CN117405876A - 诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括：探测物，其包括：第一探测物，其包含荧光标记的TnI抗体络合物和荧光标记的质控络合物；第二探测物，其包含生物素标记的TnI抗体络合物；第三探测物，其包含荧光标记的NT‑proBNP抗体络合物和荧光标记的D‑Dimer抗体络合物、DNP标记的D‑Dimer抗体络合物和荧光标记的质控络合物；试剂条；样本稀释液。本申请只需1次加样，用1个试剂条即可实现同时检测TnI、NT‑proBNP和D‑Dimer三个项目，且大幅度提高了TnI检测的灵敏度和D‑Dimer的检测范围，精密度较结合垫产品显著提高，并可室温运输和保存，方便用户使用。

Description

诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及心脏疾病诊断领域。更具体地说，本发明涉及诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前市面上常见的检测心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D-二聚体三项联合(TnI/NT-proBNP/D-Dimer)的方法是荧光免疫法和胶体金法，上述两种方法均基于带结合垫的试剂条，如专利：CN201520584429.X、CN201520588672.9、CN202210402438.7和CN201821295581.6，因这两种方法直接将与抗原结合的荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物和质控络合物包被在试剂条的结合垫上，当样本流经结合垫时，样本中的抗原与结合垫上荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物和质控络合物反应就会不充分，导致精密度较差，变异系数很难小于10％，且TnI检测灵敏度不足。同时通过研究发现，如果直接将D-Dimer抗体包被在NC膜上时，NT和TnI荧光络合物会对D-Dimer检测造成干扰。
发明内容
本发明的目的是提供诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，通过让样本充分与荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物和质控络合物进行反应，大幅度提高了TnI检测的灵敏度和D-Dimer的抗干扰性，并可放大检测信号，节约成本。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，包括：
探测物，其包括：
第一探测物，其包含荧光标记的TnI抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
第二探测物，其包含生物素标记的TnI抗体络合物；
第三探测物，其包含荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和荧光标记的D-Dimer
抗体络合物、DNP标记的D-Dimer抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
试剂条，其包括垫卡、铺设于所述垫卡上的硝酸纤维素膜、依次间隔设于所述硝酸纤维素膜上的样本垫、质控线、第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线以及吸收垫；
样本稀释液，其与所述探测物彼此独立分开存放，所述样本稀释液可溶解所述探测物。
优选的是，所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，所述样本稀释液的制备方法为：在磷酸盐缓冲液中加入NaCl、NaN3、Tween 20和TTAB后，溶解，过滤，室温保存，其中，样本稀释液中含有200-600mM的NaCl、质量分数为0.01-0.5％的NaN3、体积分数为0.1-3％的Tween 20和质量分数为0.01-0.5％的TTAB。
优选的是，所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，荧光标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer捕获抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，接着按最终溶液与荧光染料的质量比为1：0.01-1：0.5添加荧光染料，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的荧光抗体络合物用填充交联葡聚糖G-25的层析柱进行纯化，收集首道流出的荧光抗体络合物，即得荧光标记的D-Dimer抗体络合物；
生物素标记的TnI抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的TnI捕获抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与生物素的质量比为1：0.05-1：0.5添加生物素，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的生物素抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得生物素标记的TnI抗体络合物；
DNP标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer检测抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与DNP的质量比为1：0.01-1：0.3添加DNP，包裹避光，置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的DNP抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得DNP标记的D-Dimer抗体络合物；
探测物的制备方法为：
配制基础缓冲液，基础缓冲液由1×PBS加BSA和蔗糖配制而成，其中，BSA的质量分数为0.05-10％、蔗糖的质量分数为0.05-10％；
配置探测物溶液：在基础缓冲液中分别添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含1-10μg/mL荧光标记的TnI抗体络合物、0.01-3μg/mL荧光标记的Anti-chicken IgY抗体络合物和100-500μg/mL阻断剂的探测物溶液一；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物，配制得到含1.0-10μg/mL生物素标记的TnI抗体络合物的探测物溶液二；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含1-50μg/mLDNP标记的D-Dimer抗体络合物、1-50μg/mL荧光标记的D-Dimer抗体络合物、0.01-5μg/mL荧光标记的Anti-chicken IgY抗体络合物、1-10μg/mL荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和100-500μg/mL阻断剂的探测物溶液三；
探测物分装及冻干：在探测物分装机上安装200μL移液头，在分装机上输入分装次数后开始分装，将探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别分装至相应的试管中，各自分装20-80μL后称试管重量，确认分装后的试管重量和分装前的空试管重量的差是否与分装容量一致，确认分装的分装容量一致后，缓慢抬起分装机夹具，移除后，使用过滤网分离探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三；将得到的探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别转移至不锈钢容器中，之后放入冻干机冻干，即得第一探测物、第二探测物和第三探测物。
优选的是，所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，所述试剂条的制作方法为：
用包被稀释液分别将NT-proBNP检测抗体浓度调整到0.01-5mg/mL，链霉亲和素浓度调整到0.01-5mg/mL，DNP检测抗体浓度调整到0.1-5mg/mL，chicken IgY浓度调整到0.01-3mg/mL；
抗体包被：准备好硝酸纤维素膜，并正确置于贴膜设备上，将硝酸纤维素膜粘贴在垫卡上，用喷涂设备将使用包被稀释液调整后的chicken IgY喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线，将使用包被稀释液调整后的链霉亲和素和DNP混合抗体溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第一检测线，将使用包被稀释液调整后的链霉亲和素溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第二检测线，将使用包被稀释液调整后的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第三检测线，将使用包被稀释液调整后的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第四检测线，即可获得包被后试剂条，其中，喷涂设备喷涂量为1μL/cm，喷涂速度为9cm/s，将各检测线和质控线平行喷涂于硝酸纤维素膜上进行包被，各检测线之间，以及质控线和第一检测线之间均间隔2-3mm，然后置于烘箱中，在37℃下烘干1-5天；
试剂条贴膜及切割：将样本垫粘贴在垫卡宽面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上1-2mm，吸收垫粘贴在垫卡窄面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上方，且离底板外边缘0-1mm，设定切割设备试纸条切割宽度为3-4mm，确认切断面是否平整；
试剂条组装：在底壳上安装切割好的试纸条，吸收垫装在壳的终端，合上上壳，置于压壳设备上压牢，即得试剂条。
优选的是，所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，荧光标记所采用的荧光物质是荧光素、荧光微球、量子点或量子点微球。
诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)将试剂条水平放置；
2)取150μL样本稀释液与探测物混合，获得混合试剂；
3)将30μL全血或血浆与混合试剂混合，获得样本混合液；
4)取75μL的样本混合液加入到试剂条的样本垫上，在室温反应12分钟，获得反应后的试剂条；
5)使用检测设备对反应后的试剂条上的第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线进行检测。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过让样本充分与荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物和质控络合物进行反应，且保证TnI反应有足够的灵敏度，设计了将荧光标记的TnI抗体络合物和荧光标记的质控络合物制作成1颗固体小球，即第一探测物；将生物素标记的TnI抗体络合物制作成1颗固体小球，即第二探测物；将荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和荧光标记的D-Dimer抗体络合物、DNP标记D-Dimer抗体络合物和荧光标记的质控络合物制作成1颗固体小球，即第三探测物；在反应时只需加入样本稀释液，即可将3颗探测物质快速溶解，这时再加入样本，混合，即可让样本中的抗原与荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物充分反应，此过程大幅度提高了TnI的灵敏度。此设计一方面提高了心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D-二聚体三联卡检测的精密度，可使批内变异系数(CV)小于10％，特别提高了TnI检测的灵敏度，线性下限可达到0.01ng/mL，较专利CN201520584429.X提高了10倍，较专利CN201520588672.9提高了5倍，另一方面，创新引入DNP-AnitiDNP反应系统检测D-Dimer，提高了D-Dimer抗干扰性，有效放大检测信号，节约成本，线性范围可达到50ng/mL-20000ng/mL，线性上限较专利CN201520584429.X和CN201520588672.9提高4倍。
本发明只需1次加样，用1个试剂条即可实现同时检测TnI、NT-proBNP和D-Dimer三个项目，且大幅度提高了TnI检测的灵敏度和D-Dimer的检测范围，精密度较结合垫产品显著提高并可室温运输和保存，方便用户使用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的探测物与样本稀释液的示意图；
图2是根据本发明一个实施例的试剂条的结构示意图；
图3是一致性试验中检测TnI血浆和全血样本所得到的实验系统血浆和全血检测值分别与对照系统血浆检测值和实验系统血浆检测值的相关分析图；
图4是一致性试验中检测NT-proBNP血浆和全血样本所得到的实验系统血浆和全血检测值分别与对照系统血浆检测值和实验系统血浆检测值的相关分析图；
图5是一致性试验中检测D-Dimer血浆和全血样本所得到的实验系统血浆和全血检测值分别与对照系统血浆检测值和实验系统血浆检测值的相关分析图；
图6是探测物与样本稀释液的实物图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
如图1、图2和图6所示，诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，包括：
探测物，其包括：
第一探测物，其包含荧光标记的TnI抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
第二探测物，其包含生物素标记的TnI抗体络合物；
第三探测物，其包含荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和荧光标记的D-Dimer
抗体络合物、DNP标记的D-Dimer抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
荧光物质可以是荧光素、荧光微球、量子点、量子点微球。
试剂条，其包括垫卡、铺设于所述垫卡上的硝酸纤维素膜3、依次间隔设于所述硝酸纤维素膜上的样本垫1、质控线4、第一检测线5、第二检测线6、第三检测线7和第四检测线8以及吸收垫2；
样本稀释液，其与所述探测物彼此独立分开存放，所述样本稀释液可溶解所述探测物。
将探测物制作成3颗小球，能避免全部混合成1颗，对测试结果产生一些影响，另外分开后容易质量控制，出现问题容易排查原因。
所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，所述样本稀释液的制备方法为：在磷酸盐缓冲液中加入NaCl、NaN3、Tween 20、TTAB后，溶解，过滤，室温保存，其中，样本稀释液中含有400mM的NaCl、质量分数为0.1％的NaN3、体积分数为0.8％的Tween20、质量分数为0.02％的TTAB。
所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，荧光标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer捕获抗体用1×PBS配制成2mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积12％的1M碳酸氢钠溶液，接着按最终溶液与荧光染料的质量比为1：0.09添加荧光染料，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的荧光抗体络合物用填充交联葡聚糖G-25的层析柱进行纯化，收集首道流出的荧光抗体络合物，即得荧光标记的D-Dimer抗体络合物；
生物素标记的TnI抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的TnI捕获抗体用1×PBS配制成2mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积12％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与生物素的质量比为1：0.1添加生物素，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的生物素抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得生物素标记的TnI抗体络合物；
DNP标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer检测抗体用1×PBS配制成2mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积12％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与DNP的质量比为1：0.12添加DNP，包裹避光，置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的DNP抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得DNP标记的D-Dimer抗体络合物；
探测物的制备方法为：
配制基础缓冲液，基础缓冲液由1xPBS加BSA和蔗糖配制而成，其中，BSA的质量分数为6％、蔗糖的质量分数为5％；
配置探测物溶液：在基础缓冲液中分别添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含6μg/mL荧光(Eu)标记的TnI抗体络合物、1μg/mL荧光(Eu)标记的Anti-chicken IgY抗体络合物和200μg/mL阻断剂的探测物溶液一；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物，配制得到含4μg/mL生物素标记的TnI抗体络合物的探测物溶液二；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含20μg/mLDNP标记的D-Dimer抗体络合物、20μg/mL荧光(荧光素)标记的D-Dimer抗体络合物、0.1μg/mL荧光(荧光素)标记的Anti-chicken IgY抗体络合物、5μg/mL荧光(Eu)标记的NT-proBNP抗体络合物和200μg/mL阻断剂的探测物溶液三；
探测物分装及冻干：在探测物分装机上安装200μL移液头，在分装机上输入分装次数后开始分装，将探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别分装至相应的试管中，各自分装30μL后称试管重量，确认分装后的试管重量和分装前的空试管重量的差是否与分装容量一致，确认分装的分装容量一致后，缓慢抬起分装机夹具，移除后，使用过滤网分离探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三；将得到的探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别转移至不锈钢容器中，之后放入冻干机冻干，即得第一探测物、第二探测物和第三探测物。
所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒中，所述试剂条的制作方法为：
用包被稀释液分别将NT-proBNP检测抗体浓度调整到0.1和3mg/mL，链霉亲和素浓度调整到0.1和3mg/mL，DNP检测抗体浓度调整到3mg/mL，chicken IgY浓度调整到1mg/mL；
抗体包被：准备好硝酸纤维素膜，并正确置于贴膜设备上，将硝酸纤维素膜粘贴在垫卡上，用喷涂设备将使用包被稀释液调整后的chicken IgY喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线，将使用包被稀释液调整后的0.1mg/mL的链霉亲和素和3mg/mL的DNP混合抗体溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第一检测线，将使用包被稀释液调整后的3mg/mL的链霉亲和素溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第二检测线，将使用包被稀释液调整后的0.1mg/mL的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第三检测线，将使用包被稀释液调整后的3mg/mL的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第四检测线，即可获得包被后试剂条，其中，喷涂设备喷涂量为1μL/cm，喷涂速度为9cm/s，将各检测线和质控线平行喷涂于硝酸纤维素膜上进行包被，各检测线之间，以及质控线和第一检测线之间均间隔3mm，然后置于烘箱中，在37℃下烘干4天；
试剂条贴膜及切割：将样本垫粘贴在垫卡宽面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上1.5mm，吸收垫粘贴在垫卡窄面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上方，且离底板外边缘0.5mm，设定切割设备试纸条切割宽度为3mm，确认切断面是否平整；
试剂条组装：在底壳上安装切割好的试纸条，吸收垫装在壳的终端，合上上壳，置于压壳设备上压牢，即得试剂条。
诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)将试剂条水平放置；
2)取150μL样本稀释液与探测物混合，获得混合试剂；
3)将30μL全血或血浆与混合试剂混合，获得样本混合液；
4)取75μL的样本混合液加入到试剂条的样本垫上，在室温反应12分钟，获得反应后的试剂条；
5)使用检测设备对反应后的试剂条上的第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线进行检测。
第一检测线用于检测高浓度TnI和D-Dimer；
第二检测线用于检测低浓度TnI；
第三检测线用于检测高浓度NT-proBNP；
第四检测线用于检测低浓度NT-proBNP。
以上四条检测线不局限于以上顺序，其他顺序也可以。
在测试时，首先将探测物质、样本稀释液混合，再加入血样混合，探测物质中荧光标记的TnI、NT-proBNP、D-Dimer抗体络合物分别与血液中的TnI抗原、NT-proBNP抗原、D-Dimer抗原结合形成抗体-抗原复合物，混合样本再加入到反应板的样本垫上，通过毛细血管作用在硝化纤维基质的测试带上扩散，该复合物分别会被测试带上的链霉亲和素和NT-proBNP抗体、DNP所捕获，分别形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。因此，当血液中的TnI、NT-proBNP和D-Dimer抗原越多，测试带上的夹心复合物积聚的也多。荧光信号的强度反映了被捕获的TnI、NT-proBNP和D-Dimer抗原数量，经过配套的免疫荧光分析仪的判读，能够精确定量检测出血液样本中TnI、NT-proBNP和D-Dimer抗原的浓度。
实验1.反应板(试剂条)制作
购买并筛选高质量的单克隆抗体，进行配对实验，筛选出特异性高、亲和力好的捕获抗体和检测抗体。用包被稀释液分别将NT-proBNP检测抗体浓度调整到0.1和3mg/mL，链霉亲和素浓度调整到0.1和3mg/mL，DNP检测抗体浓度调整到3mg/mL，chicken IgY浓度调整到1mg/mL。
抗体包被：准备好硝酸纤维素膜并正确置于贴膜设备上，将硝酸纤维素膜粘贴在垫卡上，用喷涂设备将使用包被稀释液调整后的chicken IgY喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线，将使用包被稀释液调整后的0.1mg/mL的链霉亲和素和3mg/mL DNP混合抗体溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第一检测线，将使用包被稀释液调整后的3mg/mL的链霉亲和素溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第二检测线，将使用包被稀释液调整后的0.1mg/mL的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第三检测线，将使用包被稀释液调整后的3mg/mL的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第四检测线，即可获得包被后试剂条，其中，喷涂设备喷涂量为1μL/cm,喷涂速度为9cm/s，将检测线和质控线平行喷涂于硝酸纤维素膜上进行包被，各检测线之间，和以及质控线和第一检测线之间均间隔3mm，然后置于烘箱中，在37℃下烘干4天。
试剂条贴膜及切割：将样本垫正确粘贴在垫卡宽面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上1.5mm，吸收垫粘贴在垫卡窄面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上方，且离底板外边缘0.5mm。设定切割设备试纸条切割宽度为3mm，确认切断面是否平整。
试剂条组装：在底壳上正确安装切割好的试纸条，吸收垫应装在壳的终端，合上上壳，置于压壳设备上压牢，得到反应板(试剂条)备用。
实验2.缓冲液制作
所述样本稀释液的制备方法为：在磷酸盐缓冲液中加入NaCl、NaN3、Tween 20、TTAB后，溶解，过滤，室温保存，其中，样本稀释液中含有400mM的NaCl、质量分数为0.1％的NaN3、体积分数为0.8％的Tween 20、质量分数为0.02％的TTAB。
荧光抗体络合物制作：将筛选出的D-Dimer捕获抗体用1×PBS配制成2mg/mL。在上述抗体中添加12％(体积)的1M碳酸氢钠溶液，然后添加1：0.09(质量)的荧光染料进溶液中，包裹避光，置于混合器上搅拌反应≥4小时，温度控制＜30℃。将标记好的荧光抗体络合物用填充交联葡聚糖G-25的层析柱进行纯化，收集首道流出的荧光抗体络合物，使用紫外分光光度计检测制备的荧光抗体络合物的浓度和络合比，2-8度避光保存备用。
生物素抗体络合物制作：将筛选出的TnI捕获抗体用1×PBS配制成2mg/mL。在上述抗体中添加12％(体积)的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再添加1：0.1(质量)的生物素，包裹避光，置于混合器上搅拌反应≥4小时，温度控制在30℃。将标记好的生物素抗体络合物用脱盐柱进行纯化，使用紫外分光光度计检测制备的生物素抗体络合物的浓度和络合比，2-8度避光保存备用。
DNP标记的D-Dimer抗体络合物制作：将筛选出的D-Dimer检测抗体用1×PBS配制成2mg/mL。在上述抗体中添加12％(体积)的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再添加1：0.12(质量)的DNP，包裹避光，置于混合器上搅拌反应≥4小时，温度控制在30℃。将标记好的DNP抗体络合物用脱盐柱进行纯化，使用紫外分光光度计检测制备的DNP抗体络合物的浓度和络合比，2-8度避光保存备用。
探测物质制作：
配制探测物质溶液：
基础缓冲液由1xPBS加BSA和蔗糖配制而成，其中，BSA的质量分数为6％、蔗糖的质量分数为5％；在基础缓冲液组分中分别添加适量的抗体络合物和阻断剂，配制得到含6μg/mL Eu标记TnI抗体络合物、1μg/mL Eu标记Anti-chicken IgY抗体络合物和200μg/mL阻断剂的探测溶液一；在基础缓冲液组分中添加适量的抗体络合物，配制得到含4μg/mL生物素标记TnI抗体络合物的探测溶液二；在基础缓冲液组分中添加适量的抗体络合物和阻断剂，配制得到含20μg/mL DNP标记D-Dimer抗体络合物、20μg/mL荧光标记D-Dimer抗体络合物、0.1μg/mL荧光标记的Anti-chicken IgY抗体络合物、5μg/mL Eu标记NT-proBNP抗体络合物和200μg/mL阻断剂的探测溶液三。用搅拌机分别搅拌上述溶液1小时使其混匀。分别取探测溶液一、探测溶液二和探测溶液三30μL放入同一瓶试管中混合后再放入适量的样本稀释液以及质控品，确认其检测结果是否与预期值相近。确认检测结果无误后可进行探测物质分装。
探测物质分装及冻干：在探测物质分装机上安装200μL移液头，分装(30μL)后称试管重量，确认分装的试管重量和孔试管重量的差是否与分装容量一致，确认分装的分装容量一致后，在探测物质分装机上输入分装次数后开始分装。完成分装后缓慢抬起分装机夹具，移除后，使用过滤网分离探测物质。将得到的探测物质转移至不锈钢容器中，确认冻干机机床的温度后放入冻干机冻干探测物质。完成冻干的探测物质储存在“18-28℃,湿度<10％”。
实验3.添加公式以及制造ID芯片
取已进行中间产品检测合格的反应板、缓冲液，TnI、D-Dimer、NT-proBNP校准品，每个校准品至少有5个浓度，每个浓度至少测试5次，将各个浓度校准品面积扫描图的平均值与浓度做标准曲线，得到线性方程，将方程式的数值导入专用软件中，将空白的原始芯片连接至电脑，通过专用软件即可将数值代码导入芯片，贴好芯片标签。
实验4.精密度试验
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000或A5000)进行精密度实验。
1.检测材料：
心肌标记物质控物，每个项目选择低、高两个浓度，具体浓度见表1。
表1检测材料的浓度
2.试验方法：
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000)对本申请的试剂盒进行精密度检测，每个项目、每个浓度重复测定20次。A2000操作步骤如下：
1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。
2)用移液器取样本稀释液150μL，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血浆30μL)并放入装有样本稀释液的探测物质试管。
3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。
4)用移液器取75μL的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。
5)在室温反应12分钟。
6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。
3.试验结果分析：
按照试验方法对质控品进行检测，并分析检测结果。
4.试验结果表2-4。
表2 TnI检测结果
表3NT-proBNP检测结果
/>
表4 D-Dimer检测结果
/>
由表2、表3、表4可以看出，对TnI、NT-proBNP、D-Dimer 3个的低值和高值质控品重复测定20次后计算平均值，标准差和CV，所得结果可见本申请的试剂盒在测定TnI低值样本时CV为4.92％，高值样本的CV为4.85％；在测定NT-proBNP低值样本时CV为4.92％，高值样本的CV为3.82％；在测定D-Dimer低值样本时CV为3.68％，高值样本的CV为2.26％。3个项目检测的CV值均＜5％，表明本申请制备的试剂盒精密度良好，适用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需求。
实验5.准确度试验
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000或A5000)进行准确度实验。
1.检测材料：
Tn-I、NT-proBNP、D-Dimer有证标准物质，浓度分别为5.00ng/mL、500pg/mL、1.0μg/mL。
2.试验方法：
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000)对本申请的试剂盒进行准确度检测，每个项目重复测定3次。A2000操作步骤如下：
1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。
2)用移液器取样本稀释液150μL，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血浆30μL)并放入装有样本稀释液的探测物质试管。
3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。
4)用移液器取75μL的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。
5)在室温反应12分钟。
6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。
3.试验结果分析：
按照试验方法对有证标准物质进行检测，并分析检测结果。
4.试验结果见表5。
表5TnI、NT-proBNP、D-Dimer检测相对偏差
由表5可以看出，对TnI、NT-proBNP、D-Dimer 3个有证标准物质重复测定3次后分别计算相对偏差，由所得结果可知本申请的试剂盒在测定TnI有证标准物质时相对偏差为1.20％～4.20％；在测定NT-proBNP有证标准物质时相对偏差为-1.11％～2.92％；在测定D-Dimer有证标准物质时相对偏差为-2.00％～1.00％。3个项目检测的相对偏差均＜5％，表明本发明制备的试剂盒准确度良好，适用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需求。
实验6.一致性试验
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000或A5000)进行一致性实验。
1.检测材料：
临床样本由相关医院提供，其中100例NT-proBNP样本由罗氏电化学发光法定值，100例TnI样本由贝克曼化学发光法定值，100例D-Dimer样本由思塔高血凝仪定值，包含血浆和同源全血，其中TnI含量分布区间是0.01-30ng/mL，NT-proBNP含量分布区间是30-30000pg/mL，D-Dimer含量分布区间是0.25-20μg/mL。
2.试验方法：
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000)对本申请的试剂盒进行一致性检测，每个项目重复测定1次。A2000操作步骤如下：
1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。
2)用移液器取样本稀释液150μL，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血浆30μL)并放入装有样本稀释液的探测物质试管。
3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。
4)用移液器取75μL的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。
5)在室温反应12分钟。
6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。
3.试验结果分析：
按照试验方法对100例电化学发光法定值样本进行检测，以血浆检测结果为基准，分析各样本类型的相关关系。
试验结果见图3-图5所示。
由图3-图5左侧图可知，以对照系统血浆检测值为X轴，实验系统血浆检测值为Y轴，绘制散点图，进行相关性分析。对100例临床血浆样本进行检测，样本平均相对偏差小于10％，R2≧0.98，斜率在0.9～1.1范围内，表明本申请制备的试剂盒与电化学发光法在检测NT-proBNP血浆时一致性良好；与化学发光法在检测TnI血浆时一致性良好；与凝血仪在检测D-Dimer血浆时一致性良好，满足临床检测TnI、NT-proBNP、D-Dimer血浆的需要。
由图3-图5右侧图可知，以实验系统血浆检测值为X轴，实验系统全血检测值为Y轴，绘制散点图，进行相关性分析。对100例临床全血样本进行检测，样本平均相对偏差小于10％，R2≧0.98，斜率在0.9～1.1范围内，表明本发明制备的试剂盒在检测TnI、NT-proBNP、D-Dimer血浆和同源全血样本时一致性良好，满足临床检测TnI、NT-proBNP、D-Dimer全血的需要。
实验7.带结合垫板条和现有带探测物质试剂盒性能对比
为了说明带待测物质的试剂盒与带结合垫板条的性能差异，现进行性能对比测试研究。
1.检测材料：
临床血浆样本由相关医院提供，其中20例NT-proBNP样本由罗氏电化学发光法定值，20例TnI样本由贝克曼化学发光法定值，20例D-Dimer样本由思塔高血凝仪定值，其中TnI含量分布区间是0.01-30ng/mL，NT-proBNP含量分布区间是30-30000pg/mL，D-Dimer含量分布区间是0.25-20μg/mL。
选择2个厂家的带结合垫的TnI试剂盒、NT-proBNP试剂盒、D-Dimer试剂盒及配套仪器购自相关代理商。
2.试验方法：
使用与本申请的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：A2000)对本申请的试剂盒进行一致性检测，每个项目、每个样本重复测定5次。同时用2个厂家的带结合垫的TnI试剂盒、NT-proBNP试剂盒、D-Dimer试剂盒同时对20个血浆样本进行检测，每个项目、每个样本重复检测5次。A2000操作步骤如下：
1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。
2)用移液器取样本稀释液150μL，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血浆30μL)并放入装有样本稀释液的探测物质试管。
3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。
4)用移液器取75μL的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。
5)在室温反应12分钟。
6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。
3.试验结果分析：
按照试验方法对20例血浆样本进行检测，分析2种方法的差异。
试验结果，见表6-8。
表6TnI检测结果对比[单位：ng/mL]
表7NT-proBNP检测结果对比[单位：pg/mL]
/>
表8 D-Dimer检测结果对比[单位：μg/mL]
如表6所示，使用带结合垫的板条和本申请试剂盒同时检测20例TnI血浆样本，其中带结合垫的板条在测试低浓度TnI血浆样本时，个别样本的精密度CV值≧10％，相对偏差≧10％，而本申请试剂盒在0.01-30ng/mL检测范围内精密度CV≤10％，相对偏差≤10％，表明本专利试剂盒性能良好，满足临床检测TnI的需要。
如表7所示，使用带结合垫的板条和本专利试剂盒同时检测20例NT-proBNP血浆样本，其中带结合垫的板条在测试低浓度NT-proBNP血浆样本时，个别样本的精密度CV值≧10％，而本专利试剂盒在30-30000pg/mL检测范围内精密度CV≤5％，相对偏差≤5％表明本专利试剂盒性能良好，满足临床检测NT-proBNP的需要。
如表8所示，使用带结合垫的板条和本专利试剂盒同时检测20例D-Dimer血浆样本，其中带结合垫的板条在检测D-Dimer血浆样本时，个别样本的精密度CV值≧10％，相对偏差≧10％，而本专利试剂盒在0.25-20μg/mL检测范围内精密度CV≤5％，相对偏差≤5％，表明本专利试剂盒性能良好，满足临床检测D-Dimer的需要。
本申请性能指标，如表9所示。
表9性能指标
样本类型：血浆、全血。
反应时间：12分钟。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，其特征在于，包括：
探测物，其包括：
第一探测物，其包含荧光标记的TnI抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
第二探测物，其包含生物素标记的TnI抗体络合物；
第三探测物，其包含荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和荧光标记的D-Dimer抗体络合物、DNP标记的D-Dimer抗体络合物和荧光标记的质控络合物；
试剂条，其包括垫卡、铺设于所述垫卡上的硝酸纤维素膜、依次间隔设于所述硝酸纤维素膜上的样本垫、质控线、第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线以及吸收垫；
样本稀释液，其与所述探测物彼此独立分开存放，所述样本稀释液可溶解所述探测物。
2.如权利要求1所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的制备方法为：在磷酸盐缓冲液中加入NaCl、NaN3、Tween 20和TTAB后，溶解，过滤，室温保存，其中，样本稀释液中含有200-600mM的NaCl、质量分数为0.01-0.5％的NaN3、体积分数为0.1-3％的Tween 20和质量分数为0.01-0.5％的TTAB。
3.如权利要求1所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，其特征在于，荧光标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer捕获抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，接着按最终溶液与荧光染料的质量比为1：0.01-1：0.5添加荧光染料，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的荧光抗体络合物用填充交联葡聚糖G-25的层析柱进行纯化，收集首道流出的荧光抗体络合物，即得荧光标记的D-Dimer抗体络合物；
生物素标记的TnI抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的TnI捕获抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与生物素的质量比为1：0.05-1：0.5添加生物素，之后包裹避光，并置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的生物素抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得生物素标记的TnI抗体络合物；
DNP标记的D-Dimer抗体络合物的制备方法为：
将筛选出的D-Dimer检测抗体用1×PBS配制成1-5mg/mL的溶液，之后向上述溶液中添加体积为上述溶液体积2-20％的1M碳酸氢钠溶液，室温反应30分钟以上，再按最终溶液与DNP的质量比为1：0.01-1：0.3添加DNP，包裹避光，置于混合器上，在30℃以下搅拌反应4小时以上，最后将标记好的DNP抗体络合物用脱盐柱进行纯化，即得DNP标记的D-Dimer抗体络合物；
探测物的制备方法为：
配制基础缓冲液，基础缓冲液由1×PBS加BSA和蔗糖配制而成，其中，BSA的质量分数为0.05-10％、蔗糖的质量分数为0.05-10％；
配置探测物溶液：在基础缓冲液中分别添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含1-10μg/mL荧光标记的TnI抗体络合物、0.01-3μg/mL荧光标记的Anti-chickenIgY抗体络合物和100-500μg/mL阻断剂的探测物溶液一；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物，配制得到含1.0-10μg/mL生物素标记的TnI抗体络合物的探测物溶液二；在基础缓冲液中添加适量的抗体络合物、质控络合物和阻断剂，配制得到含1-50μg/mLDNP标记的D-Dimer抗体络合物、1-50μg/mL荧光标记的D-Dimer抗体络合物、0.01-5μg/mL荧光标记的Anti-chicken IgY抗体络合物、1-10μg/mL荧光标记的NT-proBNP抗体络合物和100-500μg/mL阻断剂的探测物溶液三；
探测物分装及冻干：在探测物分装机上安装200μL移液头，在分装机上输入分装次数后开始分装，将探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别分装至相应的试管中，各自分装20-80μL后称试管重量，确认分装后的试管重量和分装前的空试管重量的差是否与分装容量一致，确认分装的分装容量一致后，缓慢抬起分装机夹具，移除后，使用过滤网分离探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三；将得到的探测物溶液一、探测物溶液二和探测物溶液三分别转移至不锈钢容器中，之后放入冻干机冻干，即得第一探测物、第二探测物和第三探测物。
4.如权利要求1所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂条的制作方法为：
用包被稀释液分别将NT-proBNP检测抗体浓度调整到0.01-5mg/mL，链霉亲和素浓度调整到0.01-5mg/mL，DNP检测抗体浓度调整到0.1-5mg/mL，chicken IgY浓度调整到0.01-3mg/mL；
抗体包被：准备好硝酸纤维素膜，并正确置于贴膜设备上，将硝酸纤维素膜粘贴在垫卡上，用喷涂设备将使用包被稀释液调整后的chicken IgY喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线，将使用包被稀释液调整后的链霉亲和素和DNP混合抗体溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第一检测线，将使用包被稀释液调整后的链霉亲和素溶液喷涂在硝酸纤维素膜上形成第二检测线，将使用包被稀释液调整后的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第三检测线，将使用包被稀释液调整后的NT-proBNP检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上形成第四检测线，即可获得包被后试剂条，其中，喷涂设备喷涂量为1μL/cm，喷涂速度为9cm/s，将各检测线和质控线平行喷涂于硝酸纤维素膜上进行包被，各检测线之间，以及质控线和第一检测线之间均间隔2-3mm，然后置于烘箱中，在37℃下烘干1-5天；
试剂条贴膜及切割：将样本垫粘贴在垫卡宽面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上1-2mm，吸收垫粘贴在垫卡窄面侧，要求垫压在硝酸纤维素膜上方，且离底板外边缘0-1mm，设定切割设备试纸条切割宽度为3-4mm，确认切断面是否平整；
试剂条组装：在底壳上安装切割好的试纸条，吸收垫装在壳的终端，合上上壳，置于压壳设备上压牢，即得试剂条。
5.如权利要求1所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒，其特征在于，荧光标记所采用的荧光物质是荧光素、荧光微球、量子点或量子点微球。
6.如权利要求1-5任意一项所述的诊断心脏疾病的三项联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将试剂条水平放置；
2)取150μL样本稀释液与探测物混合，获得混合试剂；
3)将30μL全血或血浆与混合试剂混合，获得样本混合液；
4)取75μL的样本混合液加入到试剂条的样本垫上，在室温反应12分钟，获得反应后的试剂条；
5)使用检测设备对反应后的试剂条上的第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线进行检测。
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