JPH01163661A - ＩｇＧ捕捉抗体および多重単クローン性抗体検出系を用いたイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般的にはイムノアッセイに関し、より詳細に
は標識多重単クローン抗体検出系を用いた固相イムノア
ッセイ（′−関する。

発明の背景 抗原に対するすべてのイムノアッセイは、検体中に存在
する可能性のある抗原に対する特異抗体を結合した後、
その抗原−抗体複合体を規定された検出系により同定す
ることに基づいている。イムノアッセイ系の性能特性は
使用免疫反応成分の結合特性に大きく左右される。規定
された反応性を有する試薬を制限なく供給生産できる技
術が鍵となる。そこで単クローン抗体の生産および開発
に関する現在発展中の技術が多重抗原決定基を有する様
々な物質の検出にイムノアッセイを用いる検査者の興味
を集めている。

イムノアッセイ系に単クローン抗体を用いることの潜在
的な利点は研究者の認識するところであった。例えば、
十分規定された試薬が定常的に供給されれば明確な性能
特性を有するイムノアツセイ系を大規模に利用すること
ができるはずである。イムノアッセイは質量作用の法則
に従うので、各分子が抗原に相対するものとなっている
免役グロブリン調製物が利用できれば、イムノアッセイ
系のキネティクス、従って感度は向上する。このことは
特に固相イムノアッセイについていえる。何故ならば、
これらの系で利用し得る免疫グロブリン濃度は固相の結
合特性によって制限を受けるからである。

イムノアッセイ系に単クローン抗体を用いることに関連
して多くの長所が存するにかかわらず、単クローン抗体
を用いて作業する際に検査者が直面し得る潜在的短所も
多く存在している。

ウィルス抗原に対する単クローン抗体を用いる上での短
所の一つは、免疫に用いたウィルス抗原株には存在する
が、人間に感染するウィルスには広く認められないよう
な抗原決定基を単りローン抗体が認識してし甘う可能性
である。これは誤った陰性反応につながる可能性がある
。

もう一つの可能性は、単クローン抗体は特異抗原決定基
と反応することがら、固相抗体−抗原−液相抗体複合体
の形成を伴うサンドイッチアッセイ（＝使用し難いので
はないがという点である。単クローン抗体は非特異的吸
収法寸たは共有結合的結合法のいずれによっても固相へ
の結合が困難なことがあり、また研究者は、単クローン
抗体を標準的標識技術を用いて各種レポータ（ｒｅｐｏ
ｒｔｅｒ　）基で標識する際に苦労している。

研究者によって単クローン抗体の開発および用途には長
足の進歩を遂げたが、多重エピトープを有する物質の検
出および／または定量のために標識多重単クローン抗体
検出系を用いたイムノアッセイを開発した者はこれまで
一人としていない。

広範な系統の物質に対する単クローン抗体を用いた多く
のイムノアッセイを記述する多くの論文および特許が出
ている。

米国特許箱４，６５９，６７８号は、検体と抗体試薬と
を液相中で反応させた後、反応生成物を、未標識抗体試
薬に対して生成させた不溶化抗−抗体で捕捉することよ
り成るインキュベーション時間を短縮した固相イムノア
ッセイ法に関する。

米国特許箱４，５３５，０５７号は、単りローンＩｇＭ
Ｈ８Ｖウィルス／抗原特異抗体と読取り可能な標識され
、好ましくはビオチン−アビジンに基づく検出系を用い
ることにより、生物学的液体中のＨ８Ｖ抗体または抗−
Ｈ８Ｖ　ＩｇＭ免疫グロブリンを検出するための固相イ
ムノアッセイを記載している。

米国特許箱４，４３０，４３７号は、Ｈ８ｖタイプ１お
よび２ヌクレオカプシドタンパクに対する単クローン抗
体を用いた試験方法を記載している。

米国特許箱４，２７１，１４０号は、酵素に基づく検出
系を用いた固相イムノアッセイを記載している。

米国特許箱４，５１４，５０５号は、単クローン抗体混
合物を用いることによりポリペプチド（例えばヒト絨毛
膜ゴナドトロピン）に対する感度を高めた放射性イムノ
アッセイを記載している。

米国特許箱４，２２８，２３７号は、リガンドの検出に
標識アビジンおよびビオチン標識試薬を用いた不溶性相
酵素イムノアッセイを記載している。

米国特許Ｒｅ、　３１，００６は、酵素に基づく検出系
を用いる不溶性相イムノアッセイを記載している。

Ｃｏ１１ｉｎｓ等、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、２１．Ａ５．ｐｐ、３７５〜３８０ｊＭａｒ、
１９８５）は、単クローン抗体対（一つは捕捉用、一つ
は検出用）を用いた牛ヘルペスウィルスタイプ１を検出
するための酵素連結免疫吸着剤アッセイの開発を記載し
ている。

Ｎｅｒｕｋａｒ等、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、２０．　ＡＩ　、　ｐｐ、　　１０９〜１１４
　（Ｊｕｌｙ　１９８４）は、ビオチン標識・多クロー
ン抗体と酵素標識ストレプトアビジンが検出に用いられ
る酵素連結免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を記載し
ている。

Ａｄ、１ｅｒ−８ｔｏｒｔｈｚ等、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１８
．　Ａ６　、ｐｐ、　１３２９〜１３３４（Ｄｅｃ、　
１９８３　）は、Ｈ８Ｖ　ニ対すルヒオチン化マウス単
りローンエｇＭ抗体を用いてＨ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−
２を検出するビオチン−アビジン増幅酵素連結免疫吸着
剤アッセイを記載している。

単純ヘルにスウィルスの同定およびタイプ分けを論じて
いる多くの論文も存在する。

５ｙｖａ　ＣＯ，Ｐ、ｒｏｄｕｃｔ、　Ｉｎｓ、ｅｒｔ
　ｆｏｒ　Ｈｅｒｐ、ｅｓ−Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕ
ｓ−１／、Ｈｅｒｐｅｓ　　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕ
ｓ−２Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ／Ｔ
ｙｐｉｎｇ　Ｔｅ５ｔ　（１９８４）は、フルオレセイ
ンイソチオシアネートで標識された多重単クローン抗体
を用いた組織培養中の単純ヘルペスウィルスの同定およ
びタイプ分けのための試験を記載している。

Ｆｒａｍｅ等、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ。

２０、　Ａ２　、　ｐｐ、　１６２〜１６６　（Ａｕｇ
、　１９８４）は、酵素イムノアッセイおよび多重未標
識単クローン抗体を用いた単純ヘルペスウィルスの同定
およびタイプ分けを記載している。

（）ｏｌｄａｔｅｉｎ等、Ｊ、　　Ｉｎｆｅｃｔ、１ｏ
ｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｖｏｌ。

１４７、　Ａ５１．　ｐｐ、　８２９〜８３７　（Ｍａ
ｙ　１９８３　）により開発された単純ヘルペスウィル
ス−１または単純ヘルにスウィルス−２のいずれかと反
応する未標識単クローン抗体のパネルは、培養された単
純ヘルペスウィルスの血清型を決めるための免疫螢光試
験に信頼性よく用いることができるほか、臨床検体の直
接抗原検出と同時に型分けを行うのにも用いることがで
きる。

Ｐｅｒｅｉｒａ等、工ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ、　Ｖｏｌ。

６５、扁１．　ｐｐ、３６３〜３６７　（Ｊａｎ、　１
９８２）は、免疫螢光、中和および免疫沈降試験を用い
て単純ヘルペスウィルス臨床的分離物の血清型を決める
のに単クローン抗体パネルを使用することを記載してい
る。

Ｐｅｒｅｉｒａ等、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　工ｍ
ｍｕｎｉｔｙ、　Ｖｏｌ。

２９、　Ａ２．　　ｐｐ、　　７２４〜７３２　（Ａｕ
ｇ、　　１９８０）は、　Ｈ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２
の鑑別に有用でありかつ免疫螢光および中和試験に有用
な単クローン抗体の製造について記載している。

イムノアッセイに関連して、検体の採集および輸送も重
要である。ウィルス輸送媒質を論じる多くの参考文献が
存在している。特に重袋なのは、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅ
ｎｔ）に基づく輸送媒質に関するＢ、Ｆ、　Ｖｅｓｔｅ
ｒｇａａｒｄの考察である（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎ
ｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　３ｄ　ｅｄ、　
Ｖｏｌ、　Ｘ。

Ｃｈａｐｔｅｒ　４．Ｉ　Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅ
ｘ　Ｖｉｒｕｓ、　ｐｐ、　２２６〜２４２　（１９８
６）　）。

発明の概要 本発明は、主としてＩｇＧ捕捉抗体と少くとも二つの標
識単クローン抗体のカクテルを検出系として用い各単ク
ローン抗体に異なる（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）抗原決定基を
認識させることより成る多重エピトープを有する物質を
検出または定′Ｉｋするための固相イムノアッセイおよ
びキットに関する。

前記単クローン抗体はレポータ系の成分で標識でき、あ
るいはそれらは、特異結合対の一構成員で標識してもよ
い。それら単クローン抗体をレポータ系の成分で標識す
るときは、それらは直接に検出するおよび／または定量
することができる。

しかしながら、単クローン抗体を特異結合対の一構成員
で標識するときは、それらを標識されていなくても標識
されていてもよい該結合対の第二構成員と反応させる必
要がある。結合対の第二構成員が標識されてｂる場合に
は、反応が止んだ後、検出釦よび／または定量を行うこ
とができる。結合対の第二構成員が標識されていない場
合には、存在する可能性のある物質を検出するまたは定
量するにはその結合対をレポータ系の成分と反応させる
必要がある。

発明の説明 本発明は、 ａ）支持体を多重エピトープを有する物質を含む疑いの
ある検体と接触させ、そしてその際該支持体には主に不
溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ該Ｉ［Ｇ抗体は疑われて
いる物質に対して特異的なものとし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
ルと接触させ、そしてその際各車クローン抗体は異なる
抗原決定基を認識するものとしまた各単クローン抗体は
（１）レポータ系の成分で標識された単クローン抗体お
よび（２）特異結合対の第一構成員で標識された単クロ
ーン抗体より成る群より選択されるものとし；ｃ）　　
ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識されてい
てもよい結合対の第二構成員と反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
Ｃの生成物をレポータ系の成分と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
たは定量することより成る、多重エピトープを有する物
質を検出または定量するだめのイムノアッセイに関する
。

本発明によれば、イムノアッセイを捕捉抗体を固体支持
体に結合後、多重エピトープを有する物質を含む疑いの
ある検体を添加することより成る前進式（ｆｏｒｗａｒ
ｄ）サンドイッチアッセイとして行うことができる。反
応が止んだら未反応物質を洗浄除去し、そして既知量の
多重標識抗体含有カクテルをその混合物に添加する。

本発明によるイムノアッセイは更に、不溶化捕捉抗体お
よび標識抗体カクテルと検体を同時に添加することより
成る同時式サンドイッチアッセイとして行うこともでき
る。

捕捉抗体はいずれの免疫グロブリンであってもよい。し
かしながら本発明の好ましい態様は主にＩｇ［）を不溶
化捕捉抗体として用いる。

支持体は広範囲にわたる様々な支持体のうち任意のもの
であってよく、筐た適切な支持体の代表例としては次の
ものを挙げることができる：合成ポリマー支持体、例え
ばポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン、
例えばアミン化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなど；
ガラスビードなど、アガロース；など。

それら支持体は、該支持体への物質の直接結合を可能に
するために、反応性基例えばカルボキシル基などを含ん
でいてもよい。

好ましい態様において、その支持体はポリスチレン・マ
イクロタイタープレートウェルより成る。

本発明によれば、検出および／または定量される物質は
多重エピトープを有することにより特徴付けられる。例
示に過ぎないが、本発明の範囲に入るものとして次の物
質を挙げることがでさる：ポリペプチドおよびタンパク
、多糖類。

核酸、およびそれらの組合せ。更に細菌、ウィルス、染
色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜なども挙げ
ることができる。タンノセクの例は、核タンパク、糖タ
ンパク、硬タンパク、プロテオグリカン、ムコタンパク
、ヒストン、アルブミン、インスリン、ペプシンなどで
ある。

更にまた、凝血因子例えばフイブリノゲン、トロンビン
などのほか、ペプチドおよびタンパクホルモン、例えば
グルカゴン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモンなど
も挙げることができる。ウィルス例としては、アデノウ
ィルス；ヘルペスウィルス例えば単純ヘルペスウィルス
、水痘ウィルス、ヘルペスウィルスＢ１サイトメガロウ
ィルス、エプスタイン−バーウィルス、ヒトヘルペスウ
ィルスタイプ６；ポックスウィルス；ピコルナウィルス
；オルソミクソウィルス、パラミクソウィルス；コロナ
ウィルス；ラブトウィルス；トガウィルス；パンヤウイ
ルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）　；アレナウイルス；ル
ベラウィルス；アルボウィルス；レオウィルス：肝炎ウ
ィルス：レトロウィルス；発癌ウィルスなどが挙げられ
る、 本発明の単クローン抗体の調製方法は周知であり、また
広範囲にわたる様々な刊行物に引用されているがそのう
ち次のものの記載を本明細書の記載の一部に含める：　
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ
、　２５６：　４９５〜４９７　（１９７５）＋Ｐｅｒ
ｅｉｒａ、等、Ｉｎｆｅｃｔ、ｉｏｎおよびＩｍｍｕｎ
ｉｔｙ、　Ｖｏｌ。

２９、　Ａ２．　ｐｐ、　７２４〜７＋２　（Ａｕｇ、
１９８０）、　Ｏｉ、等、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌ　１
ｉ、ｎｅｓ。

ｐｐ、　３５１−３７１　ｉｎ　Ｂ、　Ｍｉｓｈｅ］ｌ
−およびＳ、　Ｓｃｈｉｉｇｉ（ｅｄ、）　５ｅｌｅｃ
ｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒｉｍ
ｍｕ、ｎｏｌｏｇｙ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ
、、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃ。

（１９８０）およびＣ）ａｌｆｒｅ等、Ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ　ｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：　　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　　ａｎｄＰｒｏ
ｃｅｄｕｒｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　７３ｚ　　１）Ｉ）。

１〜４６（１９８１）。これらの方法はここではそれ以
上説明しない。

選択された支持体に依存して、捕捉抗体は多クローン捷
たは単クローンのいずれのものであってもよい。固体支
持体への結合は、直接的または間接的であろうと、共有
結合的または非共有結合的であろうと、周知の方法を用
いて達成することができる。

本発明によれば、すべての単クローン抗体は、慣用技術
を用いて標識される。それらは、レポータ系の成分で、
あるいは特異結合対の構成員で標識することができる。

特異結合対は免疫型のものでも非免疫型のものであって
もよい。免疫型特異結合対の例は抗原−抗体系またはハ
ブテン／抗−７為ブテン系である。フルオレセイン／抗
フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗−）ニトロフェ
ニル、ビオチン／抗−ビオチン、ズプチド／抗ペプチド
などを挙げることができる。特異結合対の抗体構成員は
当業者によく知られた常法により製造することができる
。かかる方法は、動物を特異結合対の抗原構成員で免疫
することより成る。その特異結合対の抗原構成員が免疫
原性ではない、すなわちハプテンであるときは、それを
担体タンパクに共有結合させて免疫原性にすることがで
きる。

非免疫型結合対は、それら二成分が相互に対する自然親
和性をシェアはするが抗体ではない系を包含する。非免
疫型対の例は、ビオチン−ストレプトアビジン、内因子
−ビタミンＥ１２、葉酸−葉酸塩結合タンパクなどであ
る。

単クローン抗体を特異結合対の構成員で共有結合的に標
識するには様々な方法を利用できる。

方法の選択は、特異結合対の構成員の性質、所望の結合
のタイプ、および様々な接合化学に対する抗体の耐性に
基づいて行われる。ビオチンは、商業的に入手し得る活
性誘導体を用いることにより単クローン抗体に共有結合
的に結合することができる。これらのうちの一部は、タ
ンパクのアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド；炭水化物部分、アルデヒドおよびカル
ボキシル基にカルボジイミド結合を介して結合するビオ
チンヒドラジド；およびスルフヒドリル基に結合するビ
オチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである
。フルオレセインは、フルオレセインインチオシアネー
トを用いてタンノ々クアミン基に結合スることができる
。ジニトロフェニル＆ハ２．４−　ジニトロベンゼンス
ルホネートまたは２，４−ジニト−２６〜 ロフルオロベンセンを用いてタンパクアミン基に結合す
ることができる。ジアルデヒド、カルボジイミド結合、
ホモ官能性架橋、およびヘテロ三官能性架橋な言む他の
標準的な接合方法を用いて単クローン抗体を特異結合対
の構成員に結合してもよい。カルボジイミド結合は一方
の物質のカルボキシル基を他方のもののアミン基に結合
する有効な方法である。カルボジイミド結合は、商業的
に人子できる試薬である１−エチル−６−（ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いる
ことにより容易に行うことができる。

二官能性イミドエステルおよび二官能性Ｎ−ヒドロキシ
スク７ンイミドエステルを含むホモ二官能性架橋剤は商
業的に人子でき、そして一つの物質のアミン基をもう一
つの物質のアミン基に結合するのに用いられる。ヘテロ
二官能性架橋剤は異なる官能基を有する試薬である。最
も普通な商業上入手し得るヘテロ三官能性架橋剤はアミ
ン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを一つ
の官能基として、そしてスルフヒドリル反応性基を第二
の官能基として有する。最も普通なスルフヒドリル反応
性基はマレイミド、ピリジルジスルフィドおよび活性ハ
ロゲンである。官能基の一つは、照射により様々な基と
反応する光活性アリールナイトレンであってもよい。本
発明による好ましい様式は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを介してビオチンと接合する単クローン抗
体である。

信号検出を容易にするために、単クローン抗体または特
異結合対の構成員をレボ−ティング系の成分で標識する
。レボ−ティング系という用語は、選択さｎたレポータ
、およびそのレポータを単クローン抗体または特異結合
対の成分に結合する任意の手段のことである。すなわち
、レポータは、単クローン抗体または特異結合対の構成
員に対し直接または間接的に、共有結合的または非共有
結合的に結合してもよい。レポータは放射性アイソトー
プ、酵素、螢光原材料、化学発光性材料または電気化学
的材料であってｊい。この汎用放射性アイソトープは１
２５工および６Ｈである。標準的な放射性アイソトープ
標識手順は、１２５工についてはクロラミンＴ、ラクト
ベルオキシダーセおよびポルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）　−
ハンター（Ｈｔ＋ｎｔｅｒ）法、および６Ｈについては
８元メチル化。

酵素もイムノアッセイのレポータとして用いられる。そ
れらに限定されるわけではないが、これらには、西洋ワ
サビベルオキシダーセ、アルカリ性ホスファターセ、β
−ガラクトシダーセ、クルコースオキ／ダーゼ、ルシフ
エラー七、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼ、およびリソ
チームが含まれる。酵素による標識は、単クローン抗体
の特異結合対構成員による標識について前記したように
ジアルデヒド、カルボジイミド結合、ホモ二官能性架橋
剤、およびヘテロ三官能性架橋剤を用いることによって
容易に行うことができる。選択される標識方法は、酵素
および被標識材料上の利用できる官能基、および両者の
接合条件に対する耐性に依存する。本発明で用いられる
標識方法は、ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅａｒ１ｍａｎｎ
＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　８＋　８７１　
（１９７１）＋Ａｖｒａｍｅａｓ　ｂよびＴｅｒｎｙｎ
ｃｋ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ８、１１７５
　（１９７１）、　Ｉｓｈｉｋａｗａ−等、Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ　４（３）：　２０９’−３２７
（１９８３）およびＪａｂｌｏｎｓｋｉ　。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８：１９９　（１
９８５）により記載されたものを営む現在用いられてい
る任意の常法であってよいがそれらに限定されるもので
はない。標識は、スペーサ筐たは他の特異結合対構成員
を用いるなどの間接法により行ってもよい。

この−例は、未標識ストレプトアビジンおよびビオチン
化酵素によるビオチン化抗体の検出であり、その際該未
標識ストレプトアビジンとビオチン化酵素は順次にまた
は同時に添加される。

酵素活性の検出は、色素原性、螢光原性、化学発光性ま
たは電気化学的変化を周知の方法により測定することに
よって容易に行うことができる。

レポータは性質が螢光原性または化学発光性であってよ
い。更に、レポータは電気化学的手段によって検出可能
なものであってよい。これらのレポータによる標識方法
の一部は前述したところである。好ましい一態様におい
ては、酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼがレポータと
して用いられ、そしてＯ−フェニレンジアミン／　Ｈ２
０２が色素原検出基質として用いられる。

本発明において有用な単クローン抗体は、ＩｇＧタイプ
のものであってよいほか、その他の免疫グロブリンであ
ってもよい。

更に、これらの単クローン抗体は、標的に応じて、多く
の抗原決定基に対するものであってよい。例示に過ぎな
いが、ヌクレオカプンドタンパク、糖タンパクまたはウ
ィルスエンベロープ（＝関連する抗原決定基を挙げるこ
とができる。

ウィルス検出のための好ましい一態様においては、本発
明は、本発明によるイムノアッセイによる試験用検体輸
送のための特別な採集および輸送系をも用いる。

採集系は、ウィルスを採集する任意の適切な手段を利用
し、１だ輸送系は緩衝された洗剤溶液を含むチューブを
利用する。検体採集後、標本をその緩衝された洗剤に浸
漬する。直接浸漬によって検体中のウィルスが溶解する
ため、より多くの抗原を試験に供することができ、また
輸送中の抗原も安定する。その溶液は、また検体中のタ
ンパクの非免疫結合を最小限に抑える担体タンパクをも
含有する。

次の洗剤を本発明の範囲に包含されるものとして挙げる
ことができるが、それらに限定されるものではない　非
イオン系洗剤例えばポリオキシエチレンエーテルおよび
アルキルフエ／キシポリエトキシ化合物；イオン系洗剤
例えばアルキル／アリールスルホネート／サルフェート
；両性イオン系洗剤；胆汁酸塩およびそれらの誘導体例
えばデオキシコール酸、およびアルキル糖例えばオクチ
ルグルコピラノシドおよびドデシルマルト７ドなど。

担体タンパク例としては血清、アルブミン、七うチンお
よびカセインが挙げられるがそれらに限定されるもので
はない。

アッセイ系と相容性のある任意の緩衝剤を本発明の実施
に用いることができる。

最も好筐しい態様においては、緩衝剤はホスフェート緩
衝食塩水であり、洗剤はＮ０ＮＩＤＥＴ　Ｐ２Ｏ（ＮＰ
４０）であり、そして担体タンパクは牛血清アルブミン
である。

もう一つの面において、本発明は、本発明のアッセイを
行うための試薬キットを提供する。

すなわち、例えば、本発明によるキットは、（ａ）主に
ＩｇＧ抗体を含む支持体、（ｂ）多量の少くとも二つの
単クローン抗体（ここで、各単クローン抗体は異なる抗
原エピトープを認識し、かつ各単クローン抗体は（１）
レポータで標識された単クローン抗体および（２）特異
結合対の第一構成員で標識された単クローン抗体より成
る群より選択される）　；　（Ｃ）　（ｂＸ２）を用い
るときは多量の、標識されていても標識されていなくて
もよい特異結合対の第二構成員；および（ｄ）結合対の
第二構成員が標識されていないときは多量のレポータ系
の成分より成っていてもよい。

試薬キットの最も好ましい態様は、前述の成分（ａ）〜
（ｄ）のすべてのほかに、−本以上のプラスチック軸付
き綿棒と、緩衝剤、洗剤および担体タンパクより成る緩
衝洗剤溶液を含むチューブとより成る採集・輸送系であ
る第五の成分（ｅ）を含む。

本発明方法は、第１．２および６表に示されルア’−夕
によって証明されるように、感度および特異度が増大す
るなど多くの顕著な長所を有する。

第１および２表は、実施例６に記載のキットを用いるこ
とにより得られた臨床データを示す。

これらの臨床データは、本発明に従って行われるイムノ
アッセイを用いることにより高い感度および特異度が達
成されることを実証している。

第　　１　　表 培賽によるＨ８Ｖ検出を本発明によって行われるイムノ
アッセイによる検出と比較する臨床結果Ｂ　　　５６　
　１５／１５　４１／４１（ｂ）　　　１００％　１０
０％ｃ　　　８２　　３８／４０　４２／４２（ｂ）　
　　１００％　　９５．４％（９５，１）（１００） 注： ａ、　　７標本はこの計算に含めなかった。これらの標
本は、細胞変性効果（ＣＰＥ）陰性でありＥＬＩＳＡ　
（酵累連結免疫吸着剤アッセイ）陽性であった。ＥＬ　
Ｉ　ＳＡ値は陰性対照例の平均値より０．０５０Ｄ単位
高よりも大きく（陰性対照例の平均値より００１〜＞３
．００Ｄ単位高の範囲）、従って明らかに抗原陽性であ
った。すべてのこれら検体は抗体ブロッキング確認試験
で試験された。各検体をウサギ丑たはヒト抗−単純ヘル
ペスウイルス血清を添すロすることにより完全に（〉９
０％）阻害した。その抗−単純ヘルズスウィルス血清は
、アッセイにおいて非阻害的であることが分かつている
濃度で添加された。これらの所見は、ＥＬＩＳＡ結果が
単純ヘルにスウイルス抗原の存在により生じたものであ
り、非特異的陽性反応ではなかったことを示している。

ｂ１脚注性、に示されたのと同じ理由により１漂本はこ
の計算に含めなかった。

Ｃ１陽性予測値（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉ
ｖｅ　Ｖａｌｕｅ；ｐｐｖ）＝真の陽性例／（真の陽性
例＋偽の陽性例） ｄ、陰性予測値（Ｎｅｇａｔｌｖｅ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉ
ｖｅ　ＶａｌｕｅｉＮＰＶ）＝直の陰性例／（真の陰性
例＋偽の陰性例）ｅ、感度＝　ＥＬＩＳＡで陽性を示し
た培養物陽性検体に対する％。

ｆ、特異度＝　Ｆ、ＬＩＳＡで陰性を示した培養物陰性
検体に対する％。

第２表は本発明が比較可能な方法よりも優れていること
を実証する比較データを示す。第６表はＯｒｔｈｏＴＭ
　Ｈ８Ｖ　ＥＬＩＳＡおよびＦａｉｒｌｅｉｇｈＤｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ　Ｈ８Ｖ　ＥＬＩＳＡの製品差入物に記載
のデータに対して、本発明を用いて得られた結果を比較
している。第２および第６表に記載の０ｒｔｈ。

試験は多クローン検出を用いた前進式サンドイッチアッ
セイである。第３表に記載のＦａｉｒｌｅｉｇｈＤｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ試験は、多クローン検出を用いた同時式サ
ンドイッチアッセイであるＣ第１表と同様、本発明につ
いてのデータは、実施例３に記載されたようなキットを
用いることにより得られブこ　。

本発明により行われたイムノアラ セイと０ｒｔｈｏ試験との比較 ＯＲＴＨＯ９／２０　２３３／２３３　　　１００　８
６Ｂ　　本発明　１５／１５　４１／４１（ａ）　　　
１００　１００（１００）　　　（１００，１ ０ＲＴＨＯ３／１５　４２／４２　　　１００　７７（
２０）　　　（１［１［］） 注： ａ、　　）化ＩＳＡ”＋”、組織培養Ｉｔ　Ｉ＋、確認
試験１１　＋”の１検体はこのデータに宮めなかった。

ｂ、　　０ｒｔｈ○試験は、製造元の指示に従って行つ
た。

Ｃ０感度−ＥＬＩＳＡで陽性を示した培養物陽性検体に
対する％。

ｄ、特異間−ＥＬＩＳＡで陰性を示した培養物陰性検体
に対する％。

注二 （ａ）　　ＯｒｔｈｏＴＭＨ８Ｖ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｅ
ＬＩＳＡ　Ｔｅ５ｔ　（Ｏｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙ、ｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、
、　Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ、）の製品差入物。

（ｂ）　　］ｌｉ：ＬＩＳＡ　ｆｏｒ　Ｈｅｒｐｅｓ　
Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ（Ｆａｉｒｌｅｉｇｈ　Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｓ、　工ｎｃ、、　Ａｂｉｌ
ｅｎｅ。

ＴＸ、）の製品差入物。

（ｃ）　　ＶＴＭはウィルス輸送媒質を表わす。

（ｄ）　　５Ａ−ＨＲＰ−ＯＰＤはストレプトアビジン
−西洋ワサビベルオキシダーセーオルトフエニレンジア
ミンである。

（ｅ）　　ＨＲＰ−ＯＰＤは西部ワサビベルオキシダー
七−オルトフエニレンジアミンである。

（ｆ）　　ＨＲＰ−ＡＢＴＳは西洋ワサビベルオキンダ
ー七−２，２′−アジノービス−（６−ニチルベンズチ
アゾリンスルホン酸）である。

（ｇ）　　ＣＰＥは細胞変性効果である。

（ｈ）　　ＨＥＲＰＴＲＡＮＴＭ標本採集系は実施例６
で論じら肛ている。

＝４２− 次の実施例は本発明の例示であって本発明の限定と解さ
れるべきではない。

実施例　１ ５５１６．５５３０７および５５３０８として同定され
る標識単クローン抗体のカクテル 単クローン抗体は、Ｌ、　Ｐｅｒｅｉｒａ等、（Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　Ｖｏｌ、　
２９．扁２．　ｐｐ、　７２４〜７３２（Ａｕｇ、　１
９８０）参照）および○］２等（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ　
−ｂｕｌｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｙｂｒｉｄ　ｃ
ｅｌｌ　１ｉｎｅｓ、　Ｐ、　３５１〜６７１参照）、
　Ｂ、　ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳ、　Ｓｃｈｉｉｇｉ（
ｅｄ、）。

５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏの方法により調製した。

エピトープ特異性は未標識抗体をビオチン標識抗体と固
相抗原に対して拮抗させることにより決定した。未標識
抗体が標識抗体の結合を阻害しなかったとき、それら抗
体は異なるエピトープに対するものであると決定した。

実施例２に記載されている第４表は、単クローン抗体と
それらの特有の特異性の間の相関を示している。従って
この実施例において５５５０６〜５５３０８として同定
される単クローン抗体は第４表に示されたものと同じ特
異性を有するが異なる濃度を用いた。この実施例では各
デテクタ単クローン抗体は’／１０００希釈度で用いた
。

単クローン抗体は、腹水液から４０％飽和硫酸アンモニ
ウムを用いた塩分側、および５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−
３００’　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　工ｎｃ、、Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）でのゲル濾過により精製した。それら単クローン
抗体を後述の如くビオチン化した。ここでも各デテクタ
単クローン抗体は１／１０００希釈度で用いた。

抗体溶液を０．１　Ｍ　ＮａＨＣ○３緩衝液（ｐＨ８，
４）ニ対して透析しそして１ゴあたり１１１ｇという濃
度に調整した。０．１−のジメチルスルホキシド中の５
０倍モル過剰のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク’／フイ
ミドエステ／Ｉ／　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡを含む様々な給源から商業的に入手することができ
る）を添加し、そして室温で２時間反応させ、その時点
で０．１−の２　Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＯ２（ｐＨ（８，０
）を添加した。１５分後に、ホスフェート緩衝食塩水（
ＰＢＳ）　（ｐ！（７，４）中の１％牛血清アルブミ７
　（Ｓｉｇｍａ社）１−を添加し、そしてその溶液をＰ
ＢＳに対して透析した。それらビオチン化抗体を４℃で
貯蔵した。

アッセイ ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルな０．
１Ｍカーボネート緩衝液（ｐＨ９，６）中で希釈された
Ｑ、ｉｍｌのＨ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２の両方に対し
反応性のある多クローン抗体（Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐ、＋
５ａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ、　ＣＡ　）で被覆し、そ
して４℃で一夜インキユベートした。それらのウェルを
０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ−Ｔ）含有ＰＢ
Ｓで洗浄し、そしてカーボネート緩衝液中の２％牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックし
た、それらのウェルなＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そして１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中で希釈された０、１ｒｎｔ、のＨ
８Ｖ−１抗原を添加し、そして６７℃で１時間インキュ
ベートした。それらのウェルなＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そ
して１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中で希釈された０、　１　
ｍｌのビオチン化デテクタ抗体を添加し、そして室温で
６０分間インキュベートした。二つのビオチン他車クロ
ーン抗体の組合せは、一部の各デテクタを混合すること
により調製した（すなわち、各抗体はデテクタ抗体の全
質量（ｔｏｔａｌ　ｍａｓｓ　）４６一 のＡずつ寄与した）。それら三つの抗体の組合せは、一
部の各デテクタを混合することにより調製した（ｆなわ
ち、各抗体は全質量の棒ずつ寄与した）。それらウェル
をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そして１％ＢＳＡ、−ＰＢＳ−
Ｔ中で希釈された０、　１　ｍｌのストレプトアビジン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（Ｅｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

（）ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を添加し、そし
て室温で１５分間インキュベートした。それらウェルを
ＰＪ３８−Ｔで洗浄し、そして０．１献のベルオキンダ
ーセｉ質（０，０５％０−フェニレンジアミン、０．１
Ｍクエン酸塩緩衝液（聞５．０）中の０．０１％Ｈ２Ｏ
２）を添加した。発色後、反応をＨ２ＳＯ４で止めそし
て４９０　ｎｍでの吸光度を測定した。

結果 レポートされた光学密度（０，Ｄ、）は検体ウェルによ
り生じた信号からブランクウェル（抗原が存在していな
い）の信号を差引くことにより測定した。三つのデテク
タの各々によって生じる信号の強さは（第１図）、顕著
に異なり、５５３０６が最も強く、５５３０７が最も弱
かった。

いずれの二つまたは三つのデテクタ抗体の組合せも、い
ずれかの組合せの全質量に相当する質重な有するいずれ
の個々の抗体の信号よりも大きな信号を生じた。このこ
とは明らかに、デテクタ抗体の組合せの相剰効果を実証
するものである。

実施例　２ 各単クローン抗体調製物の至適濃度における個別単りロ
ーン抗体デテククおよび単クローン検出カクテルの性能 単純ヘルペスウィルス糖タンパクに対して特異的である
と確認された光種類の単クローン抗体（５５３０６〜５
５３１４　）を前述の如く、調製し、精製しそしてビオ
チン化した。各デテクタ単クローン抗体の至適濃度は、
デテクタを連続希釈しパックグラウンドに対し最大信号
を与える濃度を選択することにより決定した。

第４表は、二つの実施例２および乙に用いられた各単ク
ローン抗体の特異度および濃度、および実施例１に用い
られた単クローン抗体の特異度を示している。

抗体 ５５３０７　　　　Ｈ８Ｖ　１　および２　ｇＤ　　　
　１／８００５５３０８　　　　　Ｈ８Ｖ　１　および
２ｇＤ　　　　１／１６００５５３０９　　Ｈ８Ｖ　１
　ｇＣ１／８００５５３１０　　Ｈ８Ｖ　１　ｇＢ　　
　１／１６００５５３１１　　Ｈ８Ｖ　２　ｇ（）　　
　１／８００５５５１２　　Ｈ８Ｖ　２　ｇＣ）　　　
１／１６００５５５Ｌ５　　Ｈ８Ｖ　２　ｇＢ　　　１
／１６１３０５５３１４　　Ｈ８Ｖ　２　ｇＧ　　　１
／１６００アッセイ ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルを０．
１Ｍカーボネート緩衝液（ｐＨ９，６）中で希釈された
０、１−のＨ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ’−２の両方に対し
て反応性のある多クローン抗体（Ｄａｋ。

Ｃｏｒｐ、、　５ａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ、　ＣＡ）
で被覆し、そして−夜４℃でインキュベートした。それ
らウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ−Ｔ
）を含有するＰＢＳで洗浄しそしてカーボネート緩衝液
中の２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１
時間ブロックした。それらウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し
そして１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中で希釈された０、　１
−のＨｆ９Ｖ−１抗原を添加し、そして３７°Ｃで２時
間インキュベートした。それらウェルなＰＢＳ−Ｔで洗
浄し、そして５０％正常ウサギ血清−０，１％カセイン
酸ナトリウムーＰＢＳ中で希釈されたＱ、１−のビオチ
ン化テテクタ抗体または抗体カクテルを添加し、そして
室温で３０分間インキュベートした。それらウェルをＰ
ＢＳ−Ｔで洗浄し、そして１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中で
希釈された０、１−のストレプトアビジン−西洋ワサビ
はルオキシダーゼ接合体を添加し、そして室温で１５分
間インキュベートした。それらウェルをＰＢＳ−Ｔで洗
浄し、そして０．１　ｒｎｔのベルオキシダーセ基質（
０，０５％０−フェニレンジアミン、０．１Ｍクエン酸
塩緩衝液（ｐ１４５．０）中の０．０１％Ｈ’２０２　
）　ヲ添加Ｌ　タ。発色後、反応をＨ２ＳＯ４で止め、
そして４９０　ｎｍにおける吸光度を測定した。

結　　果 第２図は、単一の単クローンデテクタと元種類の単クロ
ーン抗体カクテルとを対比したものである。ブランクの
読みに０．０５を加えることによりカットオフを決めた
。単クローン抗体デテクタカクテルを用いるとアッセイ
感度が向上するほか、ウィルス抗原検出限界も約５倍率
さい。

実施例　６ 多重単クローン抗体検出を用いる単純ヘルペスウィルス
抗原検出用キット キット組成 （ａ）単純ヘルズスウイルス−１および単純ヘルペスウ
ィルス−２に対して反応性のある抗体で被覆された固体
支持体（ポリスチレンマイクロタイタープレート）。（
ｂ）単純ヘルペスウィルス−１および単純ヘルペスウィ
ルス−２に対し特異的な多量の多重ビオチン比重クロー
ン抗体。

（ｃ）　ｕ　素’１１４識ストレプトアビジン（ストレ
プトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ）。（ｄ）
　酵素活性測定用基質（０−フェニレンジアミン／Ｈ２
Ｏ２）。（ｅ）採集および輸送系。

アッセイ 本発明の実施例２に記載した如く行った。更に一部の検
体は、ＯｒｔｈｏＴＭＨ８Ｖ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ＥＬＩ
ＳＡＴｅｓｔ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、。

Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ）を用いて試験シタ。

臨床標本 同じ検体を二つずつ綿棒で採集し、一つはウィルス培養
用培地に入れ、二つ目はＥＬＩＳＡ用ＤｕＰｏｎｔ　Ｈ
ｅｒｐｔｒａｎ”媒質に入れた。これらの標本は、産科
患者またはヘルペスを有している疑いのある患者から（
これらが感染の目にみえる徴候を発症しているかどうか
に係りすく）採集した。Ｈｅｒｐｔｒａｎ”媒質は、ホ
スフェート緩衝食塩水、Ｎ０ＮＩＤＥＴ　Ｐ　４０　（
ＮＰ４０）および牛血清アルブミンから成っている。培
養用標本は直ちに培養するか、または−７０℃に貯蔵し
た。ＥＬＩＳＡ試験用標本は試験まで４℃に貯蔵した。

結果 これ捷でに４７５標本を試験した結果（第１表）、培養
と対比した臨床感度は９５％（７７／８′１）および特
異度は１００％（３９４７３９４）であった。その臨床
性能は第２表の商業的に利用可能な０ｒｔｈＯ試験に匹
敵する。第１表および第２表のデータはこのアッセイの
性能がこれ壕で商業化され筐たは文献に報告されたいか
なる単純ヘルペスウィルス酵素イムノアッセイよりも優
れていることを示している。

実施例　４ サイトメガロウィルス（Ｃ１ｖｉＶ）に対する単りロー
ン抗体組合せ 実施例１と同様に、三種類の抗−ＣＭＶ単クコクローン
抗体、ＢおよびＣと相称）を調製し、鞘層しそしてビオ
チン化した。至適濃度は、デテクタ抗体の連続希釈を用
い、パックブラウンドに対して最大信号を与える濃度を
選択することによって決めた。

第５表は、実施例４に記載の各単クローン抗体の特異度
および濃度を示す。

Ａ　　　糖タンパクＡ　　　　１７７３３Ｂ　　　糖タ
ンパクＡ　　　　１／１４６７Ｃ糖タンパクＡ１　／２
９３３ アツセイ ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルな、０
．１　Ｍカーボネート緩衝液（ｐＨ９，６）中で希釈さ
れた多クローンウサギ抗−〇ＭＶ抗体を用いて一夜４℃
で被覆した。それらのウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そ
してカーボネート緩衝液中２％ＢＳＡを用いて６７℃で
２時間ブロックした。

それらのウェルなＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＣＭｖ抗原（
Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ＨｅｒｐｔｒａｎＴＭ中で希釈）を添
加し、そして６７℃で２時間インキュベートした。それ
らのウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そして、１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ−Ｔ中で至適濃度に希釈されたデテクタ抗体お
よびデテクタ抗体組合せを添加し、そして室温で１時間
インキュベートした。それらウェルなＰＢＳ−Ｔで洗浄
し、そして１％Ｂ８Ａ−ＰＢＳ−Ｔ中で希釈されたスト
レプトアビジン−西洋ワサビベルオキシダー七接合体を
添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。そ
れらのウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そしてＲルオキシ
ダーセｉ質（ｏ、ｏｓ％○−フェニレンジアミン、クエ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）中の０．０１％Ｈ２Ｏ２）
を添加した。発色後、反応なＨ２ＳＯ４で止め、そして
４９０　ｎｍにおける吸光度を測定した。

結　　果 第６図は、ＣＭｖに対する単一の単クローン抗体デテク
タに比べ単りローン抗体組合せを用いると性能が向上す
ることを示している。

以上、本発明の詳細な説明したが、本発明はさらに次の
実施態様によってこれを要約して示すことができる。

１、ａ）　　支持体を多重エピトープを有する物質を含
む疑いのある検体と接触させ、そしてその際該支持体に
は主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ該ＩｇＧ抗体は
疑われている物質に対して特異的なものとし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
ルと接触させ、そしてその際各車クローン抗体は異なる
抗原決定基を認識するものとしまた各単クローン抗体は
（１）レポータ系の成分で標識された単クローン抗体お
よび（２）特異結合対の第一構成員で標識された単クロ
ーン抗体より成る群より選択されるものとし； ｃ）　　ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識
されていてもよい結合対の第二構成員と反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
Ｃの生成物をレポータ系の成分と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
たは定量する ことより成る、多量エピトープを有する物質を検出筒た
は定量するためのイムノアッセイ。

２、物質がポリペプチド、タンパク、多糖類、核酸、凝
血因子、ホルモン、細菌およびウィルスより成る群より
選択される前項１記、載のイムノアッセイ。

６、　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項１−己
載のイムノアッセイ。

４、　イムノアッセイが段階的・前進式（ｓｅｑｕｅｎ
ｔｉａｌｆｏｒｗａｒｄ）イムノアッセイとして行われ
る前項１記載のイムノアッセイ。

５、　イムノアッセイが同時式イムノアッセイとして行
われる前項１記載のイムノアッセイ。

６、　単クローン抗体が免疫または非免疫特異結合対の
成分で標識される前項１記載のイムノアッセイ。

Ｚ　単クローン抗体がビオチンで標識される前項１記載
のイムノアッセイ。

８、　ビオチン化率クローン抗体をストレプトアビジン
−Ｎ洋ワサビはルオキシダーゼと接触させる前項７記載
のイムノアッセイ。

９　前項８の生成物を酵素基質としての０−７二二レン
ジアミンと反応させる前項８記載のイムノアッセイ。

１０、　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光
原性、化学発光性および電気化学的材料より成る群より
選択される前項１記載のイムノアッセイ。

１１　　レポータが直接または間接的に、共有結合的ま
たは非共有結合的に結合させる前項１０記載のイムノア
ッセイ。

１２、ａ）　　支持体を多重エビトー・プを有する物質
を含む疑いのある検体と接触させ、そしてその際該支持
体には主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ核ＩｇＧ抗
体は疑われている物質に対して特異的なものとし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
ルと接触させ、そしてその際各年クローン抗体は異なる
抗原決定基を認識するものとじまた各単クローン抗体は
（１）レポータ系の成分で標識された単クローン抗体お
よび（２）特異結合対の第一構成員で標識された単クロ
ーン抗体より成る群より選択されるものとし； ｃ）ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識され
ていてもよい結合対の第二構成員と反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
Ｃの生成物をレポータ系の成分と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
たは定量する ことより成る多重エピトープを有するウィルスを検出ま
たは定量スるためのイムノアッセイ。

１３、　　ウィルスがアデノウィルス、単純ヘルペスウ
ィルス、水痘ウィルス、ヘルペスウイルスＢ、サイトメ
ガロウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ポックス
ウィルス、ピコルナウィルス、オルソミクンウイルス、
パラミクソウィルス、コロナウィルス、ラブドウィルス
、トガウィルス、パンヤウイルス、アレナウイルス、ル
ベラウィルス、アルボウィルス、レオウィルス、肝炎ウ
ィルス、レトロウィルスおよび発癌ウィルスより成る群
より選択される前項１２記載のイムノアッセイ。

１４、　　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項１
２記載のイムノアッセイ。

１５、　イムノアッセイが段階的・前進式イムノアッセ
イとして行われる前項１２記載のイムノアッセイ。

１６、　　イムノアッセイが同時式イムノアッセイとし
て行われる前項１２記載のイムノアッセイ。

１Ｚ単クロ一ン抗体がビオチンで標識される前項１２記
載のイムノアッセイ。

１Ｂ、ビオチン化率クローン抗体をストレプトアロ　２
− ビジンー西洋ワサビペルオキシダーゼと接触させる前項
１７記載のイムノアッセイ。

１９　　前項１８の生成物を酵素基質としての。−フェ
ニレンジアミンと反応させる前項１８記載のイムノアッ
セイ。

２０、　　単クローン抗体が免疫または非免疫特異結合
対の成分で標識される前項１２記載のイムノアッセイ。

２１、　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光
原性、および化学発光性および電気化学的材料である前
項１２記載のイムノアッセイ。

２２、　　レポータが、直接的または間接的に共有結合
約１たは非共有結合的に結合される前項１２記載のイム
ノアッセイ。

２３、　　検体が、緩衝剤、洗剤および担体タンパクよ
り成る緩衝された洗剤溶液を含むチューブに直接移され
る前項１２記載のイムノアッセイ。

２４、ａ）　　支持体を多重エピトープを有する物質を
含む疑いのある検体と接触させ、そしてその際該支持体
には主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ該ＩｇＧ抗体
は疑われている物質に対して特異的なものとし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
ルと接触させ、そしてその際各年クローン抗体は異なる
抗原決定基を認識するものとじまた各単クローン抗体は
（１）レポータ系の成分で標識された単クローン抗体お
よび（２）特異結合対の第一構成員で標識された単クロ
ーン抗体より成る群より選択されるものとし； ｃ）　　ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識
されていてもよい結合対の第二構成員と反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
Ｃの生成物をレポータ系の成分と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
たは定量する ことより成る多重エピトープを有するヘルペスウィルス
を検出または定量するためのイムノアッセイ。

２５、　　ヘルペスウィルスがＨ８Ｖ−１、Ｈ８Ｖ−２
およびサイトメガロウィルスより成る群より選択される
前項２４記載のイムノアッセイ。

２６、　　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項２
４記載のイムノアッセイ。

２Ｚ　　イムノアッセイが段階的前進的イムノアッセイ
として行われる前項２４記載のイムノアッセイ。

２８、　　イムノアッセイが同時式イムノアッセイと＝
６５− して行われる前項２４記載のイムノアッセイ。

２９　　単クローン抗体が免疫または非免疫特異結合対
の成分で標識される前項２４記載のイムノアッセイ。

ロ０．単クローン抗体がビオチンで標識される前項２４
記載のイムノアッセイ。

６１、ヒオチン比重クローン抗体をストレプトアビジン
−西洋ワサビベルオキ７ダーセと接触させる前項３０記
載のイムノアッセイ。

３２、前項６１の生成物を酵素基質としてのＯ−フェニ
レンジアミンと反応させる前項６１記載のイムノアッセ
イ。

６６、　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光
原性、化学発光性および電気化学的材料より成る群より
選択される前項２４記載のイムノアッセイ。

６４、　　レポータが直接的または間接的に、共有結＝
６６一 金的または非共有結合的に結合される前項３６記載のイ
ムノアッセイ。

６５、検体が、緩衝剤、洗剤および担体タンパクより成
る緩衝された洗剤溶液を含むチューブに直接後される前
項２４記載のイムノアッセイ。

３６、ａ）　　主にＩｇＧ抗体を含む支持体；ｂ）多量
の少くとも二つの単クローン抗体（ここで各単クローン
抗体は異なる抗原エピトープを認識し、かつ各単クロー
ン抗体は（１）レポータ系の一成分で標識された単クロ
ーン抗体および（２）特異結合対の第一構成員で標識さ
れた単クローン抗体より成る群より選択される）； ｃ）　　ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されて
いても標識されていなくてもよい特異結合対の第二構成
員；および ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは、多
量の、レポータ系の成分 より成る多重エピトープを有する物質を検出または定量
するためにイムノアッセイを行つための試薬キット。

３Ｚ　　物質がポリペプチド、タンパク、多糖類、核酸
、凝血因子、ホルモン、細菌およびウィルスより成る群
より選択される前項′５６記載のキット。

３８、　　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項６
６記載のキット。

６９　　単クローン抗体が免疫または非免疫特異結合対
の成分で標識される前項３６記載のキット。

４０、　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光
原性、化学発光性および電気化学的材料より成る群より
選択される前項６６記載のキット。

４１、　　レポータが間接的に、共有結合的または非共
有結合的に結合される前項４０記載のキット。

４２、　４４ｔクロ一ン抗体がビオチンで標識される前
項３６記載のキット。

４３、　　ビオチン比重クローン抗体をストレプトアビ
ジン−西洋ワサビペルオキシダーセと接触させる前項４
２記載のキット。

４４、　　前項４５の生成物を酵素基質としての○−フ
エニレンジアミンと反応させる前項４３記載のキット。

４５、ａ）主にＩｇＧ抗体を含む支持体；ｂ）多量の少
くとも二つの単クローン抗体（ここで各単クローン抗体
は異なる抗原エピトープを認識し、かつ各単クローン抗
体は（１）レホータ糸の一成分で標識された単クローン
抗体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された
単クローン抗体より成る群より選択される）； ｃ）ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されていて
も標識されていなくてもよい特異結合対の第二構成員；
および ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは、多
量の、レポータ系の成分； ｅ）緩衝剤、洗剤および担体タンパクより成る緩衝され
た洗剤溶液を含むチューブより成る輸送系 より成る多重エピトープを有するウィルスを検出または
定量するためにイムノアッセイを行うための試薬キット
。

４６、　　ウィルスがアデノウィルス、単純ヘルペスウ
ィルス、水痘ウィルス、ヘルペスウィルスＢ１サイトメ
ガロウィルス、エプスタイン−パーウィルス、ポックス
ウィルス、ビコルナウイルス、オルンミクンウイルス、
パラミクソウィルス、コロナウィルス、ラブドウィルス
、トガウィルス、パンヤウイルス、アレナウイルス、ル
ベラウィルス、アルボウィルス、レオウィルス、肝炎ウ
ィルス、レトロウィルスおよび発癌ウィルスより成る群
より選択される前項４５記載のキット。

４７　　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項４５
記載のキット。

４８、単クローン抗体が免疫または非免疫特異結合対の
成分で標識される前項４５記載のキット。

４９　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光原
性、化学発光性および電気化学的材料より成る群より選
択される前項４５記載のキット。

５０、　　レポータが直接的または間接的に、共有結合
的または非共有結合的に結合される前項４９記載のキッ
ト。

５１、　　単クローン抗体がビオチンで標識される前項
４５記載のキット。

５２、　　ビオチン比重クローン抗体をストレプトアビ
ジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと接触させる前項５
１記載のキット。

５３、　　前項５２の生成物を酵素基質としての０−フ
ェニレンジアミンと反応させる前項５２記載のキット。

５４、ａ）　　主にＩｇＧ抗体を営む支持体；ｂ）多量
の少くとも二つの単クローン抗体（ここで各単クローン
抗体は異なる抗原エピトープを認識し、かつ各単クロー
ン抗体は（１）レポータ系の一成分で標識された単クロ
ーン抗体および（２）特異結合対の第一構成員で標識さ
れた単クローン抗体より成る群より選択される）； ｃ）ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されていて
も標識されていなくてもよい特異結合対の第二構成員＝
および ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは、多
量の、レポータ系の成分；およびｅ）緩衝剤、洗剤およ
び担体タンパクより成る緩衝された洗剤溶液を含むチュ
ーブより成る輸送系 より成る多重エピトープを有するヘルペスウィルスを検
出または定量するためにイムノアツセイを行うための試
薬キット。

５５、　　単クローン抗体がＩｇＧタイプである前項５
４記載のキット。

５６、　　物質がＨ８Ｖ−１、Ｈ８Ｖ−２およびサイト
メガロウィルスより成る群より選択されるヘルペスウィ
ルスである前項５４記載のキット。

５Ｚ　　単クローン抗体が免疫または非免疫特異結−７
３＝ 合対の成分で標識される前項５４記載のキット。

５８、　　レポータが放射性アイソトープ、酵素、螢光
原性、化学発光性および電気化学的材料より成る群より
選択される前項５４記載のキット。

５９　　レポータが直接的または間接的に、共有結合的
または非共有結合的に結合される前項５８記載のキット
。

６０、　　単クローン抗体がビオチンで標識される前項
５４記載のキット。

６１、ヒオチン化抗体をストレプトアビジン−西洋ワサ
ビペルオキシダーゼと接触させる前項６０記載のキット
。

６２、　　前項６１の生成物を酵素基質としての０−フ
ェニレンジアミンと反応させる前項６１記載のキット。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単純ヘルペスウィルスに対する標識デテクタ
抗体の組合せが相当する量のいずれの個々の単クローン
抗体により生じるいかなる信号よりも強い信号を発生さ
せることを示すグラフである。 第２図は、検出系として多重率クローン抗体のカクテル
を用いることによって達成される感度の増大を示してい
る。 第６図は、サイトメガロウィルスに対する標識デテクタ
単クローン抗体の組合せがいずれの個々の単クローン抗
体によって生じるいかなる信号よりも強いデテクタ信号
を発生させることを示している。 特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド　コンパニー 外２名 手続補正音（方式） 平成元年　１　月１３日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第２４４７２５号 ２、発明の名称 ＩｇＧ捕捉抗体および多重単クローン性抗体検出系を用
いたイムノアッセイ ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　アメリカ合衆国プラウエア州つイルミントン、マ
ーケットストリート１００７ 名称　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース・アンド
・コンノくニー ４、代理人 ５、補正命令の日付 ７、補正の内容 願書に最初に添付した図面の浄書・別紙のとおり（内容
に変更なし） 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）支持体を多重エピトープを有する物質を含む疑
   いのある検体と接触させ、そしてそ の際該支持体には主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ
   該ＩｇＧ抗体は疑われている物質に対して特異的なもの
   とし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
   ルと接触させ、そしてその際各 単クローン抗体は異なる抗原決定基を認識 するものとしまた各単クローン抗体は（１）レポータ系
   の成分で標識された単クローン抗 体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された単
   クローン抗体より成る群より選択 されるものとし； ｃ）ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識され
   ていてもよい結合対の第二構成員と 反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
   ｃの生成物をレポータ系の成分 と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
   たは定量する ことより成る、多重エピトープを有する物質を検出また
   は定量するためのイムノアツセイ。 ２）ａ）支持体を多重エピトープを有する物質を含む疑
   いのある検体と接触させ、そしてそ の際該支持体には主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ
   該ＩｇＧ抗体は疑われている物質に対して特異的なもの
   とし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
   ルと接触させ、そしてその際各 単クローン抗体は異なる抗原決定基を認識 するものとしまた各単クローン抗体は（１）レポータ系
   の成分で標識された単クローン抗 体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された単
   クローン抗体より成る群より選択 されるものとし； ｃ）ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識され
   ていてもよい結合対の第二構成員と 反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
   ｃの生成物をレポータ系の成分 と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
   たは定量する ことより成る多重エピトープを有するウィルスを検出ま
   たは定量するためのイムノアツセイ。 ３）ａ）支持体を多重エピトープを有する物質を含む疑
   いのある検体と接触させ、そしてそ の際該支持体には主に不溶化ＩｇＧ抗体を結合させかつ
   該ＩｇＧ抗体は疑われている物質に対して特異的なもの
   とし； ｂ）その物質を少くとも二つの単クローン抗体のカクテ
   ルと接触させ、そしてその際各 単クローン抗体は異なる抗原決定基を認識 するものとしまた各単クローン抗体は（１）レポータ系
   の成分で標識された単クローン抗 体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された単
   クローン抗体より成る群より選択 されるものとし； ｃ）ｂ（２）の生成物を標識されていなくても標識され
   ていてもよい結合対の第二構成員と 反応させ； ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは工程
   ｃの生成物をレポータ系の成分 と反応させ；そして ｅ）レポータの有無を読むことにより前記物質を検出ま
   たは定量する ことより成る多重エピトープを有するヘルペスウィルス
   を検出または定量するためのイムノアツセイ。 ４）ａ）主にＩｇＧ抗体を含む支持体； ｂ）多量の少くとも二つの単クローン抗体 （ここで、各単クローン抗体は異なる抗原 エピトープを認識し、かつ各単クローン抗 体は（１）レポータ系の一成分で標識された単クローン
   抗体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された
   単クローン抗体より成る 群より選択される）； ｃ）ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されていて
   も標識されていなくてもよい特異結 合対の第二構成員；および ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは、多
   量の、レポータ系の成分 より成る多重エピトープを有する物質を検出または定量
   するためにイムノアツセイを行うための試薬キット。 ５）ａ）主にＩｇＧ抗体を含む支持体、 ｂ）多量の少くとも二つの単クローン抗体 （ここで各単クローン抗体は異なる抗原エ ピトープを認識し、かつ各単クローン抗体 は（１）レポータ系の一成分で標識された単クローン抗
   体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された単
   クローン抗体より成る群 より選択される）； ｃ）ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されていて
   も標識されていなくてもよい特異結 合対の第二構成員；および ｄ）結合対の第二構成員が標識されていないときは、多
   量の、レポータ系の成分； ｅ）緩衝剤、洗剤および担体タンパクより成る緩衝され
   た洗剤溶液を含むチューブより 成る輸送系 より成る多重エピトープを有するウィルスを検出または
   定量するためにイムノアツセイを行うための試薬キット
   。 ６）ａ）主にＩｇＧ抗体を含む支持体； ｂ）多量の少くとも二つの単クローン抗体 （ここで各単クローン抗体は異なる抗原エ ピトープを認識し、かつ各単クローン抗体 は（１）レポータ系の一成分で標識された単クローン抗
   体および（２）特異結合対の第一構成員で標識された単
   クローン抗体より成る群 より選択される）； ｃ）ｂ（２）を用いるときは、多量の、標識されていて
   も標識されていなくてもよい特異結 合対の第二構成員；および ｄ）結合対の第一構成員が標識されていないときは、多
   量の、レポータ系の成分；およ び ｅ）緩衝剤、洗剤および担体タンパクより成る緩衝され
   た洗剤溶液を含むチューブより 成る輸送系 より成る多重エピトープを有するヘルペスウィルスを検
   出または定量するためにイムノアツセイを行うための試
   薬キット。