JP2595267B2 - 測光的評価を用いる物質の測定法 - Google Patents
測光的評価を用いる物質の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は分析用液体から調製された試料を測光的評価
により、好ましくはELISA法に従い分析用液体中の診断
上関連する物質特に抗体または抗原の存在を、着色し
た、酵素標識された抗原／抗体複合物を用いて測定する
場合に、ただ１個の試料の１回希釈物が調製されるのみ
であり、この分析用希釈物において抗原／抗体の結合反
応が開始され、ここで好ましくは一方の反応相手は固体
表面に固定されており、そして抗原／抗体複合物は酵素
により惹起される着色反応にかけられて着色した溶液が
調製され、そしてこの着色溶液について測定された吸光
度から、予め測定されている標準データを用いて最終希
釈物力価に相当する力価を測定する方法に関する。
により、好ましくはELISA法に従い分析用液体中の診断
上関連する物質特に抗体または抗原の存在を、着色し
た、酵素標識された抗原／抗体複合物を用いて測定する
場合に、ただ１個の試料の１回希釈物が調製されるのみ
であり、この分析用希釈物において抗原／抗体の結合反
応が開始され、ここで好ましくは一方の反応相手は固体
表面に固定されており、そして抗原／抗体複合物は酵素
により惹起される着色反応にかけられて着色した溶液が
調製され、そしてこの着色溶液について測定された吸光
度から、予め測定されている標準データを用いて最終希
釈物力価に相当する力価を測定する方法に関する。
本発明は診断上関連する物質の検出に、および操作工
程なしの定量に用いられ、その際ただ１つの試料混合物
で試料の検査に充分である。ここでの試験としては、酸
素結合イムノソルベントアツセイ（ELISA）、ラジオイ
ムノアツセイ（RIA）、核酸ハイブリツト形成、比濁法
またはその他の測定法が用いられうる。診断上関連する
物質は例えば抗原、種々の免疫グロブリンクラスの抗
体、核酸または医学的に重要な他の代謝生成物である。
程なしの定量に用いられ、その際ただ１つの試料混合物
で試料の検査に充分である。ここでの試験としては、酸
素結合イムノソルベントアツセイ（ELISA）、ラジオイ
ムノアツセイ（RIA）、核酸ハイブリツト形成、比濁法
またはその他の測定法が用いられうる。診断上関連する
物質は例えば抗原、種々の免疫グロブリンクラスの抗
体、核酸または医学的に重要な他の代謝生成物である。
診断上関連する物質の通常の定量法は２種の基本的な
原理に基づく。１つは測定すべき物質が既知含量の物質
を含有する試料を用いて予め作成された標準曲線により
定量されうる。代替法は終末点希釈を用い、測定すべき
物質を滴定することからなる。後者方法は、未希釈かま
たは少ししか希釈されてない試験すべき試料において前
記した標準曲線が作成困難であるかまたは不満足にしか
利用できない場合に常に好ましい。これは例えばELISA
法における分析特異的な抗体の測定の場合がそうであ
る。
原理に基づく。１つは測定すべき物質が既知含量の物質
を含有する試料を用いて予め作成された標準曲線により
定量されうる。代替法は終末点希釈を用い、測定すべき
物質を滴定することからなる。後者方法は、未希釈かま
たは少ししか希釈されてない試験すべき試料において前
記した標準曲線が作成困難であるかまたは不満足にしか
利用できない場合に常に好ましい。これは例えばELISA
法における分析特異的な抗体の測定の場合がそうであ
る。
この理由で本発明方法は好ましくは後者の場合にも用
いられそしてその実施形を後程詳細に説明する。診断上
関連する物質の例をあげれば、抗体でありそして前記し
た分析の例としてはELISA法が用いられる。従って、本
明細書に言う「特定の着色シグナル」は他の分析法と同
様に例えば放射性崩壊（カウント）または相対的な錯乱
光シグナルをも意味する。
いられそしてその実施形を後程詳細に説明する。診断上
関連する物質の例をあげれば、抗体でありそして前記し
た分析の例としてはELISA法が用いられる。従って、本
明細書に言う「特定の着色シグナル」は他の分析法と同
様に例えば放射性崩壊（カウント）または相対的な錯乱
光シグナルをも意味する。
ELISA法は寄生虫、細菌またはウイルスによる感染に
おける抗体または抗原の検出に用いられる知られた酵素
免疫分析法である。本発明は、例えば特定の分析用希釈
度における特定の抗体に関して分析すべき血清をミクロ
滴定プレートに固定された抗原と接触させることにより
形成される着色溶液の評価を改良するのに役立てられ、
場合により生成した抗体／抗原複合物は続いて酵素的に
検出される。特に本発明は、溶液中に形成された酵素標
識された色素形成性免疫複合物についての尺度である。
かくして調製された溶液の吸光度または光学濃度を測定
することによる、かかる溶液の測光的評価に関する。前
記したようにして形成された溶液の吸光度が所定の限界
値または閾値を越える場合は、大抵その血清は陽性と評
価される。この種の評価に関する論議は例えば「lmmun.
lnfekt.」９,33−39（1981）に記載されている。
おける抗体または抗原の検出に用いられる知られた酵素
免疫分析法である。本発明は、例えば特定の分析用希釈
度における特定の抗体に関して分析すべき血清をミクロ
滴定プレートに固定された抗原と接触させることにより
形成される着色溶液の評価を改良するのに役立てられ、
場合により生成した抗体／抗原複合物は続いて酵素的に
検出される。特に本発明は、溶液中に形成された酵素標
識された色素形成性免疫複合物についての尺度である。
かくして調製された溶液の吸光度または光学濃度を測定
することによる、かかる溶液の測光的評価に関する。前
記したようにして形成された溶液の吸光度が所定の限界
値または閾値を越える場合は、大抵その血清は陽性と評
価される。この種の評価に関する論議は例えば「lmmun.
lnfekt.」９,33−39（1981）に記載されている。
しかしながら、限界値を超過または下まわることの確
認のみならず、分析すべき血清中における抗体の存在に
関して定量的情報を取得しうることも望ましい。この目
的にいわゆる「連続希釈」を行う、すなわち種々の試料
希釈物に対してELISAを実施しそしてそれぞれ生成した
着色溶液の吸光度又は光学濃度を測定することも知られ
ている。個々の測光による測定値をグラフ中で関連させ
ることにより各血清試料につきいわゆる試料希釈物曲線
（第１図）が得られる。試料希釈物曲線が予め設けられ
た限界値を横切る試料希釈度が測定すべき抗体の最終希
釈度を示し、その際、この最終希釈度は抗体力価の逆数
である（最終希釈力価）。すなわち抗体の定量は検出限
界値に達している試料希釈度を表示することにより行わ
れる。
認のみならず、分析すべき血清中における抗体の存在に
関して定量的情報を取得しうることも望ましい。この目
的にいわゆる「連続希釈」を行う、すなわち種々の試料
希釈物に対してELISAを実施しそしてそれぞれ生成した
着色溶液の吸光度又は光学濃度を測定することも知られ
ている。個々の測光による測定値をグラフ中で関連させ
ることにより各血清試料につきいわゆる試料希釈物曲線
（第１図）が得られる。試料希釈物曲線が予め設けられ
た限界値を横切る試料希釈度が測定すべき抗体の最終希
釈度を示し、その際、この最終希釈度は抗体力価の逆数
である（最終希釈力価）。すなわち抗体の定量は検出限
界値に達している試料希釈度を表示することにより行わ
れる。
試料希釈物曲線の測定ポイントについては、しばし
ば、測定された吸光値または光学濃度が直接測定された
数値で用いられるのではなく、通常測定値補正が行われ
る。補正は、ELISA法で同時実施された適当な対照（緩
衝液、陰性血清）の測定値、またはミクロ滴定プレート
に固定された対照抗原を含有する測定すべき血清の平行
混合物の測定値、または着色生成速度を観察して出発時
の吸光度を差し引く形で行われうる。さらに、直接測定
された値を、同時実施された標準物から適当な方法で得
られる補正フアクターを乗ずるか、または直接測定され
た値を、同時実施された陰性試料についての値で割るこ
とにより得られる商または指数で表示することもでき
る。この補正された測定値は以下特定の着色シグナルと
呼ばれ最終希釈物力価についての表示の基礎をなしてい
る。
ば、測定された吸光値または光学濃度が直接測定された
数値で用いられるのではなく、通常測定値補正が行われ
る。補正は、ELISA法で同時実施された適当な対照（緩
衝液、陰性血清）の測定値、またはミクロ滴定プレート
に固定された対照抗原を含有する測定すべき血清の平行
混合物の測定値、または着色生成速度を観察して出発時
の吸光度を差し引く形で行われうる。さらに、直接測定
された値を、同時実施された標準物から適当な方法で得
られる補正フアクターを乗ずるか、または直接測定され
た値を、同時実施された陰性試料についての値で割るこ
とにより得られる商または指数で表示することもでき
る。この補正された測定値は以下特定の着色シグナルと
呼ばれ最終希釈物力価についての表示の基礎をなしてい
る。
前記した方法での定量的評価の本質的な欠点はその操
作が時間および試薬を消費することである。それゆえ、
唯一回の試料希釈でELISA法で測定された吸光度から血
清の最終希釈物力価を推論する試みがなされた。従って
例えば van Loon 及び van der Veen 氏により「J.Cli
n.Pathol.」33,635−639（1980）には、標準曲線と関連
させて、唯一回の血清希釈でELISA法を用い、トキソプ
ラズマ抗体の検出を行うことが記載されている。その場
合、血清希釈度1:800においてELISAで測定された吸光度
を、試料希釈度1:800における一連の血清で見出される
吸光度を最終希釈物力価の函数として示す標準曲線にお
ける同じ吸光度と比較する。その際この標準曲線は多数
の血清についての測定平均値をプロットすることにより
グラフに作成された。この方法の改良法は van Loon 氏
他により「J.Clin.Pathol.」34,665−669（1981）に記
載されており、それによれば、吸光値を陰性の対照血清
を1:800に希釈したものの吸光度を試料血清の吸光度か
ら差し引くことにより得られる特定の着色シグナルで置
換している。この方法により、実験的に測定された血清
が標準曲線から逸脱するのを少なくともいくつかの場合
において改良できた。しかしながらその他の場合には改
良はわずかであるので、陰性の対照血清との比較は不必
要であった。
作が時間および試薬を消費することである。それゆえ、
唯一回の試料希釈でELISA法で測定された吸光度から血
清の最終希釈物力価を推論する試みがなされた。従って
例えば van Loon 及び van der Veen 氏により「J.Cli
n.Pathol.」33,635−639（1980）には、標準曲線と関連
させて、唯一回の血清希釈でELISA法を用い、トキソプ
ラズマ抗体の検出を行うことが記載されている。その場
合、血清希釈度1:800においてELISAで測定された吸光度
を、試料希釈度1:800における一連の血清で見出される
吸光度を最終希釈物力価の函数として示す標準曲線にお
ける同じ吸光度と比較する。その際この標準曲線は多数
の血清についての測定平均値をプロットすることにより
グラフに作成された。この方法の改良法は van Loon 氏
他により「J.Clin.Pathol.」34,665−669（1981）に記
載されており、それによれば、吸光値を陰性の対照血清
を1:800に希釈したものの吸光度を試料血清の吸光度か
ら差し引くことにより得られる特定の着色シグナルで置
換している。この方法により、実験的に測定された血清
が標準曲線から逸脱するのを少なくともいくつかの場合
において改良できた。しかしながらその他の場合には改
良はわずかであるので、陰性の対照血清との比較は不必
要であった。
この知られた実施法により、実際上の使用にとっての
簡便化、すなわち１個の試料希釈物しか調製する必要が
ない方法が達成されたとしても、この方法は大きな欠点
を有する。この方法にとって適当で好ましい1:800なる
試料希釈度は非常に高いので、この方法の感度があまり
に低くなる（第１図の弱い陽性血清参照）のみならずピ
ペツト操作における誤差が増幅される。さらに、実施に
際し標準曲線を用いる操作は煩雑であるか、または測定
データを自動的に評価するにはコンピユータを必要とす
る。
簡便化、すなわち１個の試料希釈物しか調製する必要が
ない方法が達成されたとしても、この方法は大きな欠点
を有する。この方法にとって適当で好ましい1:800なる
試料希釈度は非常に高いので、この方法の感度があまり
に低くなる（第１図の弱い陽性血清参照）のみならずピ
ペツト操作における誤差が増幅される。さらに、実施に
際し標準曲線を用いる操作は煩雑であるか、または測定
データを自動的に評価するにはコンピユータを必要とす
る。
本発明の目的は、検査すべき試料をできるだけわずか
しか希釈せずに使用でき、そして力価の測定が簡単な方
法、例えばポケツト計算器を用いて行われうる、例えば
ELISA法における抗体また抗原の定量的測定法を提供す
ることである。
しか希釈せずに使用でき、そして力価の測定が簡単な方
法、例えばポケツト計算器を用いて行われうる、例えば
ELISA法における抗体また抗原の定量的測定法を提供す
ることである。
その他、本発明による方法の適用領域も記載する。
この目的は前記した種類の方法に従い、着色溶液の吸
光度（または光学濃度）を測定しそして得られたシグナ
ルAODから下記式 に従って力価を計算し、これを連続希釈により得られる
最終希釈物力価と同等とみなすことにより達成された。
ここで式（１）において力価は、シグナルAODが陰性の
対照試料に比較した検出限界での限界値シグナルに相当
する場合の最終希釈度の逆数であり、そして固定された
試験希釈度におけるα値およびβ値は、免疫学的に反応
性を有する表面と検出体としての酵素標識免疫グロブリ
ンまたは抗原とのそれぞれの組み合わせに関し同一の反
応条件および固定条件下に被分析物の既知最終希釈物力
価を有する試料について一連の試験により別々に実験的
に測定される。
光度（または光学濃度）を測定しそして得られたシグナ
ルAODから下記式 に従って力価を計算し、これを連続希釈により得られる
最終希釈物力価と同等とみなすことにより達成された。
ここで式（１）において力価は、シグナルAODが陰性の
対照試料に比較した検出限界での限界値シグナルに相当
する場合の最終希釈度の逆数であり、そして固定された
試験希釈度におけるα値およびβ値は、免疫学的に反応
性を有する表面と検出体としての酵素標識免疫グロブリ
ンまたは抗原とのそれぞれの組み合わせに関し同一の反
応条件および固定条件下に被分析物の既知最終希釈物力
価を有する試料について一連の試験により別々に実験的
に測定される。
この方法における吸光のシグナルAODとしては前記定
義された特定の着色シグナルが式（１）に挿入されるの
が好ましい。
義された特定の着色シグナルが式（１）に挿入されるの
が好ましい。
分析用希釈物として未希釈から1:800までの試料希釈
度が使用でき、1:150のみの範囲が好ましい。後者の場
合試料希釈度がなお充分に低いので、高感度の免疫検定
法が保証され、他方では1:150の試料希釈度で比較的容
易に再現されうる結果が得られうることが実験で示され
た。
度が使用でき、1:150のみの範囲が好ましい。後者の場
合試料希釈度がなお充分に低いので、高感度の免疫検定
法が保証され、他方では1:150の試料希釈度で比較的容
易に再現されうる結果が得られうることが実験で示され
た。
比較的低い試料希釈度も可能であるが、しかし免疫学
的に反応性を有する表面、例えば抗原で被覆されたミク
ロ滴定プレートにおいてのみならず、接合体においても
高い反応性と結びついた高い純度を必要とする。
的に反応性を有する表面、例えば抗原で被覆されたミク
ロ滴定プレートにおいてのみならず、接合体においても
高い反応性と結びついた高い純度を必要とする。
α値について使用しうる範囲は3.0〜3.6でありそして
β値については0.10〜0.27であることが判明した。
β値については0.10〜0.27であることが判明した。
これらの値αおよびβを正確に測定することが本発明
方法を実地に好ましく使用するための土台をなすもので
ある。αおよびβについての最適な値が一旦見出された
らすぐに、評価、すなわち分析用試料の力価測定が非常
に簡単に計算により行われうる。αおよびβについての
値は例えば、その血清にそれぞれ特定の着色シグナルを
所望の試料希釈度で測定しそしてさらに力価をそれ自体
知られた方法で終末点希釈により測定することにより、
多数の調査試料についての一連の試験に基づき試薬製造
者により判定されうる。各試料について得られた対の値
からそれを反復して適合させることにより終末点希釈に
より測定された力価（Tmeas）と、特定の着色シグナル
を挿入することにより式（１）から計算される力価（T
calc）との間の一致が最適なものとなるのに適当なα値
およびβ値が求められる。かかる反復操作においては、
例えばはじめに任意にとられたαおよびβについての数
値を用いて、各試料の特定の着色シグナルから式（１）
によりそれに該当する力価Tcalcを計算する。加えて終
末点希釈により力価Tmeasを測定する。
方法を実地に好ましく使用するための土台をなすもので
ある。αおよびβについての最適な値が一旦見出された
らすぐに、評価、すなわち分析用試料の力価測定が非常
に簡単に計算により行われうる。αおよびβについての
値は例えば、その血清にそれぞれ特定の着色シグナルを
所望の試料希釈度で測定しそしてさらに力価をそれ自体
知られた方法で終末点希釈により測定することにより、
多数の調査試料についての一連の試験に基づき試薬製造
者により判定されうる。各試料について得られた対の値
からそれを反復して適合させることにより終末点希釈に
より測定された力価（Tmeas）と、特定の着色シグナル
を挿入することにより式（１）から計算される力価（T
calc）との間の一致が最適なものとなるのに適当なα値
およびβ値が求められる。かかる反復操作においては、
例えばはじめに任意にとられたαおよびβについての数
値を用いて、各試料の特定の着色シグナルから式（１）
によりそれに該当する力価Tcalcを計算する。加えて終
末点希釈により力価Tmeasを測定する。
商Tmeas/Tcalc＝1.0である場合は、このことは試料希
釈物における吸光測定から正しい力価が導かれることを
意味する。現実的な条件の下では0.8〜1.25の間にある
商は「正確な力価」と見なされねばならない。0.5以下
および2.0以上の商は、古典的な滴定に許容される再現
性限界値をこえていることを意味する。
釈物における吸光測定から正しい力価が導かれることを
意味する。現実的な条件の下では0.8〜1.25の間にある
商は「正確な力価」と見なされねばならない。0.5以下
および2.0以上の商は、古典的な滴定に許容される再現
性限界値をこえていることを意味する。
通常なお劣る計算上の力価予測が得られる第１回目の
試験後に、αおよびβが段階的に変えられ、然るのち再
び各血清試料について計算された力価を測定された力価
と比較する。この反復操作をその満足できる一致が得ら
れるまで続ける。
試験後に、αおよびβが段階的に変えられ、然るのち再
び各血清試料について計算された力価を測定された力価
と比較する。この反復操作をその満足できる一致が得ら
れるまで続ける。
この試験では、一連の試験で血清の約50％が 0.8≦Tmeas/Tcalc≦1.25 （２） にあてはまる場合に最適となると考えられうることが示
される。これは指示薬酵素としてアルカリフオスフアク
ターゼを用いる一連の分析での経験に基づくものであ
る。ペルオキシダーゼが指示薬酵素として用いられうる
場合は、「打率」は約65％まで高められうる。しかしな
がらこれらの限界はELISA法それ自身の変動の範囲内の
もので、従って測定結果を定量的に評価するための本発
明による操作はこれを超えることができない。
される。これは指示薬酵素としてアルカリフオスフアク
ターゼを用いる一連の分析での経験に基づくものであ
る。ペルオキシダーゼが指示薬酵素として用いられうる
場合は、「打率」は約65％まで高められうる。しかしな
がらこれらの限界はELISA法それ自身の変動の範囲内の
もので、従って測定結果を定量的に評価するための本発
明による操作はこれを超えることができない。
さらに、αおよびβの値は診断用テストの性質にのみ
ならず、用いられた、免疫学的に反応性を有する固相お
よび接合体の製造バツチの如何によることが示された。
従ってこれら２種の定数はこの方法を実際に用いるに
は、例えばテストプレートおよび接合体のバツチの各組
合わせについて新たに測定されねばならないが、満足で
きる再現性を以っておよび実施に際しての非常に良好な
正確さを以って連続測定による試料の検査が行われう
る。
ならず、用いられた、免疫学的に反応性を有する固相お
よび接合体の製造バツチの如何によることが示された。
従ってこれら２種の定数はこの方法を実際に用いるに
は、例えばテストプレートおよび接合体のバツチの各組
合わせについて新たに測定されねばならないが、満足で
きる再現性を以っておよび実施に際しての非常に良好な
正確さを以って連続測定による試料の検査が行われう
る。
以下の実施例および測定結果により本発明をより詳細
に説明する。その場合添付図面をも参照する。
に説明する。その場合添付図面をも参照する。
図面において、 第１図は特定の着色シグナルを試料希釈度の函数とし
て示すものである、試料希釈曲線の形態をした従来法に
より実施された連続希釈を示し、 第２図は試料希釈度1:150における特定の着色シグナ
ルの、実際の、最後希釈により測定された力価
（Tmeas）への依存性を示し、 第３図は第２図におけると同じ試薬での、試料希釈度
1:150における特定の着色シグナルへの式（１）により
計算された力価（Tcalc）の依存性を示し、そして 第４図は1:150に希釈された調査試料の同じ特定の着
色シグナルにおける、第３図からの計算力価Tcalcに比
較した第２図からの測定力価Tmeasを示す。
て示すものである、試料希釈曲線の形態をした従来法に
より実施された連続希釈を示し、 第２図は試料希釈度1:150における特定の着色シグナ
ルの、実際の、最後希釈により測定された力価
（Tmeas）への依存性を示し、 第３図は第２図におけると同じ試薬での、試料希釈度
1:150における特定の着色シグナルへの式（１）により
計算された力価（Tcalc）の依存性を示し、そして 第４図は1:150に希釈された調査試料の同じ特定の着
色シグナルにおける、第３図からの計算力価Tcalcに比
較した第２図からの測定力価Tmeasを示す。
本発明による方法を試験するために、サイトメガロウ
イルス抗原がその壁に固定されているミクロ滴定プレー
トを用いる血清中のサイトメガロウイルスに対する抗体
を測定する試験、および風疹抗原がその壁に固定されて
いるミクロ滴定プレートを用いる血清中の風疹に対する
抗体を測定する試験を行った。試料希釈度1:150の検査
用試料を固定された抗原と反応させ、結合しなかった抗
体を洗い去り、形成された抗体／抗原複合物にコンジユ
ゲート溶液を用いて酵素を結合させ、過剰のコンジユゲ
ート溶液を洗い去り、色原体基質溶液を用いて酵素を介
して着色させ、そして次に停止溶液を用いて反応を終了
させた。ウイルス特異的な抗体の含量に応じて着色し
た、かくして調製された試料を、その光学濃度または吸
光率AODを測光的に（所定の波長で）測定することによ
り評価した。
イルス抗原がその壁に固定されているミクロ滴定プレー
トを用いる血清中のサイトメガロウイルスに対する抗体
を測定する試験、および風疹抗原がその壁に固定されて
いるミクロ滴定プレートを用いる血清中の風疹に対する
抗体を測定する試験を行った。試料希釈度1:150の検査
用試料を固定された抗原と反応させ、結合しなかった抗
体を洗い去り、形成された抗体／抗原複合物にコンジユ
ゲート溶液を用いて酵素を結合させ、過剰のコンジユゲ
ート溶液を洗い去り、色原体基質溶液を用いて酵素を介
して着色させ、そして次に停止溶液を用いて反応を終了
させた。ウイルス特異的な抗体の含量に応じて着色し
た、かくして調製された試料を、その光学濃度または吸
光率AODを測光的に（所定の波長で）測定することによ
り評価した。
連続希釈においては、同じ試料についての最終希釈力
価Tmeasを知られた方法で測定しそして本発明の式
（１）により計算された力価Tcalcと比較した。
価Tmeasを知られた方法で測定しそして本発明の式
（１）により計算された力価Tcalcと比較した。
この方法の再現性および精度を改良するために、すべ
ての場合において比吸光率または「特定の着色シグナル
AOD」を使用した。
ての場合において比吸光率または「特定の着色シグナル
AOD」を使用した。
第１図は３種の陽性血清Ａ、ＢおよびＣ、および１種
の陰性血清Ｄについての種々の試料希釈度（試料希釈度
-1）の函数としての特定の着色シグナルAODの曲線を示
す。比較的高い試料希釈度、例えば1:800においてのみ
例示されたプロツトは平行である。van Loon 氏による
適当な標準曲線の作成はこれに基づいている。
の陰性血清Ｄについての種々の試料希釈度（試料希釈度
-1）の函数としての特定の着色シグナルAODの曲線を示
す。比較的高い試料希釈度、例えば1:800においてのみ
例示されたプロツトは平行である。van Loon 氏による
適当な標準曲線の作成はこれに基づいている。
抗体力価が高い血清（例Ａ）における試料希釈曲線の
下方への折れは文献上知られたプロゾーン効果を示す
が、最終希釈力価付近での下方の領域において何故希釈
物曲線がゆるやかになるかは全く不明である。
下方への折れは文献上知られたプロゾーン効果を示す
が、最終希釈力価付近での下方の領域において何故希釈
物曲線がゆるやかになるかは全く不明である。
今、巾広い種類の試料に関する連続希釈により測定さ
れる最終希釈力価が以下に示すように、例えば1:150の
試料希釈度で測定された吸光度と関連を表わすことが見
出された。
れる最終希釈力価が以下に示すように、例えば1:150の
試料希釈度で測定された吸光度と関連を表わすことが見
出された。
ここで定数αおよびβは試料条件および試験条件に適合
されうる。
されうる。
この事実は第２〜４図から明らかである。第２図では
希釈度1:150の血清58件の特定の着色シグナルAODの依存
性が最終希釈により測定された力価Tmeasの函数として
プロツトされている。他方第３図はαおよびβについて
の最適値における吸光度AODから式（１）に従い計算さ
れた力価を示す。この曲線の散乱度が小さいことは数学
的構成から生ずる。
希釈度1:150の血清58件の特定の着色シグナルAODの依存
性が最終希釈により測定された力価Tmeasの函数として
プロツトされている。他方第３図はαおよびβについて
の最適値における吸光度AODから式（１）に従い計算さ
れた力価を示す。この曲線の散乱度が小さいことは数学
的構成から生ずる。
第４図は、式（１）に従い計算された力価の曲線が測
定値のすぐれた平均値であることを今や明らかに示して
いる。このことから従って、本発明方法を用いて最終希
釈物力価の最適な予測が得られることが明らかである。
定値のすぐれた平均値であることを今や明らかに示して
いる。このことから従って、本発明方法を用いて最終希
釈物力価の最適な予測が得られることが明らかである。
しかしながら、TcalcとTmeasとの間のこの良好な一致
は、αおよびβ値について慎重に測定された場合にのみ
得られる。
は、αおよびβ値について慎重に測定された場合にのみ
得られる。
60件の血清について行われた一連の試験から測定およ
び計算により得られた下記の表に示されるデータに基づ
き、αおよびβの測定法および最適化操作の例を説明す
る。
び計算により得られた下記の表に示されるデータに基づ
き、αおよびβの測定法および最適化操作の例を説明す
る。
表の第１欄には60件の血清について試料希釈度1:150
における試料の特定の着色シグナルの測定値が示され
る。第２欄には、同じ血清についての最終希釈系列物に
より測定された力価Tmeasが示される。第３欄には最適
化により見出された値α＝3.4514およびβ＝0.2106を用
い第１欄の着色シグナルから式（１）従ってそれぞれ計
算された同じ血清についての力価Tcalcが示される。
における試料の特定の着色シグナルの測定値が示され
る。第２欄には、同じ血清についての最終希釈系列物に
より測定された力価Tmeasが示される。第３欄には最適
化により見出された値α＝3.4514およびβ＝0.2106を用
い第１欄の着色シグナルから式（１）従ってそれぞれ計
算された同じ血清についての力価Tcalcが示される。
現代の利用しうる計算器を用いれば、特定の試薬組み
合わせについてのαおよびβの最適化する反復操作を当
業者がプログラムに作成するのに何ら大きな骨折りを要
しない。
合わせについてのαおよびβの最適化する反復操作を当
業者がプログラムに作成するのに何ら大きな骨折りを要
しない。
商Tmeas/Tcalcを次の欄に示し、しかも「過小」（0.8
より下）、「約１」（0.8〜1.25）および「過大」（1.2
5より上）に従い分けられる。
より下）、「約１」（0.8〜1.25）および「過大」（1.2
5より上）に従い分けられる。
ここに示される場合においては、血清の45％について
良好な近似が得られたことが判る。それゆえ第２図から
判る最終希釈物力価の散乱巾を考慮すると、αおよびβ
値の選択が実際上の使用にとって非常に満足できるもの
と見なされうる。
良好な近似が得られたことが判る。それゆえ第２図から
判る最終希釈物力価の散乱巾を考慮すると、αおよびβ
値の選択が実際上の使用にとって非常に満足できるもの
と見なされうる。
第１図は特定の着色シグナルを試料希釈度の函数として
示すものである、試料希釈曲線の形態をした従来法によ
り実施された連続希釈を示し、 第２図は試料希釈度1:150における特定の着色シグナル
の、実際の、最終希釈により測定された力価（Tmeas）
への依存性を示し、 第３図は第２図におけると同じ試薬での、試料希釈度1:
150における特定の着色シグナルへの、式（１）により
計算された力価（Tcalc）の依存性を示し、そして 第４図は1:150に希釈された調査試料の同じ特定の調査
シグナルにおける、第３図からの計算力価Tcalcに比較
した第２図からの測定力価Tmeasを示す。
示すものである、試料希釈曲線の形態をした従来法によ
り実施された連続希釈を示し、 第２図は試料希釈度1:150における特定の着色シグナル
の、実際の、最終希釈により測定された力価（Tmeas）
への依存性を示し、 第３図は第２図におけると同じ試薬での、試料希釈度1:
150における特定の着色シグナルへの、式（１）により
計算された力価（Tcalc）の依存性を示し、そして 第４図は1:150に希釈された調査試料の同じ特定の調査
シグナルにおける、第３図からの計算力価Tcalcに比較
した第２図からの測定力価Tmeasを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ
Claims (8)
- 【請求項１】分析用液体から調製された試料を測光的評
価により、好ましくはELISA法に従い分析用液体中の診
断上関連する物質特に抗体または抗原の存在を、着色し
た、酵素標識された抗原／抗体複合物を用いて測定する
場合に、ただ１個の試料の１回希釈物が調製されるのみ
であり、この分析用希釈物において抗原／抗体の結合反
応が開始され、ここで好ましくは一方の反応相手は固体
表面に固定されており、そして抗原／抗体複合物は酵素
により惹起される着色反応にかけられて着色した溶液が
調製され、そしてこの着色溶液について測定された吸光
度から、予め測定されている標準データを用いて最終希
釈物力価に対応する力価を測定する方法であって、その
特徴とするところは着色溶液の吸光度（または光学濃
度）を測定しそして得られたシグナルAODから下記式 に従って力価を計算し、これを連続希釈により得られる
最終希釈物力価と同等とみなすところにあり、ここで上
式（１）において力価は、シグナルAODが陰性の対照試
料に比較した検出限界での限界値シグナルに相当する場
合の最終希釈度の逆数であり、そして固定された試験希
釈度におけるα値およびβ値は、免疫学的に反応性を有
する表面と検出体としての酵素標識された免疫グロブリ
ンまたは抗原とのそれぞれの組み合わせに関し同一の反
応条件および固定条件下に被分析物の既知最終希釈物力
価を有する試料についての一連の試験により別々に実験
的に測定されたものである上記測定方法。 - 【請求項２】吸光度または光学濃度のシグナルAODとし
て、 ａ）ELISA法で同時実施された対照（例えば緩衝液また
は陰性試料）についての吸光シグナル、または対照標本
で被覆された表面上の検査すべき試料の平行混合物につ
いての吸光シグナル、または着色増大についての測定開
始時の吸光シグナルを検査すべき試料の吸光シグナルか
ら差し引くことによるか、 ｂ）検査すべき試料の吸光シグナルに同時実施された対
照試験（例えば標準物）から得られる補正フアクターを
乗ずることによるか、または ｃ）検出すべき試料の吸光シグナルおよび同時実施され
た対照実験（例えば陰性試料）から商または指数を形成
させることにより、得られる特定の着色シグナルを前記
式（１）に挿入することを特徴とする、特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - 【請求項３】分析用の希釈物として未希釈から1:800ま
で、好ましくは約1:150の範囲の試料希釈物を用いるこ
とを特徴とする、特許請求の範囲第１項または第２項記
載の方法。 - 【請求項４】αについて用いられる値が3.0〜3.6であり
そしてβ値は0.10〜0.27であることを特徴とする、特許
請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】試料について所望の分析用希釈度において
それぞれシグナルAODを測定し、さらに力価をそれ自体
知られた方法で終末点希釈により測定し、そして次に個
々の分析用液体または試料について得られた測定値の対
（力価、AOD）から、反復して適合させることにより終
末点希釈により測定された力価（Tmeas）と、式（１）
にシグナルAODを挿入することにより計算される力価（T
calc）との間の一致を最適なものとなすのに適当なα値
およびβ値を求めることにより、多数の分析用液体また
は試料についての一連の試験によりα値およびβ値を測
定することを特徴とする、特許請求の範囲第１〜３項の
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】個々の分析用液体または試料についてのそ
れぞれの商Tmeas/Tcalcが最もしばしば0.8〜1.25の範囲
内にあるα値およびβ値の対を反復して調べることによ
り決定することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載
の方法。 - 【請求項７】風疹抗原、サイトメガロウイルス抗原また
はＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）に対する抗体がそれぞれ
固定されたミクロ滴定プレートを用いる、血清中におけ
る風疹（IgG、IgM）抗体、サイトメガロウイルス（Ig
G、IgM）抗体またはHBsAgの存在を測定するための特許
請求の範囲第１〜６項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】アルカリホスフアターゼまたはペルオキシ
ダーゼを指示酵素として用いることを特徴とする特許請
求の範囲第７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3636271 | 1986-10-24 | ||
| DE3639279A DE3639279C3 (de) | 1986-10-24 | 1986-11-17 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
| DE3639279.0 | 1986-11-17 | ||
| DE3636271.9 | 1986-11-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63115060A JPS63115060A (ja) | 1988-05-19 |
| JP2595267B2 true JP2595267B2 (ja) | 1997-04-02 |
Family
ID=25848767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62266667A Expired - Lifetime JP2595267B2 (ja) | 1986-10-24 | 1987-10-23 | 測光的評価を用いる物質の測定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0264866A3 (ja) |
| JP (1) | JP2595267B2 (ja) |
| AU (1) | AU602170B2 (ja) |
| MX (1) | MX168603B (ja) |
| NO (1) | NO170908C (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3718140A1 (de) * | 1987-05-29 | 1988-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Heterogener immunoassay |
| DE3842580A1 (de) * | 1988-12-17 | 1990-06-21 | Behringwerke Ag | Verfahren zur verbesserung von richtigkeit und reproduzierbarkeit der messdaten immunometrischer tests |
| DE3911361A1 (de) * | 1989-04-07 | 1990-10-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von antikoerpern gegen erreger von infektionskrankheiten in koerperfluessigkeiten, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3122305A1 (de) * | 1981-06-05 | 1983-01-05 | Vladimir Florin 3004 Isernhagen Niculescu | "immunologisch-diagnostisches verfahren zum nachweis und zur bestimmung von antikoerpern" |
| JPS58113758A (ja) * | 1981-12-26 | 1983-07-06 | Shimadzu Corp | 免疫グロブリンの分析方法 |
| JPS58211659A (ja) * | 1982-06-03 | 1983-12-09 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法による血清ｃｒｐの簡易迅速定量法 |
| JPS6276464A (ja) * | 1985-09-30 | 1987-04-08 | Shimadzu Corp | 多項目自動分析装置 |
-
1987
- 1987-10-17 EP EP19870115218 patent/EP0264866A3/de not_active Withdrawn
- 1987-10-22 NO NO874405A patent/NO170908C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-10-23 AU AU80084/87A patent/AU602170B2/en not_active Ceased
- 1987-10-23 JP JP62266667A patent/JP2595267B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-23 MX MX896487A patent/MX168603B/es unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3122305A1 (de) * | 1981-06-05 | 1983-01-05 | Vladimir Florin 3004 Isernhagen Niculescu | "immunologisch-diagnostisches verfahren zum nachweis und zur bestimmung von antikoerpern" |
| JPS58113758A (ja) * | 1981-12-26 | 1983-07-06 | Shimadzu Corp | 免疫グロブリンの分析方法 |
| JPS58211659A (ja) * | 1982-06-03 | 1983-12-09 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法による血清ｃｒｐの簡易迅速定量法 |
| JPS6276464A (ja) * | 1985-09-30 | 1987-04-08 | Shimadzu Corp | 多項目自動分析装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO874405L (no) | 1988-04-25 |
| NO170908C (no) | 1992-12-23 |
| NO170908B (no) | 1992-09-14 |
| JPS63115060A (ja) | 1988-05-19 |
| NO874405D0 (no) | 1987-10-22 |
| AU8008487A (en) | 1988-04-28 |
| AU602170B2 (en) | 1990-10-04 |
| EP0264866A2 (de) | 1988-04-27 |
| EP0264866A3 (de) | 1990-12-27 |
| MX168603B (es) | 1993-06-01 |
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