ES2217394T3

ES2217394T3 - Inmunoensayo en una etapa utilizando reactivos "todos en uno" secos.

Info

Publication number: ES2217394T3
Application number: ES97906208T
Authority: ES
Inventors: Kim Petterson; Timo Lovgren
Original assignee: Innotrac Diagnostics Oy
Current assignee: Radiometer Turku Oy
Priority date: 1996-04-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: US6429026B1; DE69729186D1; EP0892927A1; DE69729186T2; JP3537829B2; EP0892927B1; WO1997038311A1; JP2000509486A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO INMUNOENSAYO COMPETITIVO O NO COMPETITIVO, QUE COMPRENDE LOS PASOS DE: INMOVILIZAR UN COMPONENTE ESPECIFICO DE ENSAYO EN FASE SOLIDA EN UN POCILLO DE REACCION; AÑADIR UN COMPONENTE ESPECIFICO DE ENSAYO MARCADO; SECAR DICHOS COMPONENTES; AÑADIR LA MUESTRA QUE CONTIENE EL MARCADOR QUE DEBE ANALIZARSE; PERMITIR QUE EL MARCADOR REACCIONE CON LOS COMPONENTES ESPECIFICOS DEL ENSAYO; Y DETECTAR LA SEÑAL PROCEDENTE DEL MARCADOR. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A UN DISPOSITIVO UTIL PARA REALIZAR EL NUEVO ENSAYO.

Description

Inmunoensayo en una etapa utilizando reactivos "todo en uno" secos.

Esta invención se refiere a un nuevo inmunoensayo en el que todos los componentes específicos y necesarios para el ensayo se agregan de antemano al pocillo de reacción y se secan antes de agregar la muestra. La invención se refiere, adicionalmente, a un dispositivo útil para llevar a cabo este ensayo.

Antecedentes de la invención

Las publicaciones y material restante empleados en este documento para ilustrar los antecedentes de la invención y, en particular, los casos destinados a proporcionar detalles adicionales relativos a la práctica, se incorporan como referencias.

Las marcas de quelato de lantánidos y la fluorometría de resolución temporal se introdujeron en el campo de los inmunoensayos hace ya más de 10 años (Siitari et al., Nature 301, 258-60, 1983). La disponibilidad de anticuerpos monoclonales en combinación con la elevada actividad específica de la marca permitió llevar a cabo inmunoensayos no competitivos con una mayor sensibilidad e intervalo dinámico (Ekins y Dakubu, Pure Appl. Chem 57, 473-82.1985; Lövgren y Petersson en: Van Dyke K and Van Dyke R eds. Luminiscence Immunoassays and Molecular Applications. Boca Ratón, EE.UU.: CRC Press Inc., 233-50, 1990). Desde entonces, han aparecido varias alternativas diferentes de marca, con elevadas actividades específicas (Kricka, Clin. Chem. 40, 347-57, 1994, Price and Newman eds., Principles and Practice of Immunoassays, Nueva York; Stockton Press, 650 y sigs., 1991, Dickson et al., Pharmac. Ther. 66, 207-35, 1995). Los anticuerpos monoclonales han sustituido extensamente a los anticuerpos policlonales y, siempre que sea posible, se prefiere un diseño de ensayo no competitivo. En especial, la utilidad de las nuevas marcas no isotópicas ha contribuido al actual nivel de automatización en el campo de los inmunoensayos.

Se pueden elegir estrategias alternativas para mejorar la sensibilidad y fiabilidad de los inmunoensayos (Kricka, Clin. Chem. 40, 347-57, 1994; Price and Newman eds., Principles and Practice of Immunoassays, Nueva York: Stockton Press, 650 y sigs., 1991; Dickson et al., Pharmac. Ther. 66, 207-35, 1995; Ekins and Chu, Clin. Chem. 37, 1955-67, 1991). Puesto que la sensibilidad potencial de un inmunoensayo no competitivo sólo se puede establecer utilizando marcas con una elevada actividad específica, junto con anticuerpos de alta afinidad (Ekins y Dakubu, Pure Appl. Chem. 57, 473-82, 1985; Ekins y Chu, Clin. Chem 37, 1955-67, 1991), se invierte un esfuerzo considerable en la búsqueda de tecnologías de detección más sensibles. Además de factores tales como el ruido de detección, la interferencia en la muestra que causan una señal inespecífica, y la fijación inespecífica del reactivo de marca reducen la sensibilidad global del ensayo (Ekins y Dakubu, Pure Appl. Chem 57, 473-82, 1985; Lövgren y Petersson en: Van Dyke K and Van Dyke R eds. Luminiscence Immunoassays and Molecular Applications. Boca Ratón, EE.UU.: CRC Press Inc., 233-50, 1990). Otros motivos por los que diseñar nuevas estrategias de inmunoensayos son mejorar la fiabilidad por medio de reactivos clave de alta calidad, y simplificar el ensayo mediante la eliminación de etapas innecesarias para obtener procedimientos más directos.

La fluorometría de resolución temporal y la tecnología de inmunoensayo basada en la marca de quelato de lantánido se basaron originalmente en el fluoroinmunoensayo de lantánido potenciado por la disociación (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 137, 335-43, 1984). La elevada actividad específica de la marca que se podía unir de manera covalente a los anticuerpos monoclonales, sin ningún efecto sobre la afinidad y especificidad (Lövgren y Petersson en: Van Dyke K and Van Dyke R eds., Luminiscence Immunoassays and Molecular Applications. Boca Ratón, EE.UU.: CRC Press Inc., 233-50, 1990) demostró ser muy útil en el diseño de diversos ensayos no competitivos con sensibilidad mejorada (Petersson et al., Clin. Chem. 29, 60-4, 1983; Näntö et al., Isr. J. Clin. Biochem. Lab. Sci. 4, 36, 1985; Suonpää et al., Clin. Chem. Acta 145, 341-8, 1985, Hemmilä; en: Winefordner ed. Chemical Analysis, Vol. 117, Toronto: Wiley & Sons, 343 y sigs., 1991; Xu et al., Clin. Chem. 38, 2038-43, 1992). Adicionalmente, se han llevado a cabo ensayos competitivos (Bertoft et al., FEBS Lett. 173, 313-6, 1984; Eskola et al., Clin. Chem. 31, 1731-4, 1985; Näntö et al., Isr. J. Clin. Biochem. Lab. Sci. 4, 52, 1985; Lövgren, Steroid Biochem 27, 47-51, 1987) con adecuadas características de rendimiento, si bien la marca no contribuye de manera esencial a la sensibilidad en este diseño de ensayo (Ekins y Dakubu, Pure Appl. Chem. 57, 473-82, 1985; Ekins y Chu, Clin. Chem. 37, 1955-67, 1991).

Los inmunoensayos llevados a cabo en laboratorios de forma rutinaria se han sometido a una extensa automatización. Los analizadores deben actuar en un modo de acceso aleatorio y continuo rápido. La capacidad de rendimiento debe ser similar al de los analizadores de química general y un abundante suministro de reactivos in situ debe reducir el tiempo de manipulación por parte de los operarios. Los requisitos de automatización han resultado ser difíciles para la mayoría de las tecnologías de marca y las características de rendimiento de los analitos en los paneles han sufrido debido a los compromisos a los que se ha debido llegar.

Se han descrito ensayos que utilizan reactivos secos (documentos AU 46166/89, GB 1 488 532, WO 86/04095, JP 63111467, JP 62148857, JP 62151758).

En la presente invención, los autores describen una tecnología de inmunoensayo relativamente rápida, adecuada para la automatización, en la que todos los ensayos se llevan a cabo en procedimientos de una sola etapa en pocillos de microtitulación que contienen todos los reactivos específicos para el ensayo necesarios para un ensayo en forma seca. Como marca se utiliza un quelato de lantánido estable, intrínsecamente fluorescente, con una elevada actividad específica. El rendimiento de los ensayos modelo se ha analizado en mediciones cuantitativas de marcadores cardiacos bioquímicos en sangre completa, para la detección precoz del infarto agudo de miocardio (IAM).

La confirmación o exclusión precoz de IAM resulta esencial para la adopción de decisiones terapéuticas correctas (Rozeman Y et al., Annu. Rev. Med., 1994; 45;31-44 y L Kristein Newby et al., Clin. Chem. 1995; 41: 1263-1265). Debido a que la mitad de los pacientes de IAM presenta un ECG sin valor diagnóstico en el momento de la admisión, a menudo se requieren marcadores bioquímicos para confirmar el diagnóstico. Lamentablemente, los resultados de laboratorio de los marcadores bioquímicos no suelen estar disponibles hasta varias horas después del primer diagnóstico y admisión final del paciente. Más de 50% de las muertes se produce dentro de las 2 primeras horas tras el inicio de los síntomas. Además, la disponibilidad de terapia trombolítica y los evidentes beneficios de una intervención precoz preconizan la necesidad de un diagnóstico rápido. De forma óptima, los resultados de los marcadores bioquímicos deberían estar disponibles simultáneamente con los datos del ECG. La sensibilidad de la medición de actividad de la isoenzima MB de creatin-quinasa (CK-MB), el marcador proteico más frecuentemente aceptado, es todavía demasiado baja para confirmar o excluir una lesión del miocardio durante estas primeras horas.

La mioglobina (Mb) es una proteína heme de 17.800 kDa presente en los músculos cardiaco y esquelético. Debido a su baja masa molecular, la liberación de Mb se produce de manera precoz (2-4 h) del músculo cardiaco lesionado, siendo transferida al suero. El rápido incremento de Mb en pacientes con IAM la convierten en un marcador ideal para la confirmación o exclusión precoz de IAM y para monitorizar la reperfusión cardiaca (Omán EM et al., Br. Heart J. 1990; 63: 335-338). No obstante la falta de disponibilidad rápida de resultados cuantitativos ha limitado su aplicación clínica.

Se obtendría una óptima ventaja de Mb y otros marcadores cardiacos bioquímicos con la disponibilidad de ensayos cuantitativos con un tiempo de respuesta lo suficientemente breve como para ofrecer resultados simultáneos a los del ECG, para su análisis por parte del médico. Una de las etapas que limitan la velocidad en los ensayos de los marcadores bioquímicos más precoces incluye la separación manual de plasma o suero de la sangre completa. La posibilidad de utilizar un ensayo directo sobre muestras de sangre completa acortaría notablemente el tiempo total que transcurre desde la extracción de sangre hasta la interpretación de los resultados. Por consiguiente, el objetivo de los presentes autores fue optimizar un ensayo inmunofluorométrico de resolución temporal adecuado para el procesamiento simple y automático de muestras de sangre completa, para proporcionar resultados cuantitativos altamente reproducibles de Mb y otros marcadores cardiacos bioquímicos, con el fin de tener los resultados disponibles para un diagnósticoprecoz de IAM.

Resumen de la invención

Se ha inventado un inmunoensayo en el cual todos los componentes específicos del ensayo se agregan de antemano al pocillo de reacción y se secan antes de utilizar el pocillo, en inmunoensayos para medir cuantitativamente analitos en, por ejemplo, muestras de suero, plasma o de sangre completa. De acuerdo con la invención, es posible medir marcadores bioquímicos, en especial marcadores cardiacos bioquímicos, directamente en muestras de sangre completa para la detección precoz o la exclusión de un infarto agudo de miocardio mediante el uso de una fluoroinmunoensayo de resolución temporal y quelatos de lantánido intrínsecamente fluorescentes. Se agrega una muestra de sangre completa a una solución de ensayo o tampón adecuado en pocillos de reacción o pocillos de microtitulación comunes, que contienen todos los componentes específicos del ensayo en forma seca. El inmunoensayo puede ser competitivo o no competitivo, pudiéndose medir más de un marcador cardiaco en un pocillo de reacción o pocillo de microtitulación cuando se utilicen diferentes marcas de quelatos de lantánidos (europio, terbio, samario y disprosio) simultáneamente para el ensayo de marcadores cardiacos bioquímicos individuales. Después de que la reacción inmunológica se haya completado (alcanzado el equilibrio) o interrumpido (medición cinética), los pocillos de reacción o de microtitulación se lavan con la solución de ensayo y se mide la fluorescencia de resolución temporal a partir de la marca de quelato de lantánido intrínsecamente fluorescente. La fluorescencia se mide directamente de la superficie del pocillo de reacción o de microtitulación, o después de haber disuelto el quelato de lantánido intrínsecamente fluorescente. El nivel de señal de fluorescencia de resolución temporal es una medida cuantitativa del marcador cardiaco bioquímico determinado. Marcadores cardiacos medidos típicamente son mioglobina, isoenzima MB de creatin-quinasa (CK-MB), troponina I y troponina T.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B muestran el diseño principal del inmunoensayo no competitivo ("en emparedado"; Fig. 1A) y competitivo (Fig. 1B) con el reactivo "todo en uno" seco.

La Figura 2 muestra la señal para estándar de sangre completa (cuadrados sólidos), estándar de tampón (triángulos sólidos), muestra de sangre completa (cuadrados punteados) y muestra de suero (X) frente al tiempo para una incubación a 36ºC, determinada de acuerdo con la invención.

La Figura 3 muestra la señal frente a concentración de mioglobina para el estándar de tampón (cuadrados sólidos) y estándar de sangre completa (círculos sólidos). La figura muestra, adicionalmente, el CV en % para el estándar de tampón (cuadrados abiertos) y estándar de sangre completa (círculos abiertos), determinados de acuerdo con la invención.

La Figura 4 muestra la correlación entre mioglobina según la invención usando LANFIA (quelato de lantánido fluorescente en solución) y mioglobina por RIA convencional.

La Figura 5 muestra la correlación entre mioglobina de sangre completa y mioglobina de plasma, determinada según la invención.

La Figura 6 muestra la concentración de mioglobina en un paciente de cardioversión procedente del plasma (círculos sólidos) y de sangre completa (cuadrados enteros) frente al tiempo tras el pulso eléctrico, determinada según la invención.

Descripción detallada de la invención

Inmunoensayos no competitivos y competitivos se utilizan de manera convencional en laboratorios clínicos para medir marcadores proteicos fisiológicamente importantes en muestras de suero y plasma. En el diagnóstico precoz del IAM, resultaría especialmente útil un inmunoensayo rápido, sencillo de realizar y de una sola etapa, que proporcionase resultados cuantitativos con muestras de sangre completa, para la detección de marcadores cardiacos bioquímicos. Particularmente, la Mb, pero también CK-MB, la relación s de isoformas de creatin-quinasa, troponina I y troponina T se consideran adecuados tanto para la detección precoz del IAM como para la monitorización de la reperfusión, porque sus niveles están elevados en la sangre poco después del inicio de los síntomas (Johannes Mair et al., Clin. Chem., 1995; 41:1266-1272). El ensayo recientemente introducido para la isoenzima BB de la glucógeno-fosforilasa representa otro marcador rápido y sensible de la lesión del miocardio (Georg Rabitzsch et al., Clin. Chem., 1995; 41:966-978). Se podrían utilizar inmunoensayos rápidos para la medición de la inmunofluorescencia de estos marcadores cardiacos bioquímicos para proporcionar resultados cuantitativos y altamente reproducibles con muestras de sangre completa.

El uso de fluorometría de resolución temporal y un anticuerpo monoclonal marcado con un quelato de lantánido intrínsecamente fluorescente con una elevada actividad específica permite el empleo de una muestra y un volumen de ensayo pequeños, que dan como resultado una cinética rápida, una buena sensibilidad y un intervalo de medición dinámica amplio. Los bajos límites de detección conseguidos con ensayos de sangre completa son adecuados y las curvas estándares son lineales a lo largo de todo el intervalo de medición, e incluso el efecto gancho de dosis altas no interfiere con el ensayo. Adicionalmente, el posible uso de volúmenes de muestra pequeños minimiza la interferencia potencial con las muestras de sangre completa.

La posibilidad de utilizar muestras de sangre completa elimina el tiempo necesario para la separación manual de plasma o suero. La pre-dilución de la muestra seguida por el ensayo de una sola etapa se automatiza fácilmente para dar resultados cuantitativos en menos de 20 min. Se pueden obtener resultados esencialmente idénticos utilizando un período de incubación de tan sólo 5 min, aun cuando no se alcanza el equilibrio en el ensayo. Además, la automatización del sistema de ensayo eliminará la posible imprecisión en el procedimiento manual, debida a la transferencia inexacta de la muestra y volúmenes de reactivo pequeños utilizados. De esta forma, los resultados cuantitativos de los marcadores cardiacos bioquímicos pueden estar disponibles dentro del mismo margen de tiempo que los datos del ECG. Es factible medir cuantitativamente un completo panel de marcadores bioquímicos para el diagnóstico del IAM a partir de muestras de sangre completa. Debido a los marcadores séricos bioquímicos, los rápidos resultados de los patrones de diferente liberación de, por ejemplo, mioglobina, CK-MB y troponina I ayudarán en el diagnóstico de pacientes que lleguen en diferentes momentos tras el inicio de los síntomas.

El diseño del inmunoensayo permite llevar a cabo ensayos tanto no competitivos como competitivos (Figuras 1A y 1B). En el ensayo no competitivo (Fig. 1A), el anticuerpo 10 específico para la captura del analito está inmovilizado directamente en la superficie del pocillo, o el anticuerpo biotinilado de captura está inmovilizado en la superficie de un pocillo recubierto con estreptavidina. Asimismo, se pueden utilizar otros procedimientos de recubrimiento indirecto, basados en reactivos inmovilizantes secundarios, para inmovilizar el anticuerpo específico para la captura del analito. En el fondo del pocillo, y sobre el anticuerpo de captura, se seca una capa 11 aislante que contiene hidrato de carbono y/o proteína y una adición opcional de proteína. Finalmente, se agrega el anticuerpo 12 marcado en un pequeño volumen sobre la capa aislante y se seca. El ensayo competitivo (Fig. 1B) contiene un anticuerpo 13 secundario y el anticuerpo 10 específico para la captura del analito inmovilizados en la superficie del pocillo. Se utiliza una capa 11 aislante que contiene aditivos proteicos opcionales, así como agentes bloqueadores, y el analito 14 marcado que compite se seca en un pequeño volumen sobre la capa aislante. De manera alternativa, la capa aislante se omite y el analito marcado que compite se agrega en un pequeño volumen directamente encima del anticuerpo específico y se seca. Para iniciar el inmunoensayo, sólo es preciso agregar la muestra (o el estándar) y un tampón de ensayo
común.

Se ha investigado el efecto de la composición de la capa aislante en el pocillo con reactivo seco sobre el rendimiento del inmunoensayo. Se analizó la influencia de varios aditivos tales como hidratos de carbono, proteínas y componentes bloqueadores, utilizando cantidades, volúmenes y temperaturas de secado diferentes. En un inmunoensayo no competitivo, el componente marcado se debe dispensar encima de la capa aislante en un volumen reducido, secándolo inmediatamente después. En un inmunoensayo competitivo, el componente marcado se puede agregar, de forma alternativa, directamente sobre el anticuerpo específico. El rendimiento del concepto de reactivo seco "todo en uno" se ha comparado siempre con un inmunoensayo con los correspondientes componentes en solución. Una capa aislante formada por proteínas y hidratos de carbono proporciona la menor relación de ruido de fondo y la máxima relación de señal a ruido cuando se le compara con las otras alternativas. Con una capa aislante adecuada, se logra un rendimiento que es al menos equivalente al alcanzado con todos los componentes del ensayo en solución.

Aunque el inmunoensayo según este concepto se lleva a cabo en un formato de pocillo de microtitulación convencional, se ha demostrado que se alcanzan características de rendimiento acordes con el estado actual de la técnica. Este resulta posible gracias a la tecnología de detección y marca, la fluorometría de resolución temporal y el quelato de europio fluorescente (Soini y Lövgren, CRC Crit. Rev. Anal. Chem 18, 105-154, 1987; Dickson et al., Pharmac. Ther. 66, 207-35, 1995), debido a la alta sensibilidad, a la marca inerte, poco intensa y estable, y al extenso intervalo dinámico. En consecuencia, se pueden utilizar volúmenes relativamente pequeños, en tanto que se siguen leyendo límites bajos de detección para los analitos. La cinética o velocidad de reacción de los ensayos se puede incrementar reduciendo el volumen total de ensayo y por incubación a temperaturas más altas. La velocidad de reacción de los ensayos no competitivos mejora todavía más por medio de la adición de una cantidad aumentada del anticuerpo marcado, lo que reduce también el efecto gancho de las dosis elevadas. Todos los ensayos de modelo incluidos en la evaluación del concepto de reactivo seco "todo en uno" alcanzaron el equilibrio en menos de 15 minutos cuando se les optimizó para los factores mencionados. Evidentemente, se pueden realizar ensayos mucho más rápidos con el mismo concepto si se abandona el requisito de equilibrio.

De acuerdo con el presente concepto, no se exponen ensayos de dos etapas porque, en tal caso, se debe incluir una etapa de adición de reactivo. Los ensayos competitivos comunes se suelen llevar a cabo en procedimientos de una sola etapa. En un ensayo no competitivo, esto puede considerarse, ocasionalmente, una limitación. La alta capacidad de la fase sólida, así como la tecnología de marcado que permite el uso de cantidades incrementadas del anticuerpo marcado, compensan esta limitación. La señal causada por un efecto gancho de dosis elevada nunca será inferior a la señal obtenida para el estándar máximo usado para el analito en cuestión.

El quelato de lantánido intrínsecamente fluorescente, por ejemplo, europio, se une al compuesto marcado en el inmunoensayo durante la fase tanto de incubación como de medición. En el fluoroinmunoensayo lantánido potenciado por la disociación (DELFIA), el ion de europio se disocia del quelato utilizado para marcar en una solución en la que se forma un nuevo complejo fluorescente (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 137, 335-43, 1984). Los nuevos quelatos de lantánidos intrínsecamente fluorescentes tienen una actividad específica igual a la obtenida en el procedimiento DELFIA. La liberación del componente marcado con fluorescencia de la fase sólida a solución para la medición de resolución temporal es rápida (Mitrunen et al., Clin. Chem. 41, 1115-20, 1995; Diamandis et al., Clin. Biochem. 25, 255-61, 1992). El riesgo de contaminación externa se minimiza, puesto que el ion lantánido nunca se libera del quelato antes de la medición. Son posibles ensayos de doble marca, utilizando quelatos de europio y terbio fluorescentes (Mitrunen et al., Clin. Chem. 41, 1115-20, 1995) y, de manera alternativa, la señal fluorescente se puede medir directamente de la superficie de la fase sólida, lo cual excluye todas las etapas de liberación.

Se midió el límite de detección de uno de los quelatos de europio intrínsecamente fluorescentes, 4-(2-(4-isotio-cianato-fenil)etinil)-2,6-bis((N,N-bis(carboximetil)-amino)metil)piridina. Se han sintetizado varios quelatos de lantánidos intrínsecamente fluorescentes similares (Mukkala et al., Helv. Chim. Acta 75, 1621-32, 1992). En contraste con el principio de potenciación de DELFIA, para la medición de europio el lantánido se encuentra en todo momento unido al quelato original y la energía de excitación se absorbe de manera eficaz por el resto mediador de la energía de la molécula. El límite de detección (fondo -2SD) para el quelato de europio fluorescente se ha calculado en 5x10^{-14} mol/l, que corresponde al límite de detección de europio en la solución de potenciación DELFIA (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 137, 335-43, 1984).

La marca inerte y estable de quelato de lantánido intrínsecamente fluorescente hace factible el inmunoensayo de una sola etapa con un reactivo seco "todo en uno". La posible fijación no específica del componente marcado se previene por el uso de una capa aislante en el pocillo del reactivo seco "todo en uno". En el caso de omitir la capa aislante, la fijación no específica aumenta especialmente en los ensayos no competitivos, con gran exceso de reactivo, durante el almacenamiento del pocillo. De manera óptima, el inmunoensayo no competitivo con reactivo seco "todo en uno" de una sola etapa, con adición de proteína y hidrato de carbono en la capa aislante tuvo un rendimiento mejor que el correspondiente ensayo que empleó reactivos en forma líquida. Algunos de los aditivos y, evidentemente, los bloqueadores fueron específicos para el analito. La adición del componente marcado encima de la capa aislante también resulta crucial. Especialmente en los ensayos no competitivos, el anticuerpo marcado se debe agregar en un pequeño volumen, que se seca rápidamente, con el fin de mantener la fijación inespecífica en un nivel insignificante. En un ensayo competitivo, el uso de una capa aislante no resulta esencial en tanto en cuanto el ensayo se lleva a cabo hasta el equilibrio. Una vez que la optimización específica del analito del pocillo con el reactivo seco "todo en uno" se haya llevado a efecto, su uso es extremadamente sencillo, puesto que sólo se requiere la muestra y un tampón o solución de ensayo común cuando se efectúa el inmunoensayo.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

Parte experimental Ejemplo 1 Marcado de anticuerpos monoclonales (mAb)

El mAb utilizado en la detección se marcó con un quelato fluorescente de 4-(2-(4-isotiocianato-fenil)etinil)-2,6-bis((N,N-bis(carboximetil)-amino)metil)-piridina de europio (Eu). El marcado se llevó a cabo durante la noche a 4ºC con un exceso molar de 100 veces del quelato de Eu en un tampón que contenía 50 mmol/l de NaHCO_{3} (pH 9,8). Se utilizó una elevada concentración de proteína (hasta 3,3 mg/ml) y, por lo tanto, un reducido exceso de quelato para minimizar el volumen total de la reacción de marcado. Se utilizó una columna Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) con una bomba de alta precisión P-500 (Pharmacia LKB) para separar el anticuerpo marcado del exceso de quelato. El tampón de elución utilizado contuvo por litro 50 mmol de Tris-HCl, 9g de NaCl, y 0,5g de NaN_{3}, pH 7,75 (tampón TSA).Se combinaron las fracciones que contenían la proteína marcada y se determinó el grado de marcado del anticuerpo. Se incubó una cantidad conocida del mAb marcado en un pocillo recubierto con IgG anti-ratón (Wallac Oy), los pocillos se lavaron 6 veces, y se agregó solución potenciadora DELFIA (Wallac Oy) para medir la fluorescencia del europio unido frente a un estándar de Eu. El mAb contuvo 7-8,3 de Eu por IgG. Se agregó una concentración final de 1 g/l de BSA purificada con ácido dietilen-triamino-pentaacético (DTPA) y el conjunto se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum para separar los agregados. El mAb marcado se almacenó a 4ºC.

Ejemplo 2 Biotinilación de anticuerpos monoclonales

El mAb utilizado en la captura se hizo reaccionar con un exceso molar de 100 veces de derivado de isotiocianato de biotina (BITC, Wallac Oy), disuelto en N,N-dimetilformamida (10 mmol) en un tampón que contenía 50 mmol/l de NaHCO_{3} (pH 9,8) e incubado durante 2-4 horas a temperatura ambiente. La biotina libre se separó por filtración sobre gel con una columna NAP-10 y, seguidamente, con una columna PD-10 (Pharmacia LKB), usando tampón TSA para la elución. Finalmente, se agregó 1 g/l de BSA tratado con DTPA. El mAb biotinilado se almacenó a 4ºC.

Ejemplo 3 Recubrimiento directo con anticuerpos monoclonales

El mAb de captura se inmovilizó sobre bandas de microtitulación por adsorción física. Los pocillos se recubrieron con 1 \mug del mAb en 100 \mul de tampón que contenía 0,2 mol/l de tampón NaH_{2}PO_{4} durante una noche a 35ºC. Los pocillos recubiertos se lavaron dos veces con solución de Lavado Delfia usando un lavador de placas Delfia, y a continuación se saturaron durante 3 h a temperatura ambiente con 300 \mul de una solución que contenía, por litro, 1 g de BSA, 60 g de trehalosa, 1 g de Germall II, y 50 mmol de NaH_{2}PO_{4}. Después de la saturación, los pocillos se aspiraron y secaron durante 2 h a 25ºC.

Ejemplo 4 Recubrimiento con estreptavidina e inmovilización del mAb de captura

Se recubrieron directamente bandas de Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) de baja fluorescencia UV-absorbida a 35ºC con 1 \mug/pocillo de estreptavidina (Porton Products, Reino Unido) en 0,1 ml/l de tampón citrato-fosfato (pH 5,0), que contenía, por litro, 9 g de NaCl. Las placas se lavaron dos veces con solución de Lavado Delfia (Wallac Oy) que contenía, por litro, 9 g de NaCl, 0,1 g de Germall II, 0,05 g de Tween 20, y 5 mmol de Tris-HCl (pH 7,75), suplementado con 0,05% de Tween®20, usando el lavador de placas DELFIA (Wallac Oy). Se llevó a cabo una saturación durante la noche a temperatura ambiente con un tampón que contenía, por litro, 50 mmol de Tris-HCl (pH 7,0), 60 g de sorbitol, y 2 g de BSA tratado con DTPA. Por último, las placas se aspiraron y secaron al aire.

El mAb de captura se inmovilizó sobre placas recubiertas con estreptavidina, incubando 200 ng de mAb biotinilado en 50 \mul de tampón de Ensayo Delfia (Wallac Oy) que contenía, por litro, 50 mmol de Tris-HCl (pH 7,75), 9 g de NaCl, 5 g de BSA, 0,5 g de gamma-globulina bovina, 0,1 g de Tween 20, 20 \mumol de ácido dietilen-triamino-pentaacético (DTPA), 0,5 g de NaN_{3}, y 20 mg de rojo cereza. Las bandas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación, se lavaron dos veces y se secaron al aire.

Ejemplo 5 Preparación de pocillos de microtitulación de reactivo seco "todo en uno"

La capa aislante de hidrato de carbono se preparó sobre el anticuerpo monoclonal de captura específica, indirecta o directamente inmovilizado, mediante la adición al pocillo recubierto de 10 \mul de una solución que contenía, por litro, 5 g de BSA o caseína, 100 g de sorbitol, 9 g de NaCl, 0,5 g de NaN_{3}, 0,2 g de Tween 20, 1,2 g de gamma-globulina bovina, y 50 mmol de Tris-HCl, pH 7,7. La solución en el pocillo se secó durante una noche a 35ºC. A esta capa se pueden agregar componentes y bloqueadores específicos para el ensayo tales como, por ejemplo, IgG nativa de ratón, HBR-2 y MAK-33. El mAb marcado (300 ng) se dispensó encima de la capa aislante en 1 \mul de solución que contenía, por litro, 1 g de BSA tratado con ácido dietilen-triamino-pentaacético (DTPA), 50 g de trehalosa, 9 g de NaCl, 0,05 g de rojo cereza, 0,5 g de NaN_{3}, y 50 mmol de Tris-HCl, pH 7,75. La solución dispensada se secó de inmediato al aire en el pocillo. Los pocillos de reactivo seco "todo en uno" se almacenaron a 4ºC en un envase sellado con desecante.

En un inmunoensayo competitivo, el analito marcado con quelato de Eu se agrega encima de la capa aislante, o se agrega directamente sobre el pocillo con recubrimiento específico para el analito en un volumen reducido (1 \mul) de la solución que contiene, por litro, 1 g de BSA tratado con ácido dietilen-triamino-pentaacético (DTPA), 50 g de trehalosa, 9 g de NaCl, 0,05 g de rojo cereza, 0,5 g de NaN_{3}, y 50 mmol de Tris-HCl, pH 7,75. La solución dispensada se secó de inmediato al aire en el pocillo. Los pocillos de reactivo seco "todo en uno" se almacenaron a +4ºC en un envase sellado con desecante.

Ejemplo 6 Procedimientos de inmunoensayo

Los inmunoensayos se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se diluyeron los estándares y sangre completa, plasma o suero 1:5 en tampón de ensayo. Se agregaron partes alícuotas de 10 \mul de muestras diluidas en 20 \mul de tampón de ensayo a los pocillos de reactivo seco "todo en uno". El pocillo se agitó durante 15 min a 36ºC usando una velocidad de agitación de 900 rpm con un Incubador/Agitador iEMS (Labsystem Oy, Helsinki, Finlandia) y se separó el exceso de marca lavando los pocillos seis veces. La señal del quelato de Eu fluorescente se midió después de agregar 200 \mul de solución LANFIA (Mitrunen et al., Clin. Chem. 41, 1115-20, 1995) que contenía, por litro, 50 mmol de glicina-NaOH, 1,75 mol de NaSCN, 2 mmol de Na_{2}CO_{3}, 50 ml de glicerol. 5 mg de Tween 40, 4,5 \mumol de RTPA, y 200 ml de 1 propanol, pH 10,0. El pocillo se agitó durante 3 min y se midió con un fluorómetro de placa DELFIA, modelo 1234 (Wallac Oy). De forma alternativa, la señal de fluorescencia con resolución temporal se leyó directamente de la superficie del pocillo después de haber finalizado la etapa de lavado.

Resultados Cinética

Se optimizaron los factores que afectan a la velocidad de reacción del ensayo no competitivo de una sola etapa, a saber, temperatura, concentración de componentes, volumen de ensayo y calidad de los anticuerpos. El rendimiento de la cinética optimizada de ensayo se confirmó con diferentes materiales estándares y de muestra, incubando los pocillos de microtitulación que contenían muestras de suero y sangre completa, y tampón y estándares de sangre completa durante 5, 10, 20, 30 y 60 min a +36ºC con agitación continua (Fig. 2). El equilibrio se alcanzó en 15 min con todas las muestras.

Intervalo y linealidad

Las curvas de calibración tanto para el tampón como para los estándares de sangre completa fueron lineales a lo largo del intervalo de 2 a 1250 \mug/l. La precisión interna del ensayo (n=12) con los estándares de tampón fue de 3,2-4,0% y 3,3-7,3% con los estándares de sangre completa (Fig. 3). La cantidad mínima detectable de Mb fue de 0,1 \mug/l para el ensayo de suero y de 0,6 \mug/l para el ensayo de sangre completa, calculada como el equivalente de dosis a la señal de la media de 12 replicados de estándar cero más 3 SD.

Precisión

Las CVs internas del ensayo tanto con suero como con muestras de sangre completa contaminada fueron inferiores a 4% y las CVs entre ciclos fueron inferiores a 5% y 6%, respectivamente (Tabla 1).

Linealidad

La linealidad en el intervalo de medición se confirmó diluyendo 3 muestras de suero que contenían 24,2 \mug/l, 43 \mug/l y 1103,1 \mug/l de Mb 1-32 veces con diluyente estándar y trazando las concentraciones observadas (y) frente a las esperadas (x) de mioglobina. Todas las diluciones se realizaron a partir de las muestras originales. Las 3 muestras de suero diluidas mostraron una correcta correlación lineal: y = 0,94 x - 0,13 (r=1,0), y = 1,02x - 0,38 (r=0,99) e y = 0,91x + 12,9 (r=0,99), respectivamente.

Estudios de interferencia

Se analizó la reacción cruzada con hemoglobina, agregando cantidades crecientes de hemolizado (hemoglobina 0-75 g/l) a suero Mb-deplecionado. La adición de hasta 75 g de hemoglobina por litro no provocó incremento alguno de la respuesta de ensayo.

Recuperación

El ensayo mostró niveles adecuados de recuperación tanto con muestras de suero como de sangre completa. La recuperación analítica media con muestras de sangre completa (n=5) y de suero (n=4) fue de 96% y 100%, respectivamente (Tablas 2 y 3).

Estudio comparativo

Los resultados obtenidos por el ensayo LANFIA no competitivo de inmunofluorometría usando muestras de suero se compararon con los obtenidos por el ensayo DELFIA, comunicados por Vuori et al. (Clin. Chem. 37/12, 2087-2092 (1991)) (n=9). Los dos ensayos dieron resultados con un alto grado de correlación: y = 0,68 x + 7,31 (r = 0,995). Asimismo, se observó una estrecha correlación entre los resultados de las muestras de suero obtenidos por LANFIA y un kit comercial de RIA adquirido en Biomerica (Newport Beach, CA) (n=79); y = 1,25 x -0,74, r = 0,982 (Figura 4). Los resultados por debajo del límite inferior de detección (20 ng/ml) del kit de RIA se eliminaron del análisis de regresión.

Correlación entre las muestras de sangre completa y de plasma

La Figura 5 muestra una comparación de los resultados de Mb obtenidos con el ensayo desarrollado, usando las mismas muestras de sangre completa o plasma, respectivamente (y = 0,87 x + 13,3, r = 0,981).

Resultados de mioglobina en el paciente

Asimismo, se tomaron muestras de sangre completa y de plasma de pacientes en cardioversión en diferentes momentos tras el tratamiento de pulsos eléctricos. En la Figura 6 se muestra el resultado típico para la liberación de Mb para un paciente de cardioversión.

Mediciones de CK-MB en muestras de sangre completa

Se midieron muestras de suero y sangre completa del mismo paciente, de acuerdo con la invención, para determinar la concentración de CK-MB. Los resultados se presentan en la Tabla 4.

El experto en la técnica apreciará que los métodos de la presente invención se pueden incorporar en forma de una variedad de realizaciones, de las cuales sólo se describen algunas en esta memoria descriptiva. Resultará evidente para el especialista en este campo que existen otras realizaciones. Por lo tanto, las realizaciones descritas tienen un carácter ilustrativo y no se consideran restrictivas.

TABLA 1 Precisión interna (n = 12) e intermedia (n = 10) con muestras de control de suero y sangre completa

	Muestras de suero	Muestras de sangre completa
	media ng/ml	DE	CV%	media ng/ml	DE	CV%
Control A
\hskip0,2cm En el ensayo	32,4	1,3	3,9	42,6	2	2,3
\hskip0,2cm Entre ensayos	33,4	1,4	4,3	40,5	1,6	3,9
Control B
\hskip0,2cm En el ensayo	154,2	3,4	2,2	143,2	3,4	2,4
\hskip0,2cm Entre ensayos	158,9	7,5	4,7	143,4	8,1	5,6
Control C
\hskip0,2cm En el ensayo	811	14,7	1,8	457,2	9,4	2,1
\hskip0,2cm Entre ensayos	857	30,5	3,6	465,3	27,5	6

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Recuperación de mioglobina a partir de muestra de plasma

Endógena ng/ml	Agregada ng/ml	Medida ng/ml	Recuperación %
47	92	134	96
47	184	232	100
22	367	414	106
22	734	738	98

TABLA 3 Recuperación de mioglobina a partir de muestras de sangre completa, medida frente a estándares de tampón

Endógena ng/ml	Agregada ng/ml	Medida ng/ml	Recuperación %
37	63	96	95
26	127	145	95
24	190	209	97
11	13	24	100
25	317	319	93

TABLA 4 Concentración de CK-MB en suero y sangre completa

Muestra	Suero (ng/ml)	Sangre completa ng/ml
1	114,7	156,8
2	26,6	28,0
3	219,7	194,3
4	235,9	217,5

Claims

1. Un inmunoensayo competitivo o no competitivo que comprende las etapas de:

-: inmovilizar un componente específico del ensayo sobre una fase sólida en un pocillo de reacción,

-: agregar un componente específico del ensayo, marcado,

-: secar dichos componentes,

-: agregar la muestra que contiene la marca a analizar,

-: permitir que la marca reaccione con los componentes específicos del ensayo, y

-: detectar la señal de la marca,

caracterizado porque se agrega y se seca una capa aislante, que separa los componentes inmovilizados de los componentes marcados, que pueden ser anticuerpos o antígenos, antes de la adición y desecación de dicho componente marcado.

2. Un inmunoensayo competitivo o no competitivo que comprende las etapas de:

-: agregar la muestra que contiene la marca a analizar al dispositivo que comprende un pocillo de reacción; un componente específico del ensayo inmovilizado en una fase sólida en el pocillo de reacción, ya sea directamente o a través de un par de afinidad; un componente específico del ensayo, marcado; dispositivo en el cual el componente inmovilizado y el componente marcado se han secado;

-: permitir que la marca reaccione con el componente específico del ensayo, y

-: detectar la señal de la marca

caracterizado porque se agrega y se seca una capa aislante que separa los componentes inmovilizados de los componentes marcados, que pueden ser anticuerpos o antígenos, antes de agregar y secar dicho componente marcado.

3. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque todos los reactivos, excepto la muestra, se agregan antes de secar.

4. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el pocillo de reacción es del tamaño de un pocillo de microtitulación común, o menor.

5. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la reacción inmunológica se lleva a cabo en un procedimiento de incubación.

6. El ensayo según la reivindicación 5, caracterizado porque la capa de aislamiento comprende proteínas y/o hidratos de carbono y los componentes específicos del ensayo necesarios.

7. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los componentes específicos del ensayo, agregados de antemano, se secan al aire.

8. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo consistente en suero, plasma o sangre completa.

9. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utilizan quelatos de lantánidos para marcar los componentes específicos del ensayo.

10. El ensayo según la reivindicación 9, caracterizado porque los quelatos de lantánidos se miden por fluorometría de resolución temporal.

11. El ensayo según la reivindicación 9, caracterizado porque los quelatos de lantánidos se miden

-: en solución, o

-: directamente en la fase sólida

por fluorometría de resolución temporal.

12. El ensayo según la reivindicación 9, caracterizado porque se mide más de un analito en un único pocillo de reacción, utilizando diferentes marcas de quelato de lantánidos para diferentes analitos.

13. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los componentes secos en el pocillo de reacción son específicos para

-: mioglobina,

-: isoenzima MB de creatin-quinasa,

-: troponina I específica del corazón,

-: isoenzima BB de la glucógeno-fosforilasa humana

-: mioglobina e isoenzima MB de creatin-quinasa, o

-: mioglobina, isoenzima MB de creatin-quinasa y troponina I específica del corazón.

14. Un dispositivo para utilizar en un inmunoensayo competitivo y/o no competitivo, que comprende

-: un pocillo de reacción,

-: un componente específico del ensayo inmovilizado sobre la superficie del pocillo de reacción, ya sea directamente o a través de reactivos de inmovilización secundarios,

-: un componente específico del ensayo, marcado,

caracterizado por una capa aislante que separa el componente inmovilizado del componente marcado, dispositivo en el cual el componente inmovilizado, el componente marcado y la capa aislante están secos.

15. El dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque todos los reactivos, excepto la muestra, se han agregado antes de secar.