CN104730251B - 肌钙蛋白i检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域,具体地说是一种肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法,设有试纸卡,其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有:PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体,所述稀土荧光微球的直径为60‑120nm,稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素,在基态下稳定,在340‑380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540‑600nm的荧光;所述单克隆抗体为2+2模式,即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成,以同时保证特异性和亲和力。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域,具体地说是一种能够快速准确的对肌钙蛋白I进行定量分析的肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法。
背景技术
全球每年有约1700万人死于心血管疾病,其中一半以上死于急性心肌梗死(AMI)。每年约有1000万例心肌梗死患者,其中约300万例是ST段抬高的急性心肌梗死。心肌细胞损伤后,膜的完整性和通透性改变,细胞内的大分子物质逸出,能够在血液循环中被检测到,这些大分子物质被称为心肌损伤标志物,简称心肌标志物。心肌标志物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断,对于临床诊断和治疗心血管疾病具有重要意义。
在诸多诊断AMI的临床生化指标中,肌酸激酶同功酶(CK-MB)曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”,已广泛应用多年。随着对心肌肌钙蛋白的深入研究,无论是对心肌的特异性还是诊断敏感性,CK-MB的地位都受到了严重挑战。心肌肌钙蛋白被认为是目前最好的心肌标志物,正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
肌钙蛋白是组成横纹肌细肌丝的结构蛋白,由T、C、I三亚基构成,和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。其中,肌钙蛋白I(cTnI)经大量的研究,已被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。cTnI分子量22.5KD,正常人血清中含量低于0.06ng/ml,当心肌损伤后,心肌肌钙蛋白复合物分解,cTnI被快速释放到血液中,4-6小时后开始在血液中升高,12-24小时后达到最高浓度,最高浓度能达到正常值的上万倍,升高的cTnI能在血液中维持6-10天。因此,与CK-MB相比,cTnI对心肌损伤的诊断敏感性更高,特异性更强,持续时间更长,所以cTnI已成为目前最理想的心肌标志物。
cTnI检测方法主要有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法、放射免疫分析法,胶乳颗粒增强免疫比浊法、金标方法等。ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低,多用于定性检测;放射免疫分析法灵敏度可达到4pg/ml,能检测正常人血清cTnI,比双抗夹心法灵敏,缺点是所需时间较长,检测结果不稳定,重复性比ELISA差,且存在放射性污染危险;胶乳颗粒增强免疫比浊法(PETIA)可以很方便的应用与全自动生化仪,但是灵敏度较低,无法检测到心肌细胞的早期损伤;金标方法灵敏度较低,一般只能定性,不能定量,特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用,尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测;免疫发光法方法特异性强,敏感性高,但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员,一般多在特定医疗机构使用。因此开发灵敏度更高、快捷方便的cTnI产品,仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的缺点和不足,提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性,结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便,可以准确定量的肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法。
本发明可以通过以下措施达到:
一种肌钙蛋白I检测试剂盒,设有试纸卡,其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有:PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体,所述稀土荧光微球的直径为60-120nm,稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素,在基态下稳定,在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光;所述单克隆抗体为2+2模式,即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成,以同时保证特异性和亲和力。
本发明所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm;所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素,为铕(Eu) 、钐( Sm) 、铒(Er) 、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物;所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物;结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选2种高质量的单克隆抗体。
本发明所述结合垫采用如下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含3.0% Triton X-100,2.0%BSA,pH7.5),4℃浸泡4小时,然后取出37℃烘箱烘干4小时,备用,将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上,用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜,37℃烘干2小时后制得。
本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体采用如下步骤制得:
步骤1:单克隆抗体的获得:根据2+2模式,购买并筛选高质量的单克隆抗体,进行配对实验,筛选出捕获抗体和检测抗体各两种,将用于检测的2种抗体,按照后续工作需要分装后保存于-20℃备用;
步骤2:稀土荧光微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球,用25mM,pH9.5的碳酸盐缓冲液,采用离心法洗涤3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中,加入150μl醛基化的葡聚糖,混匀,室温下暗反应4小时,采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中,置于4℃备用;
步骤3:稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜,然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合,4℃反应过夜;然后,加入硼氢化钠至终浓度5mM,4℃反应4小时;再加入等体积的封闭液(150mM Tris-HCL,pH7.5,含3%BSA,5%蔗糖),4℃封闭过夜;然后用150mM Tris-HCL,pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍,重悬于100μl的150mMTris-HCL缓冲液中(含1.2%NaCL,2%BSA,1%Tween 20),4℃避光保存备用。
本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得:
步骤1:根据前述筛选和配对实验,选择用于捕获的2种抗体,按照后续工作需要分装后保存于-20℃备用;
步骤2:分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml,膜液量为1-2μl/cm,将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被,检测线和质控线间隔为3-7mm,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时。
本发明所述样品垫通过以下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%Triton X-100,2% BSA,0.15M Tris缓冲液,pH7.5的处理液中,于4℃浸泡4个小时,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时。
本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的肌钙蛋白I检测方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1:将检测试剂及样本平衡至室温,取出试纸卡,平放;
步骤2:精确吸取25μl血清样本,样本为全血时吸取50μl样本,加入到样本孔中,再立即在下部的缓冲液孔中加入100μl样本稀释液,样本稀释液采用生理盐水或PBS,15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果;
步骤3:设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后,将试纸卡放入仓内进行检测,仪器将显示出样品浓度的定量测定结果,所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统,对肌钙蛋白I的检测范围为0-40ng/ml。
本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,同时适合血清和全血样本,并适合临床上单人份检测,相对于肌钙蛋白I定性胶体金试剂,能定量检测样本中的肌钙蛋白I含量,具有更明确的临床指导意义,具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
附图说明:
附图1是本发明中试纸卡的结构示意图。
附图2是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。
附图3中的附表1是本发明中实施例3的精密度分析结果数据。
附图标记:PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。
具体实施方式:
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明:
如附图1所示,本发明首先提出了一种肌钙蛋白I检测试剂盒,盒内设有试纸卡,所述试纸卡由下至上依次设有:PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5,其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体,所述稀土荧光微球的直径为60-120nm,稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素,在基态下稳定,在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光;所述单克隆抗体为2+2模式,即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成,以同时保证特异性和亲和力;
所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm;所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素,为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物;所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物;结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选2种高质量的单克隆抗体。
实施例1:
肌钙蛋白I检测试剂盒中试纸卡的各组成部分可以通过以下措施制得:
1、样品垫2的制备:
将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%Triton X-100,2% BSA,0.15M Tris缓冲液,pH7.5的处理液中,于4℃浸泡4个小时,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时。
2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备:
将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含3.0% Triton X-100,2.0%BSA,pH7.5),4℃浸泡4小时,然后取出37℃烘箱烘干4小时,备用,将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上,用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜,37℃烘干2小时后制得;
稀土荧光纳米微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球,用25mM,pH9.5的碳酸盐缓冲液,采用离心法洗涤3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中,加入150μl醛基化的葡聚糖,混匀,室温下暗反应4小时,采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中,置于4℃备用;
稀土荧光纳米微球标记肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜,然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合,4℃反应过夜;然后,加入硼氢化钠至终浓度5mM,4℃反应4小时;再加入等体积的封闭液(150mM Tris-HCL,pH7.5,含3%BSA,5%蔗糖),4℃封闭过夜;然后用150mM Tris-HCL,pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍,重悬于100μl的150mMTris-HCL缓冲液中(含1.2%NaCL,2%BSA,1%Tween 20),4℃避光保存备用;
3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备:
根据2+2模式,购买并筛选高质量的单克隆抗体,进行配对实验,筛选出捕获抗体和检测抗体各两种,将用于捕获的2种抗体,按照后续工作需要分装后保存于-20℃备用;
分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml,膜液量为1-2μl/cm,将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被,检测线和质控线间隔为3-7mm,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时;
试纸卡的组装:在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5,组装后得到试纸大板,按照要求切割成4mm宽,将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
上述各步骤中选用的设备及原料优选以下原料:
肌钙蛋白I特异性配对抗体:捕获抗体M18+560,检测抗体19C7+MF4,芬兰HYTEST有限公司;肌钙蛋白I质控品:英国朗道实验诊断有限公司;稀土荧光微球:上海甄准生物科技有限公司;硝酸纤维素(NC) 膜:Millipore 公司产品;牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000,水解酪蛋白:Sigma 产品,其它常用试剂均为分析纯试剂。
实施例2:准确度试验
选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪(型号:NEO-007),
荧光免疫分析仪参数的设定:在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后,取上述组装好的试纸卡,分别用0.1、0.25、1、2.5、10、20、40ng/ml的肌钙蛋白I校准品,用试纸卡进行测定,得到各校准品的荧光强度值,将结果输入到分析仪的参数中,完成分析仪的参数的设定。
主要检测材料:临床样本由相关医院获得,共200份电化学发光免疫法定值样本,其中血清样本100份,全血样本100份,肌钙蛋白I含量分布区间为0-40ng/mL 之间。
检测方法:
步骤1:将检测试剂及样本平衡至室温,取出试纸卡,平放;
步骤2:精确吸取25μl血清样本,样本为全血时吸取50μl样本,加入到样本孔中,再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(生理盐水或PBS),15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果;
步骤3:设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测,仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。
试验结果分析:
临床样本检测试剂制备完成后,按检测方法对所有临床样本进行检测,并分析检测结果。
试验结果:
如附图2所示,以实验系统的检测值为Y轴,以对照系统的测验值为X轴,绘制散点图,并进行相关性分析。临床样本检测对200 份临床定值样本检测,样本平均偏差值小于10%,最大偏差小于20%,R2>0.98,一致性系数>0.90。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好,适合用于临床检测,满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
实施例3:精密度试验
采用实施例2的试纸卡和测量系统,对本发明的试纸卡和荧光免疫层析分析仪进行精密度实验。
主要检测材料:临床样本由相关医院获得,共2份化学发光免疫法定值血清样本,其中低值定值样本临床测量值为0.13ng/ml,高值定值样本临床测量值为1.55ng/ml。
检测方法:
采用实施例2的试纸卡和测量系统,对2份定值样本各进行重复测定20次。
试验结果分析:
临床样本检测试剂制备完成后,按检测方法对临床样本进行检测,并分析检测结果。
试验结果:
如表1所示,对临床测量值为0.13ng/ml的低值定值样本和临床测量值为1.55ng/ml的高值定值样本重复测定20次后计算平均值,标准差和CV,所得结果显示用本发明的实验系统测试低值定值样本CV为8.59%,测试高值定值样本CV为5.88%。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好,适合用于临床检测,满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,同时适合血清和全血样本,并适合临床上单人份检测,相对于肌钙蛋白I定性胶体金试剂,能定量检测样本中的肌钙蛋白I含量,具有更明确的临床指导意义,具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
Claims (1)
1.一种肌钙蛋白I检测试剂盒,设有试纸卡,其特征在于所述试纸卡由下自上依次设有:PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体,稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素,在基态下稳定,在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光;所述试纸卡上的肌钙蛋白I的单克隆抗体为2+2模式,即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种单克隆抗体混合而成,以同时保证特异性和亲和力;
所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm;
所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物;所述结合垫采用如下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCl处理液中,4℃浸泡4小时,然后取出,在37℃烘箱烘干4小时,备用,将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上,用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜,37℃烘干2小时后制得;
结合垫上的所述稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体采用如下步骤制得:
步骤1:单克隆抗体的获得:根据2+2模式,购买并筛选单克隆抗体,进行配对实验,筛选出捕获抗体和检测抗体各两种,将用于检测的2种抗体,按照后续工作需要分装后保存于-20℃备用;
步骤2:稀土荧光微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球,用25mM,pH9.5的碳酸盐缓冲液,采用离心法洗涤3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中,加入150μl醛基化的葡聚糖,混匀,室温下暗反应4小时,采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中,置于4℃备用;
步骤3:稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜,其中两种抗体按照质量比1:1混合,然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合,4℃反应过夜;然后,加入硼氢化钠至终浓度5mM,4℃反应4小时;再加入等体积的封闭液,4℃封闭过夜;然后用150mM Tris-HCl,pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍,重悬于100μl的150mM Tris-HCl缓冲液中,4℃避光保存备用;
包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得:
步骤1:根据前述筛选和配对实验,选择用于捕获的2种抗体,按照后续工作需要分装后保存于-20℃备用;
步骤2:分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml,膜液量为1-2μl/cm,将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被,检测线和质控线间隔为3-7mm,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时;
所述样品垫通过以下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%Triton X-100,2% BSA,0.15M Tris缓冲液,pH7.5的处理液中,于4℃浸泡4个小时,然后置于烘箱中,37℃烘干2小时。
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