに特異性を有
する抗体を産生ずるノ・イブリッドマＩＦ３株と３Ｆ１
１株を取得した〇■ モノクローナル抗体の生産 ハイブリッドマＩＦ３株と３Ｆ１１株は、１０チウシ胎
児血清誉有ＲＰＭ１１６４０培地で９６ウエルグレート
、１２ウエルグレート、７５ｃＩｎフラスコとスケール
アップしながら培養し、そのノ・イブリッドマをプリス
タン（２・６・１０・１４−テトラメチル被ンタデカン
）投与したＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内に投与して大量に
抗体を生産させた。ハイブリッドマは１０〜１４日間で
腹水腫瘍を形成し、腹水中に高濃度の抗体が生産された
。腹水は５０％硫安分画後、ＤＥＡＥセルロースイオン
交換クロマトグラフィーによって精製することにより高
純度のモノクローナル抗体ＩＦ３および３Ｆ１１をえた
。
■ 酵素免疫測定法と各組織フェリチンの測定ヒト胎盤
、肝臓、膵臓フェリチンは、ダル口過法、セファロース
６Ｂカラム法、ＣＭ 、 ＤＥＡＥセルロースカラム法
などの操作によって精製した。これら組織フェリチンの
反応性は、本発明抗体とそれに対応するパーオキシター
ゼ標識本発明抗体とのＥＬＩＳＡ法によって行なった。
、肝臓、膵臓フェリチンは、ダル口過法、セファロース
６Ｂカラム法、ＣＭ 、 ＤＥＡＥセルロースカラム法
などの操作によって精製した。これら組織フェリチンの
反応性は、本発明抗体とそれに対応するパーオキシター
ゼ標識本発明抗体とのＥＬＩＳＡ法によって行なった。
すなわち、本発明抗体を予め１０μｆｌ／ｆｒｔｌに炭
酸水素ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ 、 ｐＨ９，５’
）に溶解させ、ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに１０
０μノずつ添加し、室温で一晩放置し固相を作製した。
酸水素ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ 、 ｐＨ９，５’
）に溶解させ、ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに１０
０μノずつ添加し、室温で一晩放置し固相を作製した。
次に上記抗体を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）で３回洗浄後、１俤ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）
含有ＰＢＳを２００μｌを加えて、室温で１時間靜診し
、抗原の結合していない部位をＢＳＡでブロックした。
）で３回洗浄後、１俤ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）
含有ＰＢＳを２００μｌを加えて、室温で１時間靜診し
、抗原の結合していない部位をＢＳＡでブロックした。
次に１９１＋ ＢＳＡ含有ＰＢＳを捨て０．０５チツイ
ーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、既知の濃度に調製し
た各組織フェリチン（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで各組織
フェリチンを２から２５０ｎシ舒までの濃度に順次調製
したもの）を１００μノずつ加えて室温で３時間放置し
、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
ーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、既知の濃度に調製し
た各組織フェリチン（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで各組織
フェリチンを２から２５０ｎシ舒までの濃度に順次調製
したもの）を１００μノずつ加えて室温で３時間放置し
、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
それから、固相に対応するパーオキシターゼ標識本発明
抗体を１００μノ加えて室温で２時間放置し、０．０５
％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、酵素の基質（
オルトフェニレンジアミン）を２００ ｐｉずつ加えて
発色させた後、６Ｎ硫酸５０μノずつ加えて反応を停止
した。
抗体を１００μノ加えて室温で２時間放置し、０．０５
％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、酵素の基質（
オルトフェニレンジアミン）を２００ ｐｉずつ加えて
発色させた後、６Ｎ硫酸５０μノずつ加えて反応を停止
した。
その結果、モノクローナル抗体ＩＦ３を用いた場合は、
第１図に示すように肝臓フェリチンに対し最も強く反応
し、以下順次胎盤フェリチン、膵臓フェリチンと反応し
、上記組織フェリチンによって異なる反応性が示された
。
第１図に示すように肝臓フェリチンに対し最も強く反応
し、以下順次胎盤フェリチン、膵臓フェリチンと反応し
、上記組織フェリチンによって異なる反応性が示された
。
またモノクローナル抗体３Ｆ１１を用いた場合には、第
２図のように、肝臓、胎盤、膵臓フェリチンのいずれと
も同等の反応性が示された。尚、第１図及び第２図にお
ける黒丸は肝臓フェリチン、二重力は胎盤フェリチンそ
して白丸は膵臓フェリチンについて測定した結果をそれ
ぞれ示している。
２図のように、肝臓、胎盤、膵臓フェリチンのいずれと
も同等の反応性が示された。尚、第１図及び第２図にお
ける黒丸は肝臓フェリチン、二重力は胎盤フェリチンそ
して白丸は膵臓フェリチンについて測定した結果をそれ
ぞれ示している。
■ 鉄代謝試験
（、） 胎盤フェリチン内の鉄の放出方法は、胎盤フ
ェリチン（０，１１１！＆）を２１の３チ２チオン酸ナ
トリウム含有酢酸す） ＩＪウム緩衝ｉ （Ｉ Ｍ、ｐ
Ｈ４，８）中に加えて室温で０．１〜６時間反応させる
ことにより、胎盤フェリチン内鉄を放出させた。放出後
１、それぞれの胎盤フェリチンは蒸留水で一晩透析し遊
離している鉄を除去した。上記各胎盤フェリチンは、分
光光度ｉｉＯＤ＝４２０ｎｍ（Ｅ””＝１００）のｆｉ 吸光度でフェリチン内鉄ｌ°を測定すると、第１表のよ
うに、フェリチン内鉄量は時間とともに減少していた。
ェリチン（０，１１１！＆）を２１の３チ２チオン酸ナ
トリウム含有酢酸す） ＩＪウム緩衝ｉ （Ｉ Ｍ、ｐ
Ｈ４，８）中に加えて室温で０．１〜６時間反応させる
ことにより、胎盤フェリチン内鉄を放出させた。放出後
１、それぞれの胎盤フェリチンは蒸留水で一晩透析し遊
離している鉄を除去した。上記各胎盤フェリチンは、分
光光度ｉｉＯＤ＝４２０ｎｍ（Ｅ””＝１００）のｆｉ 吸光度でフェリチン内鉄ｌ°を測定すると、第１表のよ
うに、フェリチン内鉄量は時間とともに減少していた。
このような操作によって得られたそれぞれのアポフェリ
チンを材料とし、■および■の方法によって得られた２
種類のモノクローナル抗体との反応性を比較検討した。
チンを材料とし、■および■の方法によって得られた２
種類のモノクローナル抗体との反応性を比較検討した。
これらの反応性は■に記したＷＬＩＳＡ法によった。
その結果、第１表に示すようにモノクローナル抗体３Ｆ
１１の場合では、フェリチン内鉄量に依存せずにいずれ
のフェリチンに対してもその反応性は全く変化しなかっ
た。
１１の場合では、フェリチン内鉄量に依存せずにいずれ
のフェリチンに対してもその反応性は全く変化しなかっ
た。
また、モノクローナル抗体ＩＦ３の場合では、上記フェ
リチン内の鉄貯蔵量が低下していくにつれてその反応性
は低下していった。
リチン内の鉄貯蔵量が低下していくにつれてその反応性
は低下していった。
（ｂ） 胎盤フェリチン内への鉄の取シ込み方法とし
ては、ｌ ｍｌの胎盤アポフェリチン（０，１■／コ）
に種々の濃度の硫酸第一鉄アンモニウム（０，０７４〜
７．４ｍＭ ） ｌ ｒｎｌを加えた。次にこの溶液に
ヨウ素酸カリウム（３，７ｍＭ ）とチオ硫酸ナトリウ
ム（１４，３ｍＭ ）含有イミダゾール緩衝液（１８，
５ｍＭ 、 ｐＨ７，４５）１−を加えて５分間反応さ
せた後、蒸留水に透析し、遊離の鉄を除去した。
ては、ｌ ｍｌの胎盤アポフェリチン（０，１■／コ）
に種々の濃度の硫酸第一鉄アンモニウム（０，０７４〜
７．４ｍＭ ） ｌ ｒｎｌを加えた。次にこの溶液に
ヨウ素酸カリウム（３，７ｍＭ ）とチオ硫酸ナトリウ
ム（１４，３ｍＭ ）含有イミダゾール緩衝液（１８，
５ｍＭ 、 ｐＨ７，４５）１−を加えて５分間反応さ
せた後、蒸留水に透析し、遊離の鉄を除去した。
このような操作によって得られたフェリチン内鉄量の異
なる胎盤フェリチンを材料とし、■に記載の方法に従っ
てＥＬＩＳＡ法によってモノクローナル抗体の反応性を
比較検討した。その結果、第２表に示すようにモノクロ
ーナル抗体３Ｆ１１の場合は上記いずれの７エリチンに
対してその反応性はほとんど変化しなかった。
なる胎盤フェリチンを材料とし、■に記載の方法に従っ
てＥＬＩＳＡ法によってモノクローナル抗体の反応性を
比較検討した。その結果、第２表に示すようにモノクロ
ーナル抗体３Ｆ１１の場合は上記いずれの７エリチンに
対してその反応性はほとんど変化しなかった。
また、モノクローナル抗体ＩＦ３の場合では胎盤フェリ
チン内への鉄量が増加するにつれてその反応性は上昇し
ていった。
チン内への鉄量が増加するにつれてその反応性は上昇し
ていった。
■ 血清フェリチンの測定
貧血患者（ヘモグロビン値が１２．０以下の患者）およ
び各種肝疾患を対象としモノクローナル抗体ＩＦ３およ
び３Ｆ１１を用いてそれぞれの血清フェリチン値を調べ
た。血清フェリチン値は■に記載の組織フェリチンの代
りに血清を被検検体とした以外は全く同様な方法で測定
した。標準フェリチンとしては、肝フェリチン（２〜２
５０ｎｇ／−までの濃度に順次調製したもの）を、また
はそれと同時に被検血清を加えて血清フェリチン値を測
定した。
び各種肝疾患を対象としモノクローナル抗体ＩＦ３およ
び３Ｆ１１を用いてそれぞれの血清フェリチン値を調べ
た。血清フェリチン値は■に記載の組織フェリチンの代
りに血清を被検検体とした以外は全く同様な方法で測定
した。標準フェリチンとしては、肝フェリチン（２〜２
５０ｎｇ／−までの濃度に順次調製したもの）を、また
はそれと同時に被検血清を加えて血清フェリチン値を測
定した。
（ａ） 第３表に示すように貧血患者の血清フェリチ
ン値は、モノクローナル抗体ＩＦ３をｍ−て測定したフ
ェリチン値がモノクローナル抗体３Ｆ１１を用いて測定
したそれに比べて低下していた。
ン値は、モノクローナル抗体ＩＦ３をｍ−て測定したフ
ェリチン値がモノクローナル抗体３Ｆ１１を用いて測定
したそれに比べて低下していた。
また、バソフェロントロリン法によって測定した血清鉄
値が正常域から高値を示す（５０〜１６０μｇ／ｄｌ）
貧血症例においてもモノクローナル抗体ＩＦ３を用いて
測定したフェリチン値はモノクローナル抗体３Ｆ１１の
を用いて測定したフェリチン値に比べて全て低値を示し
た。
値が正常域から高値を示す（５０〜１６０μｇ／ｄｌ）
貧血症例においてもモノクローナル抗体ＩＦ３を用いて
測定したフェリチン値はモノクローナル抗体３Ｆ１１の
を用いて測定したフェリチン値に比べて全て低値を示し
た。
第３表 貧血患者における血清鉄値とフェリチン値（ｂ
） 肝疾患の場合では、第３図のごとく血清フェリチ
ン量が増大すると予想される肝癌、急性肝炎の症例にお
いてモノクローナル抗体ＩＦ３を用いて測定したフェリ
チン値はモノクローナル抗体３Ｆ１１を用いて測定した
それに比べ著明々増加が示され、また肝硬変の症例にお
いてもモノクローナル抗体ＩＦ３のフェリチン値がモノ
クローナル抗体３Ｆ１１のそれに比べ増加が示された。
） 肝疾患の場合では、第３図のごとく血清フェリチ
ン量が増大すると予想される肝癌、急性肝炎の症例にお
いてモノクローナル抗体ＩＦ３を用いて測定したフェリ
チン値はモノクローナル抗体３Ｆ１１を用いて測定した
それに比べ著明々増加が示され、また肝硬変の症例にお
いてもモノクローナル抗体ＩＦ３のフェリチン値がモノ
クローナル抗体３Ｆ１１のそれに比べ増加が示された。
これに対し、慢性肝炎では、両者にほとんど差が認めら
れなかった。
れなかった。
このように本発明のモノクローナル抗体は、各各特徴を
有し、特に両抗体の特性の利用によって、貧血および鉄
過剰症患者の血中フェリチン内貯蔵状態を明確に調査で
き、また、肝炎の急性期や肝細胞ならびに弊細胞壊死時
期でのフェリチンの血中への漏出などを検出することが
できるなど、臨床検査における試薬として極めて有用で
ある。
有し、特に両抗体の特性の利用によって、貧血および鉄
過剰症患者の血中フェリチン内貯蔵状態を明確に調査で
き、また、肝炎の急性期や肝細胞ならびに弊細胞壊死時
期でのフェリチンの血中への漏出などを検出することが
できるなど、臨床検査における試薬として極めて有用で
ある。
第１図は、モノクローナル抗体ＩＦ３を用いた各組織フ
ェリチンの反応性を示しており、第２図は、モノクロー
ナル抗体３Ｆ１１を用いた各組織フェリチンの反応性を
示している。 第３図は各種肝疾患の血清を材料とし、酵素免疫測定法
によって血清フェリチン値を測定したものである。 特許出願人 株式会社スベシアルレファレンスラＲラ
トリー代 理 人 弁理士 １）中 政 浩 第１図 入ソテンｊ（虜しくｎｇ７ｍｔ） 手続補正書（自発） 昭和６０年１０月２４日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １事件の表示 特願昭６０−１４３８５０号 ２発明の名称 フェリチンに対する新規なモノクローナル抗体３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 名称株式会社 スペシアル レファレンス ラボラト
リ−４代理人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三丁目２１番３−６
０７号電話（０３）５５５−００２２ 氏名 弁理士（８５１０） １） 中 政°
浩５補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄及び図面６補正の内容 （１）明細書の記載を以下の通シに補正する。 補正個所 誤 正２頁８行
「貯蔵鉄」 「鉄貯蔵蛋白質」５頁１３行 ｒ３％
２Ｊ ｒ３チ亜２」〃１８行 ｒ（１，０）Ｊ
ｒ（１，０）Ｊ７頁１８行 「程の反」 「程
度の反」８頁２行 ｒ ＩｇＧ２０ Ｊ ｒ Ｉ
ｇＧ２ｂ Ｊ９頁１３行 「免疫法」 「免疫測定
法」〃１４行 〃 〃（２ケ所
共） 〃２０行 「フトン」 「クトシ」１１頁２行
ｒＲＰＭＩＪ ｒＲＰＭＩ １６４０Ｊ〃 ６
行 〃 〃 〃１９行 「リスチン」 「リチン」１３頁１１行
ｒ ＣＭ 、 ＤＥＡｇ Ｊ ｒ ＣＭ％ＤＥＡ
Ｂ Ｊ１５頁９行 「３％２」 「３チ亜２」２０
頁９行 「同時に」 「同様に」２２頁１２行
「肺細胞」 「胚細胞」（２〕 第１図及び第２図
を別紙の通りに補正する。
ェリチンの反応性を示しており、第２図は、モノクロー
ナル抗体３Ｆ１１を用いた各組織フェリチンの反応性を
示している。 第３図は各種肝疾患の血清を材料とし、酵素免疫測定法
によって血清フェリチン値を測定したものである。 特許出願人 株式会社スベシアルレファレンスラＲラ
トリー代 理 人 弁理士 １）中 政 浩 第１図 入ソテンｊ（虜しくｎｇ７ｍｔ） 手続補正書（自発） 昭和６０年１０月２４日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １事件の表示 特願昭６０−１４３８５０号 ２発明の名称 フェリチンに対する新規なモノクローナル抗体３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 名称株式会社 スペシアル レファレンス ラボラト
リ−４代理人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三丁目２１番３−６
０７号電話（０３）５５５−００２２ 氏名 弁理士（８５１０） １） 中 政°
浩５補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄及び図面６補正の内容 （１）明細書の記載を以下の通シに補正する。 補正個所 誤 正２頁８行
「貯蔵鉄」 「鉄貯蔵蛋白質」５頁１３行 ｒ３％
２Ｊ ｒ３チ亜２」〃１８行 ｒ（１，０）Ｊ
ｒ（１，０）Ｊ７頁１８行 「程の反」 「程
度の反」８頁２行 ｒ ＩｇＧ２０ Ｊ ｒ Ｉ
ｇＧ２ｂ Ｊ９頁１３行 「免疫法」 「免疫測定
法」〃１４行 〃 〃（２ケ所
共） 〃２０行 「フトン」 「クトシ」１１頁２行
ｒＲＰＭＩＪ ｒＲＰＭＩ １６４０Ｊ〃 ６
行 〃 〃 〃１９行 「リスチン」 「リチン」１３頁１１行
ｒ ＣＭ 、 ＤＥＡｇ Ｊ ｒ ＣＭ％ＤＥＡ
Ｂ Ｊ１５頁９行 「３％２」 「３チ亜２」２０
頁９行 「同時に」 「同様に」２２頁１２行
「肺細胞」 「胚細胞」（２〕 第１図及び第２図
を別紙の通りに補正する。
Claims (3)
- （１）ヒト胎盤フェリチンを免疫源とし、ヒト肝臓、胎
盤、膵臓の各組織フェリチンおよび血清フェリチンに対
し反応性を有し、かつ鉄代謝挙動を有することにより特
徴づけられたモノクローナル抗体 - （２）前記モノクローナル抗体がこれを産生するハイブ
リッドマ細胞系の形態にある特許請求の範囲第１項記載
のモノクローナル抗体 - （３）直接的あるいは間接的に放射性物質、螢光物質、
または発色団物質により標識された特許請求の範囲第１
項記載のモノクローナル抗体
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60143850A JPS625999A (ja) | 1985-07-02 | 1985-07-02 | フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60143850A JPS625999A (ja) | 1985-07-02 | 1985-07-02 | フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS625999A true JPS625999A (ja) | 1987-01-12 |
| JPH058678B2 JPH058678B2 (ja) | 1993-02-02 |
Family
ID=15348411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60143850A Granted JPS625999A (ja) | 1985-07-02 | 1985-07-02 | フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS625999A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6212857A (ja) * | 1985-07-10 | 1987-01-21 | Green Cross Corp:The | 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 |
| JP2008509410A (ja) * | 2004-08-12 | 2008-03-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 肝線維症の診断方法 |
| CN111875696A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-03 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种纯化Ferr的方法 |
-
1985
- 1985-07-02 JP JP60143850A patent/JPS625999A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6212857A (ja) * | 1985-07-10 | 1987-01-21 | Green Cross Corp:The | 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 |
| JP2008509410A (ja) * | 2004-08-12 | 2008-03-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 肝線維症の診断方法 |
| CN111875696A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-03 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种纯化Ferr的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH058678B2 (ja) | 1993-02-02 |
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