JPS6378066A - Ｆｄｐの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発ＥＡは、１種類のモノクロ−カル抗体を利用したフ
ィブリン分解産物（以下ＦＤＰと記す）中のＤダイマー
もしくはＤダイマーの立体構造を保持する分画の測定法
に関するものである。さらに詳細にはヒトフィブリノー
ダン又はフィブリンのプラスミン分解物中のＤモノマー
もしくはＤダイマーあるいはＤモノマーもしくはＤダイ
マーの立体構造を保持する分画と抗原抗体反応するモノ
クローナル抗体をポリスチレンラテックスに固定化する
ことにより検体中のフィプリノーデン、Ｘ分画およびＹ
分画とは反応せず、Ｄモノマー又はＤモノマーの立体構
造を保持する分画とは反応しても凝集せず、Ｄダイマー
もしくはＤダイマーの立体構造を保持する分画とだけさ
せることによるフィブリノ−ダン量、Ｘ分画借、Ｙ分画
涜に影響されない定量法であり、検体中のＤダイマーお
よびＤダイマーの立体構造を保持する分画の定量のだめ
の診断試薬として有用である。

「従来の技術」 近年、血栓・塞栓により死亡する基礎疾患が増加する傾
向にある。血栓形成の機作にはいまだに不明なことが多
いけれども、血栓形成の臨床診断法は血栓症の増加につ
れて進歩している。現在、ＦＤＰ中のＤダイマー等の定
：千的測定に抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗
体を感作したポリスチレンラテックス粒子を用いた凝集
法が一般的に用いられている。しかし、この方法は、検
体中にフィブリノ−ダンＸ分画およびＹ分画の混庄があ
ると疑似的にＦＤＰが陽性となる。このような疑似陽性
反応をなくすため、検体は完全に脱フィブリノーダン脱
Ｘ分画、脱Ｙ分画されることが要求される。けれども、
このような操作は非常に煩雑であり、緊急性を要する臨
床診断薬として適幽でない。一方、臨床的にはフィブリ
ノ−ダンの存在下でもＦＤＰ中のＤダイマー等を特異的
にかつ簡便に測定する方法ならびにその試薬の開発が期
待されていた。この諸問題を克服する目的で本発明者ら
は鋭意研究し本発明を完成するに至った。

「問題点を解法するための手段」 すなわち、本発明はヒトフィブリノーゲンのプラスミン
分解中のＤモノマーおよびヒトフィブリンのプラスミン
分解物中のＤダイマー又はＤモノマーあるいはＤダイマ
ーの立体（４′４造を保持する分画とは反応するけれど
もフィブリノ−ダン、Ｘ分画、Ｙ分画およびｅａｒｌｙ
　Ｄとは反応しない性質を有する″１種類″の抗Ｄダイ
マー、Ｄモノマーモノクローナル抗体を固定化したポリ
スチレンラテックス粒子と検体とを接触させ、該粒子と
検体中のＤダイマー又はＤダイマーの立体構造を保持す
る分画を選択的に凝集させることを特徴とするＦＤＰ中
のＤダイマー又はＤダイマーの立体構造を保持する分画
を測定するＦＤＰの測定法に関する。

近年合方１■で応用されている細胞融合法により、後述
する「モノクローナル抗体の製造」に記載した如くシて
フィブリノ−ダンＸ分画およびＹ分画と反応しない新奇
な抗Ｄダイマー、Ｄモノマーモノクローナル抗体を得、
これ会ラテックス凝集法に適用することにより、フィブ
リノ−ダン、Ｘ分画およびＹ分画の存在下でも正確に検
体中のＦ’ＤＰ中のＤダイマー等の１を測定することを
可能にした。

本発明の原理は、ＤダイマーおよびＤダイマーの立体構
造を保持する分画ある１ハはＤモノマーおよびＤモノマ
ーの立体構造を保持する分画と反応する″１種類”の抗
Ｄダイマー、Ｄモノマーモノクローナル抗体を感作した
ポリスチレンラテックス粒子を用いて、検体中のＤダイ
マーおよびＤグイマーの立体構造を保持する分画を定量
する逆受身凝集反応である。すなわち、後述の「モノク
ローナル抗体の製造」に記載のＤＤ／Ｄ−１のモノクロ
ーナル抗体ヲポリスチレンラテックス粒子の懸濁溶液（
ｐｉｆ８．０）に添加し、ＤＤ／Ｉ）−１、抗Ｄダイマ
ー。

Ｄモノマーモノクローナル抗体感作ポリスチレンラテッ
クス粒子を調製する。この抗体感作ラテックス粒子はＤ
ダイマーおよびＤダイマーの立体構造を保持する分画あ
るいはＤモノマーおよびＤモノマーの立体構造を保持す
る分画の両方と抗原抗体反応を起すが、凝集はＤダイマ
ーおよびＤダイマーの立体構造を保持する分画との間の
反応にのみ生ずるという特異な性質を有している。従っ
て前記感作ラテツクスの一定量と検体の一定量をスライ
ド板あるいはマイクロタイタープレート上で一定時間混
和した後、凝集像の有無あるいは強弱を観察し検体中の
ＤダイマーおよびＤダイマーの立体構造を保持する分画
の量を判定することができる。あるいは、感作ラテツク
スの一定量と検体の一定量を混合し、一定時間後の吸光
度の増大会適当な波長で分光学的に測定することによシ
検体中のＤダイマーおよびＤダイマーの立体構造を保持
する分画の着を定量することができる。本発明に使用す
るポリスチレンラテックス粒子は市販のものが使用でき
、その粒径は０．１〜０．８μｍを使用するのが望ｌし
い。なお、本発明に使用できる抜検体としては血漿、血
清、尿等が使用可能である。

本発明に用いられるフィプリノーケ゛ンＸ分画およびＹ
分画と反応しない新規な抗ダイマー、Ｄ七ツマ−モノク
ローナル抗体は以下のようにして得られる。

抗りダイマーＤモノマーモノクローナル抗体は新規なマ
ウス・ハイブリドーマをそれぞれ培地またはマウスの腹
腔内で培養することによって製造できる。ここで用いる
マウス・ハイブリドーマは一般的にはＤダイマーで免疫
したマウスの牌臓細胞とマウス骨ｕｉ種細胞とを、Ｋ？
１ｈｌｅｒｂよびＭｉｌｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方
法（ｎａｔｕｒｅ第２５６巻４９５頁（１９７５年）参
照〕により細胞融合して製造することが可能である。詳
細には、下記製造例に述べる如くである。

また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適
にはダルベツコ比変法イーグル氏ｍｉｎ１ｍｕｍ　ｅｓ
ｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ以下ＤＭＥと記す。）に
ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および
抗性物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む
培地が用いられる。

上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合に
は５チＣＯ２濃度、３７℃で約３日間、またマウスの腹
腔内で培養する場合には約１４日間で行なわれる。

このようにして製造された培養液またはマウスの腹水か
ら、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。

そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ダルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。

製造例Ｉ Ｄダイマーおよび（ＤＤ）　Ｅの調製方法Ｄダイマーの
調製去：′よ、主に５ｔｅｐｈａｎｌｅ　Ａ　。

０１　ｅ：ｔａとＡｎｄｒｅｔ　Ｚ　、　Ｂｕｄｚｙｎ
ｓｋｉの方法、（１９７８）Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、
５ｕｐｐ１．５８　＋　１１９　＋　０１ｅｘａ　ｅｔ
　ａｌ、の方法＋　（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　５７６　、　：Ｈ）−５０フ
ィブリノ−ダン（カビ社、スウェーデン）２０ｑ（１０
ｎ？／ｍｅ　）に、ヒトトロンビンレよび塩化カルシウ
ムをそれぞれ終＃既１０単位／ｉ、１ｏｍｂｘとなるよ
うに加え、３７℃２時間反応させフィブリノ−ダンをフ
ィブリンに変換させた。１８０００ｘｇ。

３０分遠心しフィブリンを非凝固性物質から分離した。

フィブリンは２０−のＱ、　１５　Ｍ　トＩＪスー塩酸
緩衝液（１”　７．８　）　−ｓ　ｍＭ塩化カルシウム
−０，０２４ＮａＮ５液に浮遊させる。浮遊液にヒトプ
ラスミン（１単位／　ｒｒｌ　、ミドす十字社）を１時
間毎Ｖｃ　０．５ゴ添加した。１０時間後、アゾロｆ　
＝　ｙ　（ＭｏｌｔａｙＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、
　）を２００単位加えて分解反応を停止させた。容量１
０−のりノンセファロースカラムに通過させプラスミン
を除去した。

次に、通過数を前もって５０ｍ＋ＭトＩＪス塩酸緩衝液
（ｐ）１７．ｓ　）　−０，１５Ｍ塩化ナトリウム−５
ｍＭ塩化カルシウム溶液で平衡化したセファロースＣＬ
６Ｂ（ファルマシャ社、スウェーデン）のカラム（直径
２．６　ｃｍ長さ９０閏）に充てんした。前記の溶液で
展開する分子ふるいクロマトグラフィーを行った。分子
量マーカーおよび抗り、抗Ｅ抗血清（ヘキスト社、ドイ
ツ）を用いるオフテロニー法により（ＤＤ）Ｅ複合体の
分画を同定、分離した。このようにして得られた（ＤＤ
）Ｅ１合体ｉ３Ｍ尿素−５０ｍＰｖｉクエン酸（ｐＪ１
５．５）溶液中で３７℃４時間保温する。次に５０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（Ｆ”７．４）−２８ｍＭクエン酸
ナトリウム−０，１Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化した
セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（直径２．６　ｃｍ　
、長さ９０１）に充てんし、上記の溶液で展開した。分
子１＃マーカーと抗り、抗Ｅ抗血清を用いたオフテロニ
ー法により、Ｄダイマー　（ＤＤ）分画とＥ　、　（Ｅ
）分画を同定、分離した。

Ａ　２８０　ｎｍ”’　２．０のＤダイ？−１０−を得
た。このようにしてＷ＋７１したＤダイマーは免疫原と
して、また抗りダイマーモノクローナル抗体産生性ハイ
プリトーマを選別するためのエンディムイムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）用抗原として使用する。

製造例２ （、）　　免疫化した肺臓細胞の調製：上記のＤダイマ
ー免疫原溶液（Ａ　２８０　ｎｍ＝２．０　）を等量の
フロイント氏完全アジーバントと乳化するまで混合し、
その混合液１００μｌをマウス腹腔内に投与することに
より免疫を行なった（第１回免疫）。３０日経過後、該
マウスに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した（
第２回免疫）。

第２回免疫から２１日経過後、Ｄダイマー免疫原溶液（
Ａ　２８０　ｎｍ＝２．０　）を等量の生理食塩水で希
釈し、その希釈液１００μｊを、該マウスの静脈内に投
与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、肺臓細
胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。

（ｂ）　　細胞融合： 無菌的に摘出した上記の膠原を、１０〜１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地５−を入れたシャーレに入れる。

次に、膠原を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培
地約１５１ｎｔで還流して牌細胞を流出させた後、この
牌細胞懸濁液をナイロンメツシュに通す。この牌細胞を
５０４遠心チユーブに集めて５００　Ｘ　ｇ　ｒ　１０
分間遠心する。こうして得たペレットに３〜５−のへモ
ライジング溶液（１５５ｍＭ　ＮＨａＣｌ　、　１０　
ｍＭ　ＫＨＣＯ３，１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　ｐＨ７，
０）を加え、懸濁させる。０℃で５〜１０分間放置する
と懸濁液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍｊの１
０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから
遠心分離する。このようにして得た細胞ペレットをＤＭ
Ｅ培地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細胞数を
測定する。

一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエロー
マ細胞）ＳＰ２１０−Ａｇ１４約２Ｘ１０’個に１×１
０　個の上記牌細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し
、遠心分離を行なった（　５００　Ｘ　ｇ　＊１０分間
）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３
８℃に保温しておいた４０チポリエチレングリコール４
０００溶液０．５　ｒｎｔを滴下し、遠心テー−プを手
で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレン
グリコール浴液と細胞ペレットを混合させた。次に、３
８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１−加
えてチューブを穏やかに回転させる。この操作を１０回
繰り返した後、２０〜３０ｍ１の１０〜１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００Ｘｇ
。

１０分間）を行なった、上清を除去し死後、細胞ペレッ
トを１０〜１５チウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭ
Ｅ培地にアミノプテリン４Ｘ１０　’Ｍ　、チミン７１
．６Ｘ１０　　Ｍ、ヒボキサンチ／ｌＸｌ０　　Ｍにな
るように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄後
、４０ｍ１の上記ＨＡＴ培地に懸濁する。

この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウェ
ルに２００　ｐｉずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを
含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。

培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地を約１００μｌ
除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えること
によｐ　ＨＡＴ培地中で増殖するハイグリドーマを選択
した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨ
Ｔ　培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６Ｘ１０　’Ｍ、
ヒポキサンチンｌＸｌ０−’Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイグリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０日月に、下達のＥＬＩＳＡ法により、抗Ｄモ
ノマーかつＤダイマー抗体産生ハイプリドーマをスクリ
ーニングした。

（Ｃ）　　ハイツリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養土溝中の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用グレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ　■＊日本ダイナチック株式会社）の
各ウェルに、前述の精製Ｄダイマー溶液（Ａ２８０ｎｍ
＝　０．０５−生理食塩水で希釈した。）を５０Ａｌず
つ分注し、２５℃で２時間放置した。次に０．０５％Ｔ
ｗｓｅｎ　２０−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウェ
ルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させ
た。

次にＴｗｅｅｎ　２０−生理食塩水で２００倍希釈した
ベルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社。

ダンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後
、０．０５　％　Ｔｗ＠ｅｎ　２０−生理食塩水で各ウ
ェルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１
０ｍ１フエノールおよび０．００５％過酸化水素水を含
む溶液２５０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間
反応させ各ウェルの４９０　ａｍにおける吸光度を測定
した。その結果、１９２ウエル中１２ウエルに抗体産生
が認められた。

上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗
Ｄダイマー抗体が、Ｄモノマー、フラグメ／トＸ、フラ
グメントＹ、フラグメントＥおよびフィブリノ−ダンと
反応するか否かを上記の抗原を感作した９６ウエルＥＬ
ＩＳＡ用ゾＶ−）を用いて上記と同様の方法で測定した
。その結果Ｄダイマーと反応した１２ウエルの培養上清
中、１ウエルの培養上清がＤモノマーと反応した。他の
１１ウエルの培養上清はＤモノマー、フラグメントＸ、
フラグメントＹおよびフィブリノ−ダンのすべてに反応
した。

Ｄダイマー、Ｄモノマーに特異的に反応するウェル中の
ハイプリドーマ２４ウエルプレートに移し、１０〜１５
チウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。

その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗Ｄダイマー、Ｄモ
ノマー抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によ
りクローニングした。

限界希釈法はＨＴ培地でハイプリドーマが５個／ｄとな
るように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ
系マウスの腹腔細胞がウェルあたす２Ｘ１０’個分注し
である９６ウエルプレートの各ウェルに１００μｌずつ
分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって抗Ｄダイ
マー、Ｄモノマー抗体を産生ずるハイプリドーマのクロ
ーンをスクリーニングＬ７’Ｃ０その結果、２０個の抗
体産生クローンが得られた。

これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の
高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様の方法
で再クローン化を行い、抗Ｄダイマー、Ｄモノマー特異
的抗体産生ハイプリドーマＤルΦ−１を樹立した。

製造例３（モノクローナル抗体の製造）（インビトロ法
）マウスハイプリドーマＤＤ／１）−１を１５チラシ胎
児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃、５チ二酸化炭素雰囲
気中７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離後（１
００００Ｘｇ、１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニ
ウムを５０チ最終濃度となるように徐々に加えた。混合
物を水冷下３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分
離（１００００Ｘｇ、１０分）後、得られた沈渣を少清
の１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）に溶解し
、１０００倍量の１０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液に対して
透析した。これを、１０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液ですでに平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＪ
（８，０）と０゜２　Ｍ　ＮａＣ４を含む１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐ）（８，０）の間で濃度勾配法により行な
った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で漉
網し、０．ＩＭリン酸緩衝戚（ｐｉ（８，０）に対して
透析した。ウシ血清ＩＦＧを除くために、透析物をやぎ
抗ウシ血清１．９Ｇ−セファロース４Ｂのカラムに通し
た。次ンこ通過液を０．１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐｉ
（８，０）で平衡化し之グロテインＡ−セファロース４
Ｂのカラムに充填した。カラムをＰＨ３，５の緩衝液で
溶出して、精製した抗Ｄダイマー、Ｄモノマニ特異抵抗
、　ＤＤ／１）−１を得た。

（イン・ビデ法） プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５−を１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マ
ウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマ日月肢腔内に
インビトロで増殖させたハイプリドーマＤＤ／Ｄ−１を
マウス−匹あたり２×１０　細胞となるように接種した
。

一匹のマウスから約ｌＯ〜１５−の腹水が得られた。そ
の抗体濃度は、５〜１０■／−であった。

腹水中のモノクローナル抗体の８Ｍは、（但し、ヤギ抗
ウシ血清１．？Ｇ−セファロース４Ｂのカラムを通す操
作を除く。）上記のインビトロ精製法と同様の方法で行
なった。

製造例４（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定） 抗Ｄダイマー、Ｄモノマー特異モノクローナル抗体ＤＤ
／Ｄ−１の免疫グロブリン・クラスをオフテロニー免疫
拡散法により行った。結果は表１にじめす通りでめる。

表１ 製造例５　（モノクローナル抗体の認識部位の同定）モ
ノクローナル抗体、　ＤＤ／Ｄ−１の認識部位の同定は
ウェスターンプロ、ティング法によって行なった。

実験操作は主に、バイオ・ラッド社、アメリカＺｅｔａ
−Ｐｒｏｂｅ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
　ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭａｎｎｕａｌによ９行なっ
た。実験操作の概要は次のようである。

フィブリノ−ダンをＣａ　　あるいはＥＧＴＡの存在下
でプラスミン処理を行ない、３０分、６０分、２４時間
反応後のフィブリノ−ダンの分解物を、ＤＴＴ（−′）
チオスレイトール）存在２よびノμ存在下でＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動を行なった。上記の方法でプロ
ッティング、エンデイムイムノアッセイを行ない、この
結果と５ＤＳ４？リアクリルアミドダルのクマノー・ブ
リリアント・ブルーＧ−２５０による蛋白染色の結果か
ら、モノクローナル抗体ＤＤ／Ｄ−１の認識部位の同定
を行なった。フィブリノ−ダンおよび８製Ｄダイマー、
　（ＤＤ）ＩＩＥに対しても上記と同様の方法で行なっ
た。結果は表２に示すとおシである。

表　２　　モノクローナル抗体ＤＤ−１、０−１、Ｆ−
１の種々な抗原との結合反応性 ＋：結合反応性、有 一二結合反応性、無 「実施例」 以下、実施例により本発明を更に説明する。

実験例１　：感作ポリスチレンラテックス粒子の調製平
均粒径０．２２μｍのポリスチレンラテックス粒子（日
本合成ゴム製）の１０チ懸濁液をトリス緩衝液（２０ｍ
Ｍ　トリス塩酸緩衝液−５０ｍＭ塩化ナトリウム）を用
いて遠心分離法（３００００Ｘｇ、３０分間）によって
２回洗浄した後、同緩衝液で１多懸濁液になるよう希釈
した。先に特許出願した特願昭６１−　　　　号に記載
した抗ヒトＤダイマー。

Ｄモノマーモノクローナル抗体Ｄ　Ｄ／Ｄ　−１を上記
のトリス緩衝液に透析した後、同緩衝液で０．６η／−
の濃度にした。１％ポリスチレンラテックス粒子の懸濁
液と上記抗ヒトＤダイマー、Ｄモノマーモノクローナル
（ＤＤ／Ｄ−１）溶液を１：１の容量比で混合した後、
２５℃で３時間放置することにより感作ポリスチレンラ
テックス粒子を調製した。ポリスチレンラテックス粒子
に吸着されなかった未反応のモノクローナル抗体は遠心
分離法（３００００ｘｇ。

３０分間）によって除去した。感作ボリスチレンラテッ
クスは遠心分離法（３００００Ｘｇ、３０分間）によっ
て上記のトリス緩衝数で２回洗浄した後、０．１チ中血
清アルブミンおよびｏ、ｏｉ％ツイーン２０を含むトリ
ス緩衝液に慝濁し１％懸濁液とした。この１チ懸濁液を
ラテックス凝集用試薬とした。

実験例２　ニスライド凝集法による測定ラテックス凝集
用試薬２０μ！、被検体４０μｌをガラス製スライド上
で混和し２分間揺動した後凝集の有無を判定した。結果
は表３に示した。

表　３ 注１；数字は検体の希釈倍数を表わし、該希釈倍数址で
凝集があった。

注２　：　ＤＩＣ：　ｄｌｓｓｅｍｌｎａｔｅｄ　ｉｎ
ｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　：血
管内血栓症候群注３；検体の希釈溶液’ｌ　ＯｍＭ　Ｉ
Ｊン醒級衝渣−０，１５Ｍ塩化ナトリウム（）１１１７
．２）実験例３　：分光学的方法による測定 ＬＰＩＡＴ、−１（三菱化成社２日本）を用・ハて正常
人、ＤＩＣ患者の同一人由来の血漿および血清検体中の
ＤダイマーもしくはＤダイマーの立体＋４造を保持する
分画の清を測定し、血漿検体および血清検体中のＤダイ
マー等の測定値の相関を調べた。スタンダードはＤＤＥ
を使用した。

表４　　　ＬＰＩＡ　Ｌ−１による正常人、ＤＩＣ患者
の血漿％−よび血清検体の測定値（ｎ　ｇ、／ｒ、４　
ｐ　ＤＤＥをスタンダードとする） 血清　　血漿 煮１　　２８２０　　２５９０ １２　　３１７０　　３！１０ 血清　　血漿 検体（血清あるいは血漿）ＳＯμｌを含む反応容器に１
％ラテ、クス５０μｌ　、　ト１ｊス緩衝液（〆１８．
０）２００μ！を注入後、１分間の吸光度変化を７００
ｎｒｎで測定し、その吸光度変化の測定値から検体中の
ＤＤＥを定量した。結果は表４、第１図にしめした。相
関係数ｒ＝０．９９４４という非常に良好な相関をしめ
した。なお、第１図においてＮ＝３３．回帰式ｙ＝−３
３，５＋０．９４７３ｘ 「発明の効果」 以上から明らかな如く、本発明によれはフィブリノ−ダ
ン、Ｘ分画およびＹ分画を含む検体においても前記のフ
ィブリノ−ダン、Ｘ分画、Ｙ分画の含量に関係なく検体
ＦＤＰ中のＤダイマー又はＤダイマーの立体構造を保持
する分画を正確且つ簡便に定量測定することが可能とな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿中Ｄダイマー等の濃度と血清中Ｄダイマー
等の濃度との相関を示すグラフ図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解中のＤモ
   ノマーおよびヒトフィブリンのプラスミン分解物中のＤ
   ダイマー又はＤモノマーあるいはＤダイマーの立体構造
   を保持する分画とは反応するけれどもフィブリーノーゲ
   ン、Ｘ分画、Ｙ分画およびｅａｒｌｙＤとは反応しない
   性質を有する“１種類”の抗Ｄダイマー、Ｄモノマーモ
   ノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス
   粒子と検体とを接触させ、該粒子と検体中のＤダイマー
   又はＤダイマーの立体構造を保持する分画を選択的に凝
   集させることを特徴とするＦＤＰ中のＤダイマー又はＤ
   ダイマーの立体構造を保持する分画を測定するＦＤＰの
   測定法。
2. （２）上記のモノクローナル抗体が抗原決定基を１つだ
   けもつＤモノマーもしくはＤモノマーの立体構造をもつ
   分画とは凝集することなく抗原抗体反応し、抗原決定基
   を２つもつＤダイマーもしくはＤダイマーの立体構造を
   もつ分画と選択的に凝集を生じる抗原抗体反応をする特
   許請求の範囲第１項記載の測定法。
3. （３）前記凝集物の生成速度を目視あるいは分光学的に
   測定し、前記試料中における前記ＤダイマーもしくはＤ
   ダイマーの立体構造をもつ分画の半定量あるいは定量的
   に測定する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
   。