JPS62163697A - のう胞性線維症の検出とモノクロ−ナル抗体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ この発明は、ひと免疫反応性トリプシンＣ１ｎＴ）また
はその誘導体（例えばトリプシン、トリプシノーゲン、
およびキモトリプシン、キモトリプンノーゲン）から誘
導されるＭＡｂの製造法、および血液、血清、リンパ液
および排泄（糞１史）試料、または任色の体液特に濾紙
上で乾燥した血液試料中におけるＩ　ｎ　’Ｉ”　６度
の測定におけるこれらＭＡｂの使用に関するしのである
。

［先行技術］ １（敗の研究者が、のう胞性線維症の新生児において１
１Ｕｒａ度がヒ昇していること［例えば、キング等（１
９７９年）、ランセット（Ｌ　ａｎｃｅｔ）　ｉｉ　　
１２＋７−１２１９頁、クロスリー等（１９７９年）、
ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　１巻４７２−４７４頁］
およびこの濃度は多くの場合その後正常値以下に低下す
ることを報告している。その結果、近年になって、適当
な治療法の早期確立が予後を改善し［オーキセンハム等
（１９７７年）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ディ
シーズ・才ブ・チルドレン（Ａｍ。

Ｊ　、１）　ｉｓ、ｃｈｉｌｄ、）　１３１巻９７３−
９７５頁、フレマー等（１９７７年）、ヘルベヂカ・ペ
ディアトリカ・アクタ（ｉｉｅｌｖ、Ｐａｅｄｉａｔｓ
、Ａｃｔａ）　３２巻１０７−１１４頁］おそらく不適
当な処置とカランセルの場合の年数を省略できるとの証
拠が集まって来ているので、スクリーニングテストとし
てのｔｒｔ’ｒ濃度測定［りｏスリー等（１９１１１１
年）、クリ二カ・キミ力・アクタ（ＣＩｉｎ、Ｃｈｉｍ
、Ａｃｔａ）１１３巻＋　１１−１２１頁］のプログラ
ムが開始されノこ。

紙上で乾燥した血液試料中におけるＩｌｌ’ｒｉ１５度
の上界を測定４°ることによる新生児のう胞性線維症ス
クリーン用アツセｒが数種開発された［キング等、前掲
、クロスリー等、６ｉｆ掲、およびエリアス等（１９７
７年）、ランセット（Ｌ　ａｎｃｅＬ）　ｉｉ　、　　
１１２５頁〕。５日令で高濃度のＩＲＴが見られた場合
には、乳児を１か月日に再検査する。高濃度が続く場合
、陽性の診断が出る可能性がある。

のう応性線維症（Ｃ１−’）の血液スポットで上界して
いる分子種は、トリプシンの酵素前駆体だと考えられて
いるが［クロスリー等、前掲、ゲオカス等（１９７９年
）、アメリカン・ジャーナル・オブ・フイジオロジ−（
Ａｍ、　Ｊ　、　Ｐ　ｈｙｓｉｏｌ、）　２３６　Ｑ　
７７−８３頁］、種々のラジオイムノアッセイ法では、
測定している物質が酵素前駆体なのか活性酵素なのか、
あるいは（多分）これら抗原の組合わせなのか明らかで
なかった［オコンナー等（１９８３年）、クリ二カ・キ
ミ力・アクタ（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉ組Ａｃｔａ）２９巻
＋５３−１５９頁］。このことは、明らかに、種々のア
ッセイがそこで用いろ個々の抗体製品と反応する主要分
子種、およびトレーザー抗原として用いる分子一種によ
り、アッセイ法が異なるため、これらアッセイ広間に不
一致を生ずる原因となり得るらのである。このことおよ
びその他の理由から、ＩＲＴの測定価値およびスクリー
ニングプログラム１こ才ｊけろこの種のテストの役割に
ついて多くの議論が生じた［ペディアトリクス（Ｐ　ａ
ｅｄｉａＬｒｉｃｓ）　ｌ　９８３年、７２（６）７４
１−７４４頁］。膵臓に由来する他の蛋白質ら、のう飽
性線維病による障害の結果として血液中に放出されろ可
能性がある。

また、上記従来方法では、ポリクローナル抗血清を用い
、大工の分析試料を必要とすることが多く、方法が比較
的複雑で、高度の技術的熟練と装置を要し、そのため、
新生児を大規模にスクリーニングするのに特に適するし
のではないことが指摘される。

［発明の記載］ したがって、この発明は、血液中のひとＩｒ１Ｔの検出
に係る改良法を使用することにより、臨床ベースで使用
できる新生児ＣＦ検出用診断法を提供することを目的と
するものである。

またこの発明は、上記臨床検査に使用できるＩ【じｒモ
ノクローナル抗体（ＭＡｂ）の製造法を提供することを
目的とする乙のである。

この発明は、モノクローナル抗体の製法において、下記
工ｒｉ： （ｉ）精製ひとＩＲＴまたはそれを含む抽出物を得る工
程、および （ｉｉ）上記誘導体または抽出物を投与した動物から得
た抗体産生細胞をクローン化することにより、上記誘導
体または抽出物に対する抗体を生成させる工程 を含むことを特徴とする方法をｔＪａ供するものである
。

工程（ｉ）において適当な抗原抽出物は、クロスリー等
、クリ二カ・キミ力・アクタ（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、
　ＡｃＬａ）　１９８１年ｌ１ｌ−１２１頁の方法によ
るひと剖検すい臓から得ることができろ。

工程（ｉｉ）において、誘導体またはその抽出物を投与
するに適当な動物はマウスまたはラットである。そのう
し、マウスが好ましい。また、精製ひとｌＲ’ｌ’抽出
物を１回またはそれ以上没！Ｉするのが好ましい。この
方法か好ましいため、誘導体に特異的なモノクローナル
抗体を得る作業が単純化される。

誘導体または抽出物を投与したマウスを投与後に適宜店
殺し、ひ臓を摘出し、さらに処理して細胞懸濁液を作る
。細胞懸濁液は、さらに精製（例えば遠心分離）して、
マウスミエローマ細胞との融合に用いるひ臓白血球また
はリンパ球を分離することができる。

りａ−ニング技術は、ガルフル等、ネイチュア（Ｎａｔ
ｕｒｅ）２６　Ｇ　／８５５０−２頁（１９７７年）記
載の技術等に広範に基づくことができるか、そこでは細
胞融合剤としてポリエチレングリコールを用いてハイブ
リドーマ細胞が作られ、次いでこれが、適当な細胞フィ
ーダ一層を用いる限界希釈に括づいてクローン化または
所望により適宜再クローン化される。

ハイブリドーマ細胞の培養にはウェルプレートを用いる
のが好ましく、各ウェルには適当な細ＩＩ３培養培地と
共に細胞懸濁液を置く。

スクリーニングアッセイ用に細胞試料を除いておくのが
好ましく、これは以下に記載するように実施ケる。スク
リーニングアッセイに基づいて、一定数の最もよく生育
したウェルを保存用に選ぶ。

スクリーニングアッセイ後、限界希釈により一定数の特
異的抗体産生クロノタイプを選択してモノクローナル抗
体分泌セルラインを得ることができ′　る。

限界希釈クロノタイプを含むウェルブレー１・から採取
した試料についてさらに実施したスクリーニングアッセ
イに基づいて、一定数の特異的抗体産生クローンを大量
培養用に増殖さＵるため選択する。

上記の方法で用いるに適当なスクリーニングアッセイは
、下記工程： （Ａ）ひとｒｌｔＴで表面を被覆する工程、（＋３）工
程（Ａ）の抗原を０９記のように製造したひとＩＲＴか
ら誘導されるモノク［ｌ−ナル抗体に接触さける工程、
および （Ｃ）工ｒｉ（［３）で生成した複合体を検出工程に付
する”’ｆ、、ｒｉ からなるものである。

好適には、工程（Ａ）においてウェルプレートを用い、
その各つＪルには、ひとｌ１ｌｉ’を適用する。

次いで、ひと目じｒから誘導したモノクローナル抗体を
各ウェルに加える。使用できる好適な検出工程はＥＩＡ
工程であり、そこでは適当な酵素結合体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）が複合体に結合され、次いで基質が加えられる
。別の方法として、ｒｔｌＡ、ＦＩＡ、凝集、粘着、ま
たは化学発光も適当な検出工程として用いることができ
る。

上記スクリーニングアッセイ方法の目的は、試験細胞が
ひとＩｎＴに特異的な抗体を産生じていることを確かめ
るにある。

この発明はまた、ひとＩＲＴ検出用アブセイ方法におい
て、下記工程： （ｉ）ひとＩｆｌＴから製造したモノクローナル抗体を
、抗原を含む疑のある流体試料と接触さける工程、およ
び （ｉｉ）工程（ｉ）で生成した複合体を検出工程に付す
る工程 を含むことを特徴とする方法を包含するしのであ上記の
アッセイ方法において、抗原はひとＩＲＴである。モノ
クローナル抗体は前述のように製造され、アッセイされ
る特定のひと１ｒｔＴに関係したものである。

検出工程は、スクリーニングアッセイ方法に関連して報
告されている（′Ｐ：！：！、のらのでよいが、ＲｒＡ
またＥｒＡが好適である。

好適な［２１Ａについて使用できろ適当な酵素としては
、ホスファターゼ、ベルオキノダーゼ、ウレアーゼまた
はグルコシダーゼが含まれる。Ｅ　をへの感度は、ビオ
ヂンコンジュゲートＭΔｂと酵素コンジュゲートアビノ
ンまたはストレプトアビジンのような適当な増幅系を用
いて向上さ仕ろのが好適である。

ひとＩＲ’Ｌ”の存否は、後記実施例に示すように、の
う胞性線維症の適当な診断ｈａｔ助資料として用いられ
る。

流体試料は、血清、血漿、ふん便または尿のような適当
な体液から得られる。

上記アッセイ方法は、前述のようにチューブ、ビーズ、
ウェルプレートまたはマイク【１プレートを用いて達成
でき、また慣用方法を含む他の適当な方法で実施できる
。【本の長尺部材を用いろ「スティック」法ら用いるこ
とができ、その場合モノクローナル抗体でまずその上を
コートし、その後工程（１）および（２）を行う。

この発明の他の実施態様では、モノクローナル抗体を種
々のサイズのビーズに共有結合させる。

大、きな（直径２−１０ｉｘ）ビーズはＲ１へ、ＥＩＡ
。

ＦｌΔ試験に適当であり、小さな（直径０．１−２０μ
）ビーズは、血清、血漿または他の体液中の抗原の存否
に対する試験を迅速（例えば２−３分）に実施すること
を可能にする。ビーズは、ポリスチレン、ナイロン、ガ
ラスまｌこは他の適当な材料で作ることができろ。ポリ
スチレンについて述べると、モノクローナル抗体は、モ
ルディ等、ツヤ−ナル・オブ・セル・バイオ【１ノー（
Ｊ　、　Ｃｅ１ｌ。

ｒ３ｉｏ）６４ａ７５頁（１９７５年）記載のカルボッ
イミド法を用いてこれに結合さＵ・ろことができる。

ナイロンビーズでは、適当な結合方法はヘンリーおよび
ヘルマン、ジャーナル・才ブ・イムノ【１ジカル・メソ
ッド（Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ）３５
　Ｑ　２８５百（＋９８（１年）３己１１＆のゲルター
ルアルデヒド法である。ガラスピーズでは、適当な結合
方法として米国特許第４２１０７２３号記載のノラン化
剤法を用いることかできる。これらのビーズアッセイま
たはラテックスアッセイにおいて、モノクローナル抗体
と結合したビーズを試験血清または血漿よたは他の体液
と試験４−ろとき、適当な検ｍ標準を用いて凝集の測定
を行う必要がある。この態様では、ラテックス粒子また
はビーズを既知の反射係数を有する均一な球状に作り、
検量標準として光散乱拡大、ンヤドウアングル、シャド
ウ材料の厚み、走査および透過電子顕微鏡またはレーザ
ー光散乱等に用いる。

以下に記載するように、捕獲タッグ法を実施する場合、
抗ひとＩ　ｆｔ　’ｒ　ｔｌｌｉ獲ＭＡ回モノク【１−
ナル抗体）が支持体表面に結合され、ひとＩＲＴを含む
疑のある血清または他の体液で試験する。捕獲ひとＩｌ
ｌ’ｒ抗原に結合した適当に標識されている第２ＭΔｂ
抗体でタッグされた場合、これにつつく検出工程は試料
中のひとＩＩじ■゛σ否の精密なアッセイ法を提（ｊ（
４°る。

以下の実験において、ひとＩＩ（Ｔは１１η述のクロス
リーの文献に記載された方法で製造した。その代りに、
市販品を用いることらできる（カルビオケム社カタログ
第６５０２５７号）。

後記のように捕獲タッグ実験を行なう場合、問題のＭＡ
ｈは、第１ＭＡｂ，抗原および標識第２ＭΔｂを組む３
元複合体の生成が関係した２部位アッセイ法に付される
。抗原は被検流体試料に含よれており、ＭＡｂはタッグ
と捕獲ＭＡｂの雨音の作用をなし得ず、したがって抗原
は弔−の反応部位またはエピトープをｆＴすることがわ
かった。２部位アッセイは、試験管、マルヂウエル・プ
レート・ディツプスデック、プラスデックビーズまたは
ラテックスビーズのような任意の適当な支持表面を用い
て前述のように実施できる。アッセイは、後述のように
、「順」タイプ、同時タイプまたは［逆」タイプの何れ
でもよい。

［順」タイプアッセイは、流体試料と接触する前に支持
体に結合した捕獲ＭＡｂであって、２元複合体が標識タ
ッグＭＡｂに接触する前に抗原・捕！１ＭＡｂの２元ｍ
合体を生成しているしのを含む。

これは、支持体表面に結合した捕獲ＭＡｂ，流体試料お
よび標識ＭΔｂの全てが同時に接触して３元複合体を生
成する同時アッセイ用に変更°４°るごとができる。し
かし、「逆」アッセイら用いることが可能であり、この
場合標識タッグＭ　Ａ　ｂを流体試料に加えて２元複合
体を生成させ、ついでこれを支持体表面に結合した捕獲
ＭΔ１）と接触させて３元複合体を作る。

さらに、上述の増幅アッセイ系では、捕獲Ｍ／〜ｂ１抗
原、ビオチンコンノコゲートタッグＭＡ１１および酵素
コノジュケートアビンンまたはストレプトアビジンから
なる４元複合体を生成さＵｏることができる。

また、場合によっては、ｔめコー１−　した支持体に面
、すなわち、任０の適当な方法、例えば１１；Ｉ述のカ
ルボジイミド法により捕獲ＭＡｂをｊ％　（ｆ結合させ
た乙のを用いることができろ。

別の実施態様として、この発明のアッセイ法をひとの膵
臓障害および／または膵臓炎の診断に用いることができ
ろ。この場合、ひと血漿または血清中におけろＩ　Ｉｔ
　ｉ’　８度の」１昇検出は膵臓障害の指標となる。ま
た、ひと血漿または血清中における異常に低いＩＲＴ濃
度らまた、外分泌性膵臓不全の指標である。

［実験例］ 細胞融合およびハイブリッドの選択 ヒトＩＲ’ｌ’を注射して３０後に頚部を転座さＵ・て
殺した５匹の免疫にしたマウスから牌臓を５１１を閉状
態で摘出した。このマウスは、１１り記クロスレイ（　
Ｃ　ｒｏｓｓ　ｌａｙ）の文献に報告されたところに従
うで、ｉｌ．Ｘｊ製されたヒト＋１１１を予め２回注射
して免疫にされた。胛臓は、５ｘＱの完全媒地（８５％
の１１１）Ｍ１１６４０および１５％の牛胎児血清、１
００１、Ｕ／ｍＱのイムノリン、ｌ　０　０　μｇ／．
ｔＱのストレブトマインン、２ＸＩＯ−３Ｍのグルタミ
ノ。ギブコ、グランド、アイランド（Ｇｌｂｃｏ、Ｑ　
ｒａｎｄ、Ｉ　ｇｌａｎｄ）、ニューヨーク）を含有す
る２つの６０１ｍｍのぺ１・り皿（フアシヨン（Ｆａｌ
ｃｏｎ）、３００１゜オックスナード（’Ｏｘｎａｒｄ
）、カリフォニア）内に置かれた。角度６０°でチップ
の端ｌｅｅを曲げた、３ｙＱの使い捨ての注射器に取り
付けた２ＸＩ８ゲージ針により、上記牌臓の皮膜を除去
して細胞懸濁液か製造された。次いで、この細胞懸濁液
は２２ゲージ針を付けた１０ｘ（ｌの注射器に吸引され
、そして、適当な圧力で噴出せしめられた。この操作は
、大きな細胞塊りおよび破片を除去４°るために微細な
メツシュのステンレススチールスクリーンを介して、こ
れ等の細胞をフアシヨン（Ｆａｌｃｏｎ）２００ｔチユ
ーブ内に濾過せしめる６；１に、２回行われた。

Ｌ記細胞懸濁液を新しいファルコン２００！デユープに
移送ケる前に、該細胞懸濁液は室温にて５分間静置させ
て小さな塊りおよび皮膜破片が沈降さ仕られた。これ等
の細胞は室温にて５分間３５０Ｇで遠心分離させられ、
この上澄み液を第１細胞ペレツトから新しいチューブに
デカントするととらに、５分間７００Ｇで回転させて第
２細胞ペレツトを得、２つのペレットをプールするとと
乙に５１１２の完全媒地中にｉＴ￥懸澗した。次いて、
それぞれタークスおよびトリパンブルー色素によって胛
臓の白血球（ＳＷＢＣと記す）を数えるととらにその生
存能力を推定し、＋００ｘｌＯ”の生存ＳＷ［３Ｇを総
容ｆｆ１５ｘｌ！の完全媒地内で個別のファルコン２０
０１チューブに放置した。融合に用いるＮＳ−１ミエロ
ーマ細胞は、一旦、室温にて１５分間、３８０Ｇで遠心
分離によって洗浄し、完全媒地内で５ｘｌＯ”生存細胞
数／１１２に調整計しめた。

２５ＸＩＯ”のＮＳ−１とｔｏｏｘｔｏ”の免疫５ＷＩ
ＩＣとを混合し、室温にて５分間、３５０Ｇで遠心分離
を行った。上澄み液をデカントし、その残留媒地を注意
深くパスツールピペットにより除去し、５村の使い捨て
のガラスピペット　（コーニングガラス、Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ、ニューヨーク）を用いて、１５％（Ｖ／Ｖ）のジメ
チルスルホキシド　（ＤＭＳＯ）を含むＲＰＭＩＩ６４
０中の４２％（ｖ／ｖ）のポリエチレングリコール（１
’ＥＣ９ＭＷ１５４０）溶液（ベーカーケミカル社（Ｂ
ａｋｅｒｃｈｅ＠１ｃａｌ）Ｃｏ、ニュージャーシイ）
を３７℃にて添加し、電気ピペッタ−（ピペットーエイ
ドードルモントーサイエンティフィック　Ｃｏ、ブルー
マン（Ｂｒｏｏｍａｌｌ　）、Ｐａ）の助けにより、そ
の５ｙｚＱのピペットにより３０秒間再懸濁した。この
ＰＥＧ−細胞懸濁液はさらに室温で３０秒間放置した後
、粘性のあるＰＥＧ溶液との完全混合を十分に確実とす
るために、当該チューブを一定に振りながら９０秒間に
亘って５１１Ｑの完全培地をパスツールピペットにより
滴下した。さらに、５酎の完全培地を即座に添加すると
ともに転倒により混合し、１５０秒間静置してから、室
温にて５分間３５０Ｇで遠心分離を行った。その上澄み
液をデカントし、電気ピペッタ−付の５ＲＱピペツトを
用いて、該細胞ペレットを５ｙ１２の完全媒地中にゆっ
くりとｉｌＴ懸約した。特に、完全に細胞塊集を破壊し
ないように注意をした。トリダックステッパー（ベルコ
ガラスＩｎｃ、ヴイネランド、ニュージャーシイ）を用
いて、１０−’Ｍのヒボキサンチン（ｉｉｙｐｏｘａｎ
Ｌｈｉｎａ）（シグマ）、４ｘｌＯ−’Ｍのアミノプリ
テン（ＡａａｉｎｏｐＬｅｒｉｎ）（シグマ）、Ｉ、Ｇ
ＸＩＯ−’Ｍのチミドリン（Ｔ　ｈｙｍｉｄｒｉｎｅ）
（シグマ）および４Ｘ１０−’Ｍの２−メルカプトエタ
ノール（ＭｅｒｃａｐｔｏｅＬｈａｎｏｌ）（ｉｉＡＴ
メディアム）を含むＩｘ＆の完全媒地フィーダ細胞とし
て、ｌＸｌ０’の正常［ＩＡＩ、Ｂ／Ｃマウスｓｗｎｃ
を含有するコスタ−（ＣｏｓＬａｒ）２４ウエルプレー
ト（ＣｏｓＬａｒ３５２４　、ケンブリッジ、マサチュ
ーセッツ）（以降、■°融合プレートと称する。）４個
の各ウェルに、０．０５ｉ１２の細胞懸濁液を添加した
。全部で６回の融合をこの方法で行った。

次いで、上記ビ融合プレートを、３７℃の湿ったＣ０，
５％、空気９５％中に放置した。最初、細胞を５０又は
７日日に供給し、その後、必要に応じて、０．５ｘＱの
新しいＩＩΔ′ｒ媒地を供給した。

通常１０口１にハイブリドーマの成長を示す各ウェルか
らスクリーニングアッセイのために０．５ｘＱの媒地を
除去するとともに、０．５Ｊ１１７の新しいＩＩ　Ａ　
Ｔ媒地て置換した。スクリーニングアッセイに基づき、
保存のために最も強力に成長した多数のウェルを選択し
た。選択したウェルを原ウェル（１°ウエル）と合流し
て成長せしめるようにし、次いで、各ウェルを半分に割
り、２４ウェルコスタ−プレート（２°　プレート）の
新しいウェル（２°　ウェル）に移送した。毎日、各ウ
ェルを検査し、必要な時に当該２°の２４ウエルコスク
ープレートの２倍、３倍、あるいは４倍等に拡張した。

１４〜２８日目から日日胞に夏！１゛媒地を供給した。

上記２°のプレートにおいて少なくと６２つのウェルが
強力に成長したとき、再スクリーニングのために各ウェ
ルの上澄み液からクローン型のウェルの上澄み液を選択
し、２次スクリーニングアブセイの結果から多数の特異
性抗体生産クローン型のものを選択して、限界希釈する
ことにより、モノクローナル抗体分泌性セルラインを生
成せしめた。

各２°のウェルから選択したクローン型の細胞を再びｕ
Ｑし、トリパンブルー排除法によりウェル当りの生仔細
胞敗を推計した。各クローン型のものをプレートする直
前に、頻度を０．５細胞１０．０５ｉ１２とするため、
ＨＴ媒地中で（らし各細胞が融合後２８０以上ら古いも
のであれば完全媒地中で）適宜に連続した希釈を行った
。次いで、０、ＩｘＱのＩｌ’ｌ’媒地あるいは完全媒
地中にＩ×１０−５の正常なマウス胛臓供給細胞を含む
、平底の９６ウエルを有する組織培養プレート（フロー
、ラボラトリイズ、ミッンソウガ、オンタリオ、カナダ
ＸＬＤプレート）の各ウェルに、上記容量をトリダック
ステッパーと一緒に添加した。その後、該ＬＤプレート
を３７℃の湿った５％のＣＯ，。

９５％の空気中に放置し、７〜■０日後、クローナル増
殖のスクリーニングを行った。正に増殖した各ウェルか
らスクリーニングのために０．ＩｚＱの上０み液を除去
し、これ等のウェルに最初に０゜１〜０．１５ｘｅのＩ
ＲＴ媒地又は完全媒地を供給した。ＬＤスクリーニング
アッセイに基づき、大ｍ培養へ拡張すうために“ペター
（ｂｅｔｔｅｒ）”特異性抗体生産クローンの最小２が
選択された。

一方、多量のＭＡｂを得ようとする場合には、複数の雌
のＢＡＬ　ｎ／Ｃマウスに生存数２×１０８のハイブリ
ドーマ細胞の注射に先立って１４日間、２，５，１０．
１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン、アルド
リッチ　ケミカル　コーポレーション、ミルウォーキー
、ウイスコンソン）の腹腔内注射を行い、該細胞を注射
１２〜１４日後に、マウスから腹水を集めた。この腹水
を遠心分離により清浄し、４５％の硫酸アンモニアで沈
降を行うことによりＭＡｂを回収せしめ、４℃あるいは
一７０℃のいずれかにて０．０１％のナトリウムアジド
を含む燐酸緩衝食塩水（１）ＢＳ）中に貯蔵した。

モノクローナル抗体のスクリーニングアッセイＰ　［３
Ｓ　＋、：ｌ：、ト１１Ｚ’Ｉ’（Ｉ　Ｏｕ９／ｘＱ）
（１）５０ｔｔＱを室温（２５℃）にて１時間添加する
ことにより、（Ｊ字形底部を有する９６ウエルマイクロ
試験プレート（ディスポーザブルプロダクトプティ、リ
ミテッド（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
　　ｒ’ｔｙ、　　Ｌｔｄ）アプライド、南オーストラ
リア）の各ウェルに、コーティングした。該プレートを
倒置しかったたいて過ａ１の抗原を除去し、次いで、０
，０５％のトウィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０　（シグ
マケミカルコーポレーション、セントルイス、ミズーリ
ー）を含むＩ）　Ｉ３　Ｓにより該プレートを３回洗浄
した。次いで、各ウェルに５０μｇの組織培養上澄み液
を添加するとともに室温に１時間インキュベートするこ
とにより、ヒトＩｒｔ’ｌ”に対するＭＡｂを分泌する
クローンを検出した。倒置およびたたくことによりａ離
ＭＡｂを除去し、当該プレートをｌ）　Ｉ’３　Ｓ　／
　ｌ−ウィーンで３回洗浄した。ベルオキシターゼを結
合したうさぎ抗マウスイムグ【ｌプリン（ダコパッツ、
コペンハーゲン、デンマーク）のＩ）　ｌ’３　Ｓ　／
　）ウィーン１／＋０００希釈液１００μＱを添加する
ととらに、さらに室温に１時間インキュベートした。プ
レートを再び丸返し、ＰＩ３５／トウイーンで３回洗浄
し、活性化した基質！００μＱ（使用直前に、クエン酸
５０ｍＭ、　Ｏｌ・リジンジヒドロクロラ゛　イド（シ
グマケミカルコーボレーンヨンの０−トリツノで、希＋
１ｃＱから再結晶したしの）２．５ｍＭ％　ｐｌＩ　４
　、５のＩ’：　Ｄ　Ｔへ０．０２５ｍＭを含む基質溶
液１ＯｉＱに過酸化水素の３％溶液ＩＯμｇを加えたも
の）を各ウェルに加えた。１０分後に、３Ｍの■ＩＣ１
ｌ！５０μｇを加えることにより呈色反応を停止させる
と色が青から黄に変化し、タイターテックスマルチスキ
ャン（Ｔ　１ｔｅｒｔｅｃｋ　　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）
で４５０ηｍの吸収を記録した。

ＭＡｂのヨード化 １３ｉ１ｃｈｃｍ、　　ＢｉｏｐｈｙＳ、　　Ｒｅｓ、
　　Ｃｏｍｍｕｎ、　　、　　８０゜８４９〜８５７に
記載されたフレーカ−（Ｐ　ｒａｋｅｒ）およびスペッ
ク（Ｓ　ｐｅｃｋ）の方法後、ＭＡｂをヨード化した。

ヨードゲン（ピアス・アンド・ワリナー、チェシャー、
英国）をジクロ【ｌメタン（０，２ｔｔ　９／　ｗｃ）
に溶かし、その１５μＱを試験管に加え、ゆるやかに温
めてノクロロメタンを蒸発させることにより、ヨードゲ
ンの薄膜を試験管の底部に沈着させた。試験管を水浴中
に置き、０．２ＰＢＳ中のＭＡｂ＋　００ｕ９と０．Ｉ
ｍＣ；　Ｎａ”Ｊを加え、１５分間烈しく撹拌した。反
応混合物を１）［３Ｓに対してＪｆ！Ｌｌｌｉして未結
合ヨードを除き、Ｎ　ａｌ　２　Ｓｌヲ４５％（Ｎｌｌ
ａ）ｔｓＯ＋’？’沈降すｕ゛、最後に０゜０１％ナト
リウムアンドを含むＰＢＳに再溶解さＵ・た。ヨード化
は、またＢ　ｉｌｃｈｅｍ、　　Ｊ　、、　　８９　、
１１４．１２３に記載されたクロラミン（Ｃｈｌｏｒａ
ｍｉｎｅ′１′）法（６）（ただし、クロラミン１゛の
２Ｍ過剰を使用。）によって行われた。

ベルオギシターゼ結合 過酸化ヨウ素酸塩で酸化されたベルオキシターゼを用い
て１．１　、　Ｉｌｉｓｔｃｈａｍ、Ｃｙｔｏｃｈａｍ
、　２２巻１０８４−１０９１頁、１９７４年のナカネ
およびカイオイの変法により、ｒｒｉ’ｒモノクローナ
ル抗体の結合を行った。蕉留水中の５ｘｇ／ｘＱのベル
オキシターゼを室温で２０分間０．１Ｍの過ヨウ素酸ナ
トリウム！１５容と混合するとともに、未反応過ヨウ素
酸塩を、ｐｌＩ、５のクエン酸０゜００１Ｍで平衡させ
たセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５のカラ
ムを用いるゲル濾過により除去した。

モノクローナル抗体（ＰＢＳ中）を、エスオキシクーゼ
Ｉｍｇ当たり抗体２ｍｇの割合で添加し、直ちに、その
ｐ　ＩｌをｐＨ９、５の１Ｍ炭酸ナトリウムを加えろこ
とにより９，０〜９．５にｇ整した。室温で時々撹はん
を行−）で２〜３時間反応を行わせ、バーパー、　　Ｊ
　、　　菖　ｍｍｕｎｏｌ　　　Ｍｅｓｈ、　　　Ｉ　
　ｌａｘ　　　Ｉ　　５−２３頁（１９７６年）に記載
のようにｐｌ−１９，５，２゜０Ｍのエタノールアミン
のｌ／Ｉ　Ｏ容を添加しその反応を停止Ｆさせた。４℃
で一夜放置した後、エタノールアミンを、Ｐｒ３Ｓで平
衡さ仕たセファデックスＧ２５カラムを用いるゲルろ過
で除去するとと乙に、その酵素結合体を０．０１％のメ
チオレートの存（Ｅ下・ピＣで貯蔵し／二。

１１１′ｒ−４Ｈ２／４１ビオチ・ン杷１識本法は次の
１−程を含む： （ｉ）１．０ｍ１〜１Δｂ（３ｍｇ／ｍｌ）をＯ，ＩＭ
ＮａｌｌＣＯ６に対して４℃において３時間にイったり
透析する。

（ｕ）０．ｌ　Ｍ　Ｎ−ヒト【Ｊキシザクノンイミドビ
オヂン（ｉｉＮＩＩＳ）（ングマーカタログＮｏ、１１
−１７５９から得られｊ１乙の）のジメヂルスルポキン
ド（３４、Ｉ　ｍｇ／＋ｎｌ）溶液を調製し、添加した
ＭＡｂ−１あたり６０μｌを添加する。

（ｉｉｉ）混合ホイールを用いて室温で１時間培養する
。

（ｉｖ）０．１％アジ化ナトリウムを含むＩ’ＢＳに対
し４℃で２４時間透析を行う。

（ｖ）使用するまで４℃に保存する。

蛋白質の定ｍ ｒＬｙｌａＬＬおよびＰａｒｉｓｈ　　Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　　［３ｉｏｃｈａｍ、１２１巻、２＋３−２１
４頁（１９８２年）の方法により蛋白質の定虫を行った
。

排災Ｚ又ニゲ尖り Ｐ　ｒｉｌ　Ｓ中のＭＡｂのそれぞれ５０μ［１０μｇ
／ｍｌ）を含むＰＶＣ９Ｇウェルマイクロタイタープレ
ートの谷ウェルを室温で１時間インキュベートすること
により抗原捕獲／タッグ実験を行った。

非結合ＭＡｂは、裏返してプレートをたたき、次いでス
クリーニングアッセイで述べたようにＩ）＋１Ｓ／トウ
ィーンで洗浄することにより除いた。次に、抗原捕獲を
、ＭΔｂ７１７．環ウェルにＰＢＳ／ｌ・つイーン中の
抗原（０−１０μｇ／ｍｌ）各５０μｍを室温で１時間
加えろことにより達成した。ウェルを前記のようにして
洗浄した。次いで、各ウェルにＰＢＳ／トウイーン中の
種々の１２５１拮合ＭＡｂ５０　ｐ　ｌ（２０μｇ／ｍ
ｌ）の１１０００００ｃｐを室温で１時間加えることに
より、捕獲抗原を１１１結合ＭＡｂでタッグした。洗浄
後、結合コンジュゲート（結合物）の存在を、コントロ
ンガンマカウンター中で計測することにより決定した。

上記に代え、抗原捕獲／タッグ試験を１）　［３Ｓ　Ｅ
ｌ＋適当なＭＡｂの夫々５０μＱ（１０μｇ／肩Ｑ）を
含む９６ウエルミクロタイタープレートの各ウェルを室
温で１時間インキュベートすることにより行った。非結
合Ｍ　Ａ　ｂは、プレートを裏返して軽く叩き、スクリ
ーニングアッセイのために記載したＰＩ３５／ツイーン
で洗浄して除去した。抗原捕獲はＭＡｂ被覆ウェルに室
温で１時間Ｐ　１３９　／　’ｌ”　ｍｅａｎ中の各抗
原（０〜Ｉ　ｘｇ／ｙ（Ｑ　５０μＱを加えることによ
り行った。ウェルは前記のように洗浄した。

捕獲抗原は、各ウェルに対してＰ　１３　Ｓ　／　’Ｉ
’　ｗｅｅｎ中の種々ベルオキノグーゼ結合ＭΔｂ５０
μＱ（１μ９／２ｆ２）を室温で１時間添加４゛ること
により、ベルオキングーゼ結合ＭΔｂでタッグした。洗
浄後、結合コンジュゲ−１・の存在はスクリーニングア
ッセイで記載したように１００μＱ基質の添加により決
定した。

結果 径芙慨 ヒトＩＩＲＴに対しＭＡｂを分泌する数百のハイブリド
マ・クローンを、まず酵素検定法で同定し、いくつかを
選定してザブク【１−ニングおよび腹水流体生成を行な
い、ついで捕獲／タッグ・アッセイを行なった。

キャプチャー／タッグ・抗ヒト・Ｉ１１’ｒ−ＭＡｌ）
の組合せ ４つのキャプチャー／タッグの組合仕を前記したような
ヒトトリプシンに対しつくられたＭＡｂから産生じた。

以下に示す。

（１）捕ＩＭＡｂ−１ｒＬ’ｒ−３Ｂ６／ｌ−１０−１
５７とタッグＭＡｂ・ＩＲＴ−２ＤＩ／１８２（２）捕
獲ＭＡｂ・ＩＲＴ−３Ｂ６／１４０−１５７とタッグＭ
Ａｂ−Ｉ　ｎ’ｌ’　−３ＢＧ／８４（３）捕獲ＭＡｂ
−１ｆｔ’ｒ−３Ｄ６／８４とタッグＭＡｂ−１ｒｔＴ
−２ＤＩ／１８２（ ４）捕獲ＭＡｂ・ｌ　Ｒ’ｒ−３Ｃ４１５４とタッグＭ
Ａｂ−１ｒｔ’ｒ−４Ｂ　２／４１ヒトＩＲＴの濃度を
変化させることによりこれら４つの捕獲／タッグＭ　Ａ
　ｂについて得られた結果を以下の表に示す。

表 イ４ ・４ ］ｆｆ１ ｎｖ／ｚＱ １０００　１２１２３　　　　４４６２　　　　　＋０
０１１　　　　　、　２．０１００　　４７２８　　　
　２２０７　　　　５５８１　　　　　１．２１０　　
１０３５　　　　５７３　　　　７１９　　　　　０．
７１　　　　３５９　　　　　３２７　　　　　３０３
　　　　　０．２０　　　　２３４　　　　　２９３　
　　　　１９１　　　　　０．１生物学的試料におけろ
ヒトＩＲ１’のラジオメトリヅク・アッセイ（Ｉ　ｒｔ
Ｔ−３Ｉ３（ｉ／＋　４０−１５７；１１１Ｔ−２１）
！／＋８２） 前記したような新生児から得られた適当な試料は、血液
、血しょうまたは血清を含んでらよいか、あるいはのう
性線維症の新生児スクリーニング・プログラムに適する
ように、一般に丈夫で紙に制限されない適当な吸収物質
上の乾燥血液スポット、血しようスポットまたは血清ス
ポットの杉であってもよい°。

アッセイ法 スクリーニング・カードから打ち抜いた３ｍｍの血液ス
ボブト自体を一夜、室温にて０．０５％５％ライ−２ｆ
ｉリン酸緩衝生理的食塩水ｐｌＢ、４（３００１１Ｑ）
のデユープ中、Ｉｌｌ’ｒ’−３ｒ３６／ｌ　４０−　
ｌ　５７ｂｊｔ覆６．４ｍｍのポリスチレンビーズの（
Ｔ在下でインキュベートした。翌朝、１００μＱの１−
１２５ラベルＭＡｂ・Ｉ　ｎ’ｒ　−２Ｄ　Ｉ　／　ｌ
　８２を各チューブに加え、ざらに室ｌＱで１時間イン
キュベートし、ビーズに結合した残りのラジオ活性を洗
浄した後測定した。結果を添付の第１図および第２図に
示す。

３年間までの間スクリーニング試料カード上に室温で貯
蔵した３９の確認ケースのＣＩ”から５０齢で集めた血
液試料をアッセイした。これらの試料を誕生の日付およ
び位置を合せた対照試料に対しテストした。合Ｕ・た対
照と比較した３９人のＣＦ幼児のうち３６人において該
アッセイは上界したｒＲＦレベルを示した。２つの試料
は恐らく試料変性のために上界したレベルを示さなかっ
たしので、残りのＣＦ試料は、またクロスリイ・ラジオ
イムノアッセイ（当初のテスト時）によりいずれか検知
可能なＩＲＴを示すのに失敗したのである。

この特異的な幼児には高価なすい臓酵素ザブリメントが
必要であった。

５４８５人の幼児から５日齢で集めた試料をテストし、
２７人の幼児が上界した［ｔＴレベル（１２５ｎ９／ｙ
ｒＱ）で測定された。これら２７人の幼児を１月齢で再
テストすると（再試料率０．５％）、２人だけが上昇し
たＩＲＴレベルを示し、その後、のう性線維症として確
認された。

ＩｆｌＴ・３１３Ｇ／ｌ　−１０−＋　５７オｊよびＩ
ＲＴ・２＋）Ｉ／＋８２の、ラジオメトリック法イＩＡ
法による比較 ３ｍｍの血液スポットのＩＲＴを検知するために、１−
１２５ラジオメトリック・アッセイの代えて、酵素コン
ジュゲート・タッグＭΔｌ）・ＩｎＴ・２ＤＩ／＋８２
を用いた。アッセイは同様な方法で行った。ただし、捕
獲抗原はＰＢＳツイーン中パルオキンダーゼ・コンジュ
ゲートＩＩｊＴ２ＤＩ／＋８２（１００μｌりの谷テス
トへの添加によりタッグし、室温で１時間インキュベー
１・した。洗浄後、結合コンジュゲートの存在はスクリ
ーニング・アッセイについて記載したような基質の添加
により測定した。両アッセイの、−組の血液試料につい
ての結果を以下に示す。

試料番号　　ラジオメトリック法　　ＥＩＡｎｙ／　ｘ
Ｑ　　　　　　ｎｌ／　ｚＱ１５８８２Ｇ　　　　　　
　２１８　　　　　　　２０３１６９７６５　　　　　
　５００　　　　　　　４９　Ｇ１７１＋８８　　　　
　　　　９９　　　　　　　１８０（別のＩｆじｒ−Ｅ
ＩＡスクリーニング系（目じｌ’−３Ｃ４／　５４、ｌ
　Ｉｌ’ｒｌ　１３２／＝Ｉ　ｌ））別の９６ウ工ルプ
レート増幅酵素イ１４ノアッセイを、感度および使用の
；、：　ｋ、Ｊさの両者の向上を目的として開発した。

萌述のように、このアッセイをスクリーニングカードか
ら打抜いた３ｆｆｉＩＩｌ全血スポツトについて実施す
る。スポットを、ＩｎＴ−３Ｃ４１５４で’ｈｌ　４Ｘ
［した９６ウエルマイクロタイタープレートのウェル中
、０．０５％トゥイーン２０含有のりん酸緩衝食塩水（
ｐＨ７，４）で希釈したビオヂン標識ＭＡｂ・ＩＲＴ−
４１３２／４１の１００μσ中で、室温において２〜２
４時間インキュベートする。インキュベーション後、プ
レートをスクリーニングアッセイで記載したように洗浄
し、ＩＩＩＰ標識ストレプトアビジン（アメルンヤム、
カタログ番号ＩｔＰＮＩ２３１）５０７ｚｄを谷ウェル
に加え、室温で１５分間インキュベートする。プレート
をスクリーニングアッセイ記載のように洗浄後、６ウエ
ルに基質を加えて、２０分間帖合酵素と反応させる。標
準物質および未知検体の吸収をマイクロタ、イタ−リー
ダー中、４１０ｎｍで読む。アッセイ検出範囲は、ＩＩ
ＺＴの予備アッセイ濃度を含む標窄の系列希釈により定
めた。血液スポット中、ゼロから区別できる最小検出可
能血漿Ｉｒｔ　Ｔ　濃度は、Ｉ　、　５　ｎｇ／ｍＱで
あった。結合は、２５００　ｎ９／ｌｉＱまでトリブン
ノーゲン濃度の上昇と共に連続して上昇した。このアッ
セイの実施は、そ及実験（第３図）および探索実験（第
４図）に示す。

この酵素イムノアッセイを用いるそ及実験の結果は、ｌ
　−１２５−ｆ”）セイにおＬＩテＩ　ｒｌＴ　−３８
６／１４０−１５７とＩｆｌ′ｒ−２ＤＩ／＋　８２の
組合わ仕を用いるアッセイと同等であり、このアッセイ
が３９名のＣＦ児試料中３６名のＩｌｔ’ｒａ度上昇を
対芯上昇対照値から区別できたことを示す。

（探索実験（ＩｒｌＴ−３Ｃ４１５４、ＩＲＴ−４Ｉ３
６か月にわたって日常的新生児スクリーニング用に全乳
児（Ｎ＝＋６５００）から集めた血液スポット試料をア
ッセイに付した。Ｉ　４０　ｎ９／ｚＱｃ而漿）より大
きなＩ　ＲＴ濃度を示す試料を全て再アッセイに付し、
反復アッセイ値が再び上記カットオフ値より大きな場合
、１１令で採取する第２試料を要求した。反復アッセイ
をＩ　６０１［Ａｉｌの５０検体について行ない、その
うち９６の乳児検体が１４０ｎ９／ｙσより大きな号１
０均レヘルを示した（再サンプル率０．６％）。これら
９６の乳児から第２試料を受取り、アッセイを再び行な
った。ＩＲＴ濃度１４０ｎｇ／ｚＱより大きな乳児を全
て発汗（ｓｗｅａｔ）試験および臨床検査に付した。７
名の乳児で濃度の上昇が続いた。塩素分析。

（アッセイの利点） このアッセイは、新生児におけるのう胞線維症のスクリ
ーニングに際して、既存方法よりすぐれた幾つかの利点
を示す。このアッセイは、モノクローナル抗体の使用に
よる特異性を有し、増幅イムノアッセイ２部位法の使用
で得られる高感度を示す。この高感度はまた、非分泌状
態に近づいているのう胞線維症の低下のモニターにら有
用である。このアッセイ形式の特別な利点は、標識が抗
原でなくＭＡｂの１つに導入されることである。

これによって、従来の競争的ラジオイムノアッセイ用ト
レーサーの製造に際し起り得るトリプシノーゲンに対す
る損傷がほとんど起らなくなる。さらに、固相支持体の
使用により、沈澱抗体およびポリエチレングリコール添
加の必要性がなくなる。

遠心および吸引の必要もなく、多数の試験管を取扱う際
の作業と過誤の危険性が減少する。

（膵臓機能の試験） 血漿または血清のｒｒｔ’ｒ測定は、膵臓疾患の特異的
試験として推奨されている［テムラーおよびフェルバー
、ラジオイムノアッセイ・オブ・ヒユーマン・プラズマ
・トリプシン（Ｐａｄｉｏｉｍｕｎｏａｓｓａｙｏｒ　
ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　　ｔｒｙｐｓｉｎ）、パイ
オンミカ・工・バイオフイジカ・アクタ（ｎ　ｉｏｃｈ
ｅｍ、　ｂｉｏｐｈｙｓ。

ΔｃＬａ）４４５巻７２０−７２８頁（１０００年）、
エリアス、レッドノジウ、サーキュレーテイング・コン
セントレーンヨンズ・オブ・イムノリアクティブ・トリ
プシン（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｃｏｎｃｃｎｔｒａ
Ｌｉ。

ｎｓ　　ｏｆ　　ｉ＋ｍｍｕｎｏｒｅａｃＬｉｖｃ　　
Ｌｒｙｐｓｉｎ）、ランセット（ＬａｎｃｅＬ）ｉ　　
６６−Ｇ８ｎ（１９７７年）１゜この発明の別の実施態
様として、適当なアッセイ形式におけるこれらのＩ［じ
ｒ’−ＭＡｂを、小石血漿または血清中のＩｎ’ｌ’濃
度の測定に用いて膵臓疾患の診断の一助とすることがで
きる。

ｎ１ｊ述のように、患者から得る適当な試料としては、
血液、血漿または血清が含まれる。

（アッセイ法） （＋）　　ＰＩ３５に入れた捕獲ＭＡｂ（Ｉ　ＲＴ−３
［３Ｇ／　Ｉ　４０−１５７また＋、ｔｌｆｌＴ−３０
４１５４）５０μＱ（１０μ９／ｘσ）を、９６ウエル
・マイクロタイタープレートの各ウェル中、室温で１時
間インキュベートする。倒立して非結合ＭＡｂを除き、
プレートをタップし、ついでスクリーニングアッセイ記
載のように洗浄する。その代りに、予めコートしたプレ
ートを用いることができる。

（２）　　ｆＲＴ抗原漂品または検体試料をＰ［３Ｓ／
Ｔ中に適当に希釈してプレートに加え、抗原捕獲を室温
で１時間進行させる。ウェルを前述と同様に洗浄する。

（３）ついで、捕獲Ｉ［じｒ抗原を、６ウエルに１）［
！Ｉｓ／’１’中のＭＡｂとコンジュゲートした西洋わ
さびペルオキシダーゼを室温で１時間加えることにより
タッグ（付け）する。（＋ｉｉｆ述のように、１１１１
１）フンノユゲー）１１１Ｔ−２１’）ｌ／Ｉ　５２を
ｂｌＩ　１隻１１ｔ′［’−３８６／１４０−１５７と
用い、ＩＩ　Ｉｔ　Ｐコンノコゲ−１−１１１′Ｆ−４
１３２／４１を’ｐａ捕獲ＩＩじＩ’　−３Ｃ４／　５
　、Ｉと用いる。）ウェルを洗浄４−ろ。

（＝１）ｏ、ｏｔ（０，００３％ＩＩｔＯｔ）活性化Ａ
　［３ＴＳＷ質［２，２“−アジノジ（３−エチルペン
ゾチアゾロノスルホン酸）シグマカタログ番号へ−１８
３８１１００μｆｌ！を各ウェア１／　１．：加え、室
’１Ａ！Ｌテ２０分間インキュベートする。反応を１％
修酸０．０ＥＩＩ２で停止さ仕る。

（５）　プレートを、マイク【ｌタイタープレートリー
ダー上において４２０ｎｍで読みとり、検体試料の１１
ｔＴＪ５度を適当な標準曲線で測定する。

結果を下表に示す。

０　　　　　　　　　正常血漿　　　　４７８　０２・
１９　　　正常血漿　　　　６３１（ｉ　　　０．４５
９　　　正常血漿　　　　４６３２　　　（１，８５４
正常１（１を漿　　　　４２Ｇ３　　１．６９８　　膵
臓炎確認血漿　　１６９１２５　　１．９４２　　膵臓
炎確認血漿〉５００２５０　　２．４６５　　膵臓炎確
認血漿　　１５０５００　　２．５８５　　膵臓炎確認
血漿　　１！０膵臓炎確認血漿　　１００ １ｒえＴ−３１３６／＋　４０−１５７とｌ　ＲＴ−２
Ｄ　Ｉ／　ｌ　５２ 標準曲線　　　　　　　　　　　　　　１ｆｌＴ（ｎｇ
／ｘ１２）　　Ａ　４２０　ｎｍ　　　検体試料　（ｎ
ｇ／ｘ（り００、−　　　　　正常血漿　　　１１２０
４７　　　０．０４１　　　　　正常血漿　　　１４５
２９４　　　０．１０１　　　　　正常血漿　　　９９
４１８８　　　０．１５７　　　　　正常血漿　　　６
５９３７５　　　０．３２３　　　膵臓炎確認血漿　　
１７８５７５０　　　０．５８６　　　膵臓炎確認血漿
　　２５２３１５００　　　１．００７　　　膵臓炎確
認血漿　＞　３０００３０００　　　１．３５３　　　
膵臓炎確認血漿　＞　３０００膵臓炎確認血漿　＞　３
０００ 両アッセイ形式とも、膵臓病が確認されたｒｌ−８の血
漿と正常血漿の値を明確に識別４−ろことができた。

（アッセイのｆり点） エンドペプチダーゼ類は膵臓に特異的である点でユニー
クなしのであるため、Ｉｎ’ｌ’は外分泌性機能測定ま
たは障害の理想的なマーカーであり、それ故面漿または
＋Ｉ＋ｒ清中におけろ１１じｒ濃１．７　”！常はこの
器官の損傷を反映している。急性膵炎の診断に他の酵素
（アミラーゼ、リパーゼ）が多用使用された来たが、こ
れら酵素はこの器官に特異的でなく、濃度上昇は膵臓以
外の器官および組織の病的状態によ−て６生ずる。ボリ
ン〔ｌ−ナル抗原を用いろ公知の１−１２５１１じ１′
ラジオイムノアツセイか急性膵炎のスクリーニングテス
トとして奨用されて来たが、この試験の中には４４％に
も上る高いアッセイ間変動係数のため成功しないものが
あった［コープ等、グイゼスチジン（Ｄ　ｉｇｅｓｔ　
１ｏｎ）２０巻＋５１−１５６頁（１９８０年）］。こ
れに反して、ＩＲＴ−３１３６／＋４０−１５７、ｔｎ
’ｌ’−２ＤＩ／１８２およびＩＲ’ｌ’−３Ｃ４１５
４、Ｉ　Ｒ’ｒ−４ｎ　２／４１の組合わせは１ｏｏｎ
９／ｍｕでアッセイ間変動係数が１２−１４％である。

この改冴により、ひと肝臓の外分泌性機能測定に対する
信頼できるアッセイ法が提供されるに至った。

−Ｌ述したように、アッセイ間変動係数が２−１４％で
あることかわかったので、この発明は従来のボリン［Ｉ
−ナルアッセイ系に較へて再現性が極めてずぐれている
といえろ。

Ｍ　Ａ　ｂの１−）に標識（例えば１ｔ５］、ビオチン
または酵ｆ：）を導入４゛ることによろに述の１１１点
は、標識をＩ　＋？　′ｖに結合゛４゛るとＩｌｔ’ｌ
’が極めて変性しやすいことから考えて、特に町Ｒ要で
ある。この談合の方法は本質的に変動性が太さいと考え
られるので、曝めて１１￥現性が乏しく、アッセイ間の
変動係数が大きく変る可能性がある（例えば、ｉり掲の
コープ等の文献参照）。

また、ＭΔｂに標識４−ると、現（１：、のところひと
の剖検材料からしか得られないＪＩＬＴに対する総必要
ｈ１が減少する。

この発明では、Ｉ　ＲＴ　４５度が少なくとら１１００
ｕ／Ｑの体液を再アッセイして再び！００μｇ／Ｑのカ
ットオフ値より大きな濃度か得られたときに、ＣＦ陽性
の結果とする。最小カットオフ値は１００〜１５０μ＆
／Ｃとするのが適当である。

各アッセイは、一般母集団に対４°る再サンプリング率
が１％またはそれ以下になるように較正することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図１１１１ｔＴ−３１３６／＋４０−１５７、ＩＲ
Ｔ−２ＤＩ／＋８２を用いて遡及的に測定したｔＴ濃度
を示すグラフである。ＰＩ々の期間貯蔵した５日令血液
スポットにおいて確認ＣＦを（・）、λ・を前試料群を
（＋）で示す。 第２図は探索実験（［ＲＴ−３８６／＋４０−１５７；
ＩＩ”ｔＴ−２ＤＩ／１８２）において、５］１′令の
血液スボントて１１られたｌ１ｔｉ″濃度の頻度分布を
示す図である。図中、右手の矢印２つはＣＦを、左手の
１つの矢印はスクリーン・カット・オフを示す。 第３図ハＩ　Ｉｔ　Ｔ　−３Ｃ４／　ｌ　５４、ＩＲＴ
−４ｒ３２／４１を用いて遡及的に測定したＩｒ１ｔ’
ｒ濃度を示４°グラフである。種々の期１７ｒＪ貯蔵し
た５１今血液スポットにおいて確認ＣＦを（・）で、対
照試料群を（＋）で示す。 第４図は探索実験（Ｉ　ＲＴ−３Ｃ４１５４、ＩＩｔ’
ｒ−４［３２／４１．−おイテ、５０令の血液スポット
で得られた＋　１１　’ｌ’濃度の頻度分布を示４”図
である。図中、小矢印はＣＦを、大矢印はカットオフ値
を示す。 特許出願人　マブコ　・　リ　ミ　テラ　ド代　理　人
　（弁理士）ＩＩｔ山　保　はか！名図面の浄書（内容
）こ変更なし） 第１図 ＋ｒ？蔵期開期間） 第３図 ＯＴｏｏ　　　　　２００　　　　３００　　　４００
　　　５００貯蔵期間（日）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫反応性トリプシン（ＩＲＴ）から誘導される
   モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の製法において、下記段
   階： （ｉ）精製ひとＩＲＴまたはそれを含む抽出物を得る段
   階、および （ｉｉ）上記誘導体または抽出物を投与した動物から得
   た抗体産生細胞をクローン化することにより、上記誘導
   体または抽出物に対する抗体を生成させる段階 を含むことを特徴とする方法。
2. （２）精製ＩＲＴひと剖検すい臓から得たものである、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）モノクローナル抗体がＭＡｂと接触する前に表面
   がＩＲＴ抗原で被覆された支持体を用いるスクリーニン
   グに付され、次いで生成する複合体がＭＡｂとＩＲＴ抗
   体の反応の存否を測定する検査に付される、特許請求の
   範囲第１または２項記載の方法。
4. （４）下記段階： （ｉ）ひと精製ＩＲＴまたはそれを含む抽出物で動物を
   免疫する段階、 （ｉｉ）動物からひ臓を摘出する段階、 （ｉｉｉ）ひ臓を処理して細胞懸濁液を作る段階、（ｉ
   ｖ）細胞懸濁液を精製してひ臓白血球またはリンパ球を
   分離する段階、 （ｖ）一成分として上記ひ臓白血球またはリンパ球を含
   むハイブリドーマ細胞を形成する段階、（ｖｉ）適当な
   細胞フィーダー層を用いて上記ハイブリドーマ細胞をク
   ローン化または再クローン化する段階、 （ｖｉｉ）ＩＲＴ抗原を用いてスクリーニング・アッセ
   イを実施しＩＲＴ特異性モノクローナル抗体を産生する
   ハイブリドーマ細胞を分離する段階、（ｖｉｉｉ）ＩＲ
   Ｔ抗原を含む疑のある流体試料を、段階（ｖｉｉ）後に
   分離されたハイブリドーマ細胞から製造したモノクロー
   ナル抗体と接触させる段階、および （ｉｘ）段階（ｖｉｉｉ）で生成した複合体を検出工程
   に付する段階 を含む、流体試料中のＩＲＴの検出方法。
5. （５）下記段階： （ｉ）ＩＲＴに対し反応性のモノクローナル抗体を分離
   する段階、 （ｉｉ）上記モノクローナル抗体をのう胞性線維症（Ｃ
   Ｆ）罹患の疑のある患者から得た流体試料と接触させる
   段階、および （ｉｉｉ）上記試料中におけるＩＲＴの存否を分析して
   ＩＲＴが上記モノクローナル抗体と反応したか否かを測
   定する段階 を含む、ＣＦの診断方法。
6. （６）段階（ｉｉ）においてビオチンをモノクローナル
   抗体と反応させ、ついで段階（ｉｉｉ）においてストレ
   プトアビジンまたはアビジンとコンジュゲートしたペル
   オキシダーゼの標識をもつ第２モノクローナル抗体を段
   階（ｉｉ）で生成した複合体と反応させる、特許請求の
   範囲第５項記載の方法。
7. （７）段階（ｉｉ）において血液スポット類をビオチン
   標識第１ＭＡｂとインキュベートする、特許請求の範囲
   第５項記載の方法。
8. （８）検出段階（ｉｉｉ）におけるアッセイ検出範囲が
   種々の濃度のＩＲＴを含む標準連続希釈物によって決定
   される、特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）最小血漿ＩＲＴ検出可能濃度が１．５μｇ／ｌで
   あり、この濃度が最高２５００μｇ／ｌまで増加する、
   特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）ＩＲＴ濃度が少なくとも１００μｇ／ｌ（血漿
    ）の試料を再アッセイに付したとき再び１００μｇ／ｌ
    のカットオフ値より高い濃度を示したときＣＦ陽性の結
    果が得られたとする、特許請求の範囲第９項記載の方法
    。
11. （１１）下記段階： （ｉ）ＩＲＴに対し反応性のモノクローナル抗体を分離
    する段階、 （ｉｉ）モノクローナル抗体を膵臓障害罹患の疑のある
    患者から得た流体試料と接触させる段階、（ｉｉｉ）上
    記試料中におけるＩＲＴの存否を分析してＩＲＴが上記
    モノクローナル抗体と反応したか否かを測定する段階 を含む、膵臓障害の診断方法。