DE2847176C2 - Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum - Google Patents

Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum

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Description

(e) Korrektur des in (a) erhaltenen Extinktionswertes für die zu bestimmende Substanz mit den in (b), (c) und (d) erhaltenen, durch Lipoproteine, Hämoglobin bzw. Bilirubin hervorgerufenen Extinktionsinkrementen.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Lipoprotcincn, Hämoglobin und Bilirubin durch Aufnahme des Spektrums einer einfach zu analysierenden Substanz ermittelt wird und mit diesen Werten der Extinktionswert der eigentlich zu bestimmenden Substanz korrigiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den Schritten (b), (c) und (d) das Zweiweilenlängenverfahren angewandt wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum in Gegenwart von störenden Chromogenen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Die heutige Tendenz zur Automatisierung auf dem Gebiet der Biochemie ist beträchtlich. Verschiedene
Arten automatischer klinischer Analysatoren oder Meßzellen einschließlich mit kontinuierlicher Probenströmung arbeitender Analysatoren sind bereits entwikkelt worden. Diese Analysenautomaten erlauben die Analyse einer sehr hohen Anzahl von Proben und haben zudem erheblich zur Verbesserung der Meßgenauigkeit beigetragen. Unter dem Gesichtspunkt der Genauigkeit der Messungen werfen jedoch die gegenwärtig verfügbaren automatischen klinischen Analysatoren noch einige Probleme auf und erfüllen bei weitem noch nrht die praktischen Anforderungen, da verschiedene Chromogene wie das bei Hämolyse auftretende Hämoglobin, das bei Ikterus auftretende Bilirubin oder die durch Lipoproteine hervorgerufene Chylustrübung zu einem Verlust der Meßgenauigkeit bei Analysenautomaten führzn.
Der Einfluß störender Chromogene ist insbesondere bei photometrischen und nephelometrischen Methoden beträchtlich, die nach dem Endpunkt-Verfahren arbeiten, jedoch bei kinetischen Verfahren (Messung der Reaktionsgeschwindigkeit) sehr klein. Die Anwendung kinetischer Verfahren ist zwar bei allen biochemisch zu untersuchenden Materialien grundsätzlich möglich, jedoch treten Probleme hinsichtlich der Preise der Reagentien, der Kompliziertheit der Durchführung und der Analysengeschwindigkeit auf. Entsprechend wird in jüngster Zeit ein sehr hoher Anteil aller Analysen nach photometrischen Endpunkt-Verfahren durchgeführt.
Die Entwicklung eines photometrischen Verfahrens, zu denen auch die nephelometrischen Verfahren gerechnet werden, das von Chromogenen unbeeinflußt ist und zu einer hohen Genauigkeit führt ist demgemäß für die Automatisierung von Analysatoren von großer Bedeutung.
Eine Methode, die bisher zur Verhinderung von Störungen durch diese Chromogene als am grundlegendsten angesehen wurde, besteht in der Messung einer Blindprobe für jede Versuchsprobe und jeden Test Obwohl dabei zahlreiche Probleme zu diskutieren sind, z. B. die Zusammensetzung des Reagens, wird grundsätzlich der Proben-Leerversuch mit einem Reagens gemessen, das bestimmte Materialien nicht enthält die für die Meßreaktion wesentlich sind, und der Meßwert der Versuchsprobe aus dem Unterschied zwischen dem Meßwert mit diesem Reagens und dem Meßwert mit der Reaktionslösung. Mit dieser Methode sind genaue Analysenergebnisse zu erhalten, die nahe dem richtigen Wert liegen und nicht von störenden Materialien beeinflußt sind. Wenn jedoch dieses Korrekturverfahren mit Proben-Leerversuch bei automatischen klinischen Analysatoren verwendet wird, sind zwei Messungen für jede Probe erforderlich, und die Verarbeitungsgeschwindigkeit des Analysators ist notwendig auf die Hälfte herabgesetzt, während eine erhöhte Anzahl von Reagentien erforderlich ist Entsprechend wird diese Methode gegenwärtig mit Ausnahme bestimmter spezieller Tests nicht angewandt Ein anderer Faktor, der zu einem Verlust an Meßgenauigkeit bei photometrischen Verfahren führt, besteht im Auftreten von Luftblasen und Feststoffen, die sowohl bei photometrischen Verfahren mit Strömungszelle als auch bei direkten photometrischen Verfahren mit Reagenzglas oder Prober.küvctte beobachtet werden.
Es gibt mehr als 40 Arten von Substanzen, die durch photometrische Verfahren in biochemischen Tests bestimmbar sind. Bisher werden hierzu Einwellenlängen- oder Zweiwellenlängen-Verfahren angewandt. Bei
der erstgenannten Verfahrensweise wird die Lichtextinktion bei einer be. timmten Wellenlänge nahe dem EntinkiionsmaMmum eines der Versuchsprobe oder einem Reaktionsprodul t entsprechenden reagierenden Materials entsprechend und bei der an zweiter Stelle genannten Verfahrensweise die Differenz zwischen den Lichtextinktionen bei einer Wellenlänge nahe dem Extinkiionsmaximum und bei einer anderen geeigneten Wellenlänge gemessen. Beide Verfahrensweisen sind jedoch dem Einfluß durch störende Chromogene ausgesetzt.
Aus der DE-AS 20 49 716 ist ein Verfahren zur Hämoglobinbestimmung bekannt, bei dem gegenüber früheren Verfahrensweisen nur mehr eine Messung zur Berücksichtigung eines störenden Absorptionseinflusses durchgeführt zu werden braucht Das Verfahren beruht darauf, daß bei verschiedenen Wellenlängen gemessen wird, wobei die Anzahl der Wellenlängen, bei denen die Absorptionsmessungen durchgeführt werden, um 1 größer ist als die Anzahl der in Abhängigkeit von der empfangenen Wellenlänge wesentlich absorbierenden Bestandteile.
Diese Verfahrensweise beruht folglich put" der Voraussetzung, daß das Ausmaß der Lichtabsorption durch störende Bestandteile über den gesamten vermessenen Wellenlängenbereich gleich ist, wobei sich der gemessene Absorptionswert der Probe bei der entsprechenden Wellenlänge aus der Lichtabsorption der zu bestimmenden Komponente selbst und der durch störende Bestandteile hervorgerufenen Lichtabsorption zusammensetzt. Ferner wird bei einer Wellenlänge, bei der die zu bestimmenden Bestandteile kein Licht absorbieren, die Lichtabsorption der störenden Bestandteile gemessen. Die Meßwertermittlung erfolgt bei diesem Verfahren durch Substraktion des Absorptions- J5 werts der störenden Bestandteile bei einer Wellenlänge, bei der die zu bestimmenden Komponenten keine wesentliche Absorption aufweisen, vom Absorptionswert der zu bestimmenden Komponente bei einer geforderten Wellenlänge. Blutproben enthalten jedoch drei Hauptstörsubstanzen (Bilirubin, Hämoglobin, Lipoproteine), deren Lichtabsorption jeweils in komplexer Weise von der Wellenlänge abhängt Die aus der DE-AS 20 49 716 bekannte Verfahrensweise eignet vieh daher lediglich für solche praktischen Fälle, bei denen die Lichtabsorption der störenden Bestandteile über den gesamten zu vermessenden Wellehlängenbereich gleich ist, nicht jedoch für solche Fälle, bei denen die störenden Bestandteile bei unterschiedlichen Wellenlängen unterschiedliche Absorption aufweisen und ihre Extinktion beispielsweise in Abhängigkeit von der Wellenlänge ansteigt oder abfällt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur genauen photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum in Gegenwart störender Chromogene anzugeben, bei dem die Extinktion der Probe bei mehreren verschiedenen Wellenlängen gemessen und für jeden bezüglich seines Absorptionscinflusses zu berücksichtigenden Probenbestandteil mindestens eine Messung durchgeführt wird, wobei to zugleich die störenden Bestandteile quantitativ ermittelt werden,
Die Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum in Gegenwart von störenden Chromogenen, wobei die Extinktion der Probe bei mehreren verschiedenen Wellenlängen gemessen und für jeden bezüglich seines Absorptionseinflusses zu berücksichtigenden Probenbestandieil mindestens eines Messung durchgeführt wird, gelöst durch folgende Schritte zur Ausschaltung von durch Lipoproteine, Hämoglobin und Bilirubin hervorgerufenen Störungen:
(a) photometrische Messung einer zu bestimmenden Substanz im UV-Bereich;
(b) Bestimmung des Lipoproteingehalts der Probe durch Extinktionsmessung im langwelligen Bereich des sichtbaren Spektrums, in dem die Absorption durch Lipoproteine bedingt und nicht durch Hämoglobin und Bilirubin beeinflußt ist,
(c) Bestimmung des Hämoglobingehalts der Probe durch
— Extinktionsmessung im Bereich mittlerer Wellenlängen des sichtbaren Spektrums, in dem die Absorption durch Lipoproteine und Hämoglobin bedingt, aber nicht von Bilirubin beeinflußt ist, und
— Korrektur des Meßwerts durch den in (b) ermittelten Lipoproteingehalt.
(d) Bestimmung des Bilirubingehalts dpr Probe durch
— Extinkiionsmessung im kurzwelligen Bereich des sichtbaren Spektrums, in den* die Absorption durch Lipoproteine, Hämoglobin und Bilirubin bedingt ist, und
— Korrektur des Meßwerts durch den in (b) ermittelten Lipoproteingehalt und den in (c) ermittelten Hämoglobingehalt
(e) Korrektur des in (a) erhaltenen Extinktionswerts für die zu bestimmende Substanz mit den in (b), (c) und (d) erhaltenen, durch Lipoproteine, Hämoglobin bzw. Bilirubin hervorgerufenen Extinktionsinkrementen.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Der Probe kann vor der photometrischen Messung ein geeignetes Farbreagens zugesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl bei der Einwellenlängen-Methode als auch bei der Zweiwellenlär.gen-Methode angewandt werden; in beiden Fällen werden die Meßergebnisse durch den Lipoproteingehalt, den Hämoglobingehalt und den Bilirubingehalt korrigiert, die für die gleiche Probe ermittelt wurden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Es zeigt
F i g. 1 Absorptionsspektren von verschiedenen Blutseren;
Fig. 2 Blutserum-Absorptionsspektren im sichtbaren Wcllcnlängenbereich Dei einer GOT-Rcaktion und
F i g. 3 Referenzspektren für Lipoproteine, Hämoglobin und Bilirubin in derGOT-Meßflüssigkeit.
Zunächst wird die Beziehung zwischen den störenden Komponenten und den Absorptionsspektren bei der photometrischen Analyse anhand von F i g. t erläutert.
In Fig. I entspricht die Kurve 10 dem Absorptionsspektrum eines idealen Blutserums, das frei von störendem Material ist; Kurve 12 entspricht einem Absorptionsspektrum eines realen Blutserums, das Chylus, Hämolyse- und Ikterusprodukte, d. h. Lipoproteine, Hämoglobin und Bilirubin, als Stö.'substanzen enthält. Kurve 13 ist ein Absorptionsspektrum des gleichen Blutserums wie bei Kurve 10, dem jedoch Luftblasen bzw. Feststoffe zugemischt sind.
Wenn in Fig. 1 das Einwellenlängenverfahren bei
einer Wellenlänge A2 zugrundcgelegt wird, sollten die Konzentrationen der Testkomponente in diesen drei Versuchsproben ungefähr gleich sein: tatsächlich sind jedoch die Meßwerte von Kurve 12 ungefähr zweimal so !loch und die Meßwerte von Kurve 13 ungefähr «. viermal so hoch w ie die Meßwerte von Kurve 10.
Wenn vom Zweiwellcnlängenverfahrcn ausgegangen wird, verschieben kleine Luftblasen oder Feststoffe im allgemeinen die Spektren parallel zur Ordinate, wobei die Fehler nicht so groß wie beim Einwellenlängenverfahren sind. Beim Zweiwellenlängenverfahren liegt jedoch eine komplizierte Störung durch die Chromoge· ne vor. wie dies aus Kurve 12 ersichtlich ist; wenn die Wellenlangen Aj und Aj bzw. Aj und At verwendet werden, tritt ein positiver Fehler von 50% bzw. ein negativer Fehler von 30% auf.
Die Absorptionsspektren von l.ipoproteincn. Hämoglobin und Bilirubin als störende Chromogent. die oft im realen Blutserum enthalten sind, sind von der f'robenteschat'lcnheit abhangig und überlagern sich in zali'rci- .ι ϊ ι β-chen Fallen. Die quantitative phntomcirischc Analyse ist dahi.T schwierig. Wenn diese Absorptionsspektren der Absorption durch die Versuchsprobe überlagert sind, k.inn folglich, wenn überhaupt eine Bestimmung möglich ist. nur eine geringe Genauigkeit erzielt .'■-, werden. Wenn zahlreiche Substanzen gleichzeitig in der gleichen Versuchsprobe zu untersuchen sind, wie dies bei automatischen Vielfach-Analysatoren der Fall ist, ist es daher einfacher, die am einfachsten zu analysierende Substanz zu bestimmen und mit ihr die Mengen der drei jo störenden Substanzen aus dem sich ergebenden Spektrum zu bestimmen und die Messungen für andere Substanzen mittels den ermittelten Werten der störenden Substanzen zu korrigieren, als für jede zu bestimmende Substanz ein Spektrum zu analysieren -,s
Substanzen, die sich am einfachsten für die Analyse der störenden Chromogenc eignen, sind solche, die durch liV-Absorptionsspektromctric bestimmbar sind ι. B. Glutaminsäure-Oxyarocssigsäure-Transümiiiasc (GOT).Glutaminsaure-Brenztraubensäurc-Trans.'mina- '« se (GPT). Lactatdchydrogenuse (LDH) und Hydroxybuttersauredehydrase (HBDH). Bei der Messung dieser Substanzen absorbiert die Testprobe, d. h. Nicotir.arr.idadenindinucleotid (NAD · H). lediglich im UV-Bereich, weshalb im sichtbaren Wellenlängenbereich keine »> Überlagerung mit dem Absorptionsspektrum der störenden Substanzen auftritt. Da das Reagens ferner keine Substanz enthält, die mit Hämoglobin. Bilirubin oder Lipoproteinen reagiert und es sich um eir.e neutrale Pufferflüssigkeit (pH = 7.4) handelt, sind die Spektren der störenden Substanzen relativ einfach und damit leicht zu analysieren.
F i g. 2 zeigt ein Absorptionsspektrum eines typischen Blutserums im sichtbaren Wellenlängenbereich, das für die GOT-Reaktion im UV-Bereich gemessen wird. Kurve 14 ist ein NAD · H-Absorptionsspcktrum eines idealen normalen Blutserums, das vollständig frei von störenden Chromogenen ist. im Vergleich zu Wasser; Kurve 16 ist ein Absorptionsspektrum eines Blutserums mit einem hohen Gehalt an Lipoproteinen im Vergleich uo zum Leer-Reagens; Kurve 18 ist ferner ein Absorptionsspektrum eines Blutserams mit einem hohen Gehalt an Bilirubin, gemessen gegenüber einem Leer-Reagens. Für die eingetragenen Wellenlängen gilt
An =340 nm,
Ai2=37ö nm,
Ai3=415nm, mit
Λ·,-.4Μ) um.
Ai;«=4)*<! MtIi,
Αι.. = 505 um.
Αι; « 54ti um
Ais »5/0 um.
A|o=«b(>" mn.
Aj-J = 660 nm,
Aj, =700 rn
und
Aj2 = BSC nm.
Durch Analyse der SpeV.trcn des k'·;« .·;.'>
sichtbaren Welijnlängcnbereich bei ,-Ur GOT Mc
können die Mengen der st 'rcnilon C!\··<.'. 'j
best Tint werden.
Im folgenden «ird ein Aust irrung.sfiei-.pi·.'!
Erfindung ni'her erläutert, das mn ciro ;i Analyser· 1
mater1 mit 12 MeU'^o!lenl;irgcM er,-lesen w
ist ein
SpeVc tr-irTi e\i?r e ru. COT -M.■!'-'!us
Komponente."!. Kurse 20
Lipop'wtein\i?rfrlo/'lii-!'ii, is'
sijrkeit verdünnt 1s1.; Κιι,-.e 22 ist Jin .ipokirurn tiiK'i Hämoglobin enthahcni'vt: Vcrglcit h:-llüss:.:keii. <iie ιρί GOT-Meiliiuss^l.LMi veri'-.innt is;; Kiirvc 24 ist ι·;γ»ογ ein Spektrum für eine Bilirubin enthaltende \ er^ievhäflüssigkeit, die ebenfalls mit GOT-M«.l?.f!i:s«:i;!kcit verdiinnt 'St. D:e Lipo irotein Vergleich' flüv.i/ki-it "s.:rd d'jrc* Verdünnen eines PolystyroiUtox mit Polssiymlpartikeln in der Größenordriin^ · on 20 KunkelTinheiten mit GOT-Re.igons hergestellt; dit Hämoglobin-V-.---glcichsi'lüssigkjit wird Jnrch ^'erd'.innen einer tlan-.oglobinlösuiie iv.it '.OCO mg/dl :ii: GOT-Meßflü^ipkeit bei gleichen Bedingungen wie das i.iitersiidru' Bin's;· run hergestellt; die Bilirubin-Vcrgleicinflusiigkeit wird durch Verdünnen eines Biliruhin-Kontrollbl'iiscrums v(,n 10mg/di mit (iOT-MeBfiiiss'irkcit bei gleichen Bedingungen wie das untersuchte H'.Ltscrum crhiittn. Die Kurven 20, 22 und 2-t sind pcgenJber rineri Lcerrcafcns gemessen. Die verwenjt-i-r. We'.'en!ar;j;e» sind gleich wie η Fig. 2.
Aus Fig. 3 iolgt. daß von der Absorption im Proben-Leerversiich. die im sichtbaren Wellenlangenbereich nvt GOT-Rcag'.T.s auftntt. die Absorptii<i; im !angw eiligen Bereich (λ.-.j bis A;.·) d-jrch Lipop-otcine. die Absorptioi- im mittleren WclleVarj-onbereieh (A;,■ bis A-i) auf Lip:>pn)tcir.(* und Ha.iriilobin und die Absorption im kurzweiligen Bereich (An bis A:,) durch Lipoproteine Hämoglobin und Bilirubin bedingt ist. Damit können diese drei komponenten getrennt in folgender Weise unterschieden werden:
Die Absorptionsspektren der Testprobe als P'aktünt in der GOT-Messung werden über den gesamten Weilenlängenbereich mit dem Vielweilenlängen-Spcktrometer gemessen; der GOT-Wert der Testprobe wird durch die UV-Absorption bestimmt. Gleichzeitig werden die Gehalte an Lipoproteiner. Hämoglobin und Bilirubin im Blutserum der Testprobe aus den Spektren im sichtbaren Welienlängenbereich wie foigt festgelegt:
Die Lipoproteinmenge X wird aus der Differenz der Extinktion bei zwei Wellenlängen, z. B. Ä20 und Ä21, ermittelt, die zwischen Ä» und A21 liegen, d. h. nach
(D
Λ: Ji - Differenz der Extinktion der Testprobe bei Wn-it -den Wellenlängen Aji,und A21
I,,. y - Konstant, die einer Exlinktionsdifferenz flis-·.* -pro Einheit der Trübung entspricht und aus ·, dem Spektrum 20 bestimmt ist.
Konstante, die einer Extinktionsdifferenz pro Einheit Hämoglobin entspricht und .ms dem Speklrum 22 bestimmt ist.uad Konstante, die eirer Cxtinktkinsdifiereriz pro Einheit Bilirubin entspricht und aus dem Spektrum 24 bestimmt ist.
Der Himoglobingehalt V'wird aus der Extinktionsdifferenz A -χ - η für zwei Wellenlängen (z. B. Au und Ah) im mittleren Wellenlängenbereich bestimmt, d. h. nach
(2)
Konstante, die einer Extinktionsdifferenz
pro Einheit der Trübung entspricht und aus dem Spektrum 20 bestimmt ist,
und
Konstante, die einer Extinktionsdifferenz
pro Einheit Hämoglobin entspricht und aus dem Spektrum 22 bestimmt ist.
Der Bilirubingehalt Z wird aus der F.xtinkiionsdifferen/ Λ15-16 für zwei Wellenlängen (z. B. An und Ai0) im Bereich kurzer Wellenlängen bestimmt, d. h. nach
Z -
15 16
- Y
(3)
— Konstante, die einer Extinktionsdifferenz pro Einheit der Trübung entspricht und aus dem Spektrum 20 bestimmt ist.
Mit dem Lipoprotcingehalt X. dem Hämoglobingehalt Y und dem Bilirubingehalt Z die in der obigen Weise bestimmt sind, werden die erhaltenen Extinktionswerte S nach der folgenden Gleichung korrigiert, um genauere Meßwerte 5" zu erzielen:
S-a: X-ß-Y-yZ
mit λ. β und }' ·= Koeffizienten, die durch Messung von Vergleichsfiihsigkciten mit Lipoproteine nen. Hämoglobin und Bilirubin jtiter gleichen Meßbedingungen wie bei der Testprobe bestimmt sind.
Die Konstanten T^ . >i. T\, iu. 7V. n,, f/ < h. Wi·. κ- >; ß'i- if., t.ß und / in den obigen Gleichungen sind fur ein gegebenes Anal>scngcrät und ein gegebenes Reagens korr.tant. Wenn sie daher einmal bestimmt sind, brauchen sie nicht für jeden Lauf neu ermittelt zu werden.
jo Die Auswirkung der Korrektur ist in Tabelle I angegeben. Die Messungen wurden mit einem Analysenauturiiaten mit Extinktionsmessung bei 12 Wellenlängen von 240 nm bis 850 nm wie in F i g. 3 durchgeführt, der 16 zu bestimmende Substanzen bei einer Geschwindigkeit von 120 Bestimmungen/h verarbeiten kann.
Tabelle 1 Bestimmung Zweiwcllcnlangen-Messungen Korrekturwert
CHE -0,14 0,49
(J pH) UpU)
ALP 1,93 12,1
(K.A.-Einheiten) (K.A.-Einheiten)
LAP 137 55
(Takahashi-Einheiten) (Takahashi-Einheiten)
TG -15 97
(mg/dl) (mg/dl)
CUE = Cholinesterase.
ALP = Alkaüphosphalase.
LAP = Leucinaminopeptidase.
Tu = Triglyceride.
X = 0,4( Kunkel-Einheiten)
Y = 950 (mg/dl) (Hämoglobin)
Z = 0,85 (mg/dl) (Bilirubin)
Die Cholinesterase (CHE) wurde bei 570 und 600 nm, die Alkaliphosphatase (ALP) bei 346 und 600 nm und die Leucinaminopeptidase (LAP) bei 480 und 505 nm gemessen. Die Triglyceride (TG) wurden bei 340 und 376 nm nach dem Zweiwellenlängenverfahren bestimmt. Das Testproben-Blutserum enthielt einen hohen Gehalt an Hämoglobin, wie aus den Meßwerten für X. Y und Z zu ersehen ist. Wie Tabelle 1 zeigt, werden die nach dem Zweiwellenlängenverfahren erhaltenen Meßwerte, die aufgrund der Störung durch einen hohen Anteil an Hämoglobin von der Theorie abweichende negativen Werte für CHE und TG enthalten, mit dem Lipoproteingehalt X. dem Hämoglobingehalt Y und dem Bilirubingehalt Z korrigiert, die aus den Spektren für die gleiche Testprobe bei der GOT-Messung erhalten sind.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird der Gehalt an Lipoproteinen, die zu den störenden Chromogenen in der Testprobe gehören, aus der Differenz der Extinktionen bei zwei Wellenlängen im langwelligen Bereich des sichtbaren Spektrums bestimmt; der Hämoglobingehalt wird aus dem Gehalt an Lipoproteinen und der Differenz der Extinktionen bei zwei Wellenlängen im mittleren Wellenlängenbereich
230218/437
ermittelt; der ßiliriibingchalt wird aus dem Gehalt an Lipoproteins, dom llämoglobitigehalt und der Differenz der Extinktionen bei zwei Wellenlängen im kurzwelligen Spektralbcreich ermittelt. Die Mengen der jeweiligen störenden Chromogene können entsprechend getrennt und genau bestimmt werden.
Wahrend i.ur Bestimmung der Mengen an störenden Chrimiogenen beim obigen Ausführungsbeispiel das Spektrum y?r GOT-Meßflüssigkcit herangezogen wurde, können zur Bestimmung der Mengen an störenden Chromogenen auch Spektren von im UV-Bereich vermessenen Mi-ßfUissigkeitcn. wie z.B. CPT. LDH oder IIBDII verwendet werden.
Beim obigen Ausführungsbeispiel wurde die Zweiwellenlängen-Methode angewandt; die Erfindung ist jedoch auch bei der Einwellenlängen-Methode vorteilhaft anwendbar, bei der die Extinktion bei einer einzigen geeigneten Wellenlänge ausgewertet wird.
Im folgenden wird ein weiteres Ausführungsbeispiel
r/,
K, - ψ (10)
Wenn die nach den obigen Gleichungen bestimmten Verhältnisse Ki-K, innerhalb eines vorgegebenen Bereichs n.ihe bei I liegen, z. B. zwischen 0.95 und 1,05. wird als Endwert der Meßwert einerder Methoden oder der Mittelwert der Meßwerte beider Methoden verwendet.
Bei der obigen Analyse werden der Lipoproteingohalt X, der Hamoglobingehalt V und der Bihrubingeh^lt Z, die die Störungen in der Blutserum-Testprobe darstel-
UlI L-I fHIUUIIg ti IClUlCI t, UCI UCtII HdC Il UCt L. 111 Vl Cl I Cl 11 Uli "
gen-Methode und nach der Zweiwellenlängen-Mcthode gemessen wird. Wenn das Verhältnis der nach beiden Methoden erhaltenen Meßwerte innerhalb eines vorgegebenen Bereichs nahe bei I liegt, werden die Messungen als endgültige Werte verwendet; wenn das Verhältnis außerhalb des vorgegebenen Bereichs liegt, werden die Messungen nach beiden Methoden entsprechend der Menge an störenden Komponenten in der Probe korrigiert. Wenn das Verhältnis der korrigierten Meßwerte innerhalb eines vorgegebenen Bereichs nahe bei 1 liegt, werden die korrigierten Meßwerte als endgültige Werte verwendet; wenn das Verhältnis außerhalb des vorgegebenen Bereichs liegt, werden die korrigierten Messungen der Zweiwellenlängen-Methode als endgültige Werte verwendet, oder es wird eine Anforderung für einen erneuten Versuch oder ein Warnsignal abgegeben.
Die Erfindung nützt die Tatsache aus, daß die Messungen nach der F.inwellenlängen-Methode und der Zwciwellcnlängen-Methode lediglich für eine ideale Testprobe genau sind, die weder Störsubstanzen noch Luftblasen und Feststoffe, enthält, wobei dann die Meßwerte nach bcidt.\ Methoden gleich sind, während die nach den beiden Methoden erhaltenen Meßwerte nicht gleich sind, wenn die Testprobe Störsubstanzen, Luftblasen oder Feststoffe enthält.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel werden sechs Substanzen A- Fgleichzeitig gemessen. Die photometrische Analyse wird ausgeführt, indem die Probe in gleicher Weise wie beim herkömmlichen automatischen Mehrfach-Analysator umgesetzt und nach der Einwellenlängen- und der Zweiwellenlängen-Methode vermessen wird, wonach das Verhältnis der Meßwerte beider Methoden bestimmt wird. Wenn die Meßwerte für die Substanzen A-F nach der Einwellenlängen-Methode als dt — f\ und die Meßwerte nach der Zweiwellenlängen-Methode als ai-k bezeichnet werden, sind ihre Verhältnisse ΚΛ — Kf durch die folgenden Gleichungen gegeben.
Λ' ICH. UU3 CIIICIII *J L/C IMI UItI UCI Ulli CIIIIUCIIStCII 3}JCfMl Ul IIC" trisch zu uniersuchenden Substanz ermittelt
Wenn eines der Verhältnisse K\- Kf nicht innerhalb des vorgegebenen Bereichs liegt, werden die entsprechenden Messungen mit den Werten für X. Y und Z korrigiert.
Wenn z. B. das Verhältnis Kc nicht innerhalb des vorgegebenen Bereichs liegt, werden korrigierte Meßwerte CV und CV nach den folgenden Gleichungen (11) und(12)ermittelt:
C2
Cx- a X -βΥ-γΖ C2-O1 X-β1 Y-/ Z
(in
(12)
mit λ, α', β, β', y und γ' = durch die verwendeten Reagentien und das verwendete Analysengerät gegebene Konstante.
Dann wird das Verhältnis Ki der korrigierten Messungen C1 und C2 bestimmt aus
if' - C:
(13)
Wenn das Verhältnis Kc innerhalb eines vorgegebenen Bereichs nahe bei 1 liegt, z. B. zwischen 0,95 und 1,05, werden die Meßwerte C/ und CY oder ihr Mittelwert als Endwerte für die Testsubstanz C der Testprobe verwendet.
Wenn das Verhältnis AV der durch Gleichung (13) bestimmten korrigierten N!ess'~igen nach der Korrektur nach den Gleichungen (11) und (12) nicht innerhalb des vorgegebenen Bereichs liegt, besteht die Möglichkeit, daß Luftblasen oder Feststoffe wie z. B. Siaub in der Testprobe vorhanden sind. Daher werden die Meßwerte 32-/2 nach der Zweiwellenlängen-Mathodc, die als relativ zuverlässig angesehen werden, versuchsweise als Endwerte verwendet; gleichzeitig wird jedoch ein Wiederholungsversuch angefordert
Auf diese Weise wird durch Messen des Lipoproteingehalts, des Hamogiobingehalts und des Bilirubingehalts eo jeder Testprobe und durch Korrektur der Meßwerte mit diesen Daten die Genauigkeit der photometrischen Bestimmung wesentlich verbessert. Da außerdem Luftblasen und Feststoffe wie z. B. Staub unterscheidbar sind, ist die Zuverlässigkeit der Messungen sehr hoch.
Beim obigen Ausführungsbeispiel wurde für das Verhältnis der Meßwerte ein Bereich von 0,95 bis 1,05 festgelegt; erfindungsgemäß können jedoch auch beliebige andere Bereiche gewählt werden.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche;
1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Substanzen im Blutserum in Gegenwart von störenden Chromogenen, wobei die Extinktion der Probe bei mehreren verschiedenen Wellenlängen gemessen und für jeden bezüglich seines Absorptionseinflusses zu berücksichtigenden Probenbestandteil mindestens eine Messung durchgeführt wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte zur Ausschaltung von durch Lipoproteine, Hämoglobin und Bilirubin hervorgerufenen Störungen:
(a) photometrische Messung einer zu bestimmenden Substanz im UV-Bereich,
(b) Bestimmung des Lipoproteingehalts der Probe durch Extinktionsmessung im langwelligen Bereich des sichtbaren Spektrums, in dem die Absorption durch Lipoproteine bedingt und nicht durch Hämoglobin und Bilirubin beeinflußt ist
(c) Bestimmung des Hämoglob-ngehalts der Probe -' durch
— Extinktionsmessung im Bereich mittlerer Wellenlängen des sichtbaren Spektrums, in dem die Absorption durch Lipoproteine und Hämoglobin bedingt, aber nicht von Bilirubin beeinflußt ist, und
— Korrektur des Meßwerts durch den in (b) ermittelten Lipoproteingehalt
(d) Bestimmung des Bilirubingehalts der Probe durch
— Extinktionsmessung im kurzwelligen Bereich des sichtbaren Spektrums, in dem die Absorption durch Lipoprote ite, Hämoglobin und Bilirubin bedingt ist und
— Korrektur des Meßwerts durch den in (b) ermittelten Lipoproteingehalt und den in (c) ermittelten Hämoglobingehalt
und
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