JPS6373152A - エラスタ−ゼ１の免疫学的測定方法及び測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は膵臓疾患診断に有用な、生体液中に含まれる膵
外分泌蛋白分解酵素エラスターゼ１の免疫学的測定方法
及び測定用試薬に関するものである。

膵臓の疾患は各汗検査法が進歩した現在でも診断の困難
な疾患であるといわれている。その理由は膵臓が腹腔内
の最深奥に位置するため、触診、視診、聴診等の古典的
診断法及びＸ線検査等では疾患の存在あるいは疾患の性
質の把握は困難であること、また膵疾患の臨床症状が他
の消化器系疾患と類似していること、および簡便で確実
な検査法がないことなどである。

膵疾患の生化学的な診断は古くからアミラーゼを測定し
て行われていたが、（１）慢性膵炎では、血中アミラー
ゼは極期以外に高値を示すことは少な（、また尿中アミ
ラーゼ測定もさほど実用性がなく、慢性膵炎診断には適
当でない、（２）急性膵炎では、血中、尿中アミラーゼ
は高値を示すが、発症後高値を示す期間が短く、測定時
期を逸すると診断ができない、（３）アミラーゼは膵臓
以外の臓器からも産生さね、膵疾患以外でも血中アミラ
ーゼ景は異常を示すため、血中アミラーゼの測定は膵疾
患のスクリーニング検査法として特異性に欠け、充分な
ものとはいえない、などの理由から膵疾患の新しい生化
学的診断法の開発が望まれていた。

エラスターゼは、結合織の弾力線維エラスチンを特異的
に加水分解する４外分泌蛋白分解酵素の総称であり、こ
れには２種類が存在し、これらは互いに物理化学的に、
酵素学的に、また抗原性の面から異なっており、酸性に
荷電したエラスターゼをエラスターゼ１、塩基性に荷電
したエラスターゼをエラスターゼ２と呼んでいる。

エラスターゼ１量の測定は、まず酵素学的な方法により
試みられたが、主として次の理由により成功するには至
らなかった。つまり感度が不十分であり、しかも血中に
は多量の蛋白分解酵素のインにビターが存在するため活
性型の酵素が血中に入ると瞬間的にこれらのインとビタ
ーが結合して酵素活性が失われる。さらに、基質を用い
る酵素活性測定法ではエラスターゼ以外の酵素の影響を
受けるので、特異性に欠ける。このような理由から次に
酵素を免疫学的方法により測定してみようという試みが
なされた。免疫学的活性の有無は、酵素学的活性の有無
とは異なり、エラスターゼ・インヒビターであるａ２−
マクログ四プリンと結合した複合体は免疫学的活性をも
っていないが、α１−アンチトリプシンと結合した複合
体は免疫学的活性をもっている。しかし標識抗原を用い
ろ免疫学的測定法によっても血液検体中のエラスターゼ
・インヒビターが標識抗原と結合するため標識抗原の抗
原性の一部または殆どが消失し、免疫学的活性が阻害さ
れ血中エラスターゼ１の正確な定景は不可能であった。

これに対し、犬山は標識抗原を抗原エラスターゼ１の合
成インヒビターであるＤＦＰ　（ジイソプロピルフルオ
ロホスフェート）で前処理し、標識抗原をＤＦＰでマス
クすることにより血中のエラスターゼ・インヒビターが
標識抗原に結合できないようにした（特公昭５９−２５
１８３）。ＤＦＰのエラスターゼ１への結合自体はエラ
スターゼ１の抗原活性に何ら変化を与えないので体液内
エラスターゼ１濃度を免疫学的に測定することが可能と
なったのである。

しかし、犬山の方法も体液中のエラスターゼ１の測定法
として満足できるものではなかった。何故なら、従来の
抗体はエラスターゼ１の種々の抗原決定基を認識するも
のであり、エラスターゼ１とａ−アシチドリプシンとの
結合部分（図１．Ｃ）、あるいは結合部分の近縁（図１
．Ｄ）を認識する抗体も存在する。従って、従来の抗原
ラスターゼ１抗体中にはａ　−アンチトリプシンがエラ
スターゼ１に結合している場合には全く反応できないか
、著しく反応性の低い抗体も含まれているためその力価
が低く、感度的に問題があった。また抗体の製造ロット
によりエラスターゼ１、特にａ　−アンチトリプシンと
エラスターゼ１との複合体に対する抗体の結合性に大き
な差が生じ、エラスターゼ１の測定値に変動が起こるた
め、製造管理の面で大きな障害となっていた。

また、膵癌のようなα１−アンチトリプシンが増加する
疾患においては、遊離のエラスターゼ１とａ　−アンチ
トリプシンが結合しているエラスターゼ１の両者を合わ
せたエラスターゼ１をｆｆｉ？とするよりも、α　−ア
ンチトリプシンが結合しているエラスターゼ１だけを指
標とした場合の方がその正常値からの上昇率は強調され
て表現されるため異常を見つけ易くなると考えられ、そ
のため、エラスターゼ１と（１１−アンチトリプシンと
の結合部（図１．Ｂ）を認識するモノクローナル抗体の
開発が待たれていた。

本発明はエラスターゼ１及びエラスターゼ１とａ！−ア
ンチトリプシンとの複合体に対するモノクローナル抗体
を用いる体液中のエラスターゼ１の測定法及び測定用試
薬を提供するものである。本発明者らはエラスターゼ１
とα　−アンチトリプシンとの結合部から離れた部位に
ある抗原決定基（図１、Ａ）を認識するモノクローナル
抗体を得、ａ−アンチトリプシンと結合しているエラス
ターゼ１に対しても遊離のエラスターゼ１とほぼ同等の
反応性を示す、感度面において非常に改良された、正確
な体液中のエラスターゼ１の測定法を確立すると共に、
抗体の安定な供給を確保したものである。さらに本発明
者らはエラスターゼ１とａ　−アンチトリプシンとの結
合部（図１．Ｂ）をＨするモノクローナル抗体を得るこ
とに成功し、α　−アンチトリプシン結合エラスターゼ
１を特異的に測定することにより、特に癌の診断法とし
て優れた測定系を確立した。

本発明によるエラスターゼ１の測定は、エラスターゼ１
に対する上記モノクローナル抗体に対して、被検検体中
のエラスターゼ１と、合成インにビターまたばａ　−ア
ンチトリプシンを結合させた標識エラスターゼ１とを競
合反応させた後、抗エラスターゼ１モノクローナル抗体
に結合した標識エラスターゼ１と結合していない標識エ
ラスターゼ１とを適当な方法で分離ＣＢ／Ｆ分１ＩＩ）
シ、分画の一方または両者の標識剤の活性を測定し、別
に被検検体の代わりに濃度既知の標準エラスターゼ１に
ついて同様に操作して作成した標準曲線により測定すべ
きエラスターゼ１の量を求めるものである。

エラスターゼ１に対するモノクローナル抗体は、哺乳動
物、例えばマウスをエラスターゼ１で免疫し、該マウス
より摘出した抗体産生細胞、例えば脚元細胞に、骨髄腫
細胞やエプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）など
を融合させ、永久増殖能を与え、得られた融合細胞より
目的とするモノクローナル抗体を産生ずる細胞をクロー
ニングするＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎの細胞融合
法により得ることができる。エラスターゼ１とａ　−ア
ンチトリプシンとの結合部（図１．Ｂ）を認識するモノ
クローナル抗体はα１−７ンチトリプシン結合エラスタ
ーゼ１を免疫することにより取得することも可能である
が、α１−アンチトリプシンには種特異性がないためマ
ウスをエラスターゼ１で免疫した際、マウス血中のα　
−アンチトリプシンがエラスターゼ１に結合し、そのた
めエラスターゼ１とａ　−アンチトリプシンとの結合部
（図１．Ｂ）を認識するモノクローナル抗体をも作られ
てくる。

標識エラスターゼ１の標識剤としては、放射性同位元素
、酵素、螢光物質あるいは発光物質など標識剤として通
常用いられているものを使用することができる。これら
の標識剤によるエラスターゼ１の標識化は公知の方法、
例えばクロラミン−Ｔ法や過ヨウ素酸法により行うこと
ができる。

Ｂ／Ｆ分離は、ＰＥＧ法、２抗体編、固相法など既知の
方法により行うことができる。

被検検体としては、血液の他、尿、膵液、胸水、腹水な
どを用いることができる。

合成インヒビターとしては、ジイソプロピルフルオロホ
スフェートの他に、フェニルメタンスルホニルフルオラ
イドやパラクロロマーキュリ−ベンゾエートを使用する
こともできる。また、α１−アンチトリプシンが結合し
たエラスターゼ１だけを特異的に測定するために抗エラ
スターゼ１モノクローナル抗体として、エラスターゼ１
とα１−アンチトリプシンとの結合部（図１．Ｂ）を認
識するモノクローナル抗体を用いろ場合には合成インヒ
ビターに代えてα　−アンチトリプシンを結合させた標
識エラスターゼ１を用いなければならないことば特記す
るまでもない。

本発明に用いる測定用試薬キットは、 （ｉ）　　合成インヒビターまたはα１−アンチトリプ
シンを含有する緩衝液 （＋１）　　標識エラスターゼ１ （ｊｉ）　　標準エラスターゼ１ ０ψ　抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を含有して
なる。抗エラスターゼ１モノクローナル抗体は単一の抗
原決定基を認識するものであるが、これらの混合物を用
いることもできる。

さらにエラスターゼ１の抗原決定基の異なる部位を認識
する二種以上のモノクローナル抗体を用いて、サンドイ
ツチ法により被検検体中のエラスターゼ１を測定するこ
ともできる。すなわち、固相に結合させた抗エラスター
ゼ１モノクローナル抗体に被検検体中のエラスターゼ１
を結合させた後、固相に結合している抗エラスターゼ１
モノクローナル抗体とはその認識部位を異にする抗エラ
スターゼ１モノクローナル抗体を標識剤で標識して得た
標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を反応させ、
（固相化抗体）−（エラスターゼ１）−（標識抗体）の
サンドイッチ型抗原抗体複合物を形成させ、該抗原抗体
複合物上の標識剤あるいは溶液中の標識剤の活性を測定
し、別に被検検体の代わりに濃度既知の標準エラスター
ゼ１について同様に操作して作成した標準曲線により、
測定すべき被検検体中のエラスターゼ１の量を求めるも
のである。固相としては力゛ラス、ポリスチレン、ナイ
ロン、濾紙など固相として慣用されているものを用いる
ことができる。固相の形状は棒状、プレート状、チュー
ブ状、ビーズ状などであって良い。サンドイツチ法に用
いる測定用試薬キットは（ｉ）　　固相化抗エラスター
ゼ１モノクローナル抗体 （ｉｉ）　　標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体
−標準エラスターゼ１ を含有してなる。

固相化抗体あるいは標識抗体のいずれか一方に、エラス
ターゼ１とａ　−アンチトリプシンとの結合部（図１．
Ｂ）を認識するモノクローナル抗体を用いることにより
、ａ　−アンチトリプシンが結合しているエラスターゼ
１を特異的に測定することができる。

エラスターゼ１は膵臓に特異的な酵素であるので種々の
膵臓疾患診断への応用が可能である。特に急性膵炎の診
断、その経過観察及び膵癌のスクリーニングとして有用
である。

次に実施例により本発明を説明するが本発明の本質はエ
ラスターゼ１にα１−アンチトリプシンが結合した複合
体においてもエラスターゼ１とほぼ同等の交叉反応性を
示す抗エラスターゼ１モノクローナル抗体あるいはエラ
スターゼ１とα１−アンチトリプシンとの結合部を認識
するモノクローナル抗体を用いろことを特徴とする体液
中のエラスターゼ１の測定方法及び該抗エラスターゼ１
モノクローナル抗体にあるのであってす下の実施例ニよ
って本発明が限定されるものではない。

実施例　１ 抗エラスターゼ１モノクローナル抗体の作製情製エラス
ターゼ１溶液０．１ｗｒｌ　（２５μｇ含有）に　′フ
ロイント・コンプリート・アジュバント０．１ｍｌを加
え、エマルジョンを調整した。このエマルジョン０．２
ｍｊをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。１ケ月後
エラスターゼ１溶液０．２ｒｍｌ　（５０μｇ含有）を
尾静脈より静注した。３日後層殺し牌摘出を行い、胛細
胞ｌＸｌ０”ケとマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１株）
２Ｘ１０’ケをＰＥＧ５０％存在下で細胞融合を行わせ
た。９６ｗｅ１１プレート１０枚に各（１１ｗα１を播
き、ＨＡＴ培地で２週間培養した後、培養土清中の抗体
検定を行った。抗体陽性豐ｅｌｌより限界希釈法により
り党−ニングを行い、抗体産生株を選別した。得られた
モノクローナル抗体産生株Ｉ　Ｘ　１０’ケを予めプリ
スタンを投与したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの腹腔に接
種し、２週間後に腹水を採取した。

実施例　２ エラスターゼ１の　　Ｉによる標識 、ａ＋２＠　Ｉ約３００μＣｉを採取し、リン！ｉＩ緩
衝液を加えてｐＨを７．５に調整した。エラスターゼ１
　５０μｇを加えて攪拌後クロラミンＴ（１■／＋ｍ７
）２５μｍ１ｇ添加、３０秒間振とう反応させた後、メ
タ重亜硫酸ナトリウム（１■／ｍｊ）１００μＩを加え
、反応を停止させた。標識反応液をセファデックスＧ−
２５カラム（ＩＸ３０ｃｍ）に添加し、リン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）で溶出し、遊離の′Ｉを除去して１′Ｉ標
識エラスターゼ１を回収した。

実施例　３ 競合法による血中エラスターゼ１の定型エラスターゼ１
標準液又は被検血清１００μｌに１２６１標識工ラスタ
ーゼ１液１００μ１１抗エラスターゼ１モノクローナル
抗体液１００μ看および牛γ−グロブリン（１０＋ａｇ
／　ｍｌ　）１００μ！を加え、室温で一昼夜インキユ
ペーションした。２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　液１　ｍ　ｌを加
え、撹拌混和後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、
上清をデカンテーション除去後、残った沈澱の放射能を
測定した。

エラスターゼ１標準液の測定により得られた値より作成
された標準曲線（図２）より被検血清中のエラスターゼ
１濃度を求めた。

実施例　４ 固相化抗エラスターゼ１抗体の作製 抗エラスターゼ１モノクローナル抗体含有腹水に硫酸ア
ンモニウム粉末を４０％飽和となるよう添加溶解した。

析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩衝液（ｐ
　）１７．５）に溶解し、γ−グロブリン液とした。ポ
リスチレンピーズ１個当たり２μｇ７０．３ｍ　ｌの７
−グロブリン液を加え、室温で一昼夜振とうした。未反
応のγ−グロブリンを生理食塩水にて洗浄除去し、抗体
吸着ビーズを作製した。

実施例　５ 抗エラスターゼ１モノクローナル抗体の１２５Ｉによる
標識 抗エラスターゼ１モノクローナル抗体含有腹水に硫酸ア
ンモニウム粉末を４０％飽和となるよう添加溶解した。

析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，５）に１■／　ｒｍ　ｌとなるよう溶解してγ
−グロブリン液をｐ４な。

Ｎａ“２６Ｉ約３００μＣｉを採取し、リン酸緩衝液を
加えてｐＨを７５にＴＡ整した。上記γ−グロブリン液
ｌｌ１ｌを加えて攪拌後、クロラミンＴ（１ｍｇ／腫１
）２５μｌを添加、３０秒間振どう反応後、メタ重亜硫
酸ナトリウム（１ｗ＠／　ｍｌ　）１００μｌを加え、
反応を停止させた。標識反応液をセファデックスＧ−２
５カラム（ＩＸ３０ｃｆｆＩ）に添加し、リン酸緩衝液
（ｐＨ７５）で溶出し、遊離の１２５１を除去して”’
　Ｉ　ｍ識エラスターゼ１モノクローナル抗体を回収し
た。

実施例　６ サンドイツチ法による血中エラスターゼ１の定量エラス
ターゼ１標準液または被検血清１００μ−に固相化抗体
ビーズ１個を加え、室温で振とうしながら２時間インキ
ュベーションした。生理食塩水でビーズを３回洗浄後　
１２！ｉ　■標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体
液２００μｌを加え、室温で振とうしながら２時間イン
キュベーションした。生理食塩水でビーズを３回洗浄後
ビーズの放射能を測定した。

エラスターゼ１標準液を測定し得られた値より作成した
標準曲線（図３）により被検血清中のエラスターゼ１濃
度を求めた。

【図面の簡単な説明】

図１はａ　−アンチトリプシンが結合したエラスターゼ
１の抗原決定部位を模式的に描いたものである。 図２は競合法による血中エラスターゼ１３Ｑｌ定の標準
曲線であり、図３はサンドイツチ法による血中エラスタ
ーゼ１測定の標準曲線である。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定すべき被検検体中のエラスターゼ１と合成イ
   ンヒビターあるいはα＿１−アンチトリプシンで処理し
   た標識エラスターゼ１を抗エラスターゼ１モノクローナ
   ル抗体に対して競合反応させ、次に抗エラスターゼ１モ
   ノクローナル抗体に結合した標識エラスターゼ１と結合
   していない標識エラスターゼ１とを分離しそれらの分画
   の一方または両方の標識剤の活性を測定し、別に被検検
   体の代わりに濃度既知の標準エラスターゼ１について同
   様に操作して作成した標準曲線により測定すべき被検検
   体中のエラスターゼ１の量を求めることからなるエラス
   ターゼ１の免疫学的測定方法。
2. （２）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体がエラスタ
   ーゼ１とα＿１−アンチトリプシンとの結合部から離れ
   た部位にある抗原決定基を認識するものである特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体として１種
   または２種以上のモノクローナル抗体の混合物を用いる
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）合成インヒビターがジイソプロピルフルオロホス
   フェート、フェニルメタンスルホニルフルオライドある
   いはパラクロロマーキュリーベンゾエートである特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体がエラスタ
   ーゼ１とα＿１−アンチトリプシンとの結合部を認識す
   るものであり、標識エラスターゼ１がα＿１−アンチト
   リプシンと結合している特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。
6. （６）標識剤が放射性同位元素、酵素、螢光物質あるい
   は発光物質である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
7. （７）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に結合した
   標識エラスターゼ１と結合していない標識エラスターゼ
   １の分離をＰＥＧ法、二抗体法あるいは固相法により行
   う特許請求の範囲第１項に記載の方法。
8. （８）固相に結合させた抗エラスターゼ１モノクローナ
   ル抗体に被検検体中のエラスターゼ１を結合させた後、
   固相に結合している抗エラスターゼ１モノクローナル抗
   体とはその認識する部位を異にする抗エラスターゼ１モ
   ノクローナル抗体を標識剤で標識して得た標識抗エラス
   ターゼ１モノクローナル抗体を反応させ、（固相化抗体
   ）−（エラスターゼ１）−（標識抗体）のサンドイッチ
   型抗原抗体複合物を形成させ、該抗原抗体複合物上の標
   識剤または／および溶液中の標識剤の活性を測定し、別
   に被検検体の代わりに濃度既知の標準標識エラスターゼ
   １について同様に操作して作成した標準曲線により測定
   すべき被検検体中のエラスターゼ１の量を求めることか
   らなるエラスターゼ１の免疫学的測定方法。
9. （９）固相に結合した抗エラスターゼ１モノクローナル
   抗体及び標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体がエ
   ラスターゼ１とα＿１−アンチトリプシンとの結合部か
   ら離れた部位にある抗原決定基を認識するものである特
   許請求の範囲第８項に記載の方法。
10. （１０）固相に結合した抗エラスターゼ１モノクローナ
    ル抗体あるいは標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗
    体の一方がエラスターゼ１とα＿１−アンチトリプシン
    との結合部から離れた部位にある抗原決定基を認識する
    ものであり、他の一方がエラスターゼ１とα＿１−アン
    チトリプシンとの結合部を認識するものである特許請求
    の範囲第８項に記載の方法。
11. （１１）標識剤が放射性同位元素、酵素、螢光物質ある
    いは発光物質である特許請求の範囲第８項に記載の方法
    。
12. （１２）エラスターゼ１とα＿１−アンチトリプシンと
    の結合部から離れた部位にある抗原決定基を認識するこ
    とを特徴とするエラスターゼ１に対するモノクローナル
    抗体。
13. （１３）エラスターゼ１とα＿１−アンチトリプシンと
    の結合部を認識することを特徴とするエラスターゼ１に
    対するモノクローナル抗体。
14. （１４）哺乳動物をエラスターゼ１で免疫して得た該哺
    乳動物の抗体産性細胞と継代培養可能な細胞とを融合さ
    せる細胞融合法により取得する特許請求の範囲第１２項
    あるいは第１３項に記載のモノクローナル抗体。
15. （１５）哺乳動物がマウスである特許請求の範囲第１４
    項に記載のモノクローナル抗体。
16. （１６）継代培養可能な細胞がマウスの骨髄腫細胞ある
    いはＥＢウィルスである特許請求の範囲第１４項に記載
    のモノクローナル抗体。