DE3639279C3 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische AuswertungInfo
- Publication number
- DE3639279C3 DE3639279C3 DE3639279A DE3639279A DE3639279C3 DE 3639279 C3 DE3639279 C3 DE 3639279C3 DE 3639279 A DE3639279 A DE 3639279A DE 3639279 A DE3639279 A DE 3639279A DE 3639279 C3 DE3639279 C3 DE 3639279C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- titer
- dilution
- test
- sample
- signal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von
Antikörpern oder Antigenen, in Testflüssigkeiten
nach der ELISA-Methode durch photometrische
Auswertung der aus den Testflüssigkeiten hergestellten
Proben mit eingefärbten enzymatisch markierten Antigen-/
Antikörperkomplexen, bei dem nur eine einzige Testverdünnung
der Probe hergestellt wird, in dieser Testverdünnung
eine Antigen-/Antikörper-Bindungsreaktion ausgelöst
wird, wobei vorzugsweise ein Reaktionspartner an
einer festen Oberfläche fixiert ist, und der Antigen-Antikörperkomplex
einer enzymatisch herbeigeführten
Farbreaktion unterworfen wird, um eine Farblösung herzustellen,
und aus der dieser Farblösung gemessenen
Extinktion unter Verwendung vorher gemessener Referenzdaten
ein dem Endverdünnungstiter entsprechender Titer
ermittelt wird.
Die Erfindung dient zur Detektion und stufenlosen Quantifizierung
von Antikörpern oder Antigenen, wobei ein
einziger Probenansatz für die Untersuchung der Probe
ausreicht. Als Test können hierbei der Enzyme-Linked-Immunosorbent-
Assay (ELISA), der Radio-Immuno-Assay (RIA),
die Nukleinsäure-Hybridisierung, die Nephelometrie oder
andere Bestimmungsmethoden verwendet werden.
Die gängigen Quantifizierungsverfahren von Antikörpern
oder Antigenen lassen sich auf zwei grundsätzliche
Prinzipien zurückführen. Einmal kann die Quantifizierung
der zu bestimmenden Substanz über eine Bezugskurve
erfolgen, die vorher aus Proben mit bekannten Substanzgehalt
konstruiert wurde. Die alternative Möglichkeit
besteht in einer Titration der zu bestimmenden Substanz
mittels Endpunktverdünnung. Letzterer Weg empfiehlt sich
immer dann, wenn bei unverdünnt oder nur schwach verdünnt
zu testenden Proben die oben erwähnte Bezugskurve schwierig
zu erstellen oder nur unbefriedigend zu nutzen ist.
Dies ist beispielsweise bei der Bestimmung von testspezifischen
Antikörpern im ELISA der Fall.
Die ELISA-Methode ist ein bekannter Enzym-Immuntest, der
zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen bei parasitären,
bakteriellen oder viralen Infektionen dient. Die
Erfindung dient zur Verbesserung der Auswertung von
Farblösungen, die durch Inkontaktbringen beispielsweise
des auf bestimmte Antikörper zu testenden Serums in einer
speziellen Testverdünnung mit an Mikrotitrationsplatten
fixierten Antigenen mit nachfolgendem enzymatischen
Nachweis der gegebenenfalls entstandenen Antikörper-/-
Antigen-Komplexe gebildet werden. Insbesondere bezieht
sich die Erfindung auf die photometrische Auswertung
derartiger Lösungen, bei der die Extinktion oder optische
Dichte der so hergestellten Lösung gemessen wird, welche
ein Maß für die gebildeten, enzymatisch markierten
farbbildenden Immunkomplexe in der Lösung ist. In der
Regel wird ein Serum als positiv bewertet, wenn die
Extinktion der wie beschrieben gebildeten Lösung einen
bestimmten Grenz- oder Schwellenwert überschreitet.
Diskussionen über diese Art der Auswertung finden sich z.
B. in Immun. Infekt. 9, 3339, 1981.
Es ist jedoch wünschenswert, nicht nur das Überschreiten
oder Unterschreiten des Grenzwertes festzustellen,
sondern auch quantitative Aussagen über das Vorhandensein
von Antikörpern in dem zu testenden Serum machen zu
können. Es ist bekannt, für diesen Zweck sogenannte
"Verdünnungsreihen" durchzuführen, d. h. bei verschiedenen
Probenverdünnungen den ELISA durchzuführen und die
Extinktionen oder optischen Dichten der jeweils resultierenden
Farblösungen zu messen. Durch Verbinden der
einzelnen, photometrischen Meßwerte in einer Graphik
ergibt sich für jede Serumprobe eine sogenannte Probenverdünnungskurve
(Fig. 1). Diejenige Probenverdünnung,
bei der die Probenverdünnungskurve den vorgegebenen
Grenzwert schneidet, gibt für den zu bestimmenden
Antikörper die Endverdünnung an, wobei diese Endverdünnung
der reziproke Wert des Antikörpertiters ist
(Endverdünnungstiter). Die Quantifizierung des Antikörpers
erfolgt also über die Angabe der Probenverdünnung,
in der die Nachweisgrenze erreicht wird.
Für die Meßpunkte der Probenverdünnungskurve werden
häufig die gemessenen Extinktionswerte oder optische
Dichten nicht im direkt gemessenen Zahlenwert verwendet,
sondern es erfolgt meist eine Meßwertkorrektur. Die Art
der Korrektur kann in der Subtraktion des Meßwertes einer
im ELISA mitgeführten, geeigneten Kontrolle (Puffer,
negatives Serum) oder eines Parallelansatzes des zu
bestimmenden Serum mit an der Mikrotitrationsplatte
fixiertem Kontrollantigen oder einer Startextinktion bei
Beobachtung einer Farbentwicklungskinetik bestehen.
Weiterhin sind Multiplikationen des direkt gemessenen
Meßwertes mit einem Korrekturfaktor, der sich in geeigneter
Weise aus einem mitgeführten Standard ergibt, oder
auch die Angabe eines Quotienten bzw. Index möglich, der
sich durch Division des direkt gemessenen Meßwertes mit
dem einer mitgeführten, negativen Probe ergibt. Dieser
korrigierte Meßwert wird im weiteren als spezifisches
Farbsignal bezeichnet und liegt der Angabe des Endverdünnungstiters
zugrunde.
Der wesentliche Nachteil einer quantitativen Auswertung
auf die beschriebene Weise ist, daß die Durchführung
zeit- und reagenzienaufwendig ist. Es wurden deshalb
Versuche unternommen, aus der an einer einzigen Testverdünnung
im ELISA gemessenen Extinktion auf den Endverdünnungstiter
des Serums zu schließen. So beschrieben
beispielsweise van Loon und van der Veen in J. Clin.
Pathol. 33, 635-639, 1980, den Nachweis von Toxoplasma-
Antikörpern mit der ELISA-Methode unter Verwendung einer
einzigen Serumverdünnung in Verbindung mit einer Referenzkurve.
Dabei wird die Extinktion, die im ELISA bei
einer Serumverdünnung von 1 : 800 gemessen wurde, mit der
gleichen Extinktion in der Referenzkurve verglichen,
welche die an einer Reihe von Seren in der Testverdünnung
1 : 800 gefundene Extinktion als Funktion des Endverdünnungstiters
angibt. Dabei wurde diese Referenzkurve
graphisch als Mittelwert der Meßwerte an einer Vielzahl
von Seren konstruiert. Eine Verbesserung dieses Verfahrens
wird von van Loon et al. in J. Clin. Pathol. 34,
1981, 665-669, beschrieben, bei der die Extinktionswerte
durch die spezifischen Farbsignale ersetzt werden, welche
durch Subtrahieren der Extinktion eines auf 1 : 800 verdünnten
negativen Kontrollserums von der Extinktion des
Testserums erhalten werden. Auf diese Weise konnten
die Abweichungen experimentell vermessener Seren von der
Referenzkurve zumindest in einigen Fällen verbessert
werden. In anderen Fällen war die Verbesserung jedoch so
gering, daß der Vergleich mit einem negativen Kontrollserum
unnötig war.
Obgleich durch dieses bekannte Verfahren für die Praxis
bereits schon eine Vereinfachung erreicht worden
war, indem nämlich nur noch eine einzige Testverdünnung
hergestellt werden muß, weist dieses Verfahren doch
erhebliche Nachteile auf. Die für dieses Verfahren
geeignete und empfohlene Testverdünnung von 1 : 800 ist
sehr hoch, so daß sowohl die Empfindlichkeit des Verfahrens
zu gering wird (siehe schwach positives Serum in
Fig. 1) als auch Pipettierungsfehler sich potenzieren.
Außerdem ist in der Praxis das Arbeiten mit einer Referenzkurve
lästig oder erfordert bei automatischer Meßdatenauswertung
einen Computer.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen im
ELISA zu schaffen, bei dem nur eine möglichst geringe Verdünnung
der zu untersuchenden Probe hergestellt werden muß
und die Titerbestimmung in einfacher Weise, z. B. mittels
eines Taschenrechners durchgeführt werden kann.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren
gemäß den Merkmalen in Anspruch 1.
Vorzugsweise wird bei dem Verfahren als Signal AOD für
die Extinktion das vorstehend definierte spezifische
Farbsignal in die Formel (1) eingesetzt.
Als Testverdünnungen können Probenverdünnungen im Bereich
von unverdünnt bis 1 : 150 verwendet werden. In
diesem Fall ist die Testverdünnung noch so gering, daß
eine hohe Empfindlichkeit des Immuntestverfahrens gewährleistet
ist, zum anderen haben die Experimente gezeigt,
daß mit einer Testverdünnung von 1 : 150 relativ gut
reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden können.
Niedrigere Testverdünnungen sind möglich, erfordern aber
sowohl bei der immunologisch reaktiven Oberfläche z. B.
der antigenbeschichteten Mikrotitrationsplatte, als auch
dem Konjugat einen hohen Reinheitsgrad bei hoher Reaktivität.
Es hat sich gezeigt, daß brauchbare Werte für alpha im
Bereich von 3,0 bis 3,6 und für beta im Bereich von 0,10
bis 0,27 liegen.
Die richtigen Bestimmungen dieser Werte alpha und beta
bildet die Grundlage für die vorteilhafte Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens in der Praxis. Sobald einmal
optimale Werte für alpha und beta gefunden sind, kann die
Auswertung, d. h. die Titerbestimmung der Testprobe
rechnerisch sehr einfach durchgeführt werden. Die Werte
für alpha und beta können z. B. durch den Reagenzienhersteller
anhand von Versuchsreihen an einer Vielzahl von
Untersuchungsproben bestimmt werden, indem an diesen
Seren jeweils das spezifische Farbsignal bei der gewünschten
Testverdünnung gemessen und zusätzlich der Titer
in an sich bekannter Weise durch Endpunktverdünnung
bestimmt wird. Aus dem für jede Probe erhaltenen Wertepaar
werden dann durch iterative Anpassung geeignete
Werte für alpha und beta gesucht, für die die Übereinstimmung
zwischen dem durch Endpunktverdünnung gemessenen
Titer Tmess und dem aus der Formel (1) nach Einsetzen des
spezifischen Farbsignals errechneten Titer Trech ein
Optimum erreicht wird. Bei einem derartigen iterativen
Verfahren werden beispielsweise mit zunächst willkürlich
angenommenen Zahlenwerten für alpha und beta über Formel
(1) aus dem spezifischen Farbsignal jeder Probe die
zugehörigen Titer Trech errechnet. Außerdem wird durch
Endpunktverdünnung der Titer Tmess bestimmt.
Wenn der Quotient Tmess/Trech = 1,0 ist, würde dies
bedeuten, daß der richtige Titer aus der Extinktionsmessung
bei der Testverdünnung abgeleitet worden ist.
Unter realistischen Bedingungen muß ein Quotient zwischen
0,8 und 1,25 als "Titer exakt getroffen" angesehen
werden. Quotienten unter 0,5 und über 2,0 bedeuten, daß
die für eine klassische Titration zulässigen Reproduzierbarkeitsgrenzen
überschritten wurden.
Nach dem ersten Versuch, der üblicherweise eine noch
schlechte rechnerische Titervorhersage liefert, werden
dann alpha und beta schrittweise verändert und danach
erneut für jede Serumsprobe der errechnete Titer mit dem
gemessenen Titer verglichen. Dieses Iterationsverfahren
wird fortgesetzt, bis die Übereinstimmung zufriedenstellend
ist.
Die Versuche zeigten, daß davon ausgegangen werden kann,
daß das Optimum erreicht ist, wenn in einer Versuchsreihe
für etwa 50% der Seren gilt
0,8Tmess/Trech 1,25 (2)
Diese Erfahrungen beziehen sich auf Testreihen mit
alkalischer Phosphatase als Indikatorenzym. Wenn Peroxidase
als Indikatorenzym eingesetzt werden kann, kann die
"Trefferrate" auf etwa 65% gesteigert werden. Diese
Grenzen liegen jedoch im Bereich der Streuungen der
ELISA-Methode selbst und können somit durch das erfindungsgemäße
Verfahren zur quantitativen Auswertung der
Meßergebnisse nicht überwunden werden.
Weiterhin hat sich gezeigt, daß die Werte von alpha und
beta nicht nur von der Art des diagnostischen Tests,
sondern auch von den Herstellungschargen der eingesetzten,
immunologisch reaktiven festen Phase und des Konjugats
abhängen. Die beiden Konstanten müssen dementsprechend
für den praktischen Einsatz des Verfahrens z. B.
jeweils für die Kombination einer Testplatten- und einer
Konjugatcharge neu bestimmt werden, gestatten dann aber
Reihenmessungen an Proben, die untersucht werden sollen
mit guter Reproduzierbarkeit und für die Praxis sehr
guter Genauigkeit.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und
Meßergebnissen näher erläutert. Dabei wird auch auf die
beigefügten Zeichnungen Bezug genommen.
In den Zeichnungen zeigt
Fig. 1 gemäß dem Stand der Technik durchgeführte
Verdünnungsreihen in Form von Probenverdünnungskurven,
die das spezifische Farbsignal als
Funktion der Probenverdünnungen zeigen,
Fig. 2 die Abhängigkeit des spezifischen Farbsignals
bei einer Probenverdünnung von 1 : 150 von dem
tatsächlichen, durch Endverdünnung bestimmten
Titer (Tmess),
Fig. 3 die Abhängigkeit des nach der Formel (1)
errechneten Titers (Trech) vom spezifischen
Farbsignal bei einer Probenverdünnung von 1 : 150
an den gleichen Testreagenzien wie in Fig. 2
und
Fig. 4 den gemessenen Titer Tmess aus Fig. 2 im
Vergleich zu dem errechneten Titer Trech aus
Fig. 3 bei identischen spezifischem Farbsignal
der 1 : 150 verdünnten Untersuchungsproben.
Zur Prüfung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurden
Versuche zur Bestimmung von Antikörper gegen Cytomegalovirus
in Seren mittels Mikrotitrationsplatten, an deren
Wänden Cytomegalovirus-Antigen fixiert war, und
zur Bestimmung von Antikörper gegen Rubella in Seren
mittels Mikrotitrationsplatten, an deren Wand Rubella-
Antigen fixiert war, durchgeführt. Die Untersuchungsproben
in der Testverdünnung 1 : 150 wurden zur Reaktion
mit den fixierten Antigenen gebracht, die nicht gebundenen
Antikörper ausgewaschen, über eine Konjugatlösung ein
Enzym an den gebildeten Antikörper-/Antigen-Komplexen
gebunden, die überschüssige Konjugatlösung ausgewaschen,
mittels einer chromogenen Substratlösung die Einfärbung
über das Ezym bewirkt und anschließend mit einer Stop-
Lösung die Reaktion beendet. Die so hergestellten, in
Abhängigkeit vom Gehalt der virusspezifischen Antikörper
eingefärbten Proben wurden dann bewertet, indem ihre
optische Dichte oder Extinktion AOD photometrisch (bei
einer definierten Wellenlänge) bestimmt wurde.
In Verdünnungsreihen wurde bei denselben Proben zum einen
der Endverdünnungstiter Tmess in an sich bekannter Weise
bestimmt und mit dem über die Formel (1) gemäß der
Erfindung berechneten Titer Trech verglichen.
Zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und der Genauigkeit
des Verfahrens wurden in allen Fällen die spezifische
Extinktion oder das "spezifische Farbsignal AOD"
verwendet.
Fig. 1 zeigt eine Kurvendarstellung des spezifischen
Farbsignals AOD in Abhängigkeit von verschiedenen Probenverdünnungen
(Probenverdünnungen-1) für drei positive
Seren A, B und C und für ein negatives Serum D. Die
exemplarischen Darstellungen zeigen Kurvenverläufe, die
nur in Bereichen höherer Testverdünnungen, beispielsweise
1 : 800, zu parallelisieren sind. Hierauf beruht die
Erstellung einer geeigneten Referenzkurve nach van Loon.
Während das Abknicken der Probenverdünnungskurve bei
einem Serum mit hohem Antikörpertiter (Beispiel A) den
literaturbekannten Prozoneneffekt darstellt, ist es
nicht ganz klar, warum die Verdünnungskurven im unteren
Bereich in der Nähe des Endverdünnungstiters abgeflacht
werden.
Es wurde nun gefunden, daß der durch eine Verdünnungsreihe
bestimmte Endverdünnungstiter an einer breiten
Vielfalt von Proben zu der bei einer Testverdünnung von
z. B. 1 : 150 gemessenen Extinktion in der Beziehung steht:
wobei die Konstanten alpha und beta eine Anpassung an die
Proben- und Testbedingungen gestatten.
Diese Tatsache ergibt sich aus den Fig. 2 bis 4. In
Fig. 2 ist die Abhängigkeit des spezifischen Farbsignals
AOD von 58 Seren in einer Verdünnung von 1 : 150 als
Funktion des durch Endverdünnungen bestimmten Titers Tmess
aufgetragen. Andererseits zeigt Fig. 3 den Titer, der
nach Formel (1) aus der Extinktion AOD bei optimalen
Werten für alpha und beta berechnet worden ist. Die
geringe Streubreite dieser Kurve ergibt sich aus der
mathematischen Erstellung.
Fig. 4 zeigt nun deutlich, daß die nach Formel (1)
errechnete Kurve der Titerwerte die Meßwerte hervorragend
mittelt. Hieraus ergibt sich somit, daß mit dem Verfahren
der Erfindung eine optimale Voraussage der Endverdünnungstiter
erzielt werden kann.
Diese gute Übereinstimmung zwischen Trech und Tmess wird
allerdings nur dann erhalten, wenn Sorgfalt auf die
Bestimmung der Werte für alpha und beta gelegt wird.
Anhand der folgenden Tabelle von gemessenen und
rechnerisch ermittelten Daten einer Versuchsreihe an 60
Seren wird nun als Beispiel das Vorgehen zur Bestimmung
und Optimierung von alpha und beta erläutert.
In Spalte 1 der Tabelle sind Meßwerte des spezifischen
Farbsignals an Proben in einer Testverdünnung von 1 : 150
für 60 Seren angegeben. In Spalte 2 ist der durch Endverdünnungsreihen
gemessene Titer Tmess für die gleichen
Seren angegeben. In Spalte 3 zeigt für die gleichen Seren
jeweils den nach Formel (1) aus dem Farbsignal der Spalte
1 unter Verwendung der nach Optimierung gefundenen Werte
alpha = 3,4514 und beta = 0,2106 berechneten Titer Trech.
Mit Hilfe moderner zur Verfügung stehender Rechner
bedeutet es heute keinen hohen Aufwand, das angewendete
iterative Verfahren zur Optimierung von alpha und beta
für bestimmte Reagenzienkombinationen von einem Fachmann
programmieren zu lassen.
Der Quotient Tmess/Trech ist nachfolgend angegeben, und
zwar gewichtet nach "zu klein" (kleiner als 0,8), "etwa
gleich 1" (im Bereich von 0,8-1,25) und "zu groß"
(größer als 1,25).
In dem dargestellten Fall ist ersichtlich, daß für 45%
der Seren eine gute Näherung erzielt worden ist. Unter
Berücksichtigung der Streubreite der Endverdünnungstiter,
die aus Fig. 2 ersichtlich ist, kann deshalb die Wahl
der Werte für alpha und beta als für die Praxis sehr gut
angesehen werden.
Claims (9)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in
Testflüssigkeiten nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung der
aus den Testflüssigkeiten hergestellten Proben mit enzymatisch markierten
Antigen/Antikörperkomplexen, bei dem nur eine einzige Testverdünnung, die im
Bereich von unverdünnt bis 1 : 800 liegen kann, der Probe hergestellt wird, bei dieser
Testverdünnung eine Antikörper/Antigen-Bindungsreaktion ausgelöst wird, wobei ein
Reaktionspartner an einer festen Oberfläche fixiert ist und der Antigen/
Antikörperkomplex einer enzymatisch herbeigeführten Farbreaktion unterworfen
wird, um eine Farblösung herzustellen, und wobei aus der an dieser Farblösung
gemessenen Extinktion unter Verwendung vorher gemessener Referenzdaten ein
dem Endverdünnungstiter entsprechender Titer ermittelt wird, wobei die Extinktion
(oder optische Dichte) der Farblösung gemessen wird, der Meßwert in einen
Rechner übertragen wird, der aus dem erhaltenen Signal AOD der Titer nach der
Formel:
log Titer = alpha · AOD beta (1)ermittelt, der dem durch Verdünnungsreihen erhaltbaren Endverdünnungstiter
gleichgesetzt wird, wobei in der Formel (1) der "Titer" der reziproke Wert derjenigen
Endverdünnung ist, bei der das Signal AOD dem Grenzwertsignal an der Nach
weisgrenze gegenüber negativen Kontrollproben entspricht, und die Werte alpha und
beta bei festgelegter Testverdünnung für die jeweilige Kombination von immunolo
gisch reaktiver Oberfläche und enzymmarkiertem Immunglobulin bzw. Antigen als
Detektor bei gleichen Umsetzungs- und Fixierbedingungen getrennt experimentell
durch Versuchsreihen an Proben mit bekanntem Endverdünnungstiter des Analyten
bestimmt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
als Signal AOD für die Extinktion oder optische Dichte
das spezifische Farbsignal in die Formel (1) eingesetzt
wird, das
- a) durch Subtrahieren des Extinktionssignals einer im ELISA mitgeführten Kontrolle (z. B. Puffer oder negative Probe) oder des Extinktionssignal eines Parallelansatzes der zu untersuchenden Probe auf einer mit einer Kontrollpräparation beschichteten Oberfläche oder des Extinktionssignals als Beginn einer Farbzunahmemessung von dem Extinktionssignal der zu untersuchenden Probe,
- b) durch Multiplizieren des Extinktionssignals der zu untersuchenden Probe mit einem sich aus einer mitgeführten Versuchskontrolle ergebenden Korrekturfaktor, oder
- c) nach Quotienten- bzw. Indexbildung aus dem Extinktionssignal der zu untersuchenden Probe und dem einer mitgeführten Versuchkontrolle (z. B. negative Probe)
erhalten worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
das als Testverdünnungen Probenverdünnungen von
etwa 1 : 150, verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß für alpha-Werte im Bereich von 3,0 bis
3,6 und für beta im Bereich von 0,10 bis 0,27 verwendet
werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Werte für alpha und beta durch
Versuchsreihen an einer Vielzahl von Testflüssigkeiten
oder Proben bestimmt werden, indem an diesen Proben
jeweils das Signal AOD bei der gewünschten Testverdünnung
gemessen und außerdem der Titer in an sich
bekannter Weise durch Endpunktverdünnung bestimmt wird
und dann aus den erhaltenen Wertepaaren (Titer, AOD)
für die einzelnen Testflüssigkeiten oder Proben durch
iterative Anpassung geeignete Werte für alpha und beta
gesucht werden, für die die Übereinstimmung zwischen
dem durch Endpunktverdünnung gemessenen Titer (Tmess)
und dem aus der Formel (1) durch Einsetzen des Signals
AOD errechneten Titer (Trech) ein Optimum erreicht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
iterativ das Wertepaar für alpha und beta ermittelt
wird, bei dem der jeweilige Quotient Tmess/Trech der
einzelnen Testflüssigkeiten oder Proben am häufigsten
im Bereich von 0,8 bis 1,25 liegt.
7. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1
bis 6 zur Bestimmung des Vorhandenseins von Rubella
(IgG; IgM)-Antikörpern, Cytomegalovirus (IgG; IgM)-
Antikörpern oder Hepatitis B-Oberflächen-Antigen
(HBsAg) in Seren mittels Mikrotitrationsplatten, an
denen entsprechend Rubella-Antigen, Cytomegalovirus-
Antigen oder Antikörper gegen HBsAg fixiert sind.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß alkalische Phosphatase oder Peroxidase als Indikatorenzym
eingesetzt wird.
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3639279A DE3639279C3 (de) | 1986-10-24 | 1986-11-17 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
EP19870115218 EP0264866A3 (de) | 1986-10-24 | 1987-10-17 | Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von diagnostisch relevanten Substanzen, insbesondere Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
NO874405A NO170908C (no) | 1986-10-24 | 1987-10-22 | Immunokjemisk fremgangsmaate for paavisning og bestemmelse av diagnostisk relevante substanser samt anvendelse av fremgangsmaaten |
AU80084/87A AU602170B2 (en) | 1986-10-24 | 1987-10-23 | A method for determining the presence of substances of diagnostic relevance, in particular antibodies or antigens, by the ELISA method with photometric evaluation |
MX896487A MX168603B (es) | 1986-10-24 | 1987-10-23 | Procedimiento para la determinacion de la presencia de sustancias importantes para la diagnosis, en particular anticuerpos o antigenos segun el metodo elisa mediante evaluacion fotometrica |
JP62266667A JP2595267B2 (ja) | 1986-10-24 | 1987-10-23 | 測光的評価を用いる物質の測定法 |
CA 550085 CA1287799C (en) | 1986-10-24 | 1987-10-23 | Method for determining the presence of substances of diagnostic relevance, in particular antibodies or antigens, by the elisa method with photometric evaluation |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3636271 | 1986-10-24 | ||
DE3639279A DE3639279C3 (de) | 1986-10-24 | 1986-11-17 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3639279A1 DE3639279A1 (de) | 1988-04-28 |
DE3639279C2 DE3639279C2 (de) | 1993-08-19 |
DE3639279C3 true DE3639279C3 (de) | 1996-06-20 |
Family
ID=6312429
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3639279A Expired - Lifetime DE3639279C3 (de) | 1986-10-24 | 1986-11-17 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3639279C3 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1630558A1 (de) | 2004-08-27 | 2006-03-01 | Virion / Serion GmbH | Diagnostisches Testsystem für den Nachweis von Antikörpern gegen Erreger von akuten respiratorischen Infektionen und atypischen Pneumonien |
DE102006012885A1 (de) * | 2006-03-18 | 2007-09-20 | Institut Virion/Serion Gmbh | Diagnostisches Testsystem zum simultanen, quantitativen Nachweis von HIV1 und HIV2 Antikörpern und/oder HIV Antigenen in humanem Probenmaterial |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19527160C1 (de) * | 1995-07-25 | 1997-01-23 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms durch photometrische Absorptionsmessung eines enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung |
-
1986
- 1986-11-17 DE DE3639279A patent/DE3639279C3/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1630558A1 (de) | 2004-08-27 | 2006-03-01 | Virion / Serion GmbH | Diagnostisches Testsystem für den Nachweis von Antikörpern gegen Erreger von akuten respiratorischen Infektionen und atypischen Pneumonien |
DE102006012885A1 (de) * | 2006-03-18 | 2007-09-20 | Institut Virion/Serion Gmbh | Diagnostisches Testsystem zum simultanen, quantitativen Nachweis von HIV1 und HIV2 Antikörpern und/oder HIV Antigenen in humanem Probenmaterial |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3639279A1 (de) | 1988-04-28 |
DE3639279C2 (de) | 1993-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2847176C2 (de) | Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum | |
DE68921650T2 (de) | Immunoassays. | |
DE3006899C2 (de) | ||
DE68924064T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyte durch Anwendung verschiedene Typen von Partikeln, welche durchflusszytometrisch unterschieden sind. | |
DE69412137T2 (de) | Sensoreinrichtung zum sandwichtest | |
DE60218695T2 (de) | Biosensoren und messverfahren | |
DE69025940T2 (de) | Durch Silber intensiviertes, auf Goldmarkierung beruhendes Immuntestverfahren | |
EP0576879B1 (de) | Verfahren zur analytischen Bestimmung der Konzentration eines Bestandteils einer medizinischen Probe | |
DE2503627A1 (de) | Verfahren zum nachweis von antigenen oder antikoerpern | |
DE60117699T2 (de) | Analyseverfahren durch spezifisches binden und vorrichtung, die das verfahren einsetzt | |
DE2920276A1 (de) | Nephelometrisches immunbestimmungsverfahren und nephelometer | |
DE2409273A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zum messen von antigen-antikoerper-reaktionen | |
DE3922960A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines analyten | |
DE2602068C2 (de) | Reagens zur Unlöslichmachung eines Antigen/Antikörper-Komplexes | |
DE2406959A1 (de) | Anordnung zur bestimmung von antigenen | |
DE69024453T2 (de) | Verbessertes Kalibrierungsverfahren | |
EP0957360B1 (de) | Entstörung durch Rheumafaktoren | |
EP0263401B1 (de) | Immunometrisches Bestimmungsverfahren | |
EP0243655B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung eines Reaktionspartners einer immunologischen Reaktion | |
DE69523027T2 (de) | Kalibrierung und Prüfung von Immunoassays zur Verminderung von Störungen | |
DE3639279C3 (de) | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung | |
EP0264866A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von diagnostisch relevanten Substanzen, insbesondere Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung | |
EP0366092B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von für ein Antigen klassenspezifischen Antikörpern und dazu geeignetes Reagenz | |
DE68907365T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins leichter Ketten in Urinproben, Komplex von Vorbereitungen zur Erledigung des Verfahrens und damit verbundenes Reagenz. | |
DE4309529A1 (de) | Analytisches Verfahren und Vorrichtung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: DOPATKA, HANS-DETLEF, DR., 3550 MARBURG, DE |
|
D2 | Grant after examination | ||
8363 | Opposition against the patent | ||
8366 | Restricted maintained after opposition proceedings | ||
8305 | Restricted maintenance of patent after opposition | ||
D4 | Patent maintained restricted | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: BEHRING DIAGNOSTICS GMBH, 35041 MARBURG, DE |
|
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH, 35041 MARBURG, DE |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee | ||
8370 | Indication of lapse of patent is to be deleted |