JP2010091308A - レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット - Google Patents
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Abstract
【課題】高い特異性、高い感度及び簡便性を兼ね備えた、前立腺がんの早期発見・早期治療に貢献しうる前立腺がんの判定方法や判定キットを提供すること。
【解決手段】(a)血清試料に糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;(b)工程(a)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,3-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程);(d)[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]により[α2,3-Bound PSA]を求め、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程;の各工程からなる前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法。
【選択図】なし
【解決手段】(a)血清試料に糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;(b)工程(a)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,3-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程);(d)[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]により[α2,3-Bound PSA]を求め、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程;の各工程からなる前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、前立腺特異抗原(prostate specific antigen:以下「PSA」と略す)を標的としたレクチン吸収法による前立腺がんの判定方法や判定キットに関する。
前立腺がん(prostate carcinoma)は男性の主要な死亡原因である。前立腺上皮細胞から分泌され前立腺がん細胞によっても産生されるPSAは、セリンプロテアーゼの一種で、前立腺がんに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている(例えば、非特許文献1参照)。PSAは分子量約34kDaの糖タンパク質であり、45番目のアスパラギン残基に1本の糖鎖を有し、糖鎖の中で主たるものは、非還元末端にシアル酸がα2,6結合したものである。PSAは、血中では、プロテアーゼインヒビターとの結合型と、非結合の遊離型前立腺特異抗原として存在する。PSAは、健康なときも血液中に存在するが、前立腺がんが発症すると大量のPSAが血液中に放出されることから、前立腺がんの腫瘍マーカーとして広く用いられており、前立腺がんの初期診断に対する血清PSA試験の簡便性・有用性は既に多く報告されている。
図1のグラフ(財団法人 前立腺研究財団:前立腺がん検診テキスト)は、PSA値と前立腺がんの発見率を示したもので、PSA値が高くなるにつれて、前立腺がんの確率も高くなることが示されているものの、PSA値が低いと前立腺がんの発見率が30%以下となることが示されている。日本人男性のPSA基準値としては、64歳以下の男性では3.0ng/mL、65〜69歳の男性では3.5ng/mL、70歳以上の男性では4.0ng/mLが目安といわれ、この基準値以上であれば、前立腺がんである可能性があり、医療機関でさらに詳しい検査を受けることが推奨されている(例えば、非特許文献2及び3参照)。
図2(栗山 学他:泌尿器科紀要, 41(1):39, 1995より改変)には、前立腺がん、前立腺肥大症、及び、健常男子における血清PSA値が示されている。健常男子に比べて、前立腺肥大症、前立腺がんでは数値が高く、病期が進行しているほど数値も高くなり、PSA検査は、がんの進行を示す病期の予測にも有用であるといわれている。しかし、病期がかなり進行していても、PSA値が正常範囲の例もあることや、前立腺肥大や前立腺炎でもPSA値が高値となることに起因するグレイゾーンの取り扱いの問題などから、PSA値だけで診断することはできず、疑わしい場合は、さらに他の検査を併用して、診断精度を高める必要がある。
最近、前立腺がんにおけるPSAの糖鎖変化、すなわち、前立腺がん患者では、血清PSAの糖鎖の非還元末端がα2,6結合型シアル酸からα2,3結合型シアル酸を有するものに有意に変化しており、前立腺がん特異的なPSAの糖鎖構造を糖鎖に結合活性を示すタンパク質であるレクチンが識別しうるという報告がなされ(例えば、非特許文献4〜6参照)、PSAを含む試料をPSA糖鎖構造の末端シアル酸残基のα2,3結合型を特異的に認識するイヌエンジュレクチン(MAA)や、末端シアル酸残基のα2,6結合型を特異的に認識するニワトコレクチン(SNA)に接触させ、該レクチンとPSAの糖鎖構造の親和性により分別されたPSAを測定することにより、前立腺がんと前立腺肥大を識別する方法も提案され(例えば、特許文献1参照)、レクチンを検出プローブとして用いることで、より特異的かつ高感度に前立腺がんを鑑別することが可能になると考えられてきた。
本発明の課題は、高い特異性(前立腺がん患者だけを的確に識別)、高い感度(早期がんを発見できる)及び簡便性(一般の検査施設で簡便に検査できる)を兼ね備えた、前立腺がんの早期発見・早期治療に貢献しうる前立腺がんの判定方法や判定キットを提供することにある。
血清PSA濃度は前立腺がんのスクリーニングに用いられているが、PSA濃度が10ng/mL未満(グレーゾーン)の場合、PSA濃度により前立腺がん患者を前立腺肥大等の良性患者と区別することはできない。レクチンの中には、PSAの糖鎖の非還元末端がα2,6結合型シアル酸からα2,3結合型シアル酸に変化した前立腺がん特異的糖鎖を有するPSAに選択的・優先的に結合するものがあるとの知見をもとに、本発明者らは低PSA濃度での前立腺がんの血清診断方法を新たに確立するべく鋭意研究し、糖鎖の非還元末端がα2,3結合型シアル酸を有するPSAに結合することができる数種のレクチンをレクチンブロッティング解析によりスクリーニングした。次いで、前立腺がん患者と良性患者の血清試料を用い、レクチン抗体サンドウィッチ法とレクチン吸収アッセイ法が前立腺がんの血清診断に有効かどうかを検討した。
本発明者らがスクリーニングしたレクチンの中で、MALレクチン(Maackia amurensis lectin)が、α2,3結合型シアル酸を糖鎖の非還元末端に有する前立腺がん特異的PSAにより選択的・優先的に結合することを確認した(図3参照)。30の血清試料を用いて、図4に示すレクチン抗体サンドウィッチエライザ法と図5に示すレクチン吸収アッセイ法により試験した。MALレクチン結合(吸収)分画のPSAを直接測定するレクチン抗体サンドウィッチエライザ法による試験ではレクチンの親和性が低く、前立腺がん患者を区別することはできなかったが、MALレクチン非結合(非吸収)分画のPSAを測定するレクチン吸収アッセイ法による試験では88%の特異性と81%の感受性で、20ng/mL以下のPSA低濃度の前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、(1)以下の工程を備えた前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法;(a1)血清試料に、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;(b1)工程(a1)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,3-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;や、(2)さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする前記(1)記載の判定方法;(d1)[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]により[α2,3-Bound PSA]を求め、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程;や、(3)以下の工程を備えた前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法;(a2)血清試料に糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;(b2)工程(a2)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,6-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;や、(4)さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする前記(3)記載の判定方法;(d2)[α2,6-Non-bound PSA]を[α2,3-Bound PSA]とし、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程;や、(5)吸収率が10%以上の場合、前立腺がんと判定することを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか記載の判定方法や、(6)工程(c)が、以下の工程を備えたことを特徴とする前記(1)〜(5)のいずれか記載の判定方法;(ci)血清試料に非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを接触させ、インキュベーションする工程;(cii)工程(ci)におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;や、(7)非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、BSA固相化ビーズであることを特徴とする前記(6)記載の判定方法や、(8)固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする前記(1)〜(7)のいずれか記載の判定方法や、(9)免疫学的方法が、サンドイッチエライザであることを特徴とする前記(1)〜(8)のいずれか記載の判定方法に関する。
また本発明は、(10)糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キットや、(11)糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キットや、(12)さらに、非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを含むことを特徴とする前記(10)又は(11)記載の判定キットや、(13)非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、BSA固相化ビーズであることを特徴とする前記(12)記載の判定キットや、(14)固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする前記(10)〜(13)のいずれか記載の判定キットや、(15)抗PSA抗体を含むPSA測定試薬が、抗PSA抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗PSA抗体、検出基質を含むことを特徴とする前記(10)〜(14)のいずれか記載の判定キットや、(16)標識化抗PSA抗体が、ビオチン標識抗PSAモノクローナル抗体とHRP標識ストレプトアビジンとの組合せであることを特徴とする前記(15)記載の判定キットに関する。
レクチン吸収アッセイ法を利用する本発明によると、従来の血清PSA濃度測定法では、良性疾患と前立腺がんとの鑑別は不可能であった低濃度PSA値の場合であっても、良悪の鑑別が可能となり、前立腺がんであるか否かを一般の検査施設で簡単に検査することができる。
本発明のPSAを標的とした前立腺がんの判定方法としては、(a1)血清試料に、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程、すなわち、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有するPSAと前記レクチン固相化ビーズとの複合体を形成させる工程;(b1)工程(a1)におけるインキュベーション後のビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,3-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程、すなわち、工程(a1)で形成された複合体を分離した残存試料中のPSA値を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;の(a1)、(b1)、(c)の各工程を備える方法[以下、「判定方法I」ということがある]や、(a2)血清試料に糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程、すなわち、糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有するPSAと前記レクチン固相化ビーズとの複合体を形成させる工程;(b2)工程(a2)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,6-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程、すなわち、工程(a2)で形成された複合体を分離した残存試料中のPSA値を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;の(a2)、(b2)、(c)の各工程を備える方法[以下、「判定方法II」ということがある]であれば特に制限されず、本発明の判定方法においては、特定のレクチンと、レクチン吸収アッセイ法(レクチン結合(吸収)分画のPSAを直接測定することなく、レクチン非結合(非吸収)分画のPSAを測定する方法)とを用いることを特徴としている。
上記判定方法Iにおいては、さらに、(d1)[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]により[α2,3-Bound PSA]を求め、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、例えば吸収率が10%以上のとき、前立腺がんと判定する工程;の両工程を備えることが好ましく、上記判定方法IIにおいては、さらに、(d2)[α2,6-Non-bound PSA]を実質的に[α2,3-Bound PSA]と考え、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、例えば吸収率が10%以上のとき、前立腺がんと判定する工程;の両工程を備えることが好ましい。
上記(a1)工程で用いられる、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンとしては、糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を認識することなく、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を認識するレクチンであれば特に制限されないが、MALレクチン(Maackia amurensis leukoagglutinin lectin、Maackia amurensis Lectin I、MAMレクチンともよばれる)や、MAAレクチン(Maackia amurensis agglutinin lectin、Maackia amurensis Lectin IIともよばれる)やACGレクチン(Agrocybe cylindracea galectin lectin)等を好適に例示することができる。この(a1)工程で用いられるMAL固相化ビーズ、ACG固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記(a2)工程で用いられる、糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンとしては、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を認識することなく、糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を認識するレクチンであれば特に制限されないが、SNAレクチン(Elderberry bark lectin)やSSAレクチン(Sambucus sieboldiana lectin)等を好適に例示することができる。この(a2)工程で用いられるSNA固相化ビーズ、SSA固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記(c)工程は、血清試料中の全PSAを、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程であるが、血清試料にBSA固相化ビーズ等の非特異的吸着補正用の対照タンパク質吸着用ビーズを接触させ、インキュベーションする工程(ci)と、該工程(ci)におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中の全PSAを、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程(cii)とを備えた工程とすることが、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により血清試料中の全PSAを正確に測定する上で好ましい。上記BSA固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記工程(a1,a2)工程や(b1,b2)工程や(ci)工程におけるインキュベーションとしては、例えば、20〜30℃で30〜150分間撹拌するインキュベーションを好適に例示することができる。また、固相化ビーズとしては、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラスビーズ等を例示することができ、上記工程(b1,b2)や(cii)工程におけるビーズを分離した残存試料には、反応液中からビーズを遠心分離又は濾過除去した残存液や、反応液中の磁性ビーズを磁石により固定し、マイクロピペット等で回収した上清が含まれる。
上記(b1,b2)工程や(c)工程における抗PSA抗体を用いた免疫学的方法としては、PSAを定量できる免疫学的方法であれば特に制限されず、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、エンザイムイムノアッセイが好ましく、特にエライザが好ましく、中でもサンドイッチエライザが好ましい。エライザなどの免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことができる。上記抗PSA抗体としては抗PSAモノクローナル抗体が好ましく、また、かかるモノクローナル抗体に代えて、F(ab’)2、Fabなどのモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも使用することができ、これら抗体フラグメントは、抗PSAモノクローナル抗体に便宜上含まれる。また、これらモノクローナル抗体や抗体フラグメントを標識化抗体として用いる場合、標識物質としては、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ等の酵素を例示することができ、これら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法27) 」 (第1版、石川栄治著、学会出版センター、1991年) などに記載されている方法で標識することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、125I、32P、35S、3H等のラジオアイソトープや、FITC(フルオレセインイソシアネート)、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、GFP(グリーン蛍光タンパク質)等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。
上記の抗PSA抗体を用いたサンドイッチエライザによる残存試料中のPSA値の測定は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、第1抗PSA抗体と標識化第2抗PSA抗体を用い、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等の固相、好ましくは抗体固相化エライザ用アッセイプレートのウェルに第1抗PSA抗体を固定化し、前記ウェル内に試料を加え、試料中のPSAと第1抗PSA抗体との間で抗原抗体反応を行わせ、PSAを捕捉する。その後、試料を除いて洗浄した後、ウェル内に標識化第2抗PSA抗体を加え、この標識化第2抗PSA抗体と前記ウェルに捕捉されたPSAとの間で抗原抗体反応を行わせ、第1抗PSA抗体とPSAとを介して標識化第2抗PSA抗体をウェルに結合させ、ウェルに結合した標識化第2抗PSA抗体の標識を利用してPSAを定量する。上記第1抗PSA抗体としては抗PSAモノクローナル抗体が好ましく、第2抗PSA抗体としては、第1抗PSA抗体と認識部位を異にし、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、ビオチン等で標識化された抗PSAモノクローナル抗体が好ましい。また、標識化第2抗PSA抗体に代えて、第2抗PSA抗体と標識化抗IgG抗体を用いることもできる。
本発明の前立腺がんの判定キットとしては、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた、前記判定方法Iに用いることができるキットや、糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた、前記判定方法IIに用いることができるキットであれば特に制限されず、これらキットには、BSA固相化ビーズ等の非特異的吸着補正用の対照タンパク質固相化ビーズを含むことが好ましく、上記固相化ビーズとしては、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラスビーズ等を例示することができるが、磁性ビーズが好ましい。また、上記抗PSA抗体を含むPSA測定試薬としては、PSAを定量しうる試薬であれば特に制限されないが、抗PSA抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗PSA抗体、検出基質を含むサンドイッチエライザ用試薬が好ましく、上記標識化抗PSA抗体としては、酵素標識抗PSAモノクローナル抗体の他、ビオチン標識抗PSAモノクローナル抗体とHRP標識ストレプトアビジンとの組合せを特に好適に例示することができる。
以下、実施例により本発明のレクチン吸収アッセイ法をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[測定試薬]
1.天然レクチン固相化磁性ビーズ
1)BSA固相化磁性ビーズ(total PSA濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにBSAを固相化した磁性ビーズ)5mL
2)MAL固相化磁性ビーズ(α2,3-Non-bound PSA濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにMALを固相化した磁性ビーズ)5mL
1.天然レクチン固相化磁性ビーズ
1)BSA固相化磁性ビーズ(total PSA濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにBSAを固相化した磁性ビーズ)5mL
2)MAL固相化磁性ビーズ(α2,3-Non-bound PSA濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにMALを固相化した磁性ビーズ)5mL
2.抗体固相化エライザ用アッセイプレート
(日本医学臨床検査研究所社製エライザキャプチャー用マウスモノクローナル抗PSA抗体clone 2E2を固相化)2枚
3.検出用抗体試薬(100倍検出用抗体試薬(日本医学臨床検査研究所社製エライザ検出用ビオチン標識抗PSA抗体clone 79))0.3mL
4.検出試薬(100倍HRP標識検出試薬(Zymed社製HRP標識ストレプトアビジン)0.3mL
5.緩衝液
1)検出用抗体試薬用緩衝液(TBS−0.05%Tween20,1%BSA)23mL
2)HRP標識検出試薬用緩衝液(TBS−0.05%Tween20,1%BSA)23mL
6.検出基質/反応終了液
1)検出基質(TMB)23mL
2)反応終了液(0.5M H2SO4)23mL
(日本医学臨床検査研究所社製エライザキャプチャー用マウスモノクローナル抗PSA抗体clone 2E2を固相化)2枚
3.検出用抗体試薬(100倍検出用抗体試薬(日本医学臨床検査研究所社製エライザ検出用ビオチン標識抗PSA抗体clone 79))0.3mL
4.検出試薬(100倍HRP標識検出試薬(Zymed社製HRP標識ストレプトアビジン)0.3mL
5.緩衝液
1)検出用抗体試薬用緩衝液(TBS−0.05%Tween20,1%BSA)23mL
2)HRP標識検出試薬用緩衝液(TBS−0.05%Tween20,1%BSA)23mL
6.検出基質/反応終了液
1)検出基質(TMB)23mL
2)反応終了液(0.5M H2SO4)23mL
7.標準物質(CHO細胞発現リコンビナントPSA)
標準溶液1 0pg/mL
標準溶液2 5pg/mL
標準溶液3 20pg/mL
標準溶液4 50pg/mL
標準溶液5 150pg/mL
8.磁性ビーズ反応プレート 2枚
9.血清希釈液(TBS−0.05%Tween20,1mM MnCl2,1mM CaCl2)50mL
標準溶液1 0pg/mL
標準溶液2 5pg/mL
標準溶液3 20pg/mL
標準溶液4 50pg/mL
標準溶液5 150pg/mL
8.磁性ビーズ反応プレート 2枚
9.血清希釈液(TBS−0.05%Tween20,1mM MnCl2,1mM CaCl2)50mL
[操作法]
1.試薬の調製
1)エライザ洗浄液
0.1%Tween20を含むPBS溶液を調製する。
2)検出用抗体試薬
100倍検出用抗体試薬0.23mLを検出用抗体用緩衝液23mLと混合させる。混合後は4℃保存し、なるべく早く使用する。
3)HRP標識検出試薬 ,
100倍HRP標識検出試薬0.23mLをHRP標識検出試薬用緩衝液23mLと混合させる。混合後は4℃保存し、なるべく早く使用する。
1.試薬の調製
1)エライザ洗浄液
0.1%Tween20を含むPBS溶液を調製する。
2)検出用抗体試薬
100倍検出用抗体試薬0.23mLを検出用抗体用緩衝液23mLと混合させる。混合後は4℃保存し、なるべく早く使用する。
3)HRP標識検出試薬 ,
100倍HRP標識検出試薬0.23mLをHRP標識検出試薬用緩衝液23mLと混合させる。混合後は4℃保存し、なるべく早く使用する。
2.必要な器具・器材
1)マイクロピペット
2)撹拌機能付き恒温糟(25℃で使用可能な装置)
エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォート
3)マイクロプレート用磁石スタンド
4)ボルテックスミキサー
5)マイクロプレート用分光光度計(主波長450nmおよび副波長630nm)
1)マイクロピペット
2)撹拌機能付き恒温糟(25℃で使用可能な装置)
エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォート
3)マイクロプレート用磁石スタンド
4)ボルテックスミキサー
5)マイクロプレート用分光光度計(主波長450nmおよび副波長630nm)
3.測定操作
1)磁性ビーズ反応プレートの各ウェルに、各血清検体を血清希釈液で20倍希釈した溶液を100μL加える。
2)BSA固相化磁性ビーズまたはMAL固相化磁性ビーズを撹拌し、それぞれ各ウェルに50μL加える。
3)撹拌機能付き恒温槽で800rpmで攬絆しながら、25℃、1時間インキュベーションする。
4)磁石スタンド上に磁性ビーズ反応プレートを載せ、室温で10分間静置する。
5)集積させた磁性ビーズを吸わないように注意しながらマイクロピペットで上清100μLを回収し、抗体固相化エライザ用アッセイプレートに加える。
6)各標準溶液100μLを抗体固相化エライザ用アッセイプレートの各ウェルに加える。
7)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
8)試料を除き、エライザ用洗浄液を各ウェルに200μL加える。
9)エライザ用洗浄液を除く。
10)8)と9)を計5回行い、ウェルを洗浄する。
11)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
12)各ウェルに調製した検出用抗体試薬を100μL加える。
13)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
14)8)と9)を計5回行い、ウェルを洗浄する。
15)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
16)各ウェルに調製したHRP標識検出試薬を100μL加える。
17)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
18)8)と9)を計5同行い、ウェルを洗浄する。
19)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
20)各ウェルに検出基質を100μL加える。
21)25℃で20分間、静置してインキュベーションする。
22)各ウェルに反応終了液100μLを加える。
23)マイクロプレート用分光光度計にて主波長450nm、副波長630nmの吸光度を測定する。
1)磁性ビーズ反応プレートの各ウェルに、各血清検体を血清希釈液で20倍希釈した溶液を100μL加える。
2)BSA固相化磁性ビーズまたはMAL固相化磁性ビーズを撹拌し、それぞれ各ウェルに50μL加える。
3)撹拌機能付き恒温槽で800rpmで攬絆しながら、25℃、1時間インキュベーションする。
4)磁石スタンド上に磁性ビーズ反応プレートを載せ、室温で10分間静置する。
5)集積させた磁性ビーズを吸わないように注意しながらマイクロピペットで上清100μLを回収し、抗体固相化エライザ用アッセイプレートに加える。
6)各標準溶液100μLを抗体固相化エライザ用アッセイプレートの各ウェルに加える。
7)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
8)試料を除き、エライザ用洗浄液を各ウェルに200μL加える。
9)エライザ用洗浄液を除く。
10)8)と9)を計5回行い、ウェルを洗浄する。
11)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
12)各ウェルに調製した検出用抗体試薬を100μL加える。
13)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
14)8)と9)を計5回行い、ウェルを洗浄する。
15)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
16)各ウェルに調製したHRP標識検出試薬を100μL加える。
17)撹拌しながら25℃で1時間インキュベーションする。
18)8)と9)を計5同行い、ウェルを洗浄する。
19)ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
20)各ウェルに検出基質を100μL加える。
21)25℃で20分間、静置してインキュベーションする。
22)各ウェルに反応終了液100μLを加える。
23)マイクロプレート用分光光度計にて主波長450nm、副波長630nmの吸光度を測定する。
4.PSA濃度測定
PSA濃度0〜150pg/mLの標準溶液により作成した検量線から、使用試料のPSA濃度を算出する。図6にPSA濃度測定用検量線の代表例を示す。
PSA濃度0〜150pg/mLの標準溶液により作成した検量線から、使用試料のPSA濃度を算出する。図6にPSA濃度測定用検量線の代表例を示す。
5.MALとのBound率の測定
血清検体希釈液とBSA固相化磁性ビーズを反応させた溶液の上清のPSA濃度をTotal PSAとし、MAL固相化磁性ビーズと反応させた溶液の上清のPSA濃度をα2,3-Non-bound PSAとする。
以下の式より、MAL固相化磁性ビーズに吸着したPSA濃度[Bound PSA]を求め、最終的に吸収(Bound)率を求める。
[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]=[Bound PSA]
100×[Bound PSA]/[Total PSA]=MAL Bound(%)
(算出例)
[Total PSA]=50pg/mL、[α2,3-Non-bound PSA]=30pg/mLの場合、
[Bound PSA]=50−30=20
MAL Bound(%)=100×20/50=40(%)
血清検体希釈液とBSA固相化磁性ビーズを反応させた溶液の上清のPSA濃度をTotal PSAとし、MAL固相化磁性ビーズと反応させた溶液の上清のPSA濃度をα2,3-Non-bound PSAとする。
以下の式より、MAL固相化磁性ビーズに吸着したPSA濃度[Bound PSA]を求め、最終的に吸収(Bound)率を求める。
[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]=[Bound PSA]
100×[Bound PSA]/[Total PSA]=MAL Bound(%)
(算出例)
[Total PSA]=50pg/mL、[α2,3-Non-bound PSA]=30pg/mLの場合、
[Bound PSA]=50−30=20
MAL Bound(%)=100×20/50=40(%)
[本エライザの性能]
1.感度
0pg/mLの標準溶液1を試料とした場合の吸光度は、0.1以下であり、150pg/mLの標準溶液5を試料とした場合の吸光度は、1.5〜2.8の範囲内である。
2.再現性
標準溶液2〜5を8回同時に測定するとき、変動係数(CV)は10%以下である。
3.測定範囲
本エライザによるPSA濃度測定範囲は0.5pg/mL〜150pg/mLである。
1.感度
0pg/mLの標準溶液1を試料とした場合の吸光度は、0.1以下であり、150pg/mLの標準溶液5を試料とした場合の吸光度は、1.5〜2.8の範囲内である。
2.再現性
標準溶液2〜5を8回同時に測定するとき、変動係数(CV)は10%以下である。
3.測定範囲
本エライザによるPSA濃度測定範囲は0.5pg/mL〜150pg/mLである。
[MAL固相化磁性ピーズとの反応時の留意点]
1.BSAまたはMAL固相化磁性ビーズ50μLと混合させることにより、血清検体希釈液100μL中のPSA濃度は約2/3倍となる。
また、MAL固相化磁性ビーズにPSAが吸着することにより、その上清のPSA濃度[Free PSA]はさらに低濃度となる。
各固相化磁性ビーズと反応させる検体希釈液中のPSA濃度は20pg/mL以上が望ましい。
2.血清中の成分がPSAとMAL固相化磁性ビーズとの吸着に影響を与える可能性がある。
1.BSAまたはMAL固相化磁性ビーズ50μLと混合させることにより、血清検体希釈液100μL中のPSA濃度は約2/3倍となる。
また、MAL固相化磁性ビーズにPSAが吸着することにより、その上清のPSA濃度[Free PSA]はさらに低濃度となる。
各固相化磁性ビーズと反応させる検体希釈液中のPSA濃度は20pg/mL以上が望ましい。
2.血清中の成分がPSAとMAL固相化磁性ビーズとの吸着に影響を与える可能性がある。
[測定結果]
上記の[操作法]に従い、良性患者と前立腺がん患者におけるPSA濃度(ng/mL)をレクチン吸収アッセイ法により測定し、吸収率(%)を算出した。結果を図7に示す。これらのレクチン吸収アッセイ法による試験結果から、88%の特異性と81%の感受性で、より吸収率が低いことから、前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることがわかった。
上記の[操作法]に従い、良性患者と前立腺がん患者におけるPSA濃度(ng/mL)をレクチン吸収アッセイ法により測定し、吸収率(%)を算出した。結果を図7に示す。これらのレクチン吸収アッセイ法による試験結果から、88%の特異性と81%の感受性で、より吸収率が低いことから、前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることがわかった。
Claims (16)
- 以下の工程を備えた前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法。
(a1)血清試料に、糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;
(b1)工程(a1)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,3-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;
(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程; - さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項1記載の判定方法。
(d1)[Total PSA]−[α2,3-Non-bound PSA]により[α2,3-Bound PSA]を求め、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;
(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程; - 以下の工程を備えた前立腺特異抗原(PSA)を標的とした前立腺がんの判定方法。
(a2)血清試料に糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程;
(b2)工程(a2)におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[α2,6-Non-bound PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程;
(c)血清試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程; - さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項3記載の判定方法。
(d2)[α2,6-Non-bound PSA]を[α2,3-Bound PSA]とし、[α2,3-Bound PSA]/[Total PSA]で求められる吸収率(%)を算出する工程;
(f)吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程; - 吸収率が10%以上の場合、前立腺がんと判定することを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の判定方法。
- 工程(c)が、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の判定方法。
(ci)血清試料に非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを接触させ、インキュベーションする工程;
(cii)工程(ci)におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中のPSA値[Total PSA]を、抗PSA抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程; - 非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、BSA固相化ビーズであることを特徴とする請求項6記載の判定方法。
- 固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の判定方法。
- 免疫学的方法が、サンドイッチエライザであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか記載の判定方法。
- 糖非還元末端にα2,3結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キット。
- 糖非還元末端にα2,6結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗PSA抗体を含むPSA測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キット。
- さらに、非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを含むことを特徴とする請求項10又は11記載の判定キット。
- 非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、BSA固相化ビーズであることを特徴とする請求項12記載の判定キット。
- 固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする請求項10〜13のいずれか記載の判定キット。
- 抗PSA抗体を含むPSA測定試薬が、抗PSA抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗PSA抗体、検出基質を含むことを特徴とする請求項10〜14のいずれか記載の判定キット。
- 標識化抗PSA抗体が、ビオチン標識抗PSAモノクローナル抗体とHRP標識ストレプトアビジンとの組合せであることを特徴とする請求項15記載の判定キット。
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JP2008259144A JP2010091308A (ja) | 2008-10-04 | 2008-10-04 | レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット |
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JP2008259144A Pending JP2010091308A (ja) | 2008-10-04 | 2008-10-04 | レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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WO2020013097A1 (ja) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | 公益財団法人がん研究会 | 前立腺がんに特異的な糖鎖、及びこれを用いた検査方法 |
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-
2008
- 2008-10-04 JP JP2008259144A patent/JP2010091308A/ja active Pending
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