CN117916595A - 用于校准用于确定分析物的浓度的免疫测定装置的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及校准用于确定样品中分析物的浓度的免疫测定装置的方法。可以在不使用具有已知浓度的分析物的校准标准品或不使用校准测量单元的情况下对该装置进行校准。
Description
本发明涉及分子诊断领域，特别涉及用于确定样品中分析物的浓度的免疫测定装置的校准。本发明还涉及一种确定样品中分析物的浓度的方法，其中用已经根据本发明的校准方法校准的免疫测定装置来测量该浓度。
背景技术
通常，生物化学分析仪采用分析物特异性的化学试剂和反应监测手段的组合来测定或确定被怀疑含有特定分析物的液体样品内的特定物质或分析物的存在或浓度。此类分析仪是众所周知的，并且几乎普遍采用某种校准曲线，该校准曲线将具有已知分析物浓度的样品内的分析物浓度与由反应监测手段响应于该分析物的存在而生成的信号相联系。此类样品通常被称为“校准物”或“校准溶液”或“标准溶液”。为了最大的精确度，以定期间隔(例如当生产新批次消耗品时)建立校准曲线，以对单个分析仪上的试剂细节进行补偿，并且对设备性能进行补偿。用于建立全校准曲线的分析物浓度的范围通常被选择为延伸到低于和超过预期会在生物样品(如血液、血清、血浆和尿液等)内被发现的分析物浓度的范围。
生物化学分析行业内的习惯做法是，通过使用多个校准溶液或校准物来为化学分析仪建立全校准曲线，这些校准溶液或校准物是用已知的、预先确定的分析物浓度精心制备的。对这些校准溶液或标准溶液进行一次或多次测定，并且相对于它们各自已知的分析物浓度绘制平均所得反应信号。然后使用数种数学技术中的任何一种来产生连续的校准曲线，这些数学技术被选择为产生反应信号和分析物浓度之间的关系的精确复制。校准曲线的形状受到试剂、分析物和分析仪机电设计之间的复杂相互作用的影响。因此，即使理论上的分析物-试剂反应是已知的，通常也需要采用数学技术来获得可接受的校准曲线。
用于确定分析物的浓度的大多数方式是基于免疫测定的，即，例如在所谓的“夹心测定”中使用免疫试剂(诸如抗体)检测分析物(概述参见例如图1B)。
如今，在实验室中进行的免疫测定已经经受了广泛的自动化的影响，并且对自动化免疫测定的需求正在增加。通常，此类自动化有两个必要的组件，即用于确定样品中的浓度的装置(通常也被称为“分析仪”)和可以与相应装置一起使用的(分析物特异性)测定。通常，可以使用市售的即用型试剂盒进行相应的测定，该试剂盒含有可以应用于相应装置的所有必要的试剂。理想地，装置“作为平台”适合于以自动化方式与各种不同的即用型免疫测定试剂盒一起使用，以便确保该系统的广泛适用性。
例如含有组合物(其含有免疫测定试剂)的市售试剂通常已经由制造商内部测试和校准，以确保该测定为含有已知浓度的分析物的样品提供期望的结果。该校准减少免疫测定的“批次对批次”的变化性。这还显示于图2中。
然而，测定试剂盒的内部校准通常都在制造商的场所进行，并且因此无法解释“装置对装置”的变化，即相同的构造的两个单个装置之间的变化，这种变化可能是由于例如装置的检测灵敏度中的轻微变化而导致的。因此，也有必要进行装置特异性校准。
因此，为了避免免疫测定的“装置对装置”的变化性，通过提供进一步的校准调整试剂盒来将特定装置调整到需要为使用该特定装置的分析物提供期望的结果的特定装置，校准调整试剂盒通常含有用于确定背景的空白样品以及含有已知浓度的分析物的样品，并且该装置。
这种调整必须定期进行。这种方式确保了该调整尤其避免或解释了装置中检测传感器的任何漂移效应。进一步地，装置特异性变化对于不同的分析物测定可以略有不同，或也可以受到免疫测定的“批次对批次”的变化性的影响，使得理想的情况是，每次使用新批次的免疫测定时都应重复装置特异性调整，以便获得最精确的结果。
装置的一个实例是AQT90 FLEX免疫测定分析仪(Radiometer Medical ApS)，该分析仪是可以与不同的即用型免疫测定试剂盒组合使用的平台装置，这些试剂盒用于血液或血浆样品中的特定生物标志物测试。每个批次的即用型免疫测定试剂盒由制造商校准，并且使用者必须使用批次特异性校准盒进行单个AQT90 FLEX免疫测定分析仪的装置特异性校准，该校准盒尤其含有具有已知浓度的分析物的样品。
EP 0 892 927 B1公开了一步式一体化干燥试剂免疫测定和用于使用相应的免疫测定的装置。
U.S.3,960,497公开了使用具有被测量的特定特征的已知值的标准溶液来校准化学分析仪和验证其校准的基本概念。
US 6,277,584公开了用于在低信号水平下以改进的精确度校准化学分析仪的方法。
Kunz等人.“Addressing the challenges of biomarker calibrationstandards in ligand-binding
assays:a European Bioanalysis Forum perspective”,Bioanalysis(2017)9(19),1493–1508总结了校准生物标志物测定的各种方法和校准标准。
WO 2014/143323 A1公开了用于使用免疫测定来测量分析物浓度的测定的内部校准的方法。
然而，提供单个的装置校准的需要伴随有数种缺点。由于调整试剂盒需要含有具有已知浓度的分析物的样品，因此试剂盒的生产相当昂贵，并且例如由于分析物的有限稳定性而通常具有有限的稳定性。此外，调整试剂盒通常还含有单独的不含有分析物的空白样品，即背景样品，这当然增加了调整所需的样品数量以及进行调整测量的时间。此外，客户必须获得相应的调整试剂盒。换句话说，如果客户没有为装置订购相应的调整试剂盒，则根据装置的设置，客户可能根本无法进行自动化测定，或可能由于缺少现场装置调整而获得不精确的结果。
因此，需要用于提供特定装置的调整的替代方式，其不需要使用单独的包含具有已知浓度的分析物的样品的调整试剂盒。
因此，本发明的目标在于提供用于特定单个装置调整的方法，该方法不需要使用具有已知浓度的分析物的含分析物样品。
因此，本发明的目标还在于提供用于使用相应的已校准装置来确定分析物的浓度的方法。
发明内容
通过校准免疫测定装置和使用该装置测量来自测量单元的样品信号的方法来解决该目标，该装置适合用于通过使样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触来确定样品中分析物的浓度，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，
其中该方法包括以下步骤：
a)提供来自该相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元；
b)将测定缓冲液添加到该一个或多个测量单元中；
c)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第一信号；
d)洗涤该一个或多个测量单元；
e)任选地干燥该一个或多个测量单元；
f)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第二信号；和
g)使用该第一信号的一个或多个测量值和该第二信号的一个或多个测量值来计算用于确定样品中分析物的浓度的一个或多个装置特异性校正因子。
目标进一步通过确定样品中分析物的浓度的方法来解决，该方法包括以下步骤：
i)根据本文描述的校准方法，使用来自相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元来校准免疫测定装置，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，该校准方法从而提供一个或多个装置特异性校正因子；
ii)提供含有该分析物的样品；
iii)使该样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触；
iv)洗涤该测量单元；
v)任选地干燥该测量单元；
vi)使用该免疫测定装置测量来自该测量单元的样品信号；和
vii)根据该样品信号和至少该一个或多个装置特异性校正因子来计算该分析物的浓度。
具体实施方式
如本文所用，术语“一个”，如“一个样品”中的“一个”可以是指单数的或复数的。因此，其含义与“一个或多个”相同。
作为优选的实施方案，如本文所用的术语“包含”还涵盖术语“基本上由……组成”或甚至作为“由……组成”。
如本文所用，与数字有关的术语“约”，诸如“约70℃”中的“约”涵盖确切的数字以及轻微的差异，然而这些差异是由于用于例如温度的测量方法的不精确而导致的。通常，术语“约”还涵盖比确切的数字高10％或低10％的值。例如，术语“约70℃”然后也包含63至77℃的温度。在优选的实施方案中，术语“约”涵盖比确切的数字高5％或低5％的值。在另一优选的实施方案中，术语“约”涵盖比确切的数字高1％或低1％的值。
如本文所用，术语“捕获抗体”意指被固定化的抗体，即被固定化于测量单元的内部表面上的抗体，因此其“捕获”的分析物从而也被固定化/结合到测量单元的内部表面。因此，捕获抗体针对作为抗原的感兴趣的分析物。可以将捕获抗体共价地或非共价地固定化到测量单元的表面。在一个实施方案中，固定化依赖于生物素和链霉亲和素之间的相互作用。例如，捕获抗体可以是生物素化的，并且测量单元的内部表面可以包被有共价结合的链霉亲和素。然后通过生物素和链霉亲和素之间的相互作用将捕获抗体固定化在测量单元的内部表面上。生物素和链霉亲和素之间的相互作用如此强烈，以至于其基本上是不可逆的。然而，其他固定化方法同样适合于固定化捕获抗体。然而，在免疫测定的洗涤、孵育和干燥步骤期间，捕获抗体没有将或基本上没有从测量单元的内部表面除去。
如本文所用，术语“示踪物抗体”是指用检测标记物标记的抗体。示踪物抗体针对分析物或分析物与捕获抗体的复合物。然后，标记物可以随后例如使用适当的传感器提供可检测信号，例如比色信号或荧光信号。可以将标记物共价地或非共价地附接到示踪物抗体。附接到抗体的标记物的实例包括但不限于荧光标签(诸如绿色荧光蛋白或其变体)、酶标签(诸如催化比色反应的半乳糖苷酶)、放射性同位素、小分子荧光的或磷光性染料、其他小分子着色染料和纳米颗粒等。标记物的实例特别地包括但不限于例如EP 0 892927B1或US 9,944,657中所描述的镧系元素螯合物标记物。示踪物抗体结合至分析物，在分析物、示踪物抗体和捕获抗体之间形成三元复合物(参见图1)。
将理解，本文在术语“捕获抗体”和“示踪物抗体”的上下文中所使用的术语“抗体”以免疫测定领域内的传统意义使用，即例如涵盖单克隆抗体、多克隆抗体以及那些与分析物(例如抗原)的相关表位结合的抗体的片段等。进一步地，抗体(或其片段)可以在例如动物中或在细胞系中产生，包括利用重组技术和合成或半合成方法学。
如本文所用，术语“装置的校准”、“免疫测定装置的校准”、“校准免疫测定装置”或“校准装置”是指推导出微调单个免疫测定装置(在下文中简称“装置”)所需的校正因子，以用于以高精确度确定样品中分析物的浓度。
如本文所用，术语“测量单元”是指含有用于确定样品中分析物的浓度的组分的容器，即包含示踪物抗体和捕获抗体以及任选的稳定剂和进一步的测定组分的容器。进一步地，以可以检测到由示踪物抗体的标记物生成的信号的方式配置测量单元。测量单元可以是非一次性的或一次性的。在自动化系统中，测量单元通常是一次性的，并且被配置为与用于确定分析物浓度的相应装置结合使用。通常，测量单元仅用于一次性使用。优选的是，测量单元是即用型测量单元，即不需要使用者对测量进行手动修改的测量单元。
如本文所用，术语“体液”意指由高等生物生成的任何种类的流体。非限制性实例包括血液、血浆、血清、尿液、唾液和脑脊液。在优选的实施方案中，体液来源于哺乳动物，优选人。
如本文所用，术语“校正因子”是指用于根据测量的信号(例如荧光信号)计算分析物的浓度的计算常数。校正因子可以是加常数或乘常数。因子可以是正数或负数。校正因子可以是装置特异性的或测量单元特异性的或二者都是。例如，装置特异性校正因子可以取决于仪器的灵敏度，甚至在相同型号装置的两个实施方案之间，灵敏度可以略有变化，即“装置对装置”的变化。测量单元特异性校正因子可以尤其取决于测量单元的组分的性质，该组分包含示踪物抗体和捕获抗体。因此，测量单元特定校正因子可以取决于例如抗体对分析物的亲和性、稳定剂的存在或不存在、示踪物抗体的标记物的性质、测量单元中捕获抗体和示踪物抗体的量和/或测量单元的内部表面的材料。测量单元特异性校正因子通常不依赖于用于测量的特异性单个装置。因此，测量单元特异性校正因子通常通过在多个装置上测量具有已知浓度的分析物的样品来确定，并且可以对结果进行平均以确定测量单元特异性校正因子。
如本文所用，术语“基本上”，如同在例如“基本上除去”、“基本上干燥”或“基本上不同”中的“基本上”意味着它允许与绝对值有轻微的然而可忽略不计的偏差。在优选的实施方案中，术语“基本上”还包含至多10％偏差。作为说明性实例，这意味着“基本上除去”是指至少90％将被除去。该说明性实例中的“基本上干燥”是指样品是至少90％干燥的，因此不到10％的测量单元内部表面被流体覆盖。在另一优选的实施方案中，术语“基本上”包含至多5％偏差。
如本文所用，术语“干燥”意味着测量单元不含有流体，即测量单元的内部表面不被流体覆盖。
如本文所用，术语“装置”和“分析仪”可互换地使用。
如本文所用，“自动化装置”是用于以自动化方式起作用来确定分析物的浓度的装置。例如，此类装置可以含有采样器，该采样器自动地将所需量的样品应用于测量单元，自动地进行孵育步骤、洗涤步骤、信号检测步骤和/或自动地基于所获得的测量值计算浓度。
如本文所用，术语“单个装置”是指待校准的特定装置，即确切地是被校准的一个装置，也就是具有独特标识符的装置。用于确定样品中分析物的浓度的其他装置可以具有相同的构造和相同的设置，但仍然不是“相同的单个装置”，而是相同的装置系列中的装置或相同的装置类型中的装置。例如，单个装置将是在使用者实验室的特定AQT90 FLEX免疫测定分析仪。其他AQT90 FLEX免疫测定分析仪，例如在制造商的场所但不是在使用者的实验室使用的那些，是来自相同的“装置系列”中的装置，但它们不是使用者的相同的“单个装置”。
如本文所用，术语“装置系列”意味着有相同的构造和设置的许多不同装置，例如AQT90 FLEX免疫测定分析仪，但只有一个AQT90 FLEX免疫测定分析仪是“单个装置”。
校准方法
本发明涉及校准免疫测定装置和使用该装置测量来自测量单元的样品信号的方法，该装置适合用于通过使样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触来确定样品中分析物的浓度，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，
其中该方法包含以下步骤：
a)提供来自该相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元；
b)将测定缓冲液添加到该一个或多个测量单元中；
c)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第一信号；
d)洗涤该一个或多个测量单元；
e)任选地干燥该一个或多个测量单元；
f)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第二信号；和
g)使用该第一信号的一个或多个测量值和该第二信号的一个或多个测量值来计算用于确定样品中分析物的浓度的一个或多个装置特异性校正因子。
本发明方法的实施方案的概述还展示在图1A的方案中，其中步骤a)展示为从左边起的第一测量单元(“杯”)(“即用型”)；步骤b)展示为添加到第一测量单元中的滴剂(“mL”)；“孵育”是在添加测定缓冲液之后允许组分(例如示踪物抗体)完全湿润和溶解的时间；步骤c)展示为从左起的第三测量单元(“测量”)；步骤d)和e)展示为从左起的第四测量单元(“洗涤和干燥”)，并且步骤f)展示为到最右的测量单元(”测量”)。随后基于第一信号和第二信号进行步骤g)。
通常在将装置用于确定样品中分析物的浓度之前进行校准装置的方法。优选的是，装置是自动化装置。还优选的是，装置适合于与用于确定分析物的浓度的即用型免疫测定试剂盒组合使用，甚至更优选地与含有所述免疫测定的试剂的即用型测量单元组合使用。
进一步地，优选的是，存在与本发明的方法的装置具有相同的构造的其他装置。因此，在优选的实施方案中，待校准的装置是单个装置。单个装置是相同的构造的装置系列中的，该相同的构造的装置系列可以仅在小细节(诸如，例如光学单元诸如光电倍增管中的检测传感器的灵敏度)上不同。所述其他装置中的一个或多个可以用于额外的校准实验，该额外的校准实验任选地可以使用含有已知浓度的分析物的样品。
本发明的方法的步骤遵循如上文所描述的顺序，但该方法可以在方法步骤a)至g)之前、之后和/或之间任选地含有进一步的方法步骤。
步骤a)中的一个或多个测量单元是不含分析物的。因此，本发明的方法提供了装置的校准，而不必使用具有已知(即非零)浓度的分析物的含分析物样品。因此，可以用与待用于确定样品中分析物的浓度的测量单元相同的测量单元来进行装置的校准，即，用于校准的一个或多个测量单元与用于确定样品中分析物的浓度的测量单元选自同一批次的相同测量单元。
在优选的实施方案中，测量单元具有杯的形状。每个杯都具有开口端和内部表面。内部表面的至少一部分包被有捕获抗体。杯以及用于容纳多个杯的装置例如描述于US 7,922,986 B2中。
在使用之前可以将杯单个地封闭或密封，在任何杯之间都没有流体连通。
在优选的实施方案中，步骤a)中的一个或多个测量单元是基本上干燥的或干燥的，即不含有诸如测定缓冲液的流体。这意味着所有试剂，例如捕获抗体和示踪物抗体都以干燥状态存在，并且例如示踪物抗体或其他组分需要重新构建，以便以溶液形式存在于测量单元中。
由于测量单元含有捕获抗体和示踪物抗体，因此除实际样品之外，测量单元还含有适合于确定样品中分析物的浓度的组分。
在优选的实施方案中，测量单元是即用型测量单元。
在另一优选的实施方案中，测量单元(例如可以例如来自含有相应生物测定的所有干燥组分的特定测量单元批次的即用型测量单元)先前已进行过校准，例如，通过使用来自同一批次的至少一个即用型测量单元，使用与待根据本发明方法校准的单个特定装置来自相同装置系列的至少一个装置进行校准。测量单元的校准可以通过使用含有已知浓度的分析物的一个或多个样品来进行。在一个实施方案中，已经使用主校准曲线对测量单元进行校准，其中对主校准曲线有贡献的每个样品具有不同但已知的浓度的分析物。
在另一优选的实施方案中，测量单元是分批次生产的。进一步优选的是，所述批次的生产程序确保当对相同的样品测量时，批次的所有测量单元将给出相等或基本上相等的响应，即确保用于所有实际用途的该批次的测量单元是“相同的”。当生产下一批次时，这些测量单元的响应也将对样品给出相等的响应，但响应可以与先前批次的响应不同，这也被称为“批次对批次的变化”。进一步优选的是，分别对每批次的测量单元进行校准。
在根据本发明的校准方法中，用于校准装置的测量单元和用于(随后)使用已校准装置确定样品中分析物的浓度的测量单元选自相同测量单元的批次，其中相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体。
如上文所解释，术语“相同的”意指单个测量单元是在相同的条件下生产的并且意在具有基本上相同的组成并意在表现出基本上相同的性能。在一些实施方案中，此类相同测量单元的批次来自一个或多个生产批次，优选来自相同的生产批次。
基于测量单元校准的测量，可以计算测量单元特异性校正因子，并且这种测量单元校正因子可以解释，例如通过测量单元或含有多个测量单元的盒上的条形码(也被称为工厂定义的校准数据条形码)传递到单个装置的批次对批次的特定调整。在此类实施方案中，待校准的装置然后包含相应的条形码读取器。在替代实施方案中，待校准的装置可以提供用于手动地输入测量单元特异性校正因子的手段。
在优选的实施方案中，超过一个测量单元用于根据本发明的校准方法。在不受理论约束的情况下，使用的测量单元越多，一个或多个装置特异性校正因子的最终计算将越精确。然而，实现足够精确度的测量单元的数量也可以取决于测量单元的细节，例如捕获抗体、示踪物抗体和测量单元的材料等。
在另一优选的实施方案中，当超过一个测量单元用于校准时，在本文中也被称为异常值的测量单元，其中随后的第一和第二信号与针对其他测量单元获得的第一和第二信号基本上不同，所述异常值的测量不包括在步骤g)的计算中。
在优选的实施方案中，使用约4至约16个测量单元进行该方法。
在另一优选的实施方案中，测量单元具有10至200μL，并且优选约20至约100μL的反应体积。
步骤b)中的测定缓冲液可以是任何测定缓冲液。在优选的实施方案中，测定缓冲液是水性缓冲液。合适的缓冲液优选地含有缓冲剂、盐和洗涤剂。在优选的实施方案中，缓冲液的pH为约6.5至约8，并且优选为约7.0至约7.8。特别优选的是，缓冲液的pH为约7.4。例如，在一个实施方案中，测定缓冲液是AQT90 FLEX Solution Pack(Radiometer)的商用缓冲液。
在优选的实施方案中，测定缓冲液包含缓冲剂、盐和洗涤剂。
在步骤b)中，对于测定内的一个或多个测量单元中的每一个，添加的测定缓冲液的体积通常是相同的或基本上相同的。当将测定缓冲液添加到优选的干燥测量单元中时，捕获抗体优选地保持固定化于表面上，但示踪物抗体溶解在测定缓冲液内。
在优选的实施方案中，步骤b)在添加测定缓冲液之后还含有孵育步骤。在不受理论约束的情况下，孵育步骤确保示踪物抗体在测定缓冲液中溶解。
在一个实施方案中，孵育时间为约1至约15分钟，优选为约2至约10分钟。孵育温度可以是任何温度，并且优选地为约4℃至约40℃，更优选为约22℃至约38℃。在特别优选的实施方案中，温度为约37℃。
在另一优选的实施方案中，样品在孵育期间混合。在特别优选的实施方案中，样品在孵育的整个持续时间内混合。对于测量的所有测量单元，混合的总量应优选是相同的。
在步骤c)中，通过使用合适的检测传感器对一个或多个测量单元中的每一个的第一信号进行测量。在测量时，示踪物抗体以溶液形式存在于测定缓冲液中并且生成可检测信号。在优选的实施方案中，所确定的信号是比色信号、磷光信号或荧光信号。在优选的实施方案中，第一信号是荧光信号。
特别优选的是，第一信号是时间分辨荧光信号。此类时间分辨荧光的信号传导系统例如由In Johnstone AP,Turner MW,eds.Immunochemistry 1:a practicalapproach.Oxford:IRL Press,1997,193–214页进行了描述。用于时间分辨荧光的示踪物抗体的合适标记物包含共价地附接到示踪物抗体的抗体部分的镧系元素螯合物标记物。合适的镧系元素螯合物标记物的实例例如描述在EP 0 892 927 B1或US 9,944,657中。在优选的实施方案中，标记物是基于铕的镧系元素螯合物。
由于在步骤c)中测量第一信号之前，测量单元中的示踪物抗体中没有一种被除去，因此在不受理论约束的情况下，步骤c)中生成的第一信号可以代表装置的最大信号水平的良好近似值，而不必使用含有特定分析物的校准物进行测量。
在步骤d)中，洗涤一个或多个测量单元。在优选的实施方案中，测定缓冲液用作用于洗涤的洗涤缓冲液。洗涤步骤d)因此从测量单元中除去示踪物抗体。如有必要，可以重复洗涤步骤，以从测量单元中除去或至少基本上除去所有的示踪物抗体。
洗涤步骤通常包括aa)例如通过使用负压从测量单元中除去流体，以及bb)将用于洗涤的缓冲液添加到测量单元中，以及cc)再次从测量单元中除去流体。
在一个实施方案中，步骤d)包括一个或多个洗涤步骤，其中重复步骤aa)、bb)和(任选的cc))。
在优选的实施方案中，步骤d)中的洗涤以如此方式进行：在一个或多个洗涤步骤的结束时，例如使用负压将流体从测量单元中除去或基本上除去，即在步骤e)之前已经将大部分流体除去。
在步骤e)中，在洗涤之后任选地将测量单元干燥，以进一步除去剩余的残留流体。干燥可以通过任何已知的干燥方法来进行。在不受理论约束的情况下，在洗涤步骤之后测量单元通常含有一些残余流体，即使在步骤d)的子步骤cc)中已经加将洗涤缓冲液基本上除去。在一些情况下，可以发现，在步骤d)之后测量单元是足够“干燥的”，并且残余流体(如测量单元的内侧上的薄流体膜)的量将不会对第二信号的测量(步骤f))具有任何显著的影响。在一些其他情况下，可以发现，单独的干燥步骤是优选的。
在优选的实施方案中，将测量单元空气干燥。特别优选的是，在含有测量单元之前，将用于空气干燥的空气过滤。在不受理论约束的情况下，空气的过滤除去可能影响测量精确度的污染物。
在另一优选的实施方案中，用于空气干燥的空气的温度为约50℃至约90℃。特别优选的是，空气的温度为约70℃。
在另一优选的实施方案中，空气干燥通过以5L/分钟的速度将空气吹进并穿过测量单元来进行。
在干燥之后，测量单元是干燥的，即排空测量单元之后的残余体积优选地小于6μL流体，并且甚至更优选地已经完全地干燥。
在不受理论约束的情况下，在干燥之后，测量单元然后仍然含有在洗涤期间没有除去的固定化捕获抗体。
在步骤f)中，使用与步骤c)中相同的检测传感器在步骤e)中获得的干燥测量单元上确定一个或多个测量单元中的每一个的第二信号，从而第二信号是与步骤c)中测量的第一信号相同类型的信号。
在特别优选的实施方案中，第一信号和第二信号是荧光信号，优选时间分辨荧光信号。
第一信号和第二信号可以使用任何种类的检测传感器来检测。检测传感器的非限制性实例是光学检测单元或放射性检测单元。光学检测单元的非限制性实例是雪崩光电二极管和光电倍增管等。将理解，优选地，对于测量两个信号的检测传感器是完全相同的。
在又另一特别优选的实施方案中，第一信号和/或第二信号由装置的光电倍增管(PMT)检测。普遍已知的是，光电倍增器类型的灵敏度和背景信号可以在相同构造的不同PMT之间有所不同，并且这可能是装置间变化的原因之一。
然而，与步骤c)中生成的第一信号相比，第二信号是使用从步骤e)获得的干燥测量单元生成的。由于在步骤d)和任选地在步骤e)中已经将示踪物抗体从测量单元中除去，因此在不受理论约束的情况下，第二信号应该显著地低于第一信号，并且因此可以被认为是装置特异性空白或背景信号。
令人惊讶地发现，可以使用这种信号，即使这种信号是从测量单元的干燥状态获得的，而第一信号是从含有作为介质的测定缓冲液的测量单元的“湿”状态获得的。
在测量单元中获得第一高信号和第二低信号后，不必在测量单元中提供已知浓度的分析物，就可以在步骤g)中使用第一信号的一个或多个测量值和第二信号的一个或多个测量值来计算用于确定样品中分析物的浓度的一个或多个单个装置特异性校正因子。
如上文对于测量单元校正因子所描述的，可以在算法中使用装置特异性校正因子，以更精确地将对于分析物所测量的信号转换成相应的分析物浓度。例如，当所测量的信号是荧光信号时，例如作为检测传感器的光电倍增管中所获得的荧光光子计数需要转换成分析物浓度。
在优选的实施方案中，在这种算法中，还可以考虑测量单元特异性校正因子。这也在图3中所展示的一个实例中。
在更优选的实施方案中，在步骤f)中获得的第二信号用作加常数装置特异性校正因子。在另一优选的实施方案中，在步骤c)中获得的第一信号用作乘常数装置特异性校正因子。
在特别优选的实施方案中，可以应用以下计算来确定样品的浓度：
等式1：M＝a*R(c)+b
在等式1中，“M”是所测量的信号。因子“a”是源自步骤c)中的测量(即源自第一信号)的用于装置的装置特异性灵敏度校正因子。“R(c)”是浓度上的响应函数，其优选地是严格递增的单调C2函数。然而，响应函数是不依赖于特定装置的函数。相加的“b”是装置的“背景”信号，并且可从步骤f)中获得的第二信号推导出。
在另一优选的实施方案中，装置特异性校正因子的计算包含所测量的单个装置的第一和第二信号与针对来自相同系列的一个或多个不同装置(在本文中也被称为“主装置”)所获得的相应第一和第二信号的相关性，其已经用于确定测量单元特异性校正因子。因此，主装置的所述装置特异性校正因子也可以是数个主装置的平均校正因子。在优选的实施方案中，主装置的装置特异性校正因子可以由待校准的装置读取，例如通过条形码读取器读取。在替代实施方案中，可以由使用者手动地将主装置的装置特异性校正因子输入到待校准的单个装置。
在优选的实施方案中，当超过一个测量单元用于步骤a)至f)中的校准时，步骤g)中单个装置特异性校正因子的计算包括分别对所测量的第一信号结和第二信号的结果进行平均。换句话说，当例如八个测量单元用于校准时，对八个第一信号进行平均，并且对八个第二信号进行平均。
在优选的实施方案中，针对用于确定样品中分析物的浓度的装置进行根据本发明的校准，其中该样品是体液。
在优选的实施方案中，体液是全血、尿液、血浆或血清。
在特别优选的实施方案中，体液是全血或血浆。
校准之后待确定的样品中的分析物可以是任何感兴趣的分析物。在优选的实施方案中，分析物是NT-proBNP(脑利钠肽的N-末端激素原)、降钙素原(PCT)、BNP(脑利钠肽)、D-二聚体、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、β-hCG(人绒毛膜促性腺激素)、C-反应蛋白(CRP)、肌红蛋白或CK-MB(肌酐激酶-肌肉/脑)。
确定分析物的浓度的方法
本发明进一步涉及确定样品中分析物的浓度的方法，该方法包括以下步骤：
i)根据本文描述的校准方法，使用来自相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元来校准免疫测定装置，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，该校准方法从而提供一个或多个装置特异性校正因子；
ii)提供含有该分析物的样品；
iii)使该样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触；
iv)洗涤该测量单元；
v)任选地干燥该测量单元；
vi)使用该免疫测定装置测量来自该测量单元的样品信号；和
vii)根据该样品信号和至少该一个或多个装置特异性校正因子来计算该分析物的浓度。
本发明的方法的步骤遵循如上文所描述的顺序，但该方法可以在方法步骤i)至vii)之前、之后和/或之间任选地含有进一步的方法步骤。这就是说，步骤i)和ii)的顺序不是特别关键的，并且在一些情况下，可以在装置的校准之前或期间的时间收集样品，例如血液样品。
装置、样品、分析物、捕获抗体和示踪物抗体如上文所描述用于本发明的校准方法。
在一个实施方案中，步骤ii)还可以含有用测定缓冲液稀释样品的步骤。稀释将通过引入稀释因子在步骤vii)中说明。根据样品中分析物的浓度和分析物测定的具体细节，此类稀释步骤可以是必要的。在其他实施方案中，样品按原样使用，例如不稀释的全血样品。
步骤iii)中的测量单元与用于步骤i)中的校准的一个或多个测量单元来自相同测量单元的同一批次。
在步骤iii)中，使样品与测量单元接触(例如分配到或添加到其中)。通常，在分配或添加样品之前或之后(优选之前)，还将测定缓冲液添加到测量单元中。
在优选的实施方案中，步骤iii)还含有孵育步骤。在不受理论约束的情况下，孵育步骤确保捕获抗体、分析物和示踪物抗体之间的复合物可以形成。在特别优选的实施方案中，孵育时间为约1至约15分钟，并且更优选为约2至约10分钟。
洗涤步骤iv)从样品中除去未结合的示踪物抗体。在优选的实施方案中，洗涤缓冲液是上文描述的测定缓冲液。在另一优选的实施方案中，洗涤步骤与本文上文针对步骤d)所描述的相同。
在优选的实施方案中，任选的干燥步骤v)与本文上文针对干燥步骤e)所描述的相同，并且出于与本文上文针对干燥步骤e)所解释的相同的原因可以是优选的。
在步骤vi)中，使用免疫测定装置从测量单元测量的样品信号是与上文步骤c)和f)中描述的第一信号和/或第二信号相同类型的信号。在优选的实施方案中，信号因此是荧光信号，优选时间分辨荧光信号。
在步骤vii)中，将样品信号转换成分析物浓度。如上文针对步骤g)所描述的，计算包括基于步骤i)中确定的装置特异性校正因子的校正。在优选的实施方案中，计算还考虑了测量单元特异性校正因子，优选如上文已经解释的批次特异性测量单元特异性校正因子。因此，在另一优选的实施方案中，等式1用于计算分析物的浓度。在实施方案中，来自等式1的灵敏度“a”和背景“b”也用于根据“a”和“b”应用一个或多个校正。
在另一优选的实施方案中，装置含有CPU以进行上述计算。进一步优选的是，装置配置为例如在显示屏上或作为打印输出显示计算的分析物浓度。此外，如上文已经描述的，优选的是，装置包含配置为接收条形码信息(诸如一个或多个测量单元特异性校正因子和/或主装置特异性校正因子)的条形码读取器。
附图说明
图1：图1A描述了“湿杯校准”的实例，即本发明的装置特异性校准的方法。提供含有捕获抗体和示踪物抗体的即用型测量单元并且添加缓冲液。在孵育时间段之后，根据荧光检测系统在期望的波长处(例如在616nm处)测量荧光。接下来，对测量单元进行洗涤和干燥，并且再次测量干燥测量单元的荧光。图1B描述了用于确定样品中分析物(例如抗原)的浓度的测量单元中免疫测定的原理。固定化抗体是捕获抗体。对于这种抗体，分析物可以结合。然后，例如在孵育之后可以与用可检测标记物标记的示踪物抗体一起形成三元复合物，该可检测标记物可以使用适当的检测系统来检测，诸如荧光，特别是时间分辨荧光。然而，未与分析物-捕获抗体复合物结合的示踪物抗体将通过洗涤除去，使得示踪物抗体信号指示样品中分析物的量。
图2提供了含有用于单个装置的生物测定试剂的即用型测量单元所必要的校准步骤的概述。在制造测量单元之后，对相应的测试杯(即测量单元)批次进行质量测试，并且其对于测试会通过或失败。如果其测试通过，则确定批次特异性属性。这同样适用于用于装置特异性校准的校准杯的制造，即该校准杯配置为进行校准的杯，例如额外地包含已知量或浓度的分析物的杯。此外，这些校准杯需要测试，并且校准杯批次会通过或失败于此测试。然而，当使用本发明的装置特异性校准时，此类测试是不必要的，因为校准可以在不使用此类校准杯的情况下进行，而是需要使用也适合于应用待测量的样品的测量杯，即不含有已知量或浓度的分析物的测量单元。
图3也显示了本发明的单个装置特异性校准的实施方案。将测量单元插入到单个装置中，并且输入特定批次的测量单元的工厂校准数据。接下来，将测定缓冲液添加到测量单元中，并且测量信号。然后对测量单元进行洗涤和干燥，并且测量干燥测量单元的信号。两次测量的数据是装置特异性的，并且与相应测量单元批次的输入工厂校准数据(即测量单元特定校准数据)在一起，分析物的浓度可以用单个装置上相应批次的测量单元来确定。
图4显示了在不存在装置特异性校准的情况下，每个单个装置A至E的样品L1至L5中的每一个的装置报告信号水平(以任意单位表示)。显示了每个装置的全部10个重复。可以看出，针对所测量的样品报告的信号水平在装置之间有所不同。
图5显示了在如同用AQT90 FLEX免疫测定分析仪所进行的一样，使用已知浓度的校准标准品进行校准之后，每个单个装置A至E的样品L1至L5中的每一个的装置报告信号水平(以任意单位表示)。显示了每个装置的全部10个重复。当使用标准校准方法(即关于AQT90 FLEX的方法)校正所测量的信号水平时，除去了单个装置之间的差异。因此，可以在不同的单个装置上测量样品，并且所报告的结果将是相同的。
图6显示了在使用根据本发明的“湿杯校准”进行校准之后，每个单个装置A至E的样品L1至L5中的每一个的装置报告信号水平(以任意单位表示)。显示了每个装置的全部十个重复。当使用本发明的湿杯校准方法校正所测量的信号水平时，除去了单个装置之间的差异。因此，可以在不同的单个装置上测量样品，并且所报告的结果将是相同的。
替代实施方案
在替代实施方案(以下将参考本文上文公开的包括附图的主要实施方案公开)中，捕获抗体和示踪物抗体二者中的一个分别被“捕获适体”或“示踪物适体”代替。适体是例如选自大型随机序列库的单链DNA或RNA或其合成版本(XNA，如例如LNA)或其杂交体。然而，抗体以及适体可以被选择为例如能够与特定分析物(靶分子)结合。
因此，关于上文刚刚描述的替代实施方案，应理解，在本说明书和权利要求内，术语“捕获抗体”的任何出现应被理解为“捕获适体”，加以必要的变通，和/或术语“示踪物抗体”的任何出现应被解释为“示踪物适体”，加以必要的变通。更一般地，并且当考虑本文的主要实施方案和本替代实施方案的组合时，应理解，在本说明书和权利要求内，术语“捕获抗体”的任何出现应被理解为“捕获抗体”或“捕获适体”，并且术语“示踪物抗体”的任何出现应被理解为“示踪物抗体”或“示踪物适体”，加以必要的变通。
此外，在之前提及的替代实施方案中，本发明涉及校准免疫测定装置和使用该装置测量来自测量单元的样品信号的方法，该装置适合于通过使样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触来确定该样品中分析物的浓度，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体或捕获适体和示踪物抗体或示踪物适体，
其中该方法包含以下步骤：
a)提供来自该相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元；
b)将测定缓冲液添加到该一个或多个测量单元中；
c)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第一信号；
d)洗涤该一个或多个测量单元；
e)任选地干燥该一个或多个测量单元；
f)测量该一个或多个测量单元中的每一个的第二信号；和
g)使用该第一信号的一个或多个测量值和该第二信号的一个或多个测量值来计算用于确定样品中分析物的浓度的一个或多个装置特异性校正因子。
另外，在之前提及的替代实施方案中，本发明进一步涉及确定样品中分析物的浓度的方法，该方法包含以下步骤：
i)根据本文描述的校准方法，使用来自相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元来校准免疫测定装置，其中该相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体或捕获适体和示踪物抗体或示踪物适体，该校准方法从而提供一个或多个装置特异性校正因子；
ii)提供含有该分析物的样品；
iii)使该样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触；
iv)洗涤该测量单元；
v)任选地干燥该测量单元；
vi)使用该免疫测定装置测量来自该测量单元的样品信号；和
vii)根据该样品信号和至少该一个或多个装置特异性校正因子来计算该分析物的浓度。
实施例
实施例1使用和不使用装置特异性校准的测量的比较
在下文中，将校准调整到单个装置，其中使用批次信息和试剂盒，该试剂盒在即用型测量单元中含有干燥测定试剂。
实施例1.1装置的校准
使用配置成用于时间分辨荧光的装置来用于校准。
一般测量方案如下：
在存在(“湿测量”)或不存在(“干测量”)体积为60μL、pH为7.4的合适测定缓冲液的情况下进行测量。
孵育测量单元达447±10秒。
在孵育之后，用340nm的激发波长、616nm的检测波长，使用100mA的LED电流、400μs的光持续时间，根据校准方法任选地测量时间分辨荧光(“湿测量”)。
接下来，通过重复分配和排空测量单元来洗涤测量单元，从而给予时间以除去未特异性结合的抗原以及未结合的材料。
在洗涤之后，通过以超过3L/分钟、优选5L/分钟在70±5℃向测量单元吹气达30秒来干燥测量单元，并且在干燥之后，测量时间分辨荧光(“干测量”)。
用相同系列的五个单个装置(A、B、C、D和E)重复校准。
实施例1.2不使用装置特异性校准的测量(比较实施例)
作为参考样品，通过添加五种不同浓度的人肌红蛋白来制备五种锂肝素血浆样品(在下文中也被称为L1至L5)作为标准品：48.5μg/L、L2：97.4μg/L、L3：196μg/L、L4：471μg/L以及L5：1108μg/L。
将所述样品应用于装置，并且使用包含用于检测人肌红蛋白的测量单元的盒。测量单元含有与市售的AQT90 FLEX肌红蛋白测试杯(AQT90 FLEX Myo测试试剂盒；Radiometer)中相同的试剂。
对于每个装置，加载五个肌红蛋白测试盒，并且在五个装置中的每一个上测量每个样品(L1、L2、L3、L4和L5)的十个重复。
未进行装置特异性校准。
结果总结在表1中，作为每个装置的每个样品的十个重复的平均值。
表1
进一步地，结果也显示在图4中。
L1至L5的平均值在不同装置A至E之间显著地变化。
实施例1.3在使用已知浓度的分析物用AQT90 FLEX免疫测定分析仪校准方法进行校准之后评价测量(比较实施例)
使用肌红蛋白校准盒(“Myo-CAL盒”，Radiometer，型号944-214)，用装置特异性校准来校准装置A至E，该校准盒特异于用于实施例1.2中使用的测量单元的测定批次。校准盒含有两种类型的测试测量单元，即除干燥测定试剂之外还含有已知浓度的肌红蛋白的测量单元和相应的不含有肌红蛋白的测量单元。后者用于确定背景信号。
与上述相同的测定缓冲液用于装置特异性校准的测量。进一步地，通过扫描校准盒的条形码，进一步预先确定的用于校准的测量单元特异性信息被传递到装置中。
在进行上述校准测量之后，将所获得的校准数据应用于在实施例1.2中获得的L1至L5的测量数据。
结果，即装置特异性校准校正的L1至L5的肌红蛋白水平总结在表2中。结果也显示在图5中。
表2
当与表1中的结果相比时，在装置特异性校准之后，装置A至E之间的浓度水平变化较小。
实施例1.4用湿杯校准方法进行校准之后评价测量(本发明)
使用校准盒，用湿杯校准方法来校准装置A至E，其中测量单元不含有肌红蛋白，即对应于用于实施例1.3中使用的校准盒的“背景”或“空白”测量单元。
对于装置特异性校准，通过在添加测定缓冲液之后测量时间分辨荧光来确定背景信号(“湿测量”)，该测定缓冲液与用于上述实施例的测定缓冲液相同。然后，对测量单元进行干燥，并且将所干燥的测量单元的时间分辨荧光确定为“干测量”。
两个信号，即含有测定缓冲液的测量单元的测量的第一信号和随后的“干测量”的第二信号，都用于计算装置特异性校准因子“a”和“b”。然后使用等式1将所述校准因子应用于实施例1.2的实验数据。
结果总结在表3和图6中，并且指示，例如与不使用装置特异性校准的结果相比，单个装置A至E之间的低变化性。
表3
Claims (11)
1.校准免疫测定装置和使用所述装置测量来自测量单元的样品信号的方法，所述装置适合用于通过使所述样品与选自相同测量单元的批次中的测量单元接触来确定样品中分析物的浓度，其中所述相同测量单元的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，
其中所述方法包括以下步骤：
a)提供来自所述相同测量单元的批次的一个或多个测量单元；
b)将测定缓冲液添加到所述一个或多个测量单元；
c)测量所述一个或多个测量单元中的每一个的第一信号；
d)洗涤所述一个或多个测量单元；
e)任选地干燥所述一个或多个测量单元；
f)测量所述一个或多个测量单元中的每一个的第二信号；以及
g)使用所述第一信号的一个或多个测量值和所述第二信号的一个或多个测量值来计算用于确定样品中分析物的所述浓度的一个或多个装置特异性校正因子。
2.权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个测量单元不含分析物。
3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述方法不包括使用具有已知浓度的所述分析物的含分析物样品。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品是体液，优选所述体液是全血、尿液、血浆或血清，特别地所述体液是全血或血浆。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分析物选自由NT-proBNP(脑利钠肽的N-末端激素原)、降钙素原(PCT)、BNP(脑利钠肽)、D-二聚体、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、β-hCG(人绒毛膜促性腺激素)、C-反应蛋白(CRP)、肌红蛋白和CK-MB(肌酐激酶-肌肉/脑)组成的组。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号是荧光信号。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号由所述装置的光电倍增管检测。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤b)包括在添加所述测定缓冲液之后的孵育步骤。
9.权利要求6所述的方法，其中所述荧光信号是时间分辨荧光信号。
10.确定样品中分析物的浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
i)根据权利要求1至9中任一项所述的方法使用来自相同测量单元的批次中的一个或多个测量单元来校准免疫测定装置，其中所述相同测量单元中的每一个都含有固定化于相应测量单元的内部表面上的捕获抗体和示踪物抗体，所述校准方法从而提供一个或多个装置特异性校正因子；
ii)提供含有所述分析物的样品；
iii)使所述样品与选自所述相同测量单元的批次中的测量单元接触；
iv)洗涤所述测量单元；
v)任选地干燥所述测量单元；
vi)使用所述免疫测定装置测量来自所述测量单元的样品信号；和
vii)根据所述样品信号和至少所述一个或多个装置特异性校正因子来计算所述分析物的浓度。
11.权利要求10所述的方法，其中计算所述分析物的浓度进一步包括一个或多个测量单元特定校正因子。
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