KR102659358B1 - 유리 항원을 이용한 면역 검정법에서의 후크 효과 감지 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용하여 면역검정법의 성능 및 진단 정확성이 향상된 후크 효과 감지 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유리 항원을 이용하여 면역 검정법의 성능 및 진단 정확성 향상을 위한 후크 효과를 감지하는 방법에 관한 것이다.
면역 검정법(immunoassay)은 분석하고자 하는 샘플에서 특정 물질을 확인하고 측정하기 위해 항원-항체 간의 특이적 결합에 기반한 면역 검사 방법으로서, 과도한 항원 또는 항체로 인하여 발생하는 후크 효과(Hook effect)에 의해 영향을 받는다.
상기 후크 효과(Hook effect)는 여러 면역학적 및 혈청학적 분석법에 널리 공지되어 있는 일반적인 현상이고, 임상 실험실에서 빈번하게 발생하는 문제로서, 이를 감지하는데는 많은 어려움이 있다. 특히, 면역 검정에서 후크 효과는 위음성(false negative)의 원인이 되어 정확한 진단 및 치료의 방해가 되므로, 의학적 측면에서 심각한 문제를 야기할 수 있다. 따라서, 샘플에 대한 면역 검정에서 후크 효과를 방지하고 유효한 결과를 얻기 위하여 검사하고자 하는 단일 샘플에 대한 다수의 검정이 수행될 필요가 있다.
이러한 문제를 극복하기 위하여, 일부 연구에서는 면역 검정법 중 하나인 측방유동면역분석법(lateral flow immunoassays, LFIAs)에서 성분의 방출을 지연시키거나(delayed-release components), 대조선(control line)을 사용하는 방법, 또는 스파이크 샘플(spiking sample)을 사용하는 방법을 통해 후크 효과를 감소시키고자 하였다. 그러나, 성분의 방출을 지연시키는 방법은 오직 측방유동면역분석법(LFIAs)에만 적용가능하고, 중간 패드(intermediate pad), 접합 패드(conjugation pad) 및 별도의 멤브레인과 같은 부가적인 재료들을 필요로 하며, 및 대조선을 이용하는 방법 또한 측방유동면역분석법(LFIAs)에 국한되어 있고, 다른 종류의 추가적인 항체의 사용을 필요로 한다. 또한, 스파이크 샘플(spiking sample)를 사용하는 방법은 반응 시간에 따른 성능 편차가 고려되어야 하고, 더욱이, 대조선 및 스파이크 샘플을 이용하는 방법은 임상적 검증의 성능 및 후크 효과의 검출 범위를 개선하기 위한 추가적인 연구가 필요한 실정이다.
특히, 면역 검정법은 체외진단 의료기기(in vitro diagnostics, IVD)에 적용하여 현장 진료(Point-of-care, POC)에 많이 이용되는데, 후크 효과로 공지된 간섭 현상으로 인해 의료 진단 분야에 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰된다. 이러한 후크 효과를 방지하여 유효한 결과를 얻고자 이전 연구들을 현장 진료에 적용하였고, 현재 주로 상업화된 IVD 제품에는 시약 완충액(reagent buffer)을 이용하여 샘플을 희석하는 방법이 이용되고 있다. 이는 분석하고자 하는 샘플에 대한 후크 효과를 감지하기 위하여 희석된 샘플 및 희석되지 않은 샘플을 사용하여 두 가지 검사를 수행함으로써 이루어지나, 상기 방법은 막대한 시간과 노력을 필요로 하고, 및 분석에 사용되는 시약의 비용적 측면에서도 문제를 발생시킨다. 또한, 분석 샘플 이외의 별도의 샘플을 준비해야 하는 불편함이 있을 뿐 아니라, 처리과정 중 오류가 발생할 수 있어 오히려 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 근본적인 해결책으로 보기는 힘들다
그러므로, 면역 검정법에서의 진단 정확성에 심각한 문제를 초래하는 후크 효과를 미연에 감지하여 유효한 결과를 얻을 수 있도록 임상 실험실에서뿐 아니라, 상업적 측면의 직접적인 현장 진료에도 효과적으로 적용할 수 있는 더 나은 후크 효과 감지 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명자들은 면역 검정법에서의 진단 정확성에 심각한 문제를 초래하는 후크 효과를 미연에 감지하고자 임상 실험실에서뿐 아니라, 상업적 측면의 직접적인 현장 진료에도 효과적으로 적용할 수 있는 후크 효과 감지 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유리 물질을 이용하여 면역 검정법에서의 후크 효과 감지 방법을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용하여 면역 검정법에서 효과적으로 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 별도의 물질을 추가하지 않고 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 별도의 시료를 희석하는 과정 없이 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.
결과적으로, 본 발명의 목적은 임상 실험실에서뿐 아니라, 직접적인 현장 진료에 있어서 후크 효과를 미연에 감지하여 진단 정확성을 높이는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 면역 검정법에서 효과적으로 후크 효과를 감지하기 위한 후크 효과 감지 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 목표 검출물질과 동일한 유리 물질을 이용하여 미연에 후크 효과를 감지하여 면역 검정법의 진단 정확성의 향상을 규명하였다.
본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하여 후크 효과 유무를 감지할 수 있는 면역 검정법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 후크 효과(Hook effect) 유무를 감지가능한 면역검정법(immunoassay)에 있어서, 상기 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는, 면역검정법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 다음 단계를 포함한다:
i) 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하는 단계;
ii) 면역검정에 필요한 시약을 검출 용기에 첨가하는 단계; 및
iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계.
본 명세서의 용어, "면역검정법(immunoassay)"은 항원-항체반응에 의한 응집반응 및 효소반응에 대해 탁도나 흡광도와 같은 광학적 성질의 변화에 기초하여 분석하고자 하는 시료 내 항원 또는 항체를 검출 또는 정량하는 방법을 의미한다.
본 명세서의 용어, "검출 용기"는 분석의 대상이 되는 목표 검출물질의 검출 및 정량을 위한 면역검정법을 수행할 수 있는 용기를 의미하며, 샘플의 양 및 사용하는 검출분석기기에 따라 6웰 플레이트, 12웰 플레이트, 24웰 플레이트, 48웰 플레이트, 96웰 플레이트, 또는 192웰 플레이트 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어, "유리 물질"은 면역검정법의 목표 검출물질과 동일한 종류의 물질이나 검출대상 샘플에 들어있지 않고, 본 발명의 실시자가 검출 용기 내 추가로 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 먼저 첨가되는 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)은 항원, 항체, 핵산, 화합물, 펩타이드, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유리 물질은 일반적인 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 첨가되고, 이러한 첨가과정을 스파이킹이라고 표현하기도 한다.
상기 유리 물질의 농도는 수행하는 면역검정법의 종류, 샘플 희석 배수, 및 항체 농도 등 다양한 요소에 따라 후크 효과 발생 여부가 달라질 수 있으므로, 이러한 요소들에 따라 최적화할 수 있다.
또한, 상기 유리 물질의 농도는 구체적으로 후크 효과가 발생되는 표적물질의 농도를 상기 유리 물질의 농도로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로 면역검정법에 의한 샘플 내 표적물질의 검출 또는 정량은 목표 검출물질에 대한 반응을 수행한 후, 1회 측정함으로써 수행된다.
반면, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 상기 iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계에서 소정의 시간 간격을 두고 1차 측정 및 2차 측정을 수행한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 소정의 시간 간격은 10초 내지 300초, 10초 내지 10분, 10초 내지 20분, 10초 내지 30분, 30초 내지 300초, 30초 내지 10분, 30초 내지 20분, 30초 내지 30분, 60초 내지 300초, 60초 내지 10분, 60초 내지 20분, 60초 내지 30분, 90초 내지 300초, 90초 내지 10분, 90초 내지 20분, 90초 내지 30분, 120초 내지 5분, 120초 내지 10분, 120초 내지 20분, 120초 내지 30분, 150초 내지 300초, 150초 내지 10분, 150초 내지 20분 또는 150초 내지 30분 또는 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어, "후크 효과(Hook effect)"는 면역검정에 있어서 분석하고자 하는 샘플 내 높은 목표 검출물질의 농도가 실제로 목표 검출물질에 대한 검정 반응 신호에서의 감소를 유발하여 "후크" 형태의 농도가 감소하는 양상을 관찰할 수 있고, 이로써 위음성의 결과를 발생시키는 효과를 의미한다.
본 명세서의 용어, "위음성(false negative)"은 검사하고자 하는 샘플 내 목표 검출물질이 포함되어 있음에도 불구하고, 면역검정법에 있어서 양성을 나타내는 신호가 발생하지 않는 것을 의미한다. 이와 같이, 후크 효과로 유발되는 위음성은 의학적 진단에 심각한 문제를 야기할 수 있기에 후크 효과 유무의 판단은 매우 중요하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 후크 효과 유무의 판단은 상기 1차 측정값(W1) 및 2차 측정값(W2)을 구하여 도출한 측정값의 비(W1/W2)가 소정의 후크 효과 감지 기준보다 크거나 같을 경우 검출 대상 샘플에 검출가능 범위를 초과하는 후크 효과가 있는 것으로 판정하고, 측정값의 비(W1/W2)가 후크 효과 감지 기준보다 작은 경우 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정함으로써 이루어진다.
상기 후크 효과 감지 기준은 서로 다른 농도를 가진 검출 대상 물질을 포함하는 복수개의 검출 대상 샘플에서 목표 검출물질을 측정하였을 때 목표 검출물질에 대한 측정값의 비(W1/W2)가 수렴하는 값을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 목표 검출물질에 대한 측정값의 비(W1/W2)가 수렴하는 값은, 검출 대상 물질의 농도별 측정값의 비(W1/W2)에 관한 그래프를 도시하는 경우의 점근선의 값의 ±10% 이내의 값에서 선택된다. 보다 구체적으로는 상기 점근선의 값의 ±10% 이내의 값, 점근선의 값의 ±5% 이내의 값, 점근선의 값의 ±3% 이내의 값, 점근선의 값의 ±2% 이내의 값, 또는 점근선의 값의 ±1% 이내의 값에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 면역검정법이 ELISA이고 검출대상 물질의 검출을 위한 측정 수단이 흡광도인 경우, 기질을 첨가한 후, 1차 흡광도(W1) 및 2차 흡광도(W2)를 측정하고 흡광도의 비(W1/W2)를 산출하여 후크 효과 감지 기준을 설정하며, 상기 후크 효과 감지 기준을 이용하여 표적 물질의 정량분석에서 후크 효과를 감지할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 면역검정법이 ELISA이고 검출대상 물질의 검출을 위한 측정 수단이 흡광도인 경우, 상기 측정 샘플의 흡광도 비가 상기 후크 효과 감지 기준보다 크거나 같을 경우, 검출 범위를 벗어나는 후크 효과를 갖는 샘플로 식별되고; 및 상기 후크 효과 감지 기준보다 작을 경우, 후크 효과가 없는 것으로 판정한다.
이때 후크 효과가 없는 것으로 판정될 경우, 검출 대상 샘플의 흡광도에 대한 농도를 산출하면 실제 검출 대상 샘플 내 목표 검출물질의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정된 샘플 내 목표 검출물질의 농도는 1차 측정값으로 도출된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정 수단이 흡광도 측정인 경우, 상기 1차 흡광도(W1) 측정은 기질 첨가 후 1초 내지 20초에 수행하고, 2차 흡광도(W2) 측정은 기질 첨가 후 250초 내지 350초에 수행된다.
상기 목표 검출물질의 흡광도 측정은 분광광도계(spectrophotometer)와 같은 광학분석기기를 이용하여 수행되고, 상기 흡광도 측정에 사용되는 파장대는 목표 검출물질에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서의 용어, 상기 "목표 검출물질"은 샘플 내 검출하고자 하는 대상이 되는 물질로서, 광학분석기기에 의해 측정할 수 있는 시료 내 분석하고자 하는 표적물질을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출 대상 샘플은 검사하고자 하는 상기 목표 검출물질을 포함하는 임의의 샘플일 수 있고, 예를 들어, 혈액, 뇌척수액, 림프액, 분변, 뇨, 눈물, 땀, 담즙, 양수, 조직액, 조직, 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목표 검출물질, 또는 표적물질은 이의 검출 신호를 확인하기 위한 표지물질에 의해 발생하는 신호에 의하여 존재 여부 및 존재 수준이 측정될 수 있다.
본 발명의 면역검정법은 상기 표지물질에 의해 발생하는 신호의 검출 원리 및 방법에 따라 응집반응에 의한 신호를 검출하는 면역비탁법(turbidimetric immunoassay; TIA), 라텍스응집 면역비탁법(latex immunoassay; LIA) 및 혼탁측정법(nephelometry), 방사성 동위원소를 사용하여 신호를 검출하는 방사면역분석법 (radio immunoassay; RIA), 효소에 의한 신호증폭을 사용하는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA, 또는 enzyme immunoassay; EIA), 형광을 이용하여 검출하는 면역형광법(immunofluorescent assay; IFA), 및 화학발광을 사용하는 화학발광면역측정법( chemiluminescence immunoassay; CLIA)등을 포함하고, 그 밖에도 표지 물질의 사용 방법이나 기질의 종류에 따라 다양하게 분류될 수 있으며, 목적에 따라 적절하게 선택하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 검정법은 바람직하게 효소면역측정법(ELISA), 방사면역분석법(radio immunoassay; RIA), 면역조직화학법(immunohistochemistry, IHC), 또는 유세포분석법(flow cytometry)일 수 있고, 보다 바람직하게 효소면역측정법(ELISA)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정 반응으로부터 물질의 검출 신호를 확인하기 위한 표지 물질은 화합물 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광표지, 화학발광 표지 또는 FRET 표지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로 사용되는 효소 표지는 통상적으로 기질과 반응하여 흡광도 변화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 페록시다아제(Peroxidase), 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase; HRP), 글루코오스 산화효소(glucose oxidase), 루시퍼레이즈(luciferase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 베타-글루쿠론산분해효소(beta-glucuronidase), 베타-락타메이즈(beta-lactamase), 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(Chloramphenicol acetyltransferase), 산화철 나노입자(iron oxide nanoparticle), 및 헤민-포함 복합체(hemin-containing compelx)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로 사용되는 형광 표지는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광 단백질(fluorescent protein)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 근적외선(near infrared) 형광 단백질인 IFP1.4; 적색(red) 형광 단백질인 RFP(red fluorescent protein), eRFP(enhanced red fluorescent protein), mRFP(modified red fluorescent protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), mCherry (monomeric cherry fluorescent protein), PAmcherry(photoactivatable mCherry fluorescent protein), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, mScarlet, mScarlet-i, mStrawberry(monomeric strawberry fluorescent protein), mRaspberry, mPlum, mApple, mGrape1, mGrape2, tdTomato, E2-Crimson, HcRed1, mKate, mKate2, mNeptune, mRubby, mRubby2, J-Red, mEOS4, katushka 및 mTangerine; 주황색(orange) 형광 단백질인 mOrange(monomeric orange fluorescent protein), PSmOrange(photoconvertible orange fluorescent protein), mKO 및 mKO2; 노란색(yellow) 형광 단백질인 YFP (yellow fluorescent protein), eYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein), SYFP, TagYFP, PhiYFP, mBanana, mCitrine, Venus, Topaz, mEos2, Ypet 및 ZsYellow; 초록색(green) 형광 단백질인 GFP(green fluorescent protein), eGFP(enhanced green fluorescent protein), mGFP(Modified Green Fluorescent Protein), GFPuv(cycle 3 variant of GFP), AzG(Azami Green), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Emerald GFP, T-Sapphire, mUkG. mHoneydew, Dronpa, Clover, kaede 및 Zsgreen; 파란색(blue) 형광 단백질인 BFP(blue fluorescent protein), eBFP(enhanced blue fluorescent protein), Azurite, mKalamal, PS-CFP2, mTag BFP 및 mTag BFP2; 청록색(cyan) 형광 단백질인 CFP(cyan fluorescent protein), eCFP(enhanced cyan fluorescent protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), TagCFP, mTurquoise, mTurquosie2, CyPet, Cerulean 및 mTFP(monomeric teal fluorescent protein); 초록-빨강 형광 단백질인 KikGR(green-red photoconvertible fluorescent protein); 및 원적외선 형광 단백질(far-red fluorescent protein).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 검정 반응에 사용되는 기질(substrate)은 사용한 표지 물질과 반응하여 흡광도 변화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 표지 물질의 종류에 따라서, 적절한 기질을 선택하는 것은 당업계에 잘 알려진 기술이므로 기질에 대한 구체적인 기재는 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 당업자라면 상기 면역검정법을 수행하기 위한 "면역검정에 필요한 시약"은 1차 항체, 2차 항체, 및 그 외 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 면역검정법 키트에 포함된 솔루션 용액을 포함하며 제한적으로 해석되지 않는다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군, 및 b) 유리 물질을 첨가하지 않는 실험군을 포함하여 수행된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 b) 유리 물질을 첨가하지 않는 실험군에서는 iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계에서 1회만 측정이 수행된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 면역 검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군만을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용한 면역 검정법에서의 후크 효과를 미연에 감지하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 이용하는 경우, 별도의 물질의 추가 없이 후크 효과를 미연에 감지할 수 있다
(c) 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 이용하는 경우, 별도의 시료를 희석하는 과정 없이 후크 효과를 미연에 감지할 수 있다
도 1은 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 수행하기 위한 샘플 웰 및 후크 웰에서의 실험 과정을 나타낸다.
도 2a는 IgG 농도에 따른 샘플 웰 및 후크 웰에서의 흡광도 측정값을 나타낸다.
도 2b는 IgG 농도에 따른 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 수행하기 위한 후크 웰만을 이용하는 실험 과정을 나타낸다.
도 5는 IgG 농도에 따른 후크 웰에서의 흡광도 측정값(10초), 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 후크 웰만을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.
도 2a는 IgG 농도에 따른 샘플 웰 및 후크 웰에서의 흡광도 측정값을 나타낸다.
도 2b는 IgG 농도에 따른 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 수행하기 위한 후크 웰만을 이용하는 실험 과정을 나타낸다.
도 5는 IgG 농도에 따른 후크 웰에서의 흡광도 측정값(10초), 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 후크 웰만을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
ELISA 검사에 의한 IgG 항원의 정량분석
면역 검정법 중 하나인, ELISA 검사법을 이용하여 IgG 항원의 정량분석을 수행함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 검증하고 이를 적용하기 위한 후크 효과 감지 기준을 결정하였다. 본 실시예는 당업계에서 통상적으로 사용되는 ELISA 검사법을 이용하여 수행하였다.
ELISA 검사법에 의한 IgG 항원의 검출 가능한 농도 범위는 1 내지 10 mg/mL이나, 측정된 샘플에 사용된 IgG 항원의 농도는 1 내지 200 mg/mL로서, 본 발명의 후크 효과 감지 방법의 효과를 확인하고자 20배 이상의 고농도를 포함하는 측정 샘플을 사용하였다. 즉, 사용된 IgG 항원의 농도는 1 mg/mL, 4 mg/mL, 7 mg/mL, 10 mg/mL, 13 mg/mL, 15 mg/mL, 18 mg/mL, 21 mg/mL, 24 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 60 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL 및 200 mg/mL이다.
실험예 1. 2개의 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법
2개의 웰(각각 샘플 웰 및 후크 웰)에서 IgG 항원을 분석대상 물질(샘플)로 사용하여 ELISA 검사법을 통해 IgG 항원의 농도를 측정함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 기준을 결정하고 확인하였다.
실험예 1.1. 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지
샘플 웰에는 분석대상 물질(샘플)만을 첨가하였고, 후크 웰에는 샘플을 첨가하기 전에 분석대상 물질로 사용된 IgG의 유리 항원을 첨가하였다. 본 발명의 실험예에 있어서, TMB(tetramethyl benzidine)를 기질로 사용하여 분석대상 물질을 검출하기 위한 효소-기질반응을 수행하였고, 분광광도계를 사용하여 650 nm 파장대에서 총 2회에 걸쳐 흡광도를 측정하였다. 1차 흡광도의 측정은 기질을 첨가하고 10초 후에 수행하였고, 2차 흡광도는 300초 후에 측정하였다. 모든 실험과정은 도 1에 나타낸 바와 같이 수행되었다.
도 2a는 10초 및 300초에 측정된 후크 웰에서의 흡광도 및, 300초에 측정된 샘플 웰에서의 흡광도 값을 나타내고, 샘플로 사용된 IgG 농도에 따른 흡광도의 측정값을 그래프로 나타내었다. 두 웰에서 300초에 측정된 흡광도 값을 비교하였을 때, IgG 항원의 농도가 ≥ 10 mg/mL인 경우, 후크 웰에서 측정된 흡광도 값과 비교하여 샘플 웰은 낮은 흡광도 값을 나타내며 부정확한 결과값이 측정됨으로써 후크 효과가 가지는 것을 확인하였다. 특히, 농도가 ≥ 30 mg/mL인 경우, 후크 효과로 인해 모든 흡광도 측정값이 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 1.2. 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 기준 결정
후크 웰에서 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도의 비(W1/W2)를 이용하여 ELISA 검사법에서의 후크 효과 감지 기준을 결정하였다.
도 2b는 후크 웰에서 10초 및 300초에 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도 값의 비(10초/300초)로 나타낸 그래프로서, 여기에서 IgG 항원의 농도가 증가함에 따라 한계비(threshold ratio)가 명확하게 구별되고, 특히, ≥ 30 mg/mL에서 상기 흡광도 값의 비가 포화상태(saturated)에 도달한 것을 확인하였다. 즉, 상기 실험예 1.1에서 후크 효과가 감지되었던 ≥ 30 mg/mL에서 흡광도 값의 비(10초/300초)가 약 ≥ 1.2의 값으로 포화상태에 이르는 것을 확인함으로써, 이를 후크 효과 감지 기준으로 결정하였다.
도 3에서 나타낸 바와 같이, 후크 효과 감지를 위해 결정된 기준값을 바탕으로 흡광도의 측정값이 기준보다 높은 경우, 후크 효과로 인해 농도 검출 범위를 벗어나는 것으로 간주하였다. 반면, 기준보다 낮은 경우, 흡광도의 측정값에 대한 샘플의 농도를 산출하였다.
실험예 2. 1개의 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법
2개의 웰(샘플 웰 및 후크 웰)을 사용하지 않고, 후크 웰만을 사용하여 후크 효과 감지 및 정량 분석이 동시에 수행할 수 있음을 확인하였다.
상기 실험예 1과 같이, IgG 항원을 분석대상 물질(샘플)로 사용하여 ELISA 검사법을 통해 IgG 항원의 농도를 측정함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 기준을 결정하고 확인하였다.
실험예 2.1. 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지
후크 웰에 샘플을 첨가하기 전에 분석대상 물질로 사용된 IgG의 유리 항원을 선첨가 후, 샘플을 첨가하여 검사를 수행하였으며, 모든 실험은 후크 웰만을 사용하여 수행되었다. TMB를 기질로 사용하여 분석대상 물질을 검출하기 위한 효소-기질반응을 수행하였고, 분광광도계를 사용하여 650 nm 파장대에서 총 2회에 걸쳐 흡광도를 측정하였다. 1차 흡광도의 측정은 기질을 첨가하고 10초 후에 수행하였고, 2차 흡광도는 300초 후에 측정하였다. 모든 실험과정은 도 4에 나타낸 바와 같이 수행되었다.
그 결과로써, 10초에 1차로 측정된 흡광도 값과 함께, 10초(1차) 및 300초(2차)에 측정된 흡광도 값의 비를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 1차 흡광도 측정값은 IgG 항원의 농도가 증가함에 따라 증가하였으나, ≥ 30 mg/mL에서는 오히려 측정값이 감소하여 부정확한 값이 측정되는 것을 통해 붉은색 박스로 표시된 구역이 후크 효과가 있는 후크 효과 구역(hook effect region)인 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 후크 웰만 사용한 경우에도, 2개의 웰을 사용하여 수행되었던 상기 실험예 1.1의 결과와 같이 후크 효과를 감지할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2.2. 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 기준 결정
후크 웰에서 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도의 비(W1/W2)를 이용하여 ELISA 검사법에서의 후크 효과 감지 기준을 결정하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 10초 및 300초에 측정된 흡광도 값의 비가 ≥ 30 mg/mL에서 즉, 파란색 박스로 표시된 구역에서 포화상태에 도달한 것을 확인함으로써, 30 mg/mL에서의 흡광도 비를 후크 효과 감지 기준으로 결정하였다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 후크 효과 감지를 위해 결정된 기준값을 바탕으로 흡광도의 측정값이 기준보다 높은 경우, 후크 효과로 인해 농도 검출 범위를 벗어나는 것으로 간주하였다. 반면, 기준보다 낮은 경우, 흡광도의 측정값에 대한 샘플의 농도를 산출하였다.
측정된 흡광도 값으로부터 샘플 내 분석물질의 농도를 산출하기 위한 보정(calibration)은 흡광도 값과 표준 농도간의 기준이 되는 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 수행되었다. 상기 방법은 일반적인 바이오분석법에서 널리 공지되어 있는 방법으로써, 이는 당업자라면 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 적용하는 것임을 쉽게 이해할 수 있다.
Claims (8)
- 후크 효과(Hook effect) 유무를 감지가능한 면역 검정법(immunoassay)에 있어서,
상기 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는, 면역검정법:
상기 면역검정법은 다음 단계를 포함하고:
i) 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하는 단계;
ii) 면역검정에 필요한 시약을 검출 용기에 첨가하는 단계; 및
iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계,
상기 면역검정법은 상기 iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계에서 소정의 시간 간격을 두고 1차 측정 및 2차 측정을 수행하는 것이며; 및
상기 면역검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군, 및 b) 유리 물질을 첨가하지 않는 실험군을 포함하여 수행되는 것임.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 1차 측정값(W1) 및 2차 측정값(W2)을 구하여 도출한 측정값의 비(W1/W2)가 소정의 후크 효과 감지 기준보다 크거나 같을 경우 검출 대상 샘플에 검출가능 범위를 초과하는 후크 효과가 있는 것으로 판정하고,
측정값의 비(W1/W2)가 후크 효과 감지 기준보다 작은 경우 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정하는 것인, 면역검정법.
- 제3항에 있어서, 상기 후크 효과 감지 기준은, 서로 다른 농도를 가진 검출 대상 물질을 포함하는 복수개의 검출 대상 샘플에서 목표 검출물질을 측정하였을 때 목표 검출물질에 대한 측정값의 비(W1/W2)가 수렴하는 값인, 면역검정법.
- 제3항에 있어서, 상기 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정된 샘플 내 목표 검출물질의 농도는 1차 측정값으로 도출되는 것인, 면역검정법.
- 제1항에 있어서, iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정이 흡광도 측정인 경우, 1차 흡광도(W1) 측정은 기질 첨가 후 1초 내지 20초에 수행하고, 2차 흡광도(W2) 측정은 기질 첨가 후 250초 내지 350초에 수행되는 것인, 면역 검정법.
- 삭제
- 제1항, 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군만을 포함하여 수행되는 것인, 면역검정법.
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|---|
| Shin Sungchul et al, Sensors and Actuators B: Chemical (2020.), vol 304, pp 127408. |
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|---|---|
| KR20230110090A (ko) | 2023-07-21 |
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