CN205003164U - 肌钙蛋白i、脑钠肽、d-二聚体定量联检试纸条 - Google Patents
肌钙蛋白i、脑钠肽、d-二聚体定量联检试纸条 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型公开了一种肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,包括底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述试纸条由样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接粘贴在底板上构成。所述荧光标记物结合垫含有链霉亲和素标记荧光蛋白和生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、生物素标记的脑钠肽单克隆抗体、生物素标记的D-二聚体单克隆抗体;所述硝酸纤维膜上有检测线和质控线。本实用新型不仅大大缩短了检测时间,提高了检测灵敏度,同时联合检测还大大提高了便利性。
Description
技术领域
本实用新型属于免疫检测领域,具体涉及一种高灵敏度肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(CardiactroponinI,cTnI)是分子量22.5kD的心肌蛋白,和肌钙蛋白T(TnT),肌钙蛋白C(TnC)一起,形成肌钙蛋白复合体,从而对细胞内钙离子信号的传递和肌动-肌球蛋白的相互作用起着极其主要的作用,是一种高灵敏度、高特异性的心肌损伤的标志物。1987年英国Cummins等首先报告了测定周围血中心肌肌钙蛋白浓度来诊断急性心肌梗死(AMI),引起了研究者们的广泛注意,近年来关于心肌肌钙蛋白的研究初步表明,心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心脏的特异性抗原,其释放入血循环是心肌细胞损伤的敏感和高度特异性标志,对某些心血管病的诊断、预告及疗效判断等具有重要意义。1955年美国FDA批准cTnI作为AMI的最新试验诊断指标。1999年和2000年世界生化检测标准化协会、欧洲心脏病协会和美国心脏病学会提出了新的AMI定义和诊断标准,把血清标志物检测,特别是肌钙蛋白,放在了特别重要的位置。2001年11月美国心脏病学会和心脏病协会提出测定cTnI作为诊断AMI和急性冠状动脉综合症危险分层的第一位标准。在人类心肌损伤的诊断中,cTnI已经成为“金标准”之一。与其他指标相比,cTnI具有在血中出现时间早、持续时间长,且为心肌细胞所特有的优点,所以心肌肌钙蛋白I在临床上有着广泛应用的前景。
1988年日本学者TetsujiSudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽,命名为脑钠肽(brainnatriureticpeptide,BNP)。以后的研究表明,不只是BNP这一种多肽,而是有一组多肽在生物进化的过程中逐渐发展产生(在人类和脊椎动物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin),称为利钠肽(NP)家族。其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力调节的稳态。目前用于临床检测的包括BNP和氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)两种。在心肌细胞受刺激后,产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP),该肽的一个26氨基信号肽被立即去除,形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP),后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的NT-proBNP和含有32个氨基酸、有活性的BNP。BNP主要来源是心室。在正常状态下,BNP在颗粒中储存很少,机械性刺激是心室产生及分泌BNP的主要原因。当各种心肌损伤引起心输出量下降时,反馈性的兴奋神经、体液机制,从而使血管收缩、水钠潴留、心脏前后负荷增加,心肌张力升高,心肌细胞受到牵拉,使心室肌细胞BNP合成与分泌增加,血浆BNP浓度升高。可以产生抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抑制交感神经活动、减少水钠潴留、舒张血管等作用,对心脏有保护作用。因而血液BNP水平的异常变化即可以显示心脏功能的变化。BNP对心衰的检测价值近年来已被广泛接受,现在认为BNP是心衰患者非常有力的诊断和预后的标志物,BNP的检测也为心功能的分级提供了更加可靠的依据。WieczorekSJ等比较测定了严格按美国纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级标准诊断的慢性心衰(CHF)患者血浆BNP水平,心功能I~IV级CHF患者血液BNP浓度均值较正常人明显增加,且随心功能的损害程度加重呈显著上升趋势。若以100pg/ml为cutoff值,BNP对CHF的诊断效能是:敏感度90%,特异性76%。BNP浓度值对于心衰患者的治疗效果监测也有帮助,治疗有效的患者血液BNP水平较治疗前明显降低。
D-二聚体(D-Dimer,简称DD)是交联纤维蛋白的特异降解产物之一,分子量大小约为190kDa,在体内半衰期>3小时,主要经肾脏排泄。人体纤溶系统对保持血管壁的正常通透性,维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用。正常人纤溶酶和抑制酶之间保持动态平衡,使血液循环能正常进行。机体发生凝血时,凝血酶作用于纤维蛋白原,转变为交联纤维蛋白,同时纤溶系统被激活,交联纤维蛋白溶解过程开始,纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段,形成纤维蛋白产物(FDPs),包括X-寡聚体(X-oligomer)、D-二聚体(D-Dimer)、中间片段(Intermediatefragments)、片段E(FragmentE)组成。其中,X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位,其中最小、最简单的降解终产物即是D-二聚体。1971年Wilson等首先应用纤维蛋白降解产物用于诊断肺动脉栓塞(PE)。随着研究的开展和深入,临床工作者对D-二聚体在肺动脉栓塞中的意义认识日益深刻。1999年欧洲心脏病学会急性肺动脉栓塞诊断和治疗指南中推荐用ELISA方法检测D-二聚体。阴性的D-二聚体值对于肺动脉栓塞具有理想的阴性预告作用,阴性的结果可以基本排除肺动脉栓塞,从而可以减少有创的检查。但是临床医生必须清楚它的局限性和应用的指证。D-二聚体的浓度和血栓的位置有关,在肺动脉干主要分支的浓度较高,而在次要分支的浓度较低。在大分支的敏感性为93%,小分支的敏感性为50%。虽然D-二聚体对于小分支血栓的诊断意义不够明显,然而其他检查对于小的血栓同样不明确,如肺动脉造影等。对于这些小的血栓,只要D-二聚体是阴性的,在患者心肺储备功能比较好的情况下,可以不采取抗凝治疗,临床随访的结果表明这样做是安全的。D-二聚体在深静脉血栓(DVT)中总的诊断价值和在PE中的诊断类似价值,阴性的D-二聚体可以基本排除DVT形成的可能。阳性的结果意义不大,特异性不够强,很多疾病可以引起D-二聚体的升高。D-二聚体在DVT诊断中的敏感性为95%,特异性为40%,阳性预测值为48%,阴性预测值为95%。
综上所述,cTnI、BNP、DD几种标志物的临床诊断价值各不相同,可以从不同的方面反应心肺功能,三项联合检测可用于心肺疾病的辅助诊断。
目前国内市场上暂无同类产品。
生物素-亲和素系统(biotinavidinsystem,BAS),是一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世,BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化,酶联免疫,荧光免疫,放射免疫等检测技术中,可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性,使方法更简便,有助于临床快速诊断,并利于进行大规模流行病学调查,成为研究免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速,又无放射物质污染,不需复杂仪器,充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。
生物素-亲和素系统检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上,结合生物素与亲和素间的高度放大作用,而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,分子量为68kDa,由4个亚单位组成,对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质,链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素,因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素系统研制肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检快速诊断试剂尚无报道。
实用新型内容
本实用新型的目的,在于提供一种肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统,提供高灵敏度肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条。使用本实用新型时,提高了检测灵敏度和检测稳定性,降低了非特异性结合,联合检测大幅度提高检测的准确性和便利性,检测时间不大于10分钟,大大提高了诊断效率。
本实用新型解决其技术问题的解决方案是:肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其包括底板,所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上,所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、生物素标记的脑钠肽单克隆抗体、生物素标记的D-二聚体单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白;所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别心肌肌钙蛋白I另外一个表位的单克隆抗体构成的第一检测线、识别脑钠肽另外一个表位的单克隆抗体构成的第二检测线、识别D-二聚体另外一个表位的单克隆抗体构成的第三检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫,所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方,所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
作为上述技术方案的进一步改进,所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条,所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
作为上述技术方案的进一步改进,还包括卡壳,所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内,所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述观察窗为长方形孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进,所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
本实用新型与现有技术相比,具有如下优点:
(1)本实用新型将荧光蛋白作为标记物,此标记物稳定性良好,有利于提高检测稳定性。
(2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”,提高检测灵敏度,降低非特异性结合,有利于提高试剂盒性能。
(3)利用本实用新型进行心肌肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体的检测时间不大于10分钟,心肌肌钙蛋白I检测线性范围为0.10ng/ml~30.00ng/ml,脑钠肽检测线性范围为5.0-5000.0pg/mL,D-二聚体检测线性范围为0.1-5.0mg/L,极大地提高了检测效率。
(4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读,可实现自动化,减少主观因素的影响,提供便利、快速、可靠的诊断结果。
(5)本实用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗,根据分析仪器判定结果,准确可靠。
(6)本实用新型制作方便,体积小、便于携带。
(7)本实用新型检测成本较低。
(8)本实用新型可批量生产,适用于临床快速诊断和现场快速诊断;易于保存,有利于基层单位推广。
(9)本实用新型采用联合检测,一条检测条同时检测三项,检测更加方便。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然,所描述的附图只是本实用新型的一部分实施例,而不是全部实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
图1是本实用新型实施例一的结构示意图;
图2是本实用新型实施例二的结构示意图;
图3是本实用新型实施例三的结构示意图;
图4是本实用新型实施例四的结构示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本实用新型的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本实用新型的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本实用新型的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本实用新型保护的范围。另外,文中所提到的所有联接/连接关系,并非单指构件直接相接,而是指可根据具体实施情况,通过添加或减少联接辅件,来组成更优的联接结构。
参照图1,肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其包括底板5,所述底板5上依次设有样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4,所述吸水垫4和荧光标记物结合垫2分别交叠压在硝酸纤维素膜3的两端后在硝酸纤维素膜3的表面形成检测区,荧光标记物结合垫2为玻璃纤维膜,所述样品垫1交叠压在荧光标记物结合垫2上,所述荧光标记物结合垫2上固定有生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体(浓度0.3~1.5mg/mL)、生物素标记的脑钠肽单克隆抗体(浓度0.3~1.5mg/mL)、生物素标记的D-二聚体单克隆抗体(浓度0.3~1.5mg/mL)和链霉亲和素标记(或亲和素)的荧光蛋白(使用激发光波长530nm,发射光波长570nm,浓度0.1~2.0mg/mL);所述检测区内的硝酸纤维素膜3上固定有识别心肌肌钙蛋白I另外一个表位的单克隆抗体构成的第一检测线T1(浓度0.5~3mg/mL)、识别脑钠肽另外一个表位的单克隆抗体构成的第二检测线T2(浓度0.5~3mg/mL)、识别D-二聚体另外一个表位的单克隆抗体构成的第三检测线T3(浓度0.5~3mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线C(浓度0.2~2.0mg/mL),质控线C用于检测试纸条的有效性。
将生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、生物素标记的脑钠肽单克隆抗体、生物素标记的D-二聚体单克隆抗体和链霉亲和素(或亲和素)标记的荧光蛋白固定在荧光标记物结合垫2上,将有识别心肌肌钙蛋白I另外一个表位的单克隆抗体、识别脑钠肽另外一个表位的单克隆抗体、识别D-二聚体另外一个表位的单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T1、T2、T3和质控线C。当待测样品加到样品垫1上后,通过层析作用向前移动,样品中心肌肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体分别对应与荧光标记物结合垫2上结合荧光标记物(荧光蛋白)的心肌肌钙蛋白I抗体(Mab-cTnI*Fluoro)、结合荧光标记物(荧光蛋白)的脑钠肽抗体(Mab-BNP*Fluoro)、结合荧光标记物(荧光蛋白)的D-二聚体抗体(Mab-DD*Fluoro)反应形成复合物cTnI-Mab-cTnI*Fluoro、BNP-Mab-BNP*Fluoro、DD-Mab-DD*Fluoro,在层析作用下反应复合物继续向前移动经过硝酸纤维膜上包被的cTnI抗体、BNP抗体、DD抗体(检测线)时,反应复合物分别对应被包被的cTnI抗体、BNP抗体、DD抗体捕获形成复合物(Mab-cTnI-cTnI-Mab-cTnI*Fluoro、Mab-BNP-BNP-Mab-BNP*Fluoro、Mab-DD-DD-Mab-DD*Fluoro)(检测线),通过荧光免疫分析仪读取检测线的反应信号,在激发光源的作用下,荧光物质发射特定波长的荧光信号,荧光免疫分析仪俘获荧光信号,通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值,计算出样本中心肌肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体的浓度,得到心肌肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体检测结果。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图3,所述荧光标记物结合垫2包括层叠的第一荧光标记物结合垫20和第二荧光标记物结合垫21,所述第一荧光标记物结合垫20的一端垫在样品垫1的下方,所述第二荧光标记物结合垫21交叠压在硝酸纤维素膜3的一端。荧光标记物结合垫2的分层设置,便于将荧光标记物结合垫2安装在样品垫1和硝酸纤维素膜3之间。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图3所述第一荧光标记物结合垫20中插入样品垫下方的一端设有定位条22,所述样品垫1的下端面设有能容纳定位条22的定位槽。通过定位条22便于荧光标记物结合垫2和样品垫1之间的安装固定。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图2和图4,还包括卡壳,所述底板5、样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4均置于卡壳6内,所述卡壳6壳面上对应于硝酸纤维膜3的位置设有观察窗8,卡壳6壳面上对应于样品垫1的位置设有加样孔7。
作为上述技术方案的进一步改进,所述观察窗8为长方形孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进,所述样品垫1为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。样品垫由玻璃纤维构成,经表面活性剂缓冲液浸泡处理,干燥后使用。所述样品垫1的裁剪宽度为2.5~5.0mm。
作为上述技术方案的进一步改进,所述底板5为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述卡壳6包括塑料上壳60和塑料下壳61,所述塑料上壳60扣合塑料下壳61上后形成卡壳6。
以上是对本实用新型的较佳实施方式进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:其包括底板,所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上,所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、生物素标记的脑钠肽单克隆抗体、生物素标记的D-二聚体单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白;所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别心肌肌钙蛋白I另外一个表位的单克隆抗体构成的第一检测线、识别脑钠肽另外一个表位的单克隆抗体构成的第二检测线、识别D-二聚体另外一个表位的单克隆抗体构成的第三检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫,所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方,所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
3.根据权利要求2所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条,所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
4.根据权利要求1至3任一项所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:还包括卡壳,所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内,所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
5.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述观察窗为长方形孔。
6.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
7.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
8.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
9.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I、脑钠肽、D-二聚体定量联检试纸条,其特征在于:所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |