JP2657388B2 - Ｃｋｍｂ検定及びそれに使用するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 本願発明は、ヒトクレアチンキナーゼのMBイソ酵素の
検定法及びその検定に使用するモノクローナル抗体に関
する。

酵素クレアチンキナーゼ〔例えばATP:クレアチンＮ−
ホスホトランスフェラーゼ（cratineN−phosphotranste
rase）,EC2.7.3.2〕は、２つのＭモノマー（CKMM）、２
つのＢモノマー（CKBB）、又は１つのＭモノマー及び１
つのＢモノマー（CKMB）から成る二量体である。これら
のイソ酵素のそれぞれは同一の分子量を有し、同一の触
媒反応をする。例えばそれはクレアチンの可逆性リン酸
化である。これらのイソ酵素は分子構造が異なり、アル
カリ緩衝剤中で電荷が異なるので、電気泳動法により分
離できる。Lott,J.A.のクレアチン キナーゼ、ラクテ
ート デヒドロゲナーゼ アンド ゼア イソエンザイ
ムス イン クリニカル メディスン（Creatine Kinas
e,Lactate Dehydrogenase and their Isoenzymes in Cl
inical Medicine），コーニング メディカル パブリ
ケーション（Corning Medical Publication,Medfield,M
assachusetts,1984），及びLang,H.（ed）のクレアチン
キナーゼ イソエンザイムス，パソフィジオロジー
アンド クリニカル アプリケーション（Creatine Kin
ase Isoenzymes,Pathophysiology and Clinical Applic
ation），スプリンガー−バーレイグ（Springer−Verla
g,New York,1981）を参照のこと。

激しい心筋梗塞（MI）の正しい診断は、患者の生存を
決定する重大な医学的チャレンジである。CKMBはほとん
ど心筋のみに存在するので、CKMBの血清濃度が心筋に損
害があるかどうか（つまりMIが起っているかどうか）を
決定するために使用し得る。乳酸デヒドロゲナーゼやア
スパラギン酸トランスアミナーゼのような他の酵素と比
較すると、CKMBは心筋により局存するため、MIのより特
定的マーカーである。Galen,R.S.等の“イソエンザイム
ス オブ CPK アンド LDH イン ミオカーディアル
インファークション アンド サートゥン アザーデ
ィジージズ（lsoenzymes of CPK and LDH in Myocardia
l Infarction and Certain other Diseases）",pathobi
al.Annu.,5:283−315,1975年、及びLott,J.A.等の“セ
ラム エンザイムス アンド イソエンザイムス イン
ザ ダイアグノシス アンド ディファレンシャル
ダイアグノシス オブ ミオカーディアル インファー
クション（Serum Enzymes and Isoenzymes in the Diag
nosis and Differential Diagnosis of Myocardial Inf
arction）",Clin.Chem.,26:1241,1980年，を参照のこ
と。更に、梗塞部からのCKMBの漏出は他の酵素に先んじ
て起るので、より早い診断の機会を与える。Kiyasu,J.
Y.の“カレント ステータス オブ ディテクティング
CK−MB フォーペイシャント マネジメント（Curren
t Status of Detecting CK−MB for Patient Managemen
t）",Amer.Clin.Prod.,4:23−31,1985年，を参照のこ
と。梗塞部の有無を示すことの他に、CKMBの血清濃度も
また、MIの程度や再び梗塞が起るかどうかを診断するた
めに使用できる。Lott,J.A.,supra:Konttinen,A.の“ジ
イソエンザイムネ オブ クレアチン キナーゼ イ
ン ベリアス ディジージズ（The Isoenzymes of Crea
tin Kinasein Various Diseases）",in Enzymes in Hea
lth and Disease,Inaug,Scient.Meet.Int.Soc.clin.Enz
ymol.,London,1977年,149〜153ページ;Kupper N.及びBl
iefeld W.の“セラム エンザイム チェンジズ イン
ペイシャンツ ウィズ カーディアック ディジーズ
（Serum Enzyme changes in Patients with Cardiac Di
sease）",in Advances in Clinical Enzymology,1979
年,106〜122ページ；及びHackshaw B.のClinical Chemi
stry,30:1285,1984年，を参照のこと。

その診断的重要性の観点から、血清中のCKMB濃度を測
定するための多くの技術が開発されてきた。Abbott等の
“メソッズ フォー CK−MB アナリシス ユーズド
トゥ モニター カーディアック ペイシャンツ（Meth
ods for CK−MB Analysis Used to Monitor Cardiac Pa
tients）",Journal of Clinical Immunoassay,8:147−1
51,1985年;chan等の“イムノエンザイメトリック アッ
セイ フォー クレアチン キナーゼ MB ウィズ サ
ブユニット−スペシフィンク モノクローナル アンテ
ィボディーズコンペアード ウィズ アン イミュノケ
ミカルメソッド アンド エレクトロフォレシス（Immu
noenzymetric Assayfor Creatine Kinase MB with Subu
nit−Specific Monoclonal Antibodies Compared with
an Immunochemical Method and Electrophorsesis）",C
linical Chemistry,31:465−469,1985年;Jackson等の
“トゥーサイト モノクローナル アンティボディ ア
ッセイズ フォー ヒューマン ハート−アンド ブレ
イン−タイプ クレアチン キナーゼ（Two−SiteMonoc
lonal Antibody Assays for Human Heart−and Brain−
Type Creatine Kinase）",Clinical Chemistry,30:1157
−1162,1984年；及び1986 2月13日公開PCT特許公開番号
WO86/00992,を参照のこと。残念ながら、可能な検定の
方法論は、現存までのところCKMBの完全な診断が実現し
ていない、というような多くの欠点を有している。

例えば、血清中のCKMBの濃度を測定するために開発さ
れた技術には、CK画分の電気泳動又はイオン交換分離の
後にMB画分中のCK活性を決定する方法がある。ラジオイ
ムノアッセイ及びイムノインヒビション アッセイが、
ツーサイト イムノメトリック アッセイ（two−site
immunometric assays）及びイムノインヒビション／イ
ムノプレシピテーション アッセイと共に開発されてい
る。

これらの試みは全て、同じようにしてCKMBに移動する
人為構造や変異体（分離型技術）に、又はCKBB,CKMM,マ
クロCK−１及び他の酵素により生ずるような干渉（免疫
技術）のために正しい結果が得られない。更に、電気泳
動、及び多重定温培養（multiple incubation）／洗浄
工程を伴うツーサイト イムノメトリック アッセイは
長時間を要する。

いままでのCKMBのツーサイト イムノメトリック ア
ッセイは抗−CKMM及び抗−CKBB抗体間のサンドイッチ形
成に基づいている。1986年２月13日公開のPCT特許公開
番号WO86/00992;Youens,J.E.B.等の“クリニカルアンド
アナリティカル バリデーション オブ アン エン
ザイモメトリック アッセイ フォー クレアチン キ
ナーゼ−MB イソエンザイム（Clinical and Analytica
l Validation of an Enzymometric Assay for Creatine
Kinase−MB Isoenzyme）",Ann.Clin.Biochem.,23:463
−469,1986年;Medeiros,L.J.等の“クアンティフィケー
ション オブ CK−MB バイザ クイック MB アンド
タンデム−ECK−MB イムノアッセイズ：コンパリス
ントゥ エレクトロフォレシス（Quantification of CK
−MB by the Quick MB and Tandem−ECK−MB Immunoass
ays:Comparison to Electrophoresis）",J.Clin.Immuno
assay,8:152−156,1985年；及びChan,D.W.等の“イムノ
エンザイメトリック アッセイ フォー クレアチン
キナーゼ−MB ウィズ サブユニット−スペシフィク
モノクローナル アンティボディーズ コンペアード
ウィズ アン イムノケミカル メソッド アンド エ
レクトロフォレシス（Immunoenzymetric Assay for Cre
atine Kinase−MB with Subunit−Specific Monoclonal
Antibodies Compared with an Immunochemical Method
and Electrophoresis）",Clin,Chem.,31:465−469,198
5年，を参照のこと。下記に示すように、この方法はシ
ングル インキュベーション アッセイ（a single inc
ubation assay）に使用する時、CKMM及びCKBBによる干
渉に影響されやすい標準曲線となる。

最近、CKMB検定に抗−CKMBモノクローナル抗体を使用
することが報告されている。Vaidya等の“ダイレクト
メジャーメント オブ クレアチン キナーゼ−MB ア
クティビティ イン セラム アフター イクストラク
ション ウィズ ア モノクローナル アンティボディ
ー スペシフィク トゥ ザ MB イソエンザイム（Di
rect Measurement of Creatine Kinase−MB Activity i
n Serum after Extraction with a Monoclonal Antibod
y Specificto the MB Isoenzyme）",Clinical Chemistr
y,32:657−663,1986年，を参照のこと。この研究で使用
されるモノクローナル抗体はIgG2b型のマウス抗体であ
った。抗体はポリマービーズに結合され、このビーズは
血清試料からCKMBを抽出するために使用された。抽出さ
れたCKMBの量を、CK試薬を用いて37℃で30分間前記ビー
ズを定温培養し、前記ビーズを遠心分離機にかけ、上清
部分を除去し、340nmにおけるその部分の吸光度を測定
することにより、酵素によって測定する。

Vaidya等の検定法は多くの問題をかかえている。まず
第１に、この検定法は質量濃度というよりはCKMB活性を
測定するのであるから、血液試料を採取した時点と検定
を行った時点との間でのCKMB活性の低下のために不正確
性を伴う。よく知られているように、前記期間中にそれ
ぞれの試料が置かれている環境条件と同様に、前記期間
も臨床上の条件により試料ごとに大きく変化し得る。一
方、試料中のCKMBの質量濃度は特定の保存期間や試料が
置かれている環境条件に比較的影響を受けない。Murthy
等の“アクティビティ コンセントレーション アンド
マスコンセントレーション（モノクローナル アンテ
ィボディ イムノエンザイオメトリック メソッド）コ
ンペアード フォー クレアチンキナーゼ MB イソエ
ンザイム イン セラム〔Activity Concentration and
Mass Concentration（Monoclonal Antibody Immunoenz
yometric Method）Compared for Creatine Kinase MB I
soenzyme in Serum〕",Clin,Chem.,32:1956,1986年を参
照のこと。

更に、Vaidya等の報告に開示されたモノクローナル抗
体は実施されている検定法に使用するのに時に適してい
るというわけではない。特に、前述したようにVaidya等
の抗体はIgG2b型である。当業者に既知のように、この
型の抗体は凍結に敏感で、低塩濃度の溶液中で沈殿しや
すく、他の型のIgG抗体、特にIgG1型抗体よりも蛋白質
分解酵素による劣化に影響されやすい。更に、IgG2b型
抗体と比較して、IgG1型抗体は通常誘導化しやすい。例
えば酵素、又は化学ルミネセント物質等により標識化し
やすい。Goding,J.W.のモノクローナル アンティボデ
ィーズ：プリンシプルズ アンド プラクティス（Mono
clonal Antibodies:Principles and Practice）,Academ
ic Press,Inc.,New York,1983年,15ページ；及びParha
m,P.の“オン ザ フラグメンテーション オブ モノ
クローナルIgG1,IgG2a,アンド IgG2bフロムBALB/cマイ
ス（On the Fragmentation of Monoclonal IgG1,IgG2a,
and IgG2b from BALB/c Mice）",Journal of Immunolog
y,131:2895−2902,1983年を参照のこと。

（発明の概要） 前述の観点から、生物体液中、特に血清試料中のCKMB
の濃度を測定するための改良された検定法を提供するこ
とが本願発明の目的である。より詳細には、使いやす
く、高い精度を有し、そして血清試料中に見つかるCKM
M,CKBB、マクロCK−１、又は他の酵素から実質的に干渉
されない改良されたCKMB検定法を提供することが本願発
明の目的である。

これらの目的と関連して更に実施されているCKMB検定
法に使用するのに特に適した抗−CKMBモノクローナル抗
体を提供することも本願発明の目的である。特に、IgG1
型のマウス抗−CKMBモノクローナル抗体を提供すること
が本願発明の目的である。

前述及び他の目的を達成するために、本願発明は、 （ａ）（ｉ）生物体液の試料、（ii）固体支持体に結合
されたCKBに対する抗体、及び（iii）CKMBに対する標識
化されたモノクローナル抗体の混合物を形成し、 （ｂ）前記混合物を定温培養し、 （ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離し、そして （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
と、 の各工程から成る、生物体液中のCKMBを検出する方法を
提供する。

本願発明のいくつかの好ましい実施態様においては、
固体支持体は磁性粒子から成り、そして抗−CKMBモノク
ローナル抗体が化学ルミネセント物質で標識化されてい
るIgG1型のマウスモノクローナル抗体である。

前述の方法に加えて、本願発明はまた、ネズミ由来の
雑種株化細胞から産生され、IgG1型である抗−CKMBモノ
クローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル
抗体は、CKMB検出のため前述の好ましい方法又は他の既
知の方法の実施に使用でき、その結果この酵素又は他の
酵素を検出するように開発し得る。

本願発明の原理は、好ましい実施態様と同様に、以下
に示された図面及び実施例により説明され例証される。
これらの図面や実施例は、もちろん例証の目的のみに用
いられるものであり、本願発明の範囲を制限するもので
はない。

（好ましい実施態様の説明） 前述したように、本願発明は、ヒトの血清のような生
物体液の試料中のCKMBを検出するためのツーサイト（サ
ンドイッチ）イムノアッセイに関する。特に、この検定
法は固体支持体に結合されたCKBに対する抗体（“キャ
プチャー抗体”）とCKMBに対する標識化された抗体
（“トレーサー抗体”）を使用する。

キャプチャー抗体は、CKBBに対して免疫化された動物
の血清から得られたポリクローナル抗体、又は雑種株化
細胞で産生されたモノクローナル抗体である。モノクロ
ーナル抗体及び、特にIgG1型のマウスモノクローナル抗
体が好ましい。CKBBに対するポリクローナル抗体は、特
にペル フリーズ社（Pel Freez Corporation）及びベ
ントレックス社（Ventrex Corporation）から得られ、
この抗原に対するモノクローナル抗体はハイブリテック
社（Hybritech,Inc.）から得られる。後述する実施例２
で示す通り、抗−CKBが好ましいキャプチャー抗体であ
る。と言うのは、この検定法は、シングル インキュベ
ーション工程（a single incubation step）及び単一分
離／洗浄工程を使用する場合においても、このキャプチ
ャー抗体をCKMBトレーサー抗体と組合せて使用する時、
CKMM及びCKBB両方の干渉の影響を基本的に全く受けない
からである。

キャプチャー抗体は種々の固体支持体によって運ばれ
る。例えばガラスやプラスチックビーズ、磁性粒子、棒
や円板又は他の構造物の外表面、試験チューブ又は他の
容器の内表面などである。同様にして、キャプチャー抗
体をその固体支持体に付けるために当業者に既知の多く
の技術が使用できる。その取りあつかいやすさから、磁
性粒子、特に米国特許第4,554,088号に開示された型の
磁性粒子が本願発明と共に用いるのに好ましい。キャプ
チャー抗体は従来、この型の粒子と結合させるのに、こ
の粒子をシランで被覆し、グルタルアルデヒドで活性化
し、洗浄して抗体に加える。Reichlin,M.の“ユーズ
オブ グルタルアルデヒド アズ ア カップリング
エイジェント フォー プロテインズ アンド ペプチ
ズ（Use of Glutaraldehyde as a Cupling Agent for P
roteins and Peptides）",Method of Enzymology,70:15
9−165,1980年を参照のこと。

トレーサー抗体はCKMBに対するモノクローナル抗体で
ある。前述したように、実施されている検定法に使用す
るのに適した抗体を提供するという観点から、IgG1型の
マウスモノクローナル抗体が好ましい。この型の抗体
は、例えばIgG2b型抗体などより安定で標識化しやす
い。特に、本願発明の検定法にIgG1トレーサー抗体を使
用することは、同じ条件下でIgG2b抗体を使用して得ら
れる結果より優れた結果となることがわかった。更に、
IgG1型抗体は実質的な活性のロスを伴うことなく、凍結
したり解凍したりできる。実際のセッティングにおい
て、このように凍結したり解凍したりすることは、例え
ば検定用具一式及び部品を輸送したり保管したりする際
に、行われる。

下記実施例１で詳しく述べるように、IgG1型のCKMBに
対するマウスモノクローナル抗体は、マウスを純粋CKMB
で免疫化し、その免疫化したマウスから脾臓細胞（sple
nouytes）を取出し、この脾臓細胞をマウス永久増殖株
化細胞と融合し、CKMBに対する抗体を産生する細胞を得
るため得られたハイブリドーマをスクリーニングする。
選択されたハイブリドーマにより産生された抗体は更に
スクリーニングされ、CKBB及びCKMMとの交差反応性や抗
体型を調整する。低い交差反応性、例えばCKBB及びCKMM
の相方と１％未満の交差反応性を有するIgG1型のものが
本願発明に使用される好ましいトレーサー抗体を形成す
る。

抗−CKMB抗体は種々の標識により標識化し得る。それ
は例えば、放射性標識、螢光性標識、酵素標識、化学ル
ミネセント標識その他である。化学ルミネセント標識、
特に化学ルミネセント物質としてアクリジニウム エス
テルを使用した化学ルミネセント標識が好ましい。

下記の実施例３で示すように、この型の標識を使用す
ることにより、血清試料中のCKMB濃度は、ただ２つのキ
ャリブレーター試料（calibrator samples）を使用する
だけで最終ユーザーにより決定できる。一方、他の標識
を使用した場合は通常４つ以上の標準液を必要とする。
好ましい標識及び抗体に標識を付けるのに適した技術
は、本願発明と同じ譲渡人であって1986年10月６日に出
願された米国特許出願番号915,527に開示されている
が、参考のため本願明細書にも含めた。

好ましい実施態様において、完全な検定法はたかだか
次の４つの工程の実施を必要とするに過ぎない。それ
は、１）定温培養、２）分離、３）洗浄及び４）カウン
ティングである。もちろん、所望ならばさらに定温培養
や洗浄工程を増やすことも本願発明の実施には可能であ
る。

下記実施例３で示す通り、室温で単に30分間、又は至
急で検定を行う場合は10分間でも定温培養は可能であ
る。また、アクリジニウム エステル標識を使用するこ
とで、ユーザーは患者の試料の測定された光の出力を濃
度値に変換するため、２つのキャリブレーター試料を操
作するだけでよい。更に、固体支持体として磁性粒子を
使用することで、分離がじん速に容易に行われる。

これらの要素の相乗効果により、本願発明の検定法は
全てに渡って使用し易く、じん速に行われる。試料を読
み取るのに２時間以上もかかった従来の方法と比較する
と、本願発明の検定法は１時間未満で容易に完了し得
る。心筋梗塞をじん速に診断できることの重要性という
観点から、本願発明による短い全検定時間及び実施の容
易さが重要な意味を持つ。

前述の記載に基づき、本願発明を、下記の特別な実施
例により更に説明する。

実施例１ 抗−CKMBモノクローナル抗体の調整 ヒトCKMBに対するモノクローナル抗体を下記の免疫
化、融合、スクリーニング及びイソタイプキャラクタリ
ゼーション（isotypecharacterization）の各工程を用
いて調整した。

免疫化工程記録：生後６週目のメスのA/Jマウス、Ｈ−2
aハプロタイプ（haplotype）〔ジャクソン研究所（Jack
son Laboratories）,Bar Harbor,ME 04609〕の腹膜組織
内に、同量のフロイントの完全アジュバント（complete
Freund′s adjuvant）（CFA）〔ディフコ研究所（Difc
o Laboratories）,Detroit,Michigan〕中に乳化させた3
0ugの純粋CKMB〔スクリップス研究所（Scripps Laborat
ories,San Diego,（Ａ）〕を０日目と21日目に注射し
た。１ヶ月後、フロイントの不完全アジュバンド（inco
mplete Freund′s adjuvant）中の抗原を同量、前記マ
ウスの足に皮下投入した。５週間後、20ugのCFAを腹膜
組織内に注射した。最後に19ugの殺菌塩水（sterile sa
line）を融合の４日前で前記のCAFの最後の注射後７週
間経過後、静脈内に投入した。

融合工程記録：免疫化マウスの脾臓細胞（１×10⁸）とB
alb/cマウス骨髄腫株化細胞〔アメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（American Type Culture Coll
ection）,Rockville,Maryland登録番号ATCC CRL−1581
から得られるSp2/0−Ag14細胞〕から得た細胞（２×1
0⁷）をポリエチレン グリコール（平均分子量950−105
0）（J.T.Baker,Company,phillipsburg,N.J.05865）の
存在下、主にkohler及びMilstein（Nature,256:495−49
7,1975年）の手順に従って融合した。融合した細胞は、
96−ウェル マイクロティター組織培養プレート（96−
well microtiter tissue culture plates）（Corning G
lass Works,Corning NY）内のウェルに置かれ、５％CO₂
雰囲気中で37℃で定温培養された。２週間後、CKMBと反
応性のある抗体を得るためハイブリドーマをスクリーニ
ングした。

スクリーニング工程：ハイブリドーマは、CKMBに対して
反応性の抗体を得るためダブル抗体化学ルミネセント検
定法（a double antibody chemiluminescent assay）を
使ってスクリーニングした。純粋CKMBをジメチル アク
リジニウム エステル（ｎ−ヒドロキシスクシニイミ
ド）（DMAE−NHS）で以下のように標識化した。0.1mlの
ジメチルホルムアミド中の5ugのDMAE−NHSを1ml標識緩
衝剤（0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、p
H8.0）中の100ug純粋CKMBに加えた。混合物をかきま
ぜ、15分間室温で定温培養した。この混合物を次にSeph
adex G−25（PD−10）カラム〔ファーマシア社（Pharma
cia Inc.）Piscataway,NJ 08854〕に入れ、空隙容積を
集結した。標識化したCKMBは0.1％のウシ血清アルブミ
ン（bovine serum albumin（BSA））及びリン酸塩緩衝
塩水pH7.4と0.01％チメロサール中で希釈し、４℃で保
存する。

スクリーニング工程は100uのCKMB−DMAEと100uの
ハイブリドーマ培養上清を12×75mmポリスチレンチュー
ブ（Walter Sarstedt,Princeton,NJ 08540）中で混合
し、この溶液を室温で２時間定温培養することにより構
成した。第２の抗体、すなわち磁性粒子〔Advanced Mag
netics,Inc.,Cambridge,Massachusetts;Groman等の“プ
ロダクト アプリケーションフォーカス，バイオマッグ
−−ア ニュー サポート フォー マグネティック
アフィニティ クロマトグラフ（Product Application
Focus,BioMag−−A New Support for Magnetic Affinit
y Chromatograph）",Biotechniques,1985年３月/4月，
ページ156−160参照〕に固定されたヤギ抗−マウスIg
（Cambridge Medical Diagnostics,Inc.,Billerica,MA
01865）を前記反応チューブに加え、室温で15分間定温
培養した。

コーニング磁気分離装置（A Corning magnetic separ
ation unit:Ciba−Corning Diagnostics,Walpole,MA 02
135）を、抗原／二重抗体混合物を溶液の残りの部分か
ら分離するために使用した。この混合物を蒸留水で一度
に洗浄し、フォトンカウンター（a photon counter:810
Luminometer,Ciba−Corning Diagnostics,Walpole,MA
02135）を用いてカウントした。Weeks等の“ケミルミネ
センス イムノアッセイ（chemiluminescence Immunoas
say）,"J.of Clin.Immunoassay,7:82−88,1984年を参照
のこと。

ハイブリドーマ上清は、グロース ネガティブ ウェ
ル（growth negative well）から得られるネガティブ
コントロール上清（negative control supernatants）
の３倍以上のカウント数であればポジティブ（positiv
e）であると考えられた。ポジティブ ハイブリドーマ
が選択され、株化細胞が増殖できる場である。24−ウェ
ル組織培養プレート（a24−well tissue culture plat
e:Costar,Cambridge,MA 02139）に移植した。培養上清
を24−ウエル プレートから採集し、CKMBに対する抗体
の再試験をした。

イソタイプ キャラクタリゼーション工程：モノクロー
ナル抗体のイソタイプはモノ−ABID酵素イムノアッセイ
キット（Zymed Laboratories,San Francisco,CA 9408
0）を用いて決定した。

前述の工程に従って、本願発明の検定法に使用するの
に基本的に適した２つの抗−CKMBモノクローナル抗体
（抗体“007"及び“13G1"）を確認した。どちらの抗体
もIgG1型でカッパ ライト チェイン（kappa light ch
ains）を有していた。融合により、抗−CKMB抗体の産生
に加えて抗−CKM及び抗−CKB抗体も産生することがわか
った。

007及び13G1抗体を産生するハイブリドーマは、安定
したモノクローナル抗体株化細胞を確保するために、希
釈を制限することによりクローン化した。Goding,supr
a,ページ85を参照のこと。どちらの株化細胞とも安定で
あることがわかった。

更に詳しい評価をするため、株化細胞から産生された
抗体は次のようにして純化した。50mlの培養上清をアミ
コン コンセントレーター（an Amicon Concentrator:A
micon Corporation,Danvers,MA）を使用して濃縮化し
た。濃縮物は次にan Affi−Gel Bio−Rad Protein A MA
PS II KIT（Bio−Rad Laboratories,Richmond,CA 9480
1）を使って純化した。最後に、抗体は0.1Mリン酸ナト
リウム、0.15M塩化ナトリウム、pH8.0に透析した。抗体
の純度は、高分解ゲル電気泳動法（high resolution ge
l electrophoresis）を行なうことにより確認した。

２つの抗−CKMBモノクローナルのツーサイト イムノ
アッセイに対する適合性を評価するために、種々の濃度
のCKMB,CKBB及びCKMMの標準曲線を、可能な抗−CKMB抗
体、及び抗−DKMB抗体を産生するために使用される手順
と類似であるが抗原としてCKMM及びCKBBを使用する手順
により産生された抗−CKM及び抗−CKBモノクローナル抗
体（それぞれ抗体“AH6"及び“CA8"）を用いて作成し
た。特に、標準曲線は、トレーサー抗体をDMAEにより標
識化し、キャプチャー抗体を磁性粒子に結合させること
により作成した（Advanced Magnetics,supra）。

トレーサー抗体の標識化は次のように行った。0.2ml
ジメチルホルムアミド中のDMAE−NHS40マイクログラム
を1ml標識緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナ
トリウム、pH8.0）中の抗体0.25mgに加えた。室温で15
分間経過した後、0.5ml標識緩衝液中のDL−リジン5mgを
加えて反応を停止させた。反応混合物を小さなSephadex
G−25カラム（PD−10）に入れ、空隙堆積を集めた。ク
ロマトグラフィー及びトレーサーの保存用の緩衝系は
“トレサー緩衝液”で、pHは7.4であり、0.01Mのリン酸
ナトリウム、0.1Mの塩化ナトリウム、0.25％のBSA、0.1
％のアジ化ナトリウムより構成された。Sephacryl S−4
00のクロマトグラフィーによりトレーサーのより純化を
行った。3mlのトレーサーをSephacryl S−400カラムに
入れ、“トレーサー緩衝液”中で色層分析した。10ml,2
0ml及び200mlのカラムが試験された。大きなカラムはよ
り大きな集塊からトレーサーを分離し、トレーサーピー
クの後に抽出されるいくつかの小さなピークを示した。
小さなカラムはひとつの主要なピークを示した。しか
し、どちらの場合でもシグナル／ノイズ比の10倍の増加
がバックグラウンドの減少により見られた。Sephacryl
カラムは未確認の汚染物質を吸着によって取り除いた、
と考えられている。

標準曲線を作成するのに使用される検定法の形式は次
のようであった（形式は実験ごとに少しずつ異なるが、
最終結果に影響を与える程異なることはなかった）。0.
1mlの標準液を0.1mlのトレーサー抗体に加え、かくはん
した。それぞれの実験により、0.1ml,0.2ml又は0.5mlの
キャプチャー抗体を加え、混合物を室温で再びそれぞれ
の実験により10分間、30分間又は１時間定温培養した。
この混合物をコーニング磁気分離装置を用いて分離し、
蒸留水で洗浄した。検定は、8/0ルミノメーター（an 8/
0 Luminometer）によりカウントして行った。

その結果を第１図に示す。ここに示されているよう
に、モノクローナル007及び13G1は抗−CKM及び抗−CKB
の相方とCKMB“サンドイッチ”相溶性を示したが、007
と13G1との相溶性は示さなかった。抗−CKM（AH6）及び
抗−CKB（CA8）抗体もまたCKMB“サンドイッチ”相溶性
を示した。CKMM及びCKBB抗原（1.000ug/まで）と“サ
ンドイッチ”形成をしないことが007,AH6及びCA8抗体の
高い特異性（99.9％より大）を示している。13G1抗体
は、CKBBと若干交差反応性を示した。従って、13G1抗体
はCKMB検定法に使用するのに適すると考えられるが、00
7抗体よりは好ましくないと判断された。

007抗体はその特異性により更に特徴づけられた。特
に、10ug/mlまでの純粋CKBB,CKMM及びCKMB（Scripps La
boratories,San Diego,CA）の存在下で、この抗体にCKM
B−DMAEを結合させることにした。イソ酵素標準液は50
％のグリセロール中に−20℃で保存されているストック
溶液から調製された。それぞれのイソ酵素は50mM PIPE
S,100mM塩化ナトリウム、５％BSA,0.1％アジ化ナトリウ
ム1mM EDTA及び1mMジチオトレイトール（dithiothreito
l）（pH6.7）中で所望する濃度に希釈した。100u CKM
B−DMAE及び100uイソ酵素標準液を100uの培養上清
制限希釈液、すなわち50％の最大結合度を与える希釈液
に加えた。この溶液を室温で２時間定温培養した。ヤギ
抗−マウスIg磁性粒子（Advanced Magnetics,supra）を
加え、室温で15分間定温培養した。混合液を分離し、ス
クニーリング工程に関連して前述した方法で洗浄した。
カウントの阻害がモノクローナル抗体のイソ酵素に対す
る反応性を示した。

第２図に結果を示してあるが、この図に示されている
ように、007抗体は10ug/mlの濃度までのCKMM又はCKBBと
実質的に交差反応性を示さなかった。

007抗−CKMB抗体を産生する雑種株化細胞はプダペス
ト条約の国際寄託機関であるアメリカン タイプ カル
チャー コレクション（American Type Culture Collec
tion,ATCC,Rockville,Marlyand）に寄託され、登録番号
（寄託番号）（accession number）HB9389を与えられて
いる。CA8抗−CKB抗体を産生する雑種株化細胞もまたAT
CCに寄託され、登録番号（寄託番号）HB9388を与えられ
ている。007抗体と同様に、CA8抗体もIgG1型であり、カ
ッパ ライト チェーン（kappa light chains）を有す
る。

同様にして、CA8抗体を産生する株化細胞は安定な株
化細胞である。

実施例 ２ 検定形式 この実施例は、CKMM又はCKBBによる干渉に影響されに
くく、ただ１つの定温培養工程で済むCKMB検定法の型の
開発を説明している。

CKMB標準曲線は、5,000ug/ CKMM又は1,000ug/ CK
BBのどちらかの存在下及び不存在下で４つの異なる検定
の型〔すなわちキャプチャー抗体として抗−CKM（AH6）
をトレーサー抗体として抗−CKB（CA8）又は抗−CKMB
（007）のどちらかと共に用いること、及びキャプチャ
ー抗体として抗−CKB（CA8）をトレーサー抗体として抗
−CKM（AH6）又は抗−DKMB（007）のどちらかと共に用
いること〕を使用して作成した。この標準曲線は実施例
１の標準曲線と同様の方法で作成した。

固相抗体が抗−CKMである場合、標準化した抗−CKBが
トレーサー抗体であれば標準曲線はCKBBにより阻害され
たが（第3A図）、抗−CKMBがトレーサーとして加えられ
ると阻害されなかった（第3B図）。CKBBによる阻害は、
標識化抗−CKBを加える前に洗浄工程を行なうか、又は
トレーサーの量をなん倍かに増加することによりとり除
くことができた。しかし、トレーサーの量を増加させる
と高い割合で非特定シグナル（non−specific signal）
を発生させた。キャプチャー抗体として抗−CKMを使用
すると、どのトレーサーを用いるかに係りなく標準曲線
はCKMMにより低下した（第3A図及び第3B図）。

固相抗体が抗−CKBでトレーサー抗体が抗−CKMの場
合、CKMMによる標準曲線の強い阻害が見られた（第3C
図）が、CKBBによる阻害は見られなかった（第3C図）。
トレーサー添加前の洗浄工程はCKMM阻害を防止するのに
効果があった。

最後に、固相抗体が抗−CKBでトレーサー抗体が抗−C
KMBの場合、CKMM又はCKBBによる干渉のどちらも起らな
かった（第3D図）。従って、この方法は干渉を起さず、
ただ１回の定温培養工程で済むため、他の方法より優れ
ている。

実施例３ 検定の最適化と試験 この実施例は、抗−CKB（CA8）及び抗−CKMB（007）
をそれぞれキャプチャー抗体及びトレーサー抗体として
使用している実施例２の好ましいCKMB検定法の最適化と
試験に関する。

007抗体をトレーサー抗体として使用することにより
作成された標準曲線は中程度のpHに対して敏感であるこ
とがわかった。特に、pHが6.5から8.0に上昇するにつれ
てシグナルが徐々に減少するが、pH7.4のシグナルはpH
6.5の場合より40％低かった。その結果、この検定法に
使用する試薬は0.1M MIPES緩衝液を用いpH6.5で緩衝
し、血清試料が異常なpH値を有するために生じる潜在的
定誤差（potential bias）を防止するため媒体／試料比
７が使用された。

最近の種々の刊行物には、マウス モノクローナル抗
体に利用されるイムノアッセイにおける異種親和性、お
そらく抗−マウス抗体による干渉が開示されている。Th
ompson,R.J.等の“サーキュレーティング アンティボ
ディーズ トゥ マウス モノクローナル イムノグロ
ブリンズ イン ノーマル サブジェクツ−−インシデ
ンス，スピーシズ スペシフィシティ，アンド イフェ
クツ オブ ア ツーサイト アッセイ フォー クレ
アチン−キナーゼ−MB イソエンザイム（Circulating
Antibodies to Mouse Monoclonal Immunoglobulins in
Normal Subjects−−Incidence,Species Specificity,a
nd Effects of a Two−Site Assay for Creatine−Kina
se−MB Isoenzyme）",Clin.Chem.,32:476−481,1986
年；及びMurthy,V.V.等の“アクティビティ コンセン
トレーション アンド マス コンセントレーション
（モノクローナル アンティボディー イムノエンザイ
モメトリック メソッド）コンペアード フォークレア
チン キナーゼ MB イソエンザイム イン セラム
〔Activity Concentration and Mass Concentration（M
onoclonal Antibody Immunoenzymometric Method）Comp
ared for Creatine Kinase MB Isoenzyme in Serum）",
Clin.Chem.,32:1956−1959,1986年を参照のこと。従っ
て、0.1％（v/v）非免疫マウス血清を検定媒体に加え
た。これによる標準曲線への明らかな効果はなかった。

前述の試薬を使用し、本願発明の検定法と既存のCKMB
検定法を比較するのに次の検定法計画案を用いた。

1.100uの試料、対照標準液、標準液又はキャリブレー ター（calibrator）を試験チューブに加える。（500u g/より大きいCKMB濃度を有する試料をまず希釈する 。好ましい希釈剤はフォトン測定値を濃度値に変換す るために使用されるロー キャリブレーター（low c alibrator）である。下記の説明を参照のこと。） 2.100uの抗−CKMBトレーサー抗体を次にチューブに加 える。

3.形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間か くはんする。

4.磁性粒子（Advanced Magnetics）に結合された抗−CK Ｂキャプチャー抗体を500u、それぞれのチューブに 加える。

5.形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間か くはんする。

6.チューブを30分＋／−１分間、室温（15℃ないし30 ℃）で定温培養する。

7.固相をコーニング磁気分離装置で３分間かけて分離す る。

8.チューブの水分を取り、３分間水気を切って次にブロ ット（blot）する。

9.1.0mlの蒸留水又は脱イオン水をチューブに加える。

10.形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間 かくはんする。

11.固相を磁気分離装置で３分間かけて分離する。

12.チューブの水分を取り、３分間水気を切って次にブ ロット（blot）する。

13.100uの蒸留水をチューブに加える。

14.形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間 かくはんする。

15.チューブ内のフォトン出力を、チバ コーニング ダイアグノティック社発売のマジックライト アナラ イザー（a Magic Lite Analyzer sold by Ciba Corni ng Diagnostics,Walpole,Massachusetts）を用いて２ .0秒間測定する。

フォトン出力から濃度値への変換は、ふたつのキャリ
ブレーター、すなわちハイキャリブレーター（a high c
alibrator）及びローキャリブレーター（a low calibra
tor）を用いて行なう。特に、全標準曲線は、前述の手
法を、既知のCKMB量を有する一連の標準液について行な
うことにより、試薬のそれぞれのロットについて得られ
る。この標準曲線はユーザーに供給され、ユーザーはこ
の標準曲線をマジックライトアナライザー（Magic Lite
Analyzer）にプログラムする。ハイ及びローキャリブ
レーターは、標準曲線をユーザが検定を行なう際に用い
る特定の条件に適合させるため、アナライザーにより使
用される。

検定のために求められる値は、検定を下記のカテゴリ
ーによる621の診断された患者の試料について行なうこ
とにより決定された。そのカテゴリーは非加療の正常の
人（228）、診断されたMI患者（180）、及び病院加療の
非心臓疾患関連の患者（213）である。この研究に基づ
き、非加療正常人に対する０から7ug/の規定範囲、及
び病院加療の非心臓疾患関連の患者に対する０から10ug
/の規定範囲が最も良好な診断効果を与えることがわ
かった。この研究に基づき、更に、10ug/より大きい
ピーク血清CKMB値は通常、心筋傷害を示していると言え
ることが結論づけられた。しかし、当業者に既知のよう
に、この大きさの血清CKMB高濃度はMI（例えば充血性心
臓疾患、心筋炎及び乏血）以外の心臓疾患状態又は非心
臓組織（例えば骨格筋）から起こり得る。Lott等の“セ
ラム エンザイムス アンド イソエンザイムス イン
ザ ダイアグノシス アンド ディファレンシャル
ダイアグノシス オブ ミオカーディアル イスキーミ
ア アンド ネクロシス（Serum Enzymes and Isoenzym
es in the Diagnosis and Differential Diagnosis of
Myocardial Ischemia and Necrosis）,"Clin.Chem.,26:
1241,1980年，を参照のこと。

前述の“標準”検定計画案に加えて、“至急”検定計
画案もまた開発された。この計画案は、室温培養時間を
30分から10分（＋／−30秒）に短縮すること以外は標準
計画案と同一であった。至急検定法と標準検定法との相
関関係は、回帰方程式至急＝0.96標準−3.5ug/による
γ＝0.998であることがわかった。

標準検定法の典型的標準曲線は第４図に示されてい
る。標準液は最大トレーサー結合度25％で１−700ug/
CKMBの範囲であった。1,000ug/ CKMBまで“フック
イフェクト（hook effect）”は現れず、120までの検定
チューブが“エンド オブ ラン（end of run）”効果
を起さず一度に操作できた。

標準検定法の最小検出適用量は0.65ug/であり、非
特定結合（non−specific binding）は、加えられた標
識の0.07％であった。キャプチャー及びトレーサー抗体
の結合活動性（binding kinetics）を比較すると、10分
間の定温培養後、90％より大きい割合のCKMBが固相に結
合していたことが観察された。しかし、トレーサーは平
衡に達していなかった。その結果、10分間の定温培養に
よる検定法、すなわち至急検定法において、標準曲線
は、30分間の定温培養によるものより約50％低かった。
これらの条件下では、最小検出適用量は1ug/であっ
た。

標準検定法の正確さと精度は下記のように試験され
た。1.14から263ug/の範囲の154の血清試料を、本願
発明の方法及び既存の電気泳動技術を用いて検定した。
本願発明の検定法は前記電気泳動法とよく相関し（γ＝
0.938）、一次回帰方程式CKMB（本願発明）＝1.03CKMB
（電気泳動）−0.719ug/（第５図参照）であった。

同様にして、0.1から340ug/までの範囲の168の試料
について、標準検定法はハイブリテック社（Hybritech,
Inc.）販売のタンデム−E CKMB イムノエンザイマティ
ック アッセイ（Tandem−E CKMB immunoenzymatic ass
ay）と良く相関し（γ＝0.942）、回帰方程式はCKMB
（本願発明）＝1.16CKMB（タンデム−Ｅ）＋7.5ug/で
あった。

更に本検定法の正確さを評価するために、３つの血清
試料（1.7−105ug/）を最も低い標準液で1:2及び1:4
に希釈し、CKMBについて検定した。リカバリー（recove
ries）は８％から110％、平均93％の範囲であった。

マクロ−CK−１（macro−CK−１）を用いた数個の試
料からは正確な結果が得られた。同様にして、溶血、高
脂血症、及び30mg/dlまでの濃度のビリルビンは本検定
に重大な影響を与えないことがわかった。

26の検定（Ｎ＝96）のそれぞれについて３〜５回検定
した３つの試料から得られたイントラ−アッセイCV値
（intra−assay CV values）は、それぞれ2.5,4.1,及び
210ug/のCKMBを含有する患者の血清について、12.7
％,8.1％，及び4.1％であった。同じ試料について、イ
ンター−アッセイCV値（inter−assay CV values）は1
4.4％,11.7％，及び6.8％であった。

試薬の安定性に関して、磁性粒子に結合した抗−CKB
抗体及びDMAEで標識化された抗−CKMB抗体は、４℃の水
性媒体に保存した場合少なくとも６ヶ月間は安定であっ
た。重要なことに、前述したVaidya等の方法に関して、
CKMB標準液の酵素活性は、25℃の水性媒体に１日保存し
た場合、40％減少することが観察された。一方、同じ標
準液のCKMB塊（CKMB mass）は、同じ条件下に２日間保
存した場合、完全に安定であることがわかった。

先に示すように、抗−CKMBをアクリジニウム エステ
ルで標識化し、抗−CKBを磁性粒子上に固定することに
より、本願発明はCKMBに対する迅速で高感度の検定法を
与える。同検定法は、室温でたかだか10分間の定温培養
に対して少くとも1ug/ CKMBの最小検出適用量を達成
し、また標準曲線は700ug/ CKMBまで有効である。血
清試料に適用する場合、同検定法は既存の方法と良く相
関し、患者試料中のマクロ−CK−１、又は高いレベルの
CKMM及びCKBBの存在による干渉の影響を受けない。要約
すると、本願発明の検定法は、早く、容易に使用でき、
従来の検定法より干渉を受けず、さらにこれら従来の検
定法の感度を保持しているものである。

本発明の実施態様を以下に項分け記載する。

（１） 生物体液中のクレアチンキナーゼのMBイソ酵素
を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）生物体液の試料、（ii）クレアチンキナー
ゼのＢモノマーに対する抗体であって、固体支持体に結
合したもの、及び（iii）クレアチンキナーゼのMBイソ
酵素に対する、標識化されたモノクローナル抗体、の混
合物を形成し、 （ｂ）前記混合物を定温培養し、 （ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離し、そして （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
と、 の各工程から成る方法。

（２） クレアチンキナーゼのMBイソ酵素に対するモノ
クローナル抗体がIgG1型のマウスモノクローナル抗体で
あることを特徴とする実施態様１記載の方法。

（３） クレアチンキナーゼのMBイソ酵素に対する抗体
が化学ルミネセント物質で標識化されていることを特徴
とする実施態様１記載の方法。

（４） 化学ルミネセント物質がアクリジニウムエステ
ルであることを特徴とする実施態様３記載の方法。

（５） 化学ルミネセント物質がジメチルアクリジニウ
ムエステルであることを特徴とする実施態様４記載の方
法。

（６） 固体支持体が磁性粒子から成ることを特徴とす
る実施態様１記載の方法。

（７） 固体支持体が磁性粒子から成り、クレアチンキ
ナーゼのMBイソ酵素に対するモノクローナル抗体がジメ
チルアクリジニウムエステルで標識化されているIgG1型
のマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする実
施態様１記載の方法。

（８） 更に、既知のMBイソ酵素濃度を有する試料につ
いて（ａ）から（ｄ）の各工程を実施することによって
標準曲線を作成し、この標準曲線を使って標識の検出さ
れた量を濃度値に変換することにより試料中のクレアチ
ンキナーゼのMBイソ酵素の濃度を決定する付加的工程を
含むことを特徴とする実施態様１記載の方法。

（９） ネズミ由来の雑種株化細胞から産生されるモノ
クローナル抗体であって、ヒトクレアチンキナーゼのMB
イソ酵素の抗原性決定子の１種類以上と特異的に結合
し、IgG1型から成るモノクローナル抗体。

（10） ネズミ由来の雑種株化細胞が寄託登録番号HB93
89の株化細胞であることを特徴とする実施態様９記載の
モノクローナル抗体。

（11） 寄託登録番号がHB9388のネズミ由来の雑種株化
細胞。

（12） 実施態様11記載の雑種株化細胞の変異体であっ
て、ヒトクレアチンキナーゼのMBイソ酵素の１種類以上
の抗原性決定子に特異的に結合しそしてIgG1型から成る
抗体を産生する変異体。

【図面の簡単な説明】

第１図は次の抗−CK抗体の特異性及び“サンドイッチ”
相溶性を示した表である。抗−CK抗体:AH6−−抗−CKM;
CA8−−抗−CKB;13G1−−抗−CKMB;及び007−−抗−CKM
B。標準曲線（０−1,000ug/）は表に示されたキャプ
チャー／トレーサー抗体を使用したCKBB,CKMM及びCKMB
のそれぞれについて作成された。相溶性の組合せ
（“＋”組合せ）は1ug/以上の感度を有した。非相溶
性の組合せ（“−”組合せ）は0.1％未満の免疫反応性
を有した。13G1抗体はCKBB（約１％）と“トレース”交
差反応性を有することがわかった。 第２図は007抗体の特異性を示している。特に、この図
は種々の濃度の純粋CKMB（△印）、CKMM（×印）、及び
CKBB（○印）存在下で007抗体に標識化したCKMBを結合
させることを示している。数値は０標準液（Bo）のカウ
ントと比較した拮抗剤の存在下での結合したカウントの
百分率と加えられた拮抗剤の濃度（ug/ml）の関係とし
てプロットしてある。 第３図は、各種の検定法を行なう際に含まれるCKMM及び
CKBBによる阻害に対するCKMB標準曲線の感受性を示して
いる。黒丸はCKMBのみを含む標準曲線を示し、白丸は5,
000ug/のCKMMを加えた標準曲線を示し、そして三角は
1,000ug/のCKBBを加えた標準曲線を示している。 第４図は、抗−CKB抗体（CA8）をキャプチャー抗体とし
て、抗−CKMB抗体（007）をトレーサー抗体として使用
することにより得られる典型的標準曲線を示す。 第５図は、本願発明に従って行われたCKMB検定法（抗−
CKB（CA8）をキャプチャー抗体とし、抗−CKMB（007）
をトレーサー抗体とした）と、従来の電気泳動分離技術
に従って行われた検定法との間の相関関係を示してい
る。患者の血清は双方の方法で２度テストされた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クリスチン シー ヴィトコーカス アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 フォックスボロ ハワード アベニュー 11 (56)参考文献 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，33［９ ］（1987）Ｐ．1517−1520 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，30［７ ］（1984）Ｐ．1157−1162 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，32［４ ］（1986）Ｐ．657−663 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，32［６ ］（1986）Ｐ．1139 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ. Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．，24［１］（1986) Ｐ．97−102 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，32［３ ］（1986）Ｐ．476−481

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物体液中のクレアチンキナーゼのMBイソ
   酵素を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）生物体液の試料、（ii）クレアチンキナー
   ゼのＢモノマーに対する抗体であって、固体支持体に結
   合したもの、及び（iii）クレアチンキナーゼのMBイソ
   酵素に対して特異的であり、かつヒトクレアチンキナー
   ゼのBBおよびMMイソ酵素とは実質的に交差反応性のない
   IgG1型のモノクローナル抗体であって、標識化されたも
   の、の混合物を形成し、 （ｂ）前記混合物を定温培養し、 （ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離し、そして （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
   と、の各工程から成り、上記（ａ）〜（ｄ）の工程を１
   時間未満で完了することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】クレアチンキナーゼのMBイソ酵素に対する
   前記抗体が化学ルミネセント物質で標識化されているこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記固体支持体が磁性粒子から成ることを
   特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】更に、既知のMBイソ酵素濃度を有する試料
   について前記（ａ）から（ｄ）の各工程を実施すること
   によって標準曲線を作成しそしてその標準曲線を使って
   標識の検出された量を濃度値に変換することにより、試
   料中のクレアチンキナーゼのMBイソ酵素の濃度を決定す
   る工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】生物体液中のクレアチンキナーゼのMBイソ
   酵素を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）生物体液の試料、（ii）クレアチンキナー
   ゼのＢモノマーに対する抗体であって、磁性粒子から成
   る固体支持体に結合したもの、及び（iii）クレアチン
   キナーゼのMBイソ酵素に対して特異的であり、かつヒト
   クレアチンキナーゼのBBおよびMMイソ酵素とは実質的に
   交差反応性のないIgG1型のモノクローナル抗体であっ
   て、化学ルミネセント物質で標識化されたもの、の混合
   物を形成すること、 （ｂ）前記混合物を定温培養すること、 （ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離すること、 （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
   と、 （ｅ）既知のMBイソ酵素濃度を有する試料について前記
   （ａ）から（ｄ）の各工程を実施することによって標準
   曲線を作成しそしてその標準曲線を使って標識の検出さ
   れた量を濃度値に変換することにより、試料中のクレア
   チンキナーゼのMBイソ酵素の濃度を決定すること、の各
   工程から成り、上記（ａ）〜（ｄ）の工程を１時間未満
   で完了することを特徴とする方法。
6. 【請求項６】ネズミ由来の雑種株化細胞から産生される
   モノクローナル抗体であって、ヒトクレアチンキナーゼ
   のMBイソ酵素の抗原性決定子の１種類以上に対する特異
   的結合能を有しかつヒトクレアチンキナーゼのBBおよび
   MMイソ酵素とは実質的に交差反応性がなくそしてIgG1型
   であることを特徴とするモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】前記ネズミ由来の雑種株化細胞が寄託登録
   番号9388または9389の株化細胞であることを特徴とする
   請求項５記載のモノクローナル抗体。
8. 【請求項８】ヒトクレアチンキナーゼのMBイソ酵素の１
   種類以上の抗原性決定子に対する特異的結合能を有しか
   つヒトクレアチンキナーゼのBBおよびMMイソ酵素とは実
   質的に交差反応性がなくそしてIgG1型であるモノクロー
   ナル抗体を産生するネズミ由来の雑種株化細胞。