JP2617299C

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Publication number: JP2617299C
Authority: JP
Original assignee: ダイナボツト株式会社
Publication date: 1999-08-23

Description

【発明の詳細な説明】本発明は膵臓疾患診断に有用な、生体液中に含まれる膵外分泌蛋白分解酵素エ
ラスターゼ１の免疫学的測定方法に関するものである。膵臓の疾患は各種検査法が進歩した現在でも診断の困難な疾患であるといわれ
ている。その理由は膵臓が腹腔内の最深奥に位置するため、触診、視診、聴診等
の古典的診断法及びＸ線検査等では疾患の存在あるいは疾患の性質の把握は困難
であること、また膵疾患の臨床症状が他の消化器形疾患と類似していること、お
よび簡便で確実な検査法がないことなどである。膵疾患の生化学的な診断は古くからアミラーゼを測定して行われていたが、（
１）慢性膵炎では、血中アミラーゼは極期以外に高値を示すことは少なく、また
尿中アミラーゼ測定もさほど実用性がなく、慢性膵炎診断には適当でない、（２
）急性膵炎では、血中、尿中アミラーゼは高値を示すが、発症後高値を示す期間
が短く、測定時期を逸すると診断ができない、（３）アミラーゼは膵臓以外の臓
器からも産生され、膵疾患以外でも血中アミラーゼ量は異常を示すため、血中ア
ミラーゼの測定は膵疾患のスクリーニング検査法として特異性に欠け、充分なも
のとはいえない、などの理由から膵疾患の新しい生化学的診断法の開発が望まれ
ていた。エラスターゼは、結合織の弾力線維エラスチンを特異的に加水分解する膵外分
泌蛋白分解酵素の総称であり、これには２種類が存在し、これらは互いに物理化
学的に、酵素学的に、また抗原性の面から異なっており、酸性に荷電したエラス
ターゼをエラスターゼ１、塩基性に荷電したエラスターゼをエラスターゼ２と呼
んでいる。エラスターゼ１量の測定は、まず酵素学的な方法により試みられたが、主とし
て次の理由により成功するには至らなかった。つまり感度が不十分であり、しか
も血中には多量の蛋白分解酵素のインヒビターが存在するため活性型の酵素が血
中に入ると瞬間的にこれらのインヒビターが結合して酵素活性が失われる。さらに、基質を用いる酵素活性測定法ではエラスターゼ以外の酵素の影響を受けるの
で、特異性に欠ける。このような理由から次に酵素を免疫学的方法により測定し
てみようという試みがなされた。免疫学的活性の有無は、酵素学的活性の有無と
は異なり、エラスターゼ・インヒビターであるα₂−マクログロブリンと結合し
た複合体は免疫学的活性をもっていないが、α₁−アンチトリプシンと結合した
複合体は免疫学的活性をもっている。しかし標識抗原を用いる免疫学的測定法に
よっても血液検体中のエラスターゼ・インヒビターが標識抗原と結合するため標
識抗原の抗原性の一部または殆どが消失し、免疫学的活性が阻害され血中エラス
ターゼ１の正確な定量は不可能であった。これに対し、大山は標識抗原を抗原エ
ラスターゼ１の合成インヒビターであるＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフ
エート）で前処理し、標識抗原をＤＦＰでマスクすることにより血中のエラスタ
ーゼ・インヒビターが標識抗原に結合できないようにした（特公昭５９−２５１
８３）。ＤＦＰのエラスターゼ１への結合自体はエラスターゼ１の抗原活性に何
ら変化を与えないので体液内エラスターゼ１濃度を免疫学的に測定することが可
能となったのである。しかし、大山の方法も体液中のエラスターゼ１の測定法として満足できるもの
ではなかった。何故なら、従来の抗体はエラスターゼ１の種々の抗原決定基を認
識するものであり、エラスターゼ１とα₁−アンチトリプシンとの結合部分（図
１，Ｃ）、あるいは結合部分の近縁（図１，Ｄ）を認識する抗体も存在する。従
って、従来の抗エラスターゼ１抗体中にはα₁−アンチトリプシンがエラスター
ゼ１に結合している場合には全く反応できないか、著しく反応性の低い抗体も含
まれているためその力価が低く、感度的に問題があった。また抗体の製造ロット
によりエラスターゼ１、特にα₁−アンチトリプシンとエラスターゼ１との複合
体に対する抗体の結合性に大きな差が生じ、エラスターゼ１の測定値に変動が起
こるため、製造管理の面で大きな障害となっていた。また、膵癌のようなα₁−アンチトリプシンが増加する疾患においては、遊離
のエラスターゼ１とα₁−アンチトリプシンが結合しているエラスターゼ１の両
者を合わせたエラスターゼ１を指標とするよりも、α₁−アンチトリプシンが結
合しているエラスターゼ１だけを指標とした場合の方がその正常値からの上昇率は強調されて表現されるため異常を見つけ易くなると考えられ、そのため、エラ
スターゼ１とα₁−アンチトリプシンとの結合部（図１，Ｂ）を認識するモノク
ローナル抗体の開発が待たれていた。本発明はエラスターゼ１及びエラスターゼ１とα₁−アンチトリプシンとの複
合体に対するモノクローナル抗体を用いる体液中のエラスターゼ１の測定法及び
測定用試薬を提供するものである。本発明者らはエラスターゼ１とα₁−アンチ
トリプシンとの結合部から離れた部位にある抗原決定基（図１，Ａ）を認識する
モノクローナル抗体を得、α₁−アンチトリプシンと結合しているエラスターゼ
１に対しても遊離のエラスターゼ１とほぼ同等の反応性を示す、感度面において
非常に改良された、正確な体液中のエラスターゼ１の測定法を確立すると共に、
抗体の安定な供給を確保したものである。さらに本発明者らはエラスターゼ１と
α₁−アンチトリプシンとの結合部（図１，Ｂ）を認識するモノクローナル抗体
を得ることに成功し、α₁−アンチトリプシン結合エラスターゼ１を特異的に測
定することにより、特に癌の診断法として優れた測定系を確立した。本発明によるエラスターゼ１の測定は、エラスターゼ１に対する上記モノクロ
ーナル抗体に対して、被検検体中のエラスターゼ１と、α₁−アンチトリプシン
を結合させた標識エラスターゼ１とを競合反応させた後、抗エラスターゼ１モノ
クローナル抗体に結合した標識エラスターゼ１と結合していない標識エラスター
ゼ１とを適当な方法で分離（Ｂ／Ｆ分離）し、分画の一方または両者の標識剤の
活性を測定し、別に被検検体の代わりに濃度既知の標準エラスターゼ１について
同様に操作して作成した標準曲線により測定すべきエラスターゼ１の量を求める
ものである。エラスターゼ１に対するモノクローナル抗体は、哺乳動物、例えばマウスをエ
ラスターゼ１で免疫し、該マウスより摘出した抗体産生細胞、例えば脾臓細胞に
、骨髄腫細胞やエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）などを融合させ、永
久増殖能を与え、得られた融合細胞より目的とするモノクローナル抗体を産生す得ることができる。エラスターゼ１とα₁−アンチトリプシンとの結合部（図１
，Ｂ）を認識するモノクローナル抗体はα₁−アンチトリプシン結合エラスター
ゼ１を免疫することにより取得することも可能であるが、α₁−アンチトリプシンには種特異性がないためマウスをエラスターゼ１で免疫した際、マウス血中の
α₁−アンチトリプシンがエラスターゼ１に結合し、そのためエラスターゼ１と
α₁−アンチトリプシンとの結合部（図１，Ｂ）を認識するモノクローナル抗体
をも作られてくる。標識エラスターゼ１の標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質ある
いは発光物質など標識剤として通常用いられているものを使用することができる
。これらの標識剤によるエラスターゼ１の標識化は公知の方法、例えばクロラミ
ン−Ｔ法や過ヨウ素酸法により行うことができる。Ｂ／Ｆ分離は、ＰＥＧ法、２抗体法、固相法など既知の方法により行うことが
できる。被検検体としては、血液の他、尿、膵液、胸水、腹水などを用いることができ
る。 α₁−アンチトリプシンが結合したエラスターゼ１だけを特異的に測定するた
めに抗エラスターゼ１モノクローナル抗体として、エラスターゼ１とα₁−アン
チトリプシンとの結合部（図１，Ｂ）を認識するモノクローナル抗体を用いる場
合にはα₁−アンチトリプシンを結合させた標識エラスターゼ１を用いなければ
ならないことは特記するまでもない。本発明に用いる測定用試薬キットは、（ｉ）α₁−アンチトリプシンを含有する緩衝液（ｉｉ）標識エラスターゼ１（ｉｉｉ）標準エラスターゼ１（ｉｖ）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を含有してなる。抗エラスターゼ１モノクローナル抗体は単一の抗原決定基を認
識するものであるが、これらの混合物を用いることもできる。さらにエラスターゼ１の抗原決定基の異なる部位を認識する二種以上のモノク
ローナル抗体を用いて、サンドイッチ法により被検検体中のエラスターゼ１を測
定することもできる。すなわち、固相に結合させた抗エラスターゼ１モノクロー
ナル抗体に被検検体中のエラスターゼ１を結合させた後、固相に結合している抗
エラスターゼ１モノクローナル抗体とはその認識部位を異にする抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を標識剤で標識して得た標識抗エラスターゼ１モノクロー
ナル抗体を反応させ、（固相化抗体）−（α₁−アンチトリプシントと結合した
エラスターゼ１）−（標識抗体）のサンドイッチ型抗原抗体複合物を形成させ、
該抗原抗体複合物上の標識剤のあるいは溶液中の標識剤の活性を測定し、別に被
検検体の代わりに濃度既知のα₁−アンチトリプシンと結合させた標準エラスタ
ーゼ１について同様に操作して作成した標準曲線により、測定すべき被検検体中
のエラスターゼ１の量を求めるものである。固相としてはガラス、ポリスチレン
、ナイロン、濾紙など固相として慣用されているものを用いることができる。固
相の形状は棒状、プレート状、チューブ状、ビーズ状などであって良い。サンド
イッチ法に用いる測定用試薬キットは（ｉ）固相化抗エラスターゼ１モノクローナル抗体（ｉｉ）標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体（ｉｉｉ）標準エラスターゼ１（ｉｖ）α₁−アンチトリプシンを含有する緩衝液を含有してなる。固相化抗体あるいは標識抗体のいずれか一方に、エラスターゼ１とα₁−アン
チトリプシンとの結合部（図１，Ｂ）を認識するモノクローナル抗体を用いるこ
とにより、α₁−アンチトリプシンが結合しているエラスターゼ１を特異的に測
定することができる。エラスターゼ１は膵臓に特異的な酵素であるので種々の膵臓疾患診断への応用
が可能である。特に急性膵炎の診断、その経過観察及び膵癌のスクリーニングと
して有用である。次に実施例により本発明を説明するが本発明の本質はエラスターゼ１にα₁−
アンチトリプシンが結合した複合体においてもエラスターゼ１とほぼ同等の交叉
反応性を示す抗エラスターゼ１モノクローナル抗体あるいはエラスターゼ１とα
₁−アンチトリプシンとの結合部を認識するモノクローナル抗体を用いることを
特徴とする体液中のエラスターゼ１の測定方法及び該抗エラスターゼ１モノクロ
ーナル抗体にあるのであって以下に実施例によって本発明が限定されるものでは
ない。実施例１抗エラスターゼ１モノクローナル抗体の作製精製エラスターゼ１溶液０．１ｍｌ（２５μｇ含有）にフロインド・コンプリ
ート・アジュバント０．１ｍｌを加え、エマルジョンを調整した。このエマルジ
ュン０．２ｍｌをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。１ヶ月後エラスターゼ
１溶液０．２ｍｌ（５０μｇ含有）を尾静脈より静注した。３日後屠殺し脾摘出
を行い脾細胞１×１０⁸ヶとマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１株）２×１０⁷ヶを
ＰＥＧ５０％存在下で細胞融合を行わせた。９６ｗｅｌｌプレート１０枚に各０
．１ｍｌを播き、ＨＡＴ培地で２週間培養した後、培養上清中の抗体検定を行っ
た。抗体陽性ｗｅｌｌより限界希釈法によりクローニングを行い、抗体産生株を
選別した。得られたモノクローナル抗体産生株１×１０⁷ヶを予めプリスタンを
投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に接種し、２週間後に腹水を採取した。実施例２エラスターゼ１の¹²⁵Ｉによる標識Ｎａ¹²⁵Ｉ約３００μＣｉを採取し、リン酸緩衝液を加えてｐＨを７．５に調
整した。エラスターゼ１５０μｇを加えて攪拌後クロラミンＴ（１ｍｇ／ｍｌ
）２５μｌを添加、３０秒間振とう反応させた後、メタ重亜硫酸ナトリウム（１
ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、反応を停止させた。標識反応液をセファデック
スＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ）に添加し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶
出し、遊離の¹²⁵Ｉを除去して¹²⁵Ｉ標識エラスターゼ１を回収した。実施例３競合法による血中エラスターゼ１の定量エラスターゼ１標準液又は被検血清１００μｌに¹²⁵Ｉ標識エラスターゼ１液
１００μｌ、抗エラスターゼ１モノクローナル抗体液１００μｌおよび牛γ−グ
ロブリン（１０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、室温で一昼夜インキュベーショ
ンした。２０％ＰＥＧ液１ｍｌを加え、攪拌混和後３０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、上清をデカンテーション除去後、残った沈澱の放射能を測定した。エラスターゼ１標準液の測定により得られた値より作成された標準曲線（図２
）より被検血清中のエラスターゼ１濃度を求めた。実施例４固相化抗エラスターゼ１抗体の作製抗エラスターゼ１モノクローナル抗体含有腹水に硫酸アンモニウム粉末を４０
％飽和となるよう添加溶解した。析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、γ−グロブリン液とした。ポリエスチレンビーズ
１個当り２μｇ／０．３ｍｌのγ−グロブリン液を加え、室温で一昼夜振とうし
た。未反応のγ−グロブリンを生理食塩水にて洗浄除去し、抗体吸着ビーズを作
製した。実施例５抗エラスターゼ１モノクローナル抗体の12⁵Ｉによる標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体含有腹水に硫酸アンモニウム粉末を４０
％飽和となるよう添加溶解した。析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解してγ−グロブリン液を得た
。Ｎａ¹²⁵Ｉ約３００μＣｉを採取し、リン酸緩衝液を加えてｐＨを７．５に調
整した。上記γ−グロブリン液１ｍｌを加えて攪拌後、クロラミンＴ（１ｍｇ／
ｍｌ）２５μｌを添加、３０秒間振とう反応後、メタ重亜硫酸ナトリウム（１ｍ
ｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、反応を停止させた。標識反応液をセファデックス
Ｇ−２５カラム（１×３０ｃｍ）に添加し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出
し、遊離の¹²⁵Ｉを除去して¹²⁵Ｉ標識エラスターゼ１モノクローナル抗体を回収
した。実施例６サンドイッチ法による血中エラスターゼ１の定量エラスターゼ１標準液または被検血清１００μｌに固相化抗体ビーズ１個を加
え、室温で振とうしながら２時間インキュレーションした。生理食塩水でビーズ
を３回洗浄後、¹²⁵Ｉ標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体液２００μｌを
加え、室温で振とうしながら２時間インキュベーションした。生理食塩水でビー
ズを３回洗浄後ビーズの放射能を測定した。エラスターゼ１標準液を測定し得られた値より作成した標準曲線（図３）により被検血清中のエラスターゼ１濃度を求めた。

【図面の簡単な説明】図１はα₁−アンチトリプシンが結合したエラスターゼ１の抗原決定部位を模
式的に描いたものである。図２は競合法による血中エラスターゼ１測定の標準曲線であり、図３はサンド
イッチ法による血中エラスターゼ１測定の標準曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】１．測定すべき被検検体中のエラスターゼ１と、α₁−アンチトリプシンを結合
させた標識エラスターゼ１とを抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に対して競
合反応させ、次に抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に結合した標識エラスタ
ーゼ１と結合していない標識エラスターゼ１とを分離し、それらの分画の一方ま
たは両方の標識剤の活性を測定し、そして別に被検検体の代わりに濃度既知のα
₁−アンチトリプシンを結合させた標準エラスターゼ１について同様に操作して
作成した標準曲線により測定すべき被検検体中のエラスターゼ１の量を求めるこ
とからなるエラスターゼ１の免疫学的測定方法。２．抗エラスターゼ１モノクローナル抗体として１種または２種以上のモノクロ
ーナル抗体の混合物を用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。３．標識剤が放射性同位元素、酵素、蛍光物質あるいは発光物質である特許請求
の範囲第１項記載の方法。４．抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に結合した標識エラスターゼ１と結合
していない標識エラスターゼ１の分離をＰＥＧ法、二抗体法あるいは固相法によ
り行う特許請求の範囲第１項記載の方法。５．固相に結合させた抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に被検検体中のエラ
スターゼ１を結合させた後、固相に結合している抗エラスターゼ１モノクローナ
ルとはその認識する部位を異にする抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を標識
剤で標識して得た標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を反応させ、（固相
化抗体）−（α₁−アンチトリプシントと結合したエラスターゼ１）−（標識抗
体）のサンドイッチ型抗原抗体複合物を形成させ、該抗原抗体複合物上の標識剤
または／および溶液中の標識剤の活性を測定し、そして別に被検検体の代わりに
濃度既知のα₁−アンチトリプシントを結合させた標準エラスターゼ１について
同様に操作して作成した標準曲線により測定すべき被検検体中のエラスターゼ１
の量を求めることからなるエラスターゼ１の免疫学的測定方法。６．標識剤が放射性同位元素、酵素、蛍光物質あるいは発光物質である特許請求
の範囲第７項記載の方法。