JP2000509486A

JP2000509486A - １段階オールインワン乾燥試薬イムノアッセイ

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Publication number: JP2000509486A
Application number: JP9535865A
Authority: JP
Inventors: ペテルソン，キム; レブグレン，ティモ
Original assignee: ペテルソン，キム; レブグレン，ティモ
Priority date: 1996-04-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: EP0892927B1; DE69729186D1; JP3537829B2; ES2217394T3; WO1997038311A1; EP0892927A1; US6429026B1; DE69729186T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規の競合的又は非競合的イムノアッセイ法であって、次の工程：反応ウェル内で固相上にアッセイ特異的成分を固定化し；標識されたアッセイ特異的成分を添加し；上記成分を乾燥させ；分析されるべきマーカーを含有するサンプルを添加し；上記マーカーを上記アッセイ特異的成分と反応させ；そして上記標識からのシグナルを検出する、を含む前記アッセイ法を提供する。さらに、本発明は、上記の新規アッセイの実施に有用なデバイスにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】１段階オールインワン乾燥試薬イムノアッセイ本発明は、必要なアッセイ特異的成分の全てが、そのサンプルが添加される前に、その反応ウェルに事前に添加され、そして乾燥されている新規なイムノアッセイに関する。本発明は、さらに、上記アッセイを実施において有用なデバイスにも関する。発明の背景本発明の背景を明らかにするために本明細書中に使用する刊行物その他の材料、及び特に、その実施に関するさらなる詳細を提供するためのケースを、引用により取り込む。ランタニド・キレート標識及び時間分解(time-resolved)フルオロメトリーは、10年以上も前に既にイムノアッセイの分野に導入された（Siitari et al．Nat ure 301，258-60，1983）。上記標識の高い比活性との組合せにおけるモノクローナル抗体の利用可能性は、優れた感度及びダイナミック・レンジをもつ非競合的イムノアッセイが実施されることを可能にした(Ekins and Dakubu，Pure Appl K and Van Dyke R eds．Luminescece Immunoassays and Molecular Application s．Boca Raton，U.S.A:CRC Press Inc.，233-50，1990)。高い比活性をもついくつかの異なる標識がその後に出現してきている(Kricka Clin Chem 40，347-57， 1994，Price and Newman eds.，Principles and Practice of Immunoassays．Ne w York:Stockton Press，650pp，1991，Dickson et al．Pharmac Ther 66，207 -35，1995)。モノクローナル抗体は広くポリクローナル抗体の代りに使用され、そして非競合的アッセイのデザインは、可能なときはいつも好ましいものである。特に、新規の非アイソトープ標識の有用性は、イムノアッセイの分野の現在の自動化レベルに貢献した。別の戦略も、イムノアッセイの感度及び信頼性を改善するために選択されることができる(Kricka Clin Chem 40，347-57，1994，Price and Newman eds.，Pri nciples and Practice of Immunoasays．New York:Stockton Press，650pp，199 1，Dickson et al．Pharmac Ther 66，207-35，1995，Ekins and Chu Clin Che m 37，1955-67，1991)。非競合的イムノアッセイの高い感度は、高アフィニティー抗体と共に高比活性をもつ標識を使用することによってのみ具現化されることができるので(Ekins and Dakubu，Pure Appl Chem 57，473-82，1985，Ekins an d Chu Clin Chem 37，1955-67，1991)、より高い感度の検出技術について探索についてかなりの努力が払われている。検出器ノイズの如き要因に加えて、標識試薬の非特異的シグナル及び非特異的結合を生じさせるサンプル中の妨害が、全体のアッセイ感度を減少させる(Ekins and Dakubu，Pure Appl Che nd Van Dyke R eds．Luminescece Immunoassays and Molecular Applications． Boca Raton，U.S.A:CRC Press Inc.，233-50，1990)。新規のイムノアッセイ戦略をデザインするための他の理由は、高品質のキー試薬により信頼性を改善すること、そしてより直接的な手順を得るために不必要な段階を取り除くことによりアッセイを単純化することである。時間分解フルオロメトリー及びランチニト・キレート標識に基づくイムノアッセイ技術は、元来、解離強化ランタニド・フルオロイムノアッセイ(dissociatio n enhanced lanthanide fluoroimmunoas Anal Biochem 137，335-43，1984）。そのアフィニティー及び特異性に対するいかなる影響を伴わずにモノクローナル抗体に共有結 ssson in:Van Dyke K and Van Dyke R eds．Luminescece Immunoassays and Mol ecular Applications．Boca Raton，U.S.A:CRC Press Inc.，223-50，1990)は、改善された感度をもついくつかの非競合的アッセイのデザインにおいてひじょうに有用であることが証明．Chemical Analysis，Vol 117．Toronto:Wiley & Sons，343pp，1991，Xu et a l．Clin Chem 38，2038-43，1992)。さらに、良好な性能特性をもつ競合アッセイ(Bertoft et al．FEBS Lett 173，31 oid Biochem 27，47-51，1987)が行われた。但し、その標識は、このアッセイ・デザインにおいてその感度に本質的に寄与しない(Ekins and Dakubu，Pure Appl Chem 57，473-82，1985，Ekins and Chu Clin Chem 37，1955-67，1991)。日常的な実験室内で行われるイムノアッセイは、広く自動化されている。アナライザーは、速いランダムな及び連続的なアクセス・モードにおいて作動しなければならない。処理能力は、一般的な化学アナライザーのものと同様なものでなければならず、そして試薬の大きな搭載（on-board）供給が、オペレーターの実地の時間を減少させなければならない。自動化の要求は、ほとんどの標識技術について困難であることが判明し、そして上記パネル内の分析物（an alytes）の性能特性は、行なわれなければならなかった妥協のために欠点をもっていた。本発明において、我々は、乾燥形態において１のテストにおいて必要なアッセイ特異的試薬の全てを入れたマイクロタイトレーション・ウェル内の１段階手順において全てのアッセイが行われるところの自動化のために好適な比較的速いイムノアッセイ技術について記載する。高比活性をもつ本質的に螢光性の安定性ランタニド・キレートを、標識として使用する。モデル・アッセイの性能は、急性心筋梗塞(acute myocardial infarction(AMI))の早期検出のための全血中の生化学的心臓マーカーを、定量的計測においてテストされてきた。 AMIの早期確認又は除外は、正しい処置の決定のために不可欠である(Rozenman Y et al.，Annu Rev Med 1994;45:31-44及びL Kristein Newby et al.，Clin C hem 1995;41:1263-1265)。AMI患者の全てが入院時に非診断的ECGsをとられるということを部分的原因として、生化学的マーカーが、診断を確認するためにしばしば必要とされる。不幸なことに、生化学的マーカーに基づく実験室結果は、通常、患者の最初の診断及び最終的な入院後数時間まで利用されることができない。死の50％以上が兆候の開始後最初の２時間以内に生じる。さらに、血栓溶解治療の利用可能性及び早期介在の明らかな利点は、速い診断のための必要性を高める。最適には、生化学的マーカーに基づく結果は、ECGデータと同時に利用されなければならない。さらに、クレアチン・キナーゼMBアイソザイム(CK-MB)、最も多く認められたタンパク質マーカー、活性計測の感度は、上記の早期時間の間の心筋損傷を正確に決定し又は除外するためには低すぎる。ミオグロビン（Myoglobin(Mb)）は、心筋及び骨格筋中に存在する17,800kDaのヘム・タンパク質である。その低分子量の質量に因り、Mbは、損傷した心筋から早期に（２〜４時間）放出され、そして血清に移動する。AMIを患う患者におけるMbの速い上昇は、それを、AMIの早期確認又は除外のために、そして心臓再灌流のモニタリングのために理想的なマーカーにしている（Ohman EM et al.，Br Heart J 1990;63:335-338)。しかしながら、定量結果の速い利用可能性の欠如が、その臨床的適用を制限してきた。 Mbその他の生化学心臓マーカーの最適な利点は、臨床医により分析されるであろうECGと同時に結果を提供するために十分に短い所要時間をもつ定量アッセイをもって、得られるであろう。ほとんどの早期生化学マーカーのアッセイにおける律速段階の中の１は、全血からの血漿又は血清の手動分離を含む。血液サンプルについて直接アッセイを使用する可能性は、血液採取から結果解析までの全時間を顕著に短縮するであろう。それ故、我々の目的は、AMIの早期診断のために利用可能な結果を得るためにMbその他の生化学心臓マーカーに基づく高再現性の定量結果を作り出すために、全血サンプルの簡単な自動処理のために好適な速い時間分解免疫螢光計測アッセイ（rapid time-resolved immunofluorometric ass ay）を最適化することであった。本発明の要約例えば、血漿、血清又は全血サンプル中の分析物（analytes）を定量的に計測するためのイムノアッセイにそのウェルが使用される前に、アッセイ特異的成分の全てが事前に反応ウェルに添加され、そして乾燥されるようなイムノアッセイが発明されてきた。本発明に従えば、生化学マーカー、特に生化学心臓マーカーが、時間分解フルオロイムノアッセイ及び本質的に螢光性のランタニド・キレートの使用により急性心筋梗塞を早期に検出し又は除外するために全血サンプルから直接的に計測されることができる。全血サンプルは、乾燥形態においてアッセイ特異的成分の全てを含む小さな反応ウェル又は普通のマイクロタイトレーション・ウェル内の好適なアッセイ溶液又はバッファー中に添加される。イムノアッセイは、競合的又は非競合的のいずれかであることができ、そして２以上の心臓マーカーが、異なるランタニドキレート標識（ユーロピウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウム）が個々の生化学心臓マーカーのアッセイについて同時に使用されるとき、１の反応ウェル又はマイクロタイトレーション・ウェル内で計測されることができる。免疫反応が完結し（平衡に達し）、又は中断された（速度計測）後、その反応ウェル又はマイクロタイトレーション・ウェルを、上記アッセイ溶液で洗浄し、そして本質的に螢光性のランタニド・キレート標識からの時間分解螢光を計測する。螢光は、上記反応ウェル又はマイクロタイトレーション・ウェルの表面から直接的に計測されるか、又は上記の本質的に螢光性のランタニド・キレートが溶液中に運ばれた後に計測される。上記の時間分解螢光シグナルのレベルは、測定された生化学心臓マーカーの定量的な尺度である。典型的には、計測された心臓マーカーは、ミオグロビン、クレアチン・キナーゼMBアイソザイム(CK-MB)、トロポニンＩ（troponin I）及びトロポニンＴである。図面の簡単な説明図１Ａと１Ｂは、１段階オールインワン乾燥試薬非競合的（サンドイッチ；図１Ａ）及び競合的（図１Ｂ）イムノアッセイの主なデザインを示す。図２は、本発明に従って測定された、＋36℃におけるインキュベーション時間に対する、全血標準（黒四角）、バッファー標準（黒三角）、全血サンプル（点四角）及び血清サンプル（×）についてのシグナルを示す。図３は、バッファー標準（黒四角）、全血標準（黒三角）についての、ミオグロビン濃度対シグナルを示す。本図はさらに、本発明に従って測定された、バッファー標準（白四角）と全血標準（白丸）についてのCV％を示す。図４は、LANFIA（溶液中の螢光性ランタニド・キレート）を使用した本発明によるミオグロビンと、慣用のRIAによるミオグロビンの間の相関を示す。図５は、本発明に従って測定された、全血からのミオグロビンと血漿からのミオグロビンの間の相関を示す。図６は、本発明に従って測定された、電気パルス後の時間に対する、電気的除細動(cardioversion)患者の血漿からのミオグロビン濃度（黒丸）と全血からのミオグロビン濃度（黒四角）を示す。発明の詳細な説明非競合的及び競合的イムノアッセイは、血清及び血漿サンプル中の生理学的に重要なタンパク質マーカーを計測するために臨床実験室において日常的に使用される。AMIの早期診断においては、全血サンプルを用いた定量的な結果をもたらす実施し易い、１段階のイムノアッセイが、生化学的心臓マーカーの検出のために特に有用であろう。特に、MbだけでなくCK-MB、クレアチン・キナーゼのイソ形態Ｓ、トロポニンＩ及びトロポニンＴが、AMIの早期検出と再灌流のモニタリングのために好適であると考えられる。なぜなら、それは、兆候の開始直後に血液中に上昇するからである(Johannes Mair et al.，Clin Chem 1995;41:1266-12 72)。グリコーゲン・ホスホリラーゼ・アイソザイムBBのための最近導入されたアッセイは、心筋損傷のための他の速く、かつ、高感度のマーカーを提示する(Georg Rabit zsch et al.，Clin Chem 1995;41:966-978)。これらの生化学心臓マーカーの速い免疫螢光計測アッセイは、全血サンプルによる定量的で、高い再現性を有する結果を提供するために使用されることができるであろう。高い比活性をもつ本質的に螢光性のランタニド・キレートにより標識されたモノクロナール抗体及び時間分解フルオロメトリーの使用は、速い速度、良好な感度及び広いダイナミック計測レンジをもたらす、小サンプル及びアッセイ容量の使用を可能にする。達成された、全血アッセイに伴う低検出限界は適当なものであり、そしてその標準曲線は、その全計測レンジにわたり線形であり、そしてさらにその高投与量のフック効果(hook effect)は、そのアッセイを妨害しない。その上、可能性のある小サンプル容量の使用は、全血サンプルによる潜在的な妨害を最小化する。全血サンプルを使用することができるということは、血漿又は血清の手動の分離に要する時間を取り除く。サンプルの事前希釈、その後の１段階アッセイは、20分以内に定量結果を与えるように容易に自動化される。本質的に同一の結果が、たった５分間のインキュベーションを使用して得られることができる。但し、平衡なこのアッセイにおいて達成されない。さらに、使用される小サンプル及び試薬容量の不正確な移しに因る手動手順における可能性のある不正確さは、アッセイ・システムの自動化により取り除かれるであろう。従って、生化学心臓マーカーの定量的な結果が、EC Gデータと同じ時間枠内で入手できることとなる。AMIの診断のための生化学マーカーの全パネルが全血サンプルから定量的に計測されることができるということが実行可能である。生化学血清マーカーのために、例えば、ミオグロビン、CK-M B及びトロポニンＩに対する異なる放出パターンの速い結果が、兆候の開始後に異なる時間に起こる患者の診断を支援するであろう。上記イムノアッセイのデザインは、非競合的アッセイと競合的アッセイの両方が実施されることを許容する（図１Ａと１Ｂ）。非競合的アッセイ（図１）においては、分析物特異的な捕獲抗体(catching antibody)(10)が、ウェルの表面上に直接的に固定化されるか、又はビオチン化捕獲抗体が、ストレプトアビジンでコートされたウェルの表面上に固定化されるかのいずれかである。また、第２の固定化試薬に基づく他の間接的なコーティング手順が、分析物特異的捕獲抗体を固定化するために使用されることができる。炭水化物及び／又はタンパク質及び任意的タンパク質添加物を含む遮断層(insulating layer)(11)を、ウェルの底部にある捕獲抗体の上部で乾燥させる。最終的に、標識された抗体（12）を、上記遮断層の上部に小量添加し、そして乾燥させる。競合的アッセイ（図１Ｂ）は、ウェルの表面上に固定化された第２抗体（13）と分析物特異的抗体（10）を含む。任意的タンパク質添加物及びブロッキング剤を含む遮断層（11）が使用され、そして標識された競合する分析物（14）が、その遮断層の上部に小容量で乾燥される。あるいは、この遮断層は省かれ、そして標識された競合性分析物が特異的抗体の上部に直接的に小容量で添加され、そして乾燥される。イムノアッセイを開始するためには、サンプル（又は標準）と一般的なアッセイ・バッファーだけが添加される必要がある。イムノアッセイの実施に対する乾燥試薬ウェル内の遮断層組成物の効果を調べた。いくつかの添加物、例えば炭水化物、タンパク質及びブロッカー成分の影響力を、さまざまな量、容量及び乾燥温度を使用してテストした。非競合的イムノアッセイにおいては、標識された成分は、小容量でその遮断層の上部に小分けされ、そして直ちに乾燥されなければならない。あるいは、競合的イムノアッセイにおいては、標識された成分は、特異的抗体の上部に直接的に添加されることができる。オールインワン乾燥試薬コンセプトの性能を、常に、溶液中の対応成分を用いたイムノアッセイと比較した。タンパク質と炭水化物から作られた遮断層は、他の代替法に比較したとき最低のバックグラウンドと最高のシグナル対ノイズ比を提供する。適当な遮断層により、溶液中の全アッセイ成分により得られる性能と少なくとも等価であるアッセイ性能が達成される。上記コンセプトに従うイムノアッセイは慣用のマイクロタイター・ウェル形式において行われることができるけれども、現在の技術水準に従う性能特性が達成されるということが証明されている。上記検出及び標識技術、時間分解フルオロメトリー及び螢光性ユーロ 8，105-154，1987，Dickson et al．Pharmac Ther 66，207-35，1995）は、その高い感度により、不活性の、緩やかな(lenient)、かつ、安定性の標識、並びに広いダイナミック・レンジが、これを可能にする。従って、比較的小さなサンプル容量が、分析物についての低検出限界を未だ未しながら、使用されることができる。上記アッセイの動態又は反応速度は、全アッセイ容量を減少させることにより、そして高温においてインキュベートすることにより、上昇されることができる。非競合性アッセイの反応速度は、高投与量のフック効果を同様に減少させる標識された抗体の増加量を添加することにより、さらに改善される。１段階オールインワン乾燥試薬コンセプトの評価に含まれるモデル・アッセイの全てが、上述した要因に関して最適化されたとき、15分以内に平衡に達した。明らかに、より速いアッセイは、この平衡要求が放棄される場合、同一コンセプトに従って行われることができる。提示されたコンセプトに従えば、２段階アッセイは全く報告されない。なぜなら、その後、試薬添加段階が含まれなければならないからである。普通の競合性アッセイは、通常、１段階手順において行われる。非競合性アッセイにおいては、これは、時折、制限として考えられることができる。標識された抗体の増加量の使用を許容する固相及び標識技術の高い能力は、この制限を補償する。高投与量のフック効果により生じるシグナルは、着目の分析物のために使用される最高の標準のために得られたシグナルの下まで決して下降しないであろう。本質的に螢光性のランタニド、例えばユーロピウム、キレートは、インキュベーション期及び計測期の両者の間に、イムノアッセイにおいて標識された成分に結合される。解離強化されたランタニド・フルオロイムノアッセイ（DELFIA）において、ユーロピウム・イオンは、新たな螢光錯体が形成される溶液中に標識付けのために使 137，335-43，1984）。新たな本質的に螢光性のランタニド・キレートは、上記D ELFIA手順において得られたものに等価な比活性をもつ。固相から時間分解計測のための溶液への螢光標識された成分の放出は、速いものである（Mitrunen et al．Clin Chem 41，1115-20，1995，Diamandis et al．Chin Biochem 25，255- 61，1992）。外からの汚染についての危険は最小化される。なぜなら、ランタニド・イオンはその計測前にそのキレートから決して放出されないからである。螢光ユーロピウム及びテルビウム・キレートを使用した２重標識（Dual-label）アッセイが可能であり(Mitrunen et al．Clin Chem 41，1115-20，1995)、そしてあるいは、その螢光シグナルは、放出段階の全てを排除する固相表面から直接的に計測されることができる。本質的に螢光性のユーロピウム・キレートの中の１、４−（２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチニル）−２，６，−ビス((Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノ)メチル)ピリジンの検出限界が、計測された。いくつかの同様の本質的に螢光性のランタニド・キレートが合成されている(Mukkala et al．He lv Chim Acta 75，1621-32，1992)。ユーロピウムの計測のためのDELFIA強化原理に比較して、ランタニドは、常に、元のキレートに結合し、そしてその励起エネルギーは、その分子のエネルギ一仲介部分により効率的に吸収される。螢光性ユーロピウム・キレートについての検出限界（バックグラウンド＋２SD）は、５ ×10^-14mol／Ｌと推定され、これは、DELFIA強化溶液中のユーロピウムの検出限界に対応す不活性、かつ、安定性の本質的に螢光性のランタニド・キレート標識は、本１段階のオールインワン乾燥試薬イムノアッセイを実行可能なものにする。可能性のある、標識された成分の非特異性結合は、オールインワン乾燥試薬ウェル内での遮断層の使用により防止される。この遮断層が省かれる場合、非特異的結合が、特に、そのウェルの保存の間の高過剰の試薬の、非競合的アッセイにおいて、増加する。最適には、上記遮断層中に添加されたタンパク質と炭水化物の両方による非競合性のイムノアッセイが、液体の形態で試薬を使用する対応のアッセイよりも、よりよく行われる。上記添加物のいくつか及び明らかに上記ブロッカーは、分析物特異的であった。遮断層の上部への標識された成分の添加も、決定的である。特に、非競合性アッセイにおいては、標識された抗体は、その非特異的結合を有意にしないように速く乾燥される小容量において添加されなければならない。競合性アッセイにおいては、遮断層の使用は、そのアッセイが平衡まで行われる限り、不可欠ではない。一旦、１段階オールインワン乾燥試薬ウェルの分析物特異的最適化が行われれば、それらの使用は極めて簡単である。なぜなら、サンプルと一般的なアッセイ・バッファー又は溶液だけが、そのイムノアッセイが行われるときに、要求されるからである。以下の実施例を、限定のためではなく、説明のために提供する。実験実施例１モノクローナル抗体の標識付け検出において使用されるMabを、ユーロピウム（Eu）の４−（２−（４−イソチオシアナトーフェニル）エチニル）−２，６，−ビス((Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノ)メチル)−ピリジンの螢光性キレートで標識した。標識付けを、50mmol／Ｌ NaHCO₃を含むバッファー（pH 9.8）中に100倍モル過剰の上記 Euキレートを用いて、４℃で一夜、行った。(3.3mg／mLまでの)高タンパク質濃度及びこれ故低過剰のキレートを、上記標識付け反応の全容量を最小化するために使用した。高精度ポンプP-500（Pharmacia LKB）を備えたSuperdex 200 HR 10 ／30カラム（Pharmacia LKB，Uppsala，Sweden）を、過剰のキレートから標識された抗体を分離するために使用した。使用した溶出バッファーは、１リッター当り、50mmolのTris-HCl、９ｇのNaCl、及び0.5ｇのNaN₃を含んでいた、pH7.75(TS A−バッファー)。標識されたタンパク質を含む画分をプールし、そしてその抗体の標識付けの程度を測定した。既知量の上記標識mAbを、抗−マウスIgGコート・ウェル(Wallac Oy)内でインキュベートし、これらのウェルを６回洗浄し、そしてDELFIA強化溶液〔DELFIA Enhancement solution（Wallac Oy）を、Eu標準に対する結合したユーロピウムの螢光を計測するために添加した。上記mAbは、IgG当り７〜8.3のEuを含んでいた。１ｇ／Ｌの最終濃度のジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）精製BSAを添加し、そしてこのプールを、0.2μｍフィルターを通して濾過して凝集物を除去した。標識されたmAbを４℃ で保存した。実施例２モノクローナル抗体のビオチン化捕獲において使用されるmAbを、50mmol／ＬのNaHCO₃を含むバッファー（pH9.8 ）中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（10mmol）中に溶解された100倍モル過剰の、ビオチンのイソチオシアネート誘導体(BITC，Wallac Oy)と反応させ、そして室温において２〜４時間インキュベートした。遊離のビオチンを、溶出のためにTSA−バッファーを使用してNAP-10カラムを用いた。そしてその後、PD-10カラム(Pharmacia LKB)を用いたゲル濾過により分離した。最終的に１ｇ／ＬのDTPA −処理BSAを添加した。このビオチン化mAbを４℃で保存した。実施例３モノクローナル抗体による直接的コーティング上記捕獲mAbを、物理的吸着を通じてマイクロタイトレーション・ストリップ上に固定化した。これらのウェルを、35℃で一夜、0.2mol／ＬのNaH₂PO₄バッファーを含む100μＬのバッファー中の１μｇのmAbでコートした。コートされたウェルを、Delfiaプレートウォッシュを使用することによりDelfia Wash溶液で２回洗浄し、そして次に１リッター当り、１ｇのBSA、60ｇのトレハロース、１ｇのGermall II、及び50mmolのNaH₂PO₄を含む溶液300μｌで室温で３時間飽和させた。飽和後、上記ウェルを吸引し、そして25℃で２時間乾燥させた。実施例４ストレプトアビジンによるコーティング及び上記捕獲mAbの固定化 UV−吸収低螢光性Maxisorbストリップ(Nunc，Roskilde，Denmark)を、１リッター当り９ｇのNaClを含む0.1mol／Ｌのシトレート−ホスフェート・バッファー (pH5.0)中１μｇ／ウェルのストレプトアビジン(Porton Products，United King dom)で、35℃で一夜直接的にコートした。これらのプレートを、DELFIA Platewa sh(Wall９ｇのNaCl、0.1ｇのGermall II、0.05gのTween 20、及び５mmolのTris-HCl（pH 7.75）を含むDELFIA Wash溶液(Wallac Oy)で２回洗浄した。室温での一夜の飽和を、１リッター当り、50mmolのTris-HCl（pH7.0）、60ｇのソルビトール及び２ｇのDTPA−処理BSAを含むバッファーを用いて行った。最終的にこれらのプレートを吸引し、そして風乾した。上記捕獲mAbを、１リッター当り、50mmolのTris-HCl（pH7.75）、９ｇのNaCl 、５ｇのBSA、0.5ｇのウシ−γ−グロブリン、0.1ｇのTween 40、20μmolのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、0.5ｇのNaN₃、及び20mgのチェリー・レッド（cherry red）を含む、50μＬのDELFIA Assayバッファー(Wallac Oy)中で2 00ngのビオチン化mAbをインキュベートすることによりストレプトアビジン・コートされたプレート上に固定化した。上記ストリップを振とうしながら室温で30 分間インキュベートし、そして２回洗浄し、そして風乾した。実施例５オールインワン乾燥試薬マイクロタイトレーション・ウェルの調製上記遮断炭水化物層を、１リッター当り、５ｇのBSA又はカゼイン、100ｇのソルビトール、９ｇのNaCl、0.5ｇのNaN₃、0.2ｇのTween 20、1.2ｇのウシ・ガンマグロブリン、及び50mmolのTris-HClを含む溶液、pH7.7の10μｌを上記コートされたウェルに添加することにより、間接的に又は直接的に固定化された特異的捕獲モノクローナル抗体上で調製した。ウェル内の溶液を35℃で一夜乾燥させた。例えば、生来のマウスIgG，HBR-2及びMAK-33のようなアッセイ特異的成分及びブロッカーが、この層に添加されることができる。標識されたmAb（300ng）は、１リッター当り、１ｇのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）−処理BSA、50ｇのトレハロース、９ｇのNaCl、0.05ｇのチェリー・レッド（cherry red）、0.5ｇのNaN₃、及び50m molのTris-HClを含む溶液、pH7.75の１μＬ中、上記遮断層の上部に小分けした。小分けされた溶液を、直ちに、上記ウェルに空気を吹きつけることにより乾燥させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤と共に密封された容器内に４ ℃で保存した。競合性イムノアッセイにおいては、Euキレート標識された分析物が、１リッター当り、１ｇのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）−処理BSA、50ｇのトレハロース、９ｇのNaCl、0.05のチェリー・レッド、0.5ｇのNaN₃、及び50mmol のTris-HClを含む溶液、pH7.5の小容量（１μＬ）中、上記遮断層上にか又は上記分析物特異的コート・ウェルに直接的に添加される。小分けされた溶液を、直ちにウェルに空気を吹きつけることにより乾燥させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤と共に密封容器内に４℃で保存した。実施例６イムノアッセイ手順イムノアッセイを、以下の手順に従って行った。標準及び全血、血漿、又は血清のサンプルをアッセイ・バッファー中で１：５に希釈した。20μＬのアッセイ・バッファー中の希釈サンプル10μＬアリコートを、上記１段階オールインワン乾燥試薬ウェルに添加した。このウェルを、iEMS Incubator／Shaker(Labsystem Oy，Helsimki，Finland) を用いて900rpmの振とう速度を使用して36℃で15分間振とうし、そして過剰の標識を、上記ウェルを６回洗浄することにより除去した。螢光性Euキレートのシグナルを、１リッター当り、50mmolのブリシン−NaOH、1.75molのNaSCN、２mmolの Na₂CO₃、50mLのグリセロール、５mgのTween 40、4.5μmolのDTPA、及び200mLの１−プロパノールを含む、200μＬのLANFIA溶液(Mitrunen et al．Clin Chem 41 ，1115-20，1995)、pH10.0を添加した後に計測した。このウェルを３分間振とうし、そしてDELFIAプレート・フルオロメーター、モデル1234(Wallac Oy)を用いて計測した。あるいは、時間分解螢光シグナルを、その洗浄段階が完結した後に、そのウェルの表面から直接読んだ。結果動態１段階非競合性アッセイの反応レンジに影響を及ぼす要因、すなわち、温度、成分濃度、アッセイ容量及び抗体の品質、を最適化した。最適化されたアッセイ動態の性能を、連続振とうしながら＋36℃で５，10，20，30及び60分間、血清及び全血サンプル、並びにバッファー及び全血標準を含むマイクロタイトレーション・ウェルをインキュベートすることにより、異なる標準及びサンプル材料を用いて確認した。レンジ及び線形性バッファーと全血標準の両方についての換算曲線は、２から1250μｇ／Ｌまでのレンジにわたり線形であった。バッファー標準を用いたアッセイ内精度（ｎ＝１２）は、全血標準を用いて3.2−4.0％及び3.3−7.3％であった（図３）。Mbの最低検出可能量は、ゼロ標準プラス３SDの、12反復の平均のシグナルに等しい投与量として推定したとき、血清アッセイについて0.1μｇ／Ｌ、そして全血アッセイについて0.6μｇ／Ｌであった。精度血清とスパイクした全血サンプルの両方を用いたアッセイ内CVは、全て４％未満であり、そしてラン間のCV(between-run CVs)は、それぞれ、５％未満と６％未満であった（表１）。線形性計測レンジ内の線形性を、標準的な希釈剤で１〜32倍希釈された、24.2μｇ／Ｌ、43μｇ／Ｌ及び1103.1μｇ／Ｌを含む３つの血清サンプルを希釈し、そして観察（ｙ）対予想（ｘ）ミオグロビン濃度をプロットすることにより確認した。全ての希釈物を、元のサンプルから作った。上記の３つの希釈された血清サンプルは、それぞれ、良好な線形相関を示した；ｙ＝0.94ｘ−0.13(ｒ＝1.0)、ｙ＝1 .02ｘ−0.38（ｒ＝0.99）及びｙ＝0.91ｘ＋12.9(ｒ＝0.99）。妨害試験ヘモグロビンとの交差反応を、Mb涸渇血清に溶血液（hemolysate）の増加量（ヘモグロビン０〜75ｇ／Ｌ）を添加することにより調べた。１リッター当り75ｇのヘモグロビンまでの添加は、いかなる増加したアッセイ応答をも引き起こさなかった。回収率血清及び全血サンプルを用いたアッセイは良好な回収率を示した。全血（ｎ＝５）と血清（ｎ＝４）サンプルによる平均の分析的回収率は、それぞれ、96％と 100％であった（表２と表３）。比較試験血清サンプルを使用した非競合性免疫螢光計測LANFIAアッセイにより得られた結果を、Vuori et al.(Clin.Chem．37／12，2087-2092(1991))により報告された DELFIAアッセイにより得られたものと比較した（ｎ＝９）。上記２のアッセイは、高い程度の相関：ｙ＝0.68ｘ＋7.31( ｒ＝0.995)をもつ結果を与えた。LANFIAにより得られた血清サンプルの結果と、 Biomerica（Newport Beach，CA）から購入した商業的RIAキットにより得られた結果との間にも密な相関が得られた（ｎ＝79）：ｙ＝1.25ｘ−0.74、ｒ＝0.982( 図４)。このRIAキットの検出下限（20ng／mL）未満の結果を、上記回帰分析から除外した。全血サンプルと血漿サンプルの間の相関図５は、それぞれ、全血又は血漿のいずれかの同一サンプルを使用した開発されたアッセイにより得られたMb結果の比較を示す(ｙ＝0.87ｘ＋13.3、ｒ＝0.981 )。ミオグロビンについての患者の結果全血サンプルと血漿サンプルを、電気パルス処理後の異なる時に電気除細動患者からも採取した。１の電気除細動患者からのMb放出についての典型的な結果を図６に示す。全血サンプル中のCK-MB計測同一患者からの血清サンプルと全血サンプルを、それらのCK-MB濃度について本発明に従って計測した。これらの結果を表４に示す。本発明に係る方法がさまざまな態様で取り込まれることができ、その中のほんの数個が本明細書中に開示されているということが理解されよう。他の態様が存在し、そして本発明の本質から逸脱しないということは当業者に明らかであろう。従って、記載した態様は説明的なものであり、そして限定として解釈されてはならない。表１．血清対照サンプルと全血対照サンプルを用いた内（ｎ＝12）精度と間（ｎ＝10）精度血清サンプル全血サンプル平均 SD CV 平均 SD CV ng／ml ％ ng／ml ％対照Ａ内アッセイ 32.4 1.3 3.9 42.6 2 2.3 間アッセイ 33.4 1.4 4.3 40.5 1.6 3.9 対照Ｂ内アッセイ 154.2 3.4 2.2 143.2 3.4 2.4 間アッセイ 158.9 7.5 4.7 143.4 8.1 5.6 対照Ｃ内アッセイ 811 14.7 1.8 457.2 9.4 2.1 間アッセイ 857 30.5 3.6 465.3 27.5 6 表２．血漿サンプルからのミオグロビンの回収内因添加計測回収 ng／mL ng／mL ng／mL ％ 47 92 134 96 47 184 232 100 22 367 414 106 22 734 738 98 表３．バッファー標準に対して計測された全血サンプルからのミオグロビンの回収内因添加計測回収ng ／mL ng／mL ng／mL ％ 37 63 96 95 26 127 145 95 24 190 209 97 11 13 24 100 25 317 319 93 表４．血清及び全血中のCK-MB濃度サンプル血清（ng/mL）全血（ng／mL） 1 114.7 156.8 2 26.6 28.0 3 219.7 194.3 4 235.9 217.5

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レブグレン，ティモフィンランド国，エフイーエン―21610 キルヤラ，アリ―キルヤラ，ハカメーエンティー 57

Claims

【特許請求の範囲】１．競合的又は非競合的イムノアッセイ法であって、以下の工程； −反応ウェル内の固相上にアッセイ特異的成分を固定化し； −標識されたアッセイ特異的成分を添加し； −上記成分を乾燥させ； −分析されるべきマーカーを含有するサンプルを添加し； −上記マーカーが上記アッセイ特異的成分と反応することを許容し；そして −上記標識からのシグナルを検出する、を含む、前記イムノアッセイ法。２．競合的又は非競合的イムノアッセイ法であって、以下の工程； −分析されるべきマーカーを含有するサンプルを、反応ウェル；上記反応ウェル内の固相上に直接的に又はアフィニティー対を介して固定化されたアッセイ特異的成分；標識されたアッセイ特異的成分を含むデバイスに添加し、ここで、そのデバイス内で、上記の固定化された成分と標識が乾燥されており； −上記マーカーが上記アッセイ特異的成分と反応することを許容し；そして −上記標識からのシグナルを検出する、を含む、前記イムノアッセイ法。３．前記反応ウェルが、通常のマイクロタイトレーション・ウェルのサイズ又はそれより小さなサイズを有する、請求項１又は２に記載のアッセイ法。４．前記の免疫反応が１のインキュベーション手順内で行われる、請求項１又は２に記載のアッセイ法。５．抗体又は抗原であることができる、前記標識された成分から前記の固定化された成分を分離する遮断層が、乾燥前に添加される、請求項１又は２に記載のアッセイ法。６．前記の固定化された成分と標識された成分、抗体と抗原が、いずれの遮断層を伴わずに前記乾燥ウェル内に存在する、請求項１又は２に記載の競合的アッセイ法。７．前記遮断層が、タンパク質及び／又は炭水化物、並びに前記の必要なアッセイ特異的成分を含む、請求項５に記載のアッセイ法。８．前記の事前に添加されたアッセイ特異的成分が風乾されている、請求項１又は２に記載のアッセイ法。９．前記のサンプルが、血清、血漿又は全血から成る群から選ばれた、請求項１又は２に記載のアッセイ法。 10．前記ランタニド・キレートが、アッセイ特異的成分を標識するために使用される、請求項１又は２に記載のアッセイ法。 11．前記ランタニド・キレートが、時間分解フルオロメトリーにより計測される、請求項10に記載のアッセイ法。 12．前記ランタニド・キレートが、時間分解フルオロメトリーにより、 −溶液中で、又は −前記固相上で直接的に、計測される、請求項10に記載のアッセイ法。 13．２以上の分析物が、異なる分析物について異なるランタニド・キレート標識を使用することにより１の単反応ウェル内で計測されている、請求項10に記載のアッセイ法。 14．前記反応ウェル内の乾燥成分が、 −ミオグロビン； −クレアチン・キナーゼ・アイソザイムMB； −心臓特異的トロポニンＩ； −ヒト・グリコーゲン・ホスホリラーゼ・アイソザイムBB； −ミオグロビン及びクレアチン・キナーゼ・アイソザイムMB；又は −ミオグロビン、クレアチン・キナーゼ・アイソザイムMB及び心臓特異的トロポニンＩ、に特異的である、請求項１又は２に記載のアッセイ法。 15．競合的及び／又は非競合的イムノアッセイにおける使用のためのデバイスであって； −反応ウェル； −上記反応ウェルの表面上に、直接的にか又は第２の固定化試薬を介して、固定化されたアッセイ特異的成分； −標識されたアッセイ特異的成分；及び −場合により、上記の標識された成分から上記の固定化された成分を分離する遮断層、を含み、このデバイス内で、上記の固定化された成分、上記の標識された成分及び上記の任意的遮断層が全て乾燥されている、前記デバイス。