DE4204853C2

DE4204853C2 - Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben und System zur Anwendung desselben

Info

Publication number: DE4204853C2
Application number: DE4204853A
Authority: DE
Inventors: Masahito Ito; Junkichi Miura; Yoshio Fujii; Hiroshi Satake; Fuzio Yamada; Kouichi Tagami; Fuminori Umesato
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1991-02-18
Filing date: 1992-02-18
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2012-02-19
Also published as: JPH04331369A; DE4204853A1; US5436166A; JP2602366B2

Description

Die am 20. September 1991 eingereichte US-Anmeldung mit der Serien nummer 07/763203 bezieht sich auf die vorliegende Anmeldung, und die Gegenstände in der Anmeldung sind in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben und ein System zur Anwendung desselben, und insbesondere ein Verfahren, das einen Analysator benutzt. Die Chromatographie umfaßt eine Trennsäule, einen Detektor und einen Probenehmer zum automatischen Einführen von Proben in den Chroma tograph.

Im allgemeinen werden, wenn ein Analysator benutzt wird, Analysebedin gungen durch einen Analytiker bzw. Labortechniker bestimmt und werden durch ein Eingeben numerischer Werte und ähnlichem von einer Tastatur und durch Einstellen eines variablen Widerstandes bzw. Resistors einge stellt. Insbesondere in dem Fall, wo eine Vielzahl von Bestandteilen analysiert werden, müssen zuerst die Analysebedingungen zum Identifizie ren der einzelnen Bestandteile eingestellt werden. Beispielsweise werden eine Retentionszeit und ihre Toleranz beim Identifizieren von Bestandtei len durch eine Chromatographie auf der Basis der Meßergebnisse von Versuchsproben durch einen Analytiker beurteilt und werden dann in eine Datenverarbeitungseinheit gegeben. Auch bei der JP-A-63-290958, die auf die Peaknachführung gerichtet ist, werden die Retentionszeiten der Peaks auf einem Chromatogramm als Bezug durch einen Analytiker eingege ben.

Weiterhin wird in der JP-A-60-239669 die Konversion der Zeitbasis von einem Chromatogramm zu einem anderen Chromatogramm mit den Hauptpe aks durchgeführt, die als der Bezug zwischen den zwei Chromatogrammen benutzt werden. Dies steht zur Verfügung als Verfahren zum Identifizieren eines Peaks zwischen den Chromatogrammen, bei denen die Retentionszeiten geändert werden, aber die Retentionszeiten der Peaks auf dem Chromato gramm werden als der Bezug auch durch den Bediener beurteilt.

Darüberhinaus mußte der Bediener beim Stand der Technik, wie den oben genannten JP-A-63-290958 und JP-A-60-239669, vor der Analyse unbekannter Proben immer die Analysebedingungen einmal einstellen.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Einrichtung zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben zu schaffen, wobei ein Analysator selbst fähig ist, in den Proben enthaltene Bestandteile, die zu erfassen sind, automatisch zu bestimmen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Einrichtung zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben zu schaffen, wobei ein Bediener Retentionszeiten der zu analysierenden einzelnen Bestandteile nicht in einen Analysator eingeben muß.

Diese Aufgaben werden durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Einrichtung nach Anspruch 6 gelöst.

Die vorliegende Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnung erläutert, wobei

Fig. 1 ein Blockdiagramm ist, das eine Systemanordnung eines Kate cholamin-Analysators als ein erstes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 2 eine Ansicht ist, teilweise diagrammäßig und teilweise blockdia grammäßig, die beim Erklären eines Flußprinzips bei dem Sy stem der Fig. 1 nützlich ist;

Fig. 3 eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines Peakidentifi zierungsverfahrens ist, das in dem System der Fig. 1 verwendet wird;

Fig. 4A eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines anderen Peakidentifizierungsverfahrens ist;

Fig. 4B ein Flußdiagramm eines anderen Ausführungsbeispiels ist;

Fig. 4C ein anderes Flußdiagramm ist, das ein anderes Verfahren zum Steuern von Meßbedingungen zeigt;

Fig. 5 ein Blockdiagramm ist, das eine Systemanordnung eines Analy sators für glykosyliertes Hämoglobin als ein zweites Ausführungs beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 6 eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines Peakidenti fizierungsverfahrens ist, das bei dem System der Fig. 5 verwen det wird; und

Fig. 7 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Chromatogramms von dem System der Fig. 5 zeigt.

Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Chromatogramm als das Meß ergebnis einer bekannten Probe, wie beispielsweise einer Standardprobe, benutzt, um Retentionszeiten von in einer Reihe unbekannter Proben enthaltenen zu erfassenden Bestandteilen zu bestimmen.

Zuerst wird die Information für qualitative und quantitative Analysen von dem Meßergebnis der Standardprobe extrahiert. Dann wird beurteilt, ob diese Information ausreichend ist oder nicht. Wenn die Information nicht ausreichend ist, werden die Analysebedingungen für die Kontrolle nochmals geprüft, und die Messung der Standardprobe wird fortgeführt, bis die Information ausreichend wird. In dem anderen Fall, wenn die Information ausreichend ist, wird der Bezug für die qualitativen und quantitativen Analysen durch einige Werte ausgedrückt, um die Analyse bedingungen für eine Identifizierung, eine Datenanalyse und ähnliches zu bestimmen.

Um die vorliegende Erfindung auszuführen, werden vorbestimmte Kom ponenten, die den Analysator bilden, und vorbestimmte Reagenzien benutzt. Im Falle eines Chromatographiesystems entsprechen eine Säule, ein Extraktionsmittel bzw. Eluierungsmittel und die Standardprobe jenen Komponenten und Reagenzien. Die Komponente und das Reagenz sind nicht notwendigerweise ein Paar. Das bedeutet, daß eine Vielzahl von Kombinationen möglich sein kann, solange wie der Analysator das inter essierende Paar aus den Kombinationen erkennen kann.

Das erste Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird im nach folgenden unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis Fig. 4 beschrieben.

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das eine Systemanordnung eines Flüssig chromatographiesystems zum Analysieren von Katecholamin zeigt, auf das die vorliegende Erfindung angewandt ist. Bei diesem Analysator wird das Katecholamin vor einem Trennen von Katecholamin mit einem Fluo reszenzlabel bzw. -Indikator vorderivatisiert, und wird dann in einer Vor säule, die in einem Reaktionsbereich vorgesehen ist, einmal absorbiert, um Unreinheiten zu eliminieren, und wird danach als eine Probe in eine Trennsäule eingeführt. An einen Mechanismus-Steuerbereich 6 ist ein Eingabebereich 15 angeschlossen, der mit einer Starttaste versehen ist Ein Auto-Probennehmer 5 ist mit einer beweglichen Pipettennadel 38 ausgestattet. In diesem Zusammenhang ist die Nadel 38 entlang einer Linie beweglich, die der Aufstellung eines Containers 10, der eine dahin ein gestellte Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reagenzlösung aufweist, eines Standardprobencontainers 11, einer Mischkammer 12 und Containern 9 für eine unbekannte Probe entspricht.

Wenn ein Bediener für den Analysator die Starttaste drückt, die in dem Eingabebereich 15 des Analysators vorgesehen ist, saugt der Probenneh mer 5 400 µl der Standardprobe ein, um sie in die Mischkammer 12 abzugeben, und zwar aufgrund des Befehls von dem Mechanismus-Steuer bereich 6. In der Standardprobe 11 sind drei Arten von Katecholamin enthalten, d. h. 1.000 pg/ml Noradrenalin (NE), 1.000 pg/ml Adrenalin (E) und 1.000 pg/ml Dopamin (DA). Nachfolgend wird eine wäßrige Lösung 10 eines Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reagenzes, das aus 400 µl 60 mM 1,2-Diphenylethylendiamin (DPE) besteht, angesaugt, um zu der Mischkammer abgegeben zu werden, um mit der Standardprobe 11 gemischt zu werden. 400 µl der resultierenden gemischten Flüssigkeit wird zu einem Meßrohr 64 in dem Reaktionsbereich 2 geführt, um die Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reaktion zu beginnen.

Nach Ablauf von drei Minuten wird das derivatisierte Katecholamin einmal in einer Vorsäule 65 in dem Reaktionsbereich 2 absorbiert. Nach Ablauf weiterer drei Minuten wird das derivatisierte Katecholamin zusammen mit einem Eluierungsmittel, das von einer Eluierungsmittel zuführpumpe 1 durch eine Ventilschaltung zugeführt ist, zu der Trenn säule 3 geführt, um getrennt zu werden und durch eine "Reverse Phase" Chromatographie vorbereitet zu werden. Schließlich wird es durch einen Fluoreszenzdetektor 4 erfaßt. Das Chromatogramm wird als die erfaßten Daten in einem Datenanalysebereich 7 gespeichert.

Nachfolgend wird das Flußprinzip in dem System der Fig. 1 unter Be zugnahme auf Fig. 2 beschrieben.

Ein entfernbares Probengestell 27 ist auf einer Bühne 28 in dem Auto- Probennehmer 5 des Katecholamin-Analysators montiert. Das Probenge stell 27 hält eine Vielzahl von Probencontainern 9 mit Blutplasma-Pro ben, die dorthineingetan sind. Darüberhinaus sind in dem Probengestell 27 der Reaktionsreagenzcontainer 10 für die Fluoreszenz-Derivatisierung und Standardprobencontainer 11a und 11b angeordnet. In diesem Auto- Probennehmer 5 sind die Mischkammer 12, ein Düsenreinigungsgefäß 34, ein Ablaufanschluß 35 und ein Injektionsanschluß 36 in der festen Posi tion neben der Bühne 28 vorgesehen.

Die Pipettendüse 38 dient, um die Probe oder das Reagenz in die Mischkammer 12 durch Pipettieren hinein zu pipettieren, oder überträgt die gemischte Probe von der Mischkammer 12 zu dem Injektionsanschluß 36. Ein Antriebsmechanismus 37 hat X-, Y- und Z-Antriebsfunktionen, so daß er die Pipettendüse 38 in Längs-, Breiten-, oder Vertikalrichtung frei antreiben kann, um die Düse 38 zu der Position über irgendeinem Container oder Anschluß in dem Probennehmer zu bewegen. Das obere Ende der Pipettierdüse 38 ist durch ein Dreiwegeventil 26 mit einer Pipettenpumpe 17 und einem Reinigungsflüssigkeitsgefäß 18 durch eine Kapillarverbindung 39, wie beispielsweise ein Plastikrohr, gekoppelt. Ein Halteabschnitt 19 zum Halten der Pipettendüse 38 kann auf einer Schie ne bewegt werden. Die Pipettenpumpe 17 ist eine Pumpe von zylin drischem Typ, die durch einen Impulsmotor angetrieben wird.

Bei dem Flußprinzipsystem, das eine Vorsäule 65 aufweist, wird eine Reinigungsflüssigkeit von einem Flüssigkeitsgefäß 61 durch ein Proben einführungsventil 63 durch eine Pumpe 62 zu der Vorsäule 65 bei einer festen Flußrate geführt. Ein Meßrohr 64, das zusätzlich in dem Proben einführungsventil 63 vorgesehen ist, mißt die Probe, die mit einer von dem Injektionsanschluß 36 injizierten Flüssigkeit gemischt ist.

Das Eluierungsmittel von einem Eluierungsmittelgefäß 66 wird zu der Trennsäule 3 durch eine Pumpe 1 bei einer festen Flußrate geführt. In diesem Zusammenhang wird dieses Eluierungsmittel durch ein Säulen schaltventil 67 zu einer Trennsäule 65 geführt. Durch Umlegen des Säulenschaltventils 67 wird das Eluierungsmittel über die Vorsäule 65 geführt. In dieser Hinsicht wird die Probe, die in der Vorsäule 65 verarbeitet worden ist, zu der Trennsäule 3 geführt.

Die Probenbestandteile, die von der Trennsäule 3 eluiert worden sind, fließen durch eine Flußzelle 59 eines Fluorphotometers. Das durch das Fluorphotometer 4 erhaltene Meßsignal wird durch einen Analog/Digital wandler 55 zu einer Signalverarbeitungseinheit 56 eingegeben. Die Signalverarbeitungseinheit enthält den Datenanalysebereich 7 und den Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14, gezeigt in Fig. 1, und kann das Ergebnis der Signalverarbeitung an einen Drucker 13 und einen CRT 8 ausgeben. Schaltventile 57 und 58 sind derart vorgesehen, um die Flüssigkeit in den Pumpen 62 und 1 wie erforderlich leeren zu können.

Als nächstes wird das Verfahren zum Identifizieren des auf der Basis des Chromatogramms der Standardprobe zu analysierenden Bestandteile unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben.

Dieses Identifizierungsverfahren ist ein Verfahren, bei dem die Breite des Zeitfensters als die Identifizierungstoleranz auf der Basis des Chromato gramms der Standardprobe 11 begrenzt ist. Dann wird dieses Verfahren Verfahren mit reduziertem Fenster genannt, wenn es anwendbar ist. Dieses Verfahren nutzt aus, daß die Peaks der drei Katecholaminbestand teile, die in der Standardprobe 11 enthalten sind, so erfaßt sind, daß sie viel größer als jene sind, die auf den Unreinheiten basieren. Der Datenanalysebereich 7 wendet zuerst die Zeitfenster, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, auf das Chromatogramm 20 an und identifiziert drei Peaks 23, 22 und 21 als DA, E bzw. NE, und zwar in der Reihenfolge abnehmender Retentionszeit. In dem Fall, wo eine Vielzahl von Peaks in einem Zeitfenster vorhanden ist, werden weitere Peaks näher identifi ziert, die jeweils eine größere Retentionszeit haben.

Tabelle 1

Der Datenanalysebereich 7 überträgt die Information der Retentionszeit t_R, des Peakbereichs A und der Peakhöhe h, die sich auf die Peaks 21, 22 und 23 bezieht, die von dem Chromatogramm 20 erhalten sind, zu dem Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14. Der Bereich 14 beur teilt, ob die Information, die jene Peaks betrifft, zu den in Tabelle 2 aufgelisteten Bedingungen paßt oder nicht. Dann, wenn sie paßt, gibt der Bereich 14 einen Befehl zu dem Datenanalysebereich 7 aus, um die Breite des Zeitfensters zu reduzieren. Dann werden die Zeitfenster, die jeweils eine kleine Breite entsprechend den Peaks 21, 22 bzw. 23 auf weisen, eingestellt. Das Zentrum jedes Zeitfensters mit einer kleinen Breite wird als die Retentionszeit jedes Peak benutzt. Die Toleranz von dem Zentrum besteht, wie in Tabelle 3 gezeigt, in einer kleinen Zeit breite. Dies resultiert in dem Fehler beim Identifizieren, wenn solche reduzierten Zeitfenster auf die Chromatogramme unbekannter Proben angewendet werden, die reduziert werden. Wenn der Datenanalysebe reich 7 das Chromatogramm 20 analysiert, wird eine vorbestimmte Schwelle auf die Peakhöhe angewandt. Dann wird, in dem Fall, wo drei Peaks, die die Schwelle überschreiten, nicht in dem Chromatogramm 20 erhalten werden können, die Identifizierung beurteilt, daß sie ein Fehler ist.

Fig. 4B zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel. Bei einem Schritt 100 wird jeder Peak gegen die in Tabelle 2 aufgelisteten Bedingungen ge prüft. Wenn irgendein Peak nicht zu den Bedingungen paßt, wird eine Anleitung (I) auf dem CRT 8 gezeigt wie folgt (Schritt 101):
"Peak (s) ist (sind) außerhalb des normalen Bereiche Bitte Säule und Reagenzien prüfen".

Im anderen Fall, wenn alle Peaks zu den Bedingungen passen, wird die Korrelation zwischen den Peaks im Schritt 102 beurteilt. Die Korrela tion wird durch das Verhältnis von Retentionszeiten der Peaks angezeigt, und das Verhältnis beschreibt die Balance zwischen den jeweiligen Retentionszeiten. Wenn das Verhältnis außerhalb der im Schritt 102 aufgelisteten Bedingungen liegt, wird eine Anleitung (II) auf dem CRT 8 gezeigt wie folgt (Schritt 103):
"Balance jeweiliger Retentionszeiten der Peaks ist nicht normal. Bitte Säule und Reagenzien prüfen."

In der Tat wird die Balance unter den Retentionszeiten durch Berechnen ihrer Differenzen beurteilt. In diesem Fall werden die im Schritt 102 aufgelisteten Bedingungen durch die folgenden ersetzt.
t_E - t_NE < 0,30 Min.
und
t_DA - t_E < 0,60 Min. ?

Wenn die durch den Auto-Probennehmer 5 in den Chromatographie analysator eingeführte unbekannte Probe getrennt ist und das Meßergeb nis in der Form des Chromatogramms erhalten ist, werden die individuel len Zeitfenster, die jeweils eine in Tabelle 3 aufgelistete kleine Breite haben, auf das Chromatogramm der unbekannten Probe angewendet, so daß die Bestandteile, die in der unbekannten Probe enthalten sind, identifiziert werden.

Tabelle 2

Tabelle 3

Als nächstes wird unter Bezugnahme auf Fig. 4 ein weiteres Peakiden tifizierungsverfahren beschrieben. Dieses Identifizierungsverfahren ist ein Verfahren, bei dem ein einzelnes Zeitfenster zuerst auf ein Chromato gramm der Standardprobe angewendet wird, um die Peaks einer Vielzahl zu erfassender Bestandteile zu identifizieren.

Der Datenanalysebereich 7 zählt die Peaks, die in dem einzelnen Zeit fenster in dem Chromatogramm 20 vorhanden sind, und von welchen Bereichen größer als oder gleich wie 100.000 µV·s sind. Nur im Falle eines Vorhandenseins von drei Peaks überträgt der Bereich 7 die Rete ntionszeit t_R, den Peakbereich A und die Peakhöhe h zu dem Analy sebedingungs-Entscheidungsbereich 14. Andererseits wird die Identifizie rung beurteilt, daß sie ein Fehler ist. Das einzelne Zeitfenster kann den ganzen Bereich des Chromatogramms abdecken. Der Analysebedings- Entscheidungsbereich 14 diagnostiziert das Meßergebnis auf der Basis der Tabelle 2 auf die gleiche Art, wie oben beschrieben. Wenn das Ergeb nis akzeptabel ist, gibt der Bereich 14 einen Befehl zu dem Datenanaly sebereich 7 aus, um die reduzierten Zeitfenster von Tabelle 3 für die Analyse der unbekannten Proben zu benutzen.

Die Zeitfenster von Tabelle 3, die automatisch auf der Basis des Ver fahrens der Fig. 3 oder der Fig. 4 bestimmt werden, werden durch den Drucker 13 auf das Chromatogramm 20 überschrieben. Darüberhinaus können jene Zeitfenster auf dem Chromatogramm auf dem CRT 8 angezeigt werden. Danach werden bei der Analyse der unbekannten Probe 9, wie beispielsweise Blutplasma, jene Zeitfenster benutzt, um die Daten zu analysieren. Die quantitative Analyse der unbekannten Probe wird durch die proportionale Berechnung unter Verwendung der Peak bereiche der Standardprobe als der Bezug durchgeführt. Genauer gesagt wird der Bereich jedes Peaks, von dem ein Bestandteil auf der Basis der individuellen Zeitfenster von Tabelle 3 identifiziert ist, mit dem Bereich jedes Peaks der Standardprobe verglichen. Dann wird die Konzentration jedes Bestandteile der unbekannten Probe proportional berechnet, und zwar aufgrund einer Bedingung, daß der Peakbereich jedes Bestandteile der Standardprobe 1.000 pg/ml ist.

Während des Durchführens der Analyse kann in einigen Fällen ein Fehler auftreten. Für einen derartigen Fehler können einige Grunde in Erwägung gezogen werden. In dem Fall, wo die Säule, das Reagenz oder die Komponente fehlerhaft bzw. degradiert wird, wird der Analyti ker von dieser Information informiert, so daß der Austausch der degra dierten Säule, des Reagenzes oder der Komponente erforderlich ist. Zu sätzlich dazu kann ein Fall auftreten, wo der Analysator selbst die Steuerbedingungen ändert, so daß die Analyse ohne irgendeine Behinde rung ausgeführt werden kann. Wenn die Peaks allgemein klein sind, ist es beispielsweise praktisch, den Verstärkungsfaktor des Fluoreszenzdetek tors 4 zu erhöhen, die Reaktionstemperatur des Reaktionsbereichs 2 anzuheben oder ihre Reaktionszeit auszudehnen. Wenn die Retentions zeiten der Peaks kurz sind, ist es darüberhinaus praktisch, die Flußrate der Pumpe 1 zu verringern oder die Temperatur der Säule 3 zu reduzie ren. Wenn die Fehler auftreten, befiehlt der Analysebedingungs-Ent scheidungsbereich 14 dem Mechanismus-Steuerbereich 6, die Steuerbedin gungen der individuellen Antriebsbereiche zu ändern, und zwar unter Verwendung der Regeln, die auf der Basis der Daten von dem Chroma togramm 20 und den Sensoren aufgestellt sind. Beispielsweise in dem Fall, wo die Retentionszeit des letzten Peaks länger ist als jene des Bezugs, wird zuerst die Grenze der Trennung jedes Peaks auf der Basis der Auflösung Rs, des Intervalls der Retentionszeit ΔT_R und der theore tischen Bodenzahl N abgeschätzt. Wenn die Trennung die Grenze hat und der Druck geringer als der Referenzwert ist, wird die Berechnung derart durchgeführt, daß die Retentionszeit des letzten Peaks innerhalb des Referenzwertes liegt, wodurch die Flußrate der Pumpe 1 erhöht wird. Sogar wenn die Trennung die Grenze hat, wenn der Druck größer als oder gleich dem Referenzwert ist, wird die Berechnung in Übereinstim mung mit den Regeln durchgeführt und es wird gleichzeitig empfohlen, die Temperatur der Säule 3 anzuheben und die Flußrate der Pumpe 1 zu erhöhen. Der Mechanismus-Steuerbereich 6 ändert die Bedingungen der Steuerung in der Art, wie oben beschrieben ist, und steuert den Betrieb jedes Antriebsbereichs derart, daß die Standardprobe 11 wieder gemessen wird.

Weiterhin ist zum Zwecke der Messung des Zustands der Reaktion ein Verfahren vorgeschlagen, wobei zwei Arten von Proben benutzt werden, von denen die Konzentration bekannt ist Genauer ausgedrückt, werden die Standardprobe 11a, die 1.000 pg/ml NE, 1.000 pg/ml E und 1.000 pg/ml DA enthält, und die Standardprobe 11b, die 500 pg/ml NE, 1.000 pg/ml E und 2.000 pg/ml DA enthält, individuell gemessen. Wenn die Linearität der Reaktion normal ist, hat das Meßergebnis der Probe 11b den Bestimmungswert, der proportional zu der Konzentration ist. Wenn die Linearität der Reaktion geringer als oder gleich dem Bezug ist, führt der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14 die Berechnung in Über einstimmung mit vorbestimmten Regeln durch und befiehlt dem Mecha nismus-Steuerbereich 6, die Bedingungen der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit des Reaktionsbereichs 2 zurückzusetzen.

Weiterhin können die Temperatur der Säule 3 und die Flußrate der Pumpe 1 gemäß der Retentionszeit t_DA des letzten Peaks DA gesteuert werden. Fig. 4C zeigt ein Ausführungsbeispiel dafür. Bei diesem Aus führungsbeispiel werden die letzte Retentionszeit t_DA und deren Toleranz als 2,50 Min. bzw. ± 0,50 Min. unter normalen Bedingungen angenom men.

Wenn die letzte Retentionszeit t_DA geringer als 2,00 Min. ist, sollte die Flußrate der Pumpe 1 erniedrigt werden. Die Flußrate der Pumpe 1 wird durch den Bereich 6 gesteuert. Konkret ausgedrückt, wird der Druck der Pumpe unterdrückt, so daß die laufende Flußrate F sich auf F × (t_DA/2,50) erniedrigt.

Wenn die letzte Retentionszeit t_DA größer als 3,00 Min. ist (Schritt 114), werden ein Interval Δt_R zwischen den Peaks DA und E (Schritt 116) und ein Index einer Anzahl von theoretischen Böden (Schritt 118) beur teilt. In den Schritten 116 und 118 bezeichnet t_E die Retentionszeit (Min.) des Peaks E, h_DA bezeichnet die Höhe (in µV) des Peaks DA und A_DA bezeichnet den Bereich (in µV × Min.) des Peaks" DA.

Wenn das Interval Δt_R größer als 1,00 Min. ist und der Index auch größer als 1.000 ist, wird Schritt 120 durchgeführt. In den anderen Fällen wird der gegenwärtige Algorithmus beendet und eine unbekannte Probe wird in das Flußprinzip eingeführt, weil die letzte Retentionszeit t_DA innerhalb der Toleranz angenommen wird.

Beim Schritt 120 wird der vorhandene Druck der Pumpe 1 mit ihrem spezifizierten Druck verglichen und der Spielraum dazwischen bestimmt Aufgrund der Annahme, daß der Druck der Pumpe proportional zu der Flußrate ist, ist der Druck nämlich auch umgekehrt proportional zu der letzten Retentionszeit t_DA. Dadurch wird der Druck P′ der Pumpe, der die letzte Retentionszeit t_DA 2,50 Min. ergibt, berechnet, und der Druck P′ wird beurteilt, ob er innerhalb des spezifizierten Drucks der Pumpe, z. B. 100 bar, liegt. In dem Fall, wo der Druck P′ außerhalb der Spezi fikation ist, wird die Temperatur der Säule erhöht (um 2°K), um die Retentionszeit zu verkürzen (Schritt 122). Wenn im Gegensatz dazu der Druck P′ innerhalb der Spezifikation liegt, wird der Druck der Pumpe erhöht, um die derzeitige Flußrate F auf F × (t_DA/2,50) zu erhöhen.

Die oben beschriebene Korrektur für die Meßbedingung wird wiederholt, bis die letzte Retentionszeit t_DA innerhalb der Toleranz liegt (Schritt 126).

Wenn zum Zwecke des Analysierens von Blutplasma und Urin die Standardproben mit den verschiedenen Konzentrationen oder die Stan dardproben mit den verschiedenen Konzentrationsverhältnisse vorbereitet werden, führt der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14 weiterhin die Beurteilung auf der Basis der Schwelle des Peakbereichs oder des Bereichsverhältnisses der drei Bestandteile durch. Somit ist es ohne irgendeine Eingabe von dem Analytiker möglich, zu erkennen, was zu analysieren ist leer Bereich 14 kann das erkannte Analyseverfahren zu dem Steuerbereich 6 einstellen.

Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist unter der Annahme beschrieben, daß das Katecholamin drei Bestandteile NE, E und DA hat. Die Analyse kann jedoch auch in Hinsicht auf den spezifischen Fall durch geführt werden, wo das Katecholamin sechs Bestandteile einschließlich DOPA, DOPAC und DOPEG zusätzlich dazu aufweist. In diesem Fall ist es möglich, die Analysebedingung auszuwählen, bei der die Analyse für drei Bestandteile in einer kürzeren Zeit beendet werden kann als jene Analyse für sechs Bestandteile. Der in Fig. 1 gezeigte Analysator kann das Analyseverfahren bestimmen, indem er nur entweder die Stan dardprobe von drei Bestandteilen oder jene von sechs Bestandteilen aus wählt, ohne eine Eingabeoperation von dem Bediener. Während der Einstelloperation des Chromotographiesystems wird die Standardprobe gemessen, und das Vielfachpeaks-Identifizierungsverfahren wird durch das oben angeführte einzelne Fenster angewendet. Der Analysebedingungs- Entscheidungsbereich 14 zählt die Zahl der Peaks, von welchen Bereiche die Referenzschwelle überschreiten. Wenn die Anzahl der Peaks drei ist, befiehlt dann der Bereich 14 dem Mechanismus-Steuerbereich 6 die Analyse für drei Bestandteile auszuführen, während, wenn ihre Anzahl sechs ist, der Bereich 14 dem Bereich 6 befiehlt, die Analyse für sechs Bestandteile auszuführen. Danach geht die Analyse zu der Standard probe weiter; und dann zu den unbekannten Proben. Auch wenn keine Messung während der Einstelloperation durchgeführt wird, kann weiterhin ein Verfahren derart durchgeführt werden, daß die Standardprobe durch das Analyseverfahren für sechs Bestandteile mit einer langen Analysezeit gemessen wird, und auf Erfassen der drei Peaks hin das Analysever fahren zu dem Analyseverfahren für drei Bestandteile umgeschaltet wird.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird im nachfolgenden unter Bezugnahme auf Fig. 5 und Fig. 6 beschrieben. Das in Fig. 5 gezeigte System ist ein Flüssigchromatographieanalysator, der glykosyliertes Hämoglobin durch die Ionenaustauschchromatographie analysiert. Eine Eluierungsmittel-Zuführpumpe 40 führt die Eluierungs mittel A48, B49 und C50 derart zu, daß A48, B49 und C50 ge schaltet werden, um jeweils für 1,9 Min., 1,0 Min. und 0,4 Min. für jede Probe zugeführt zu werden. Somit führt die Pumpe 40 die schrittweise Eluierung durch. Demgemäß wird mit jeder unbekannten Probe 51 die schrittweise Eluierung in einem Zyklus von 3,3 Min. aufeinanderfolgend durchgeführt.

Vor der Chromatographietrennung der unbekannten Proben 51 saugt ein Auto-Probennehmer 43 mit einer beweglichen Nadel 5 µl einer Standard probe 52 von Hämoglobin (Hb) an, das eine Vielzahl von zu erfassenden Bestandteilen enthält, um es der Verdünnungsbehandlung auszusetzen, und danach führt er die resultierende Flüssigkeitslösung zu dem Chroma tographie-Flußprinzip mit einer Trennsäule 41. Die Standardprobe wird zusammen mit dem Eluierungsmittel A48 in die Trennsäule 41 einge führt, so daß die Bestandteile, die darin enthalten sind, getrennt und verstreut werden. Jeder Bestandteil, der von der Trennsäule 41 eluiert worden ist, wird durch einen Detektor 42 mit Absorptionsvermögen im sichtbaren Bereich erfaßt. Das Chromatogramm wird als die erfaßten Daten in einem Datenanalysebereich 45 gespeichert.

Eine Signalverarbeitungseinheit, die den Datenanalysebereich 45 und einen Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 enthält, erhält die Peaks, die den Bestandteilen entsprechen, die auf der Basis des Chro matogramms der Standardprobe zu erfassen sind, stellt die Breiten der Zeitfenster der Peaks ein und wendet die so eingestellten Zeitfenster auf das Chromatogramm jeder unbekannten Probe an, um dadurch die in jeder unbekannten Probe enthaltenen Bestandteile zu identifizieren. Ein Mechanismus-Steuerbereich 44 betätigt den Probennehmer 43, wenn das Operationsstartsignal von einem Eingabebereich 15 angelegt ist, um den Probennehmer 43 das Abtasten der Standardprobe 53 durchführen zu lassen. Nachdem die Zeitfenster gesetzt worden sind, betätigt der Be reich 44 den Probennehmer 43 wieder, um den Probennehmer 43 das Abtasten jeder unbekannten Probe 51 durchführen zu lassen. Die Chromatogramme der Standardprobe und der unbekannten Proben wer den zu einem Drucker 47 und einem CRT 46 ausgegeben.

Im nachfolgenden wird das Verfahren zum Identifizieren der Peaks der Bestandteile unter Verwendung des Chromatogramms der Standardprobe unter Bezugnahme auf Fig. 6 beschrieben. Der Datenanalysebereich 45 wählt die Peaks, von denen Bereiche größer als oder gleich 3.000 µV·s sind, aus dem Chromatogramm 60 der Standardprobe aus, das von dem Detektor 42 erhalten ist, und wendet die in Tabelle 4 gezeigten Zeitfen ster darauf an. Als ein Ergebnis wird erkannt, daß die Retentionszeit des Peaks Ao 2,50 Min. beträgt, die Retentionszeit des Peaks A1c 1,66 Min. beträgt, und jene des Peaks A1a 0,41 Min. beträgt. In Tabelle 4 ist die Retentionszeit des gemessenen Peaks A1c gezeigt. Die Peaks L·A1c, F und A1b werden auf der Basis des Berechnungsausdrucks der Tabelle 4 berechnet. Das bedeutet, daß der Peak L·A1c unter Verwen dung von (1,46 ± 0,15) Min. gesucht wird, ausgedrückt durch das Be rechnungsergebnis von (1,00 × 1,66 - 0,20) und ihrer Toleranz als das Zeitfenster. In Fig. 6 ist der entsprechende Peak nicht identifiziert Auf ähnliche Weise wird das Zeitfenster des Peaks F berechnet, um in dem Bereich von (0,97 ± 0,15) Min. zu sein, und jenes des Peaks A1b wird berechnet, um in dem Bereich (0,56 ± 0,20) Min. zu sein. Im Falle der Fig. 6 beträgt die Retentionszeit des Peaks F 0,97 Min- und jene des Peaks A1b beträgt 0,64 Min.

Tabelle 4

Die einzelnen Zeitfenster, die in Hinsicht auf die Peaks Ao und A1c reduziert sind, werden auf die Chromatogramme der unbekannten Proben 51 angewendet. Das bedeutet, daß das Zeitfenster für den Peak Ao auf (2,50 ± 0,15) Min. eingestellt wird, und das Zeitfenster für den Peak A1c wird auf (1,66 ± 0,15) Min. eingestellt.

Der Peak L·A1c oder F als der Unterpeak kann in einigen Fällen nicht von der Hb-Standardprobe 52 getrennt und erfaßt werden. Daher ist das oben angegebene Verfahren verfügbar. Der Datenanalysebereich 45 führt die Identifizierung in bezug auf das Chromatogramm in Überein stimmung mit dem Verfahren durch, wie es oben beschrieben ist. Zuerst werden die Peaks ausgewählt, von denen Bereiche die Schwelle über schreiten. Nachfolgend werden Ao und A1c unter Verwendung des oben angegebenen Verfahrens mit reduziertem Zeitfenster identifiziert. Der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 reduziert die Toleranzen der Peaks Ao und A1c auf ± 0,15 für die unbekannte Probe 51 des Blutes. Dann wird das Zeitfenster jedes restlichen Peaks auf der Basis der Retentionszeit von A1c berechnet und dem Datenanalysebereich 45 wird befohlen, die Identifizierung durchzuführen.

Das Zeitfenster jedes Peaks ist eine Funktion, die der Retentionszeit von A1c innewohnt. Dies kann als das weiterentwickelte Identifizierungsver fahren betrachtet werden, und zwar aufgrund der relativen Retentionszeit, in der die Retentionszeit des Unterpeaks proportional zu der Retentions zeit des Hauptpeaks ist. Anders ausgedrückt wird in diesem Fall die proportionale Berechnung auf die allgemeine Funktion erstreckt, und die Zeitfenster werden als die Funktionen benutzt, die den zugeordneten Peaks innewohnen. Dieses Verfahren ist der Chromatographie verfügbar, die das Eluierungsverfahren anwendet, bei dem die proportionale Bezie hung nicht einfach unter den Retentionszeiten errichtet wird. Die Peaks L·A1c, F, A1b und A1a werden in der Reihenfolge abnehmender Reten tionszeit identifiziert. Mit dem Bestimmungswert des Bestandteils wird das Verhältnis, das durch seinen Peakbereich gebildet wird, in der Form einer Prozentangabe durch den Steuerbereich 44 auf dem CRT 46 angezeigt. Darüberhinaus wird das identifizierte Chromatogramm durch den Drucker 47 gedruckt, wie es in Fig. 7 gezeigt ist. Wenn kein Peak in dem berechneten Zeitfenster vorhanden ist, wird die Suchzeit gedruckt und der Bestimmungswert wird 0,0%. Danach werden, wenn die unbe kannten Proben 51 analysiert sind, Ao und A1c unter Verwendung des Verfahrens eines reduzierten Zeitfensters identifiziert, während die Peaks L·A1c, F, A1b und A1a unter Verwendung des Verfahrens jeweiliger variabler Zeitfenster identifiziert werden.

Fig. 7 zeigt die so erhaltenen beobachteten Daten.

Es wird im weiteren ein anderes Peakidentifizierungsverfahren beschrie ben. Bei diesem Identifizierungsverfahren wird ein Verfahren zum Identifizieren der Peaks von vielen zu erfassenden Bestandteilen ange wendet, die durch die Chromatographietrennung unter Verwendung des o.g. einzelnen Zeitfensters erhalten werden.

Bei diesem Identifizierungsverfahren werden die Bestandteile der Stan dardprobe zuerst durch die Trennsäule getrennt, und dann werden die Peaks, deren Bereiche größer als oder gleich 3.000 µV·s sind, ausgewählt. Als nächstes werden unter Verwendung der Zeitfenster von Tabelle 5 die Peaks, deren Scheitelpunkte in dem zugehörigen Zeitfenster vorhanden sind, erfaßt.

Nachfolgend werden mit dem Zeitfenster A von Tabelle 5 zwei Peaks in der Reihenfolge eines abnehmenden Bereichs ausgewählt. In diesem Fall, (1), wenn alle zwei Peaks ausgewählt werden, werden die Peaks als A1a und A1b in der Reihenfolge anwachsender Retentionszeit identifi ziert, und (2), wenn nur ein Peak ausgewählt wird, wird der Peak als A1b identifiziert.

Tabelle 5

Als nächstes werden mit dem Zeitfenster B der Tabelle 5 drei Peaks in der Reihenfolge eines abnehmenden Bereichs ausgewählt. In diesem Falle, (1) wenn alle drei Peaks ausgewählt werden, werden die Peaks als F, L·A1c und A1c in der Reihenfolge anwachsender Retentionszeit identifiziert, und (2), wenn zwei Peaks ausgewählt werden, wird der Peak mit größerer Retentionszeit als A1c identifiziert. Ein weiterer Peak wird als L·A1c identifiziert, wenn seine Retentionszeit innerhalb 0,4 Min. nahe A1c ist. Andererseits wird er als F identifiziert. (3) Wenn nur ein Peak ausgewählt wird, wird er als A1c identifiziert.

Weiterhin wird mit dem Zeitfenster C der Tabelle 5 der Peak mit dem größten Bereich als Ao identifiziert.

Um dieses Identifizierungsverfahren auszuführen, erfaßt der Datenanalyse bereich 45 der Fig. 5 zuerst die Peaks, deren Bereiche größer als oder gleich 3.000 µV·s sind, aus dem Chromatogramm 60, wie es in Fig. 6 gezeigt ist. Dann wird das Chromatogramm 60 in drei Zeitfenster aufgeteilt. Mit jedem Zeitfenster werden die Peaks, die jeweils einen großen Bereich aufweisen, ausgewählt und danach in Übereinstimmung mit den Regeln identifiziert. Der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 empfängt das Identifizierungsergebnis. Dann, wenn Ao und A1c nicht identifiziert sind, wird das Identifizierungsergebnis als Fehler beurteilt Wenn Ao und A1c identifiziert sind, befiehlt der Bereich 53 dem Steuer bereich 44, die Analyse der nachfolgenden unbekannten Probe 51 fort zuführen.

Bei dem Analysator für glykosyliertes Hämoglobin kann, auf die gleiche Art wie bei dem Katecholamin-Analysator, die Retentionszeit der indivi duellen Peaks von dem Referenzwert abweichen. In einem derartigen Fall wird die Änderung der Pumpenflußrate und der Säulentemperatur wie oben beschrieben eine effektive Maßnahme. Da der Analysator für glykosyliertes Hämoglobin die schrittweise Eluierung durchführt, kann darüberhinaus der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 die Berech nung in Übereinstimmung mit den Regeln durchführen, um dem Steuer bereich 44 zu befehlen, die Schaltzeit jedes Eluierungsmittels zu ändern. In diesem Fall ändert der Steuerbereich 44 die Bedingungen der Steue rung und mißt wieder die Standardprobe.

Wie hierin vorgestellt ist, stellt gemäß der vorliegenden Erfindung der Bediener des Analysators nur die Proben ein, um die Operation zu starten, und die Analysebedingungen werden automatisch von dem Analy sator selbst bestimmt. Daher ist der Bediener des Analysators frei von der Schwierigkeit, die Analysebedingungen zu untersuchen.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung der Chromatographieanalyse einer unbe kannten Probe, umfassend die Schritte:

a) Durchführen der Chromatographieanalyse einer Standardprobe mit Bestandteilen, die in der unbekannten Probe zu messen sind, unter Vorgabe erster Retentionszeitfenster, in denen Peaks der jeweils zu messenden Bestandteile erwartet werden, wobei die ersten Reten tionszeitfenster definiert sind durch jeweilige erste erwartete Reten tionszeiten und jeweilige erste Toleranzen um die jeweiligen ersten Retentionszeiten;
b) Bestimmen, ob die detektierten Peaks und ihre jeweiligen Höhen auf die zu messenden Bestandteile schließen lassen;
c) wenn das Ergebnis von b) positiv ist, Vorgabe zweiter Retentions zeitfenster, definiert durch jeweilige zweite Retentionszeiten gleich den jeweiligen gemessenen Retentionszeiten der detektierten Peaks sowie durch jeweilige zweite Toleranzen um die jeweiligen zweiten Retentionszeiten, wobei die zweiten Toleranzen kleiner als die ersten Toleranzen sind;
d) Durchführen der Chromatographieanalyse der unbekannten Probe unter Vorgabe der jeweiligen zweiten Retentionszeitfenster.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten Retentionszeitfenster voneinander verschieden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte b) bis d) automatisch durchgeführt werden.

4. Verfahren zur Durchführung der Chromatographieanalyse einer unbe kannten Probe nach Anspruch 1, dahin abgewandelt, daß vor dem Schritt b) in einem Schritt b1) bestimmt wird, 1. ob die Zahl der detektierten Peaks gleich der Zahl der zu messenden Bestandteile ist und 2. ob Bereiche der detektierten Peaks wenigstens in einem vor bestimmten Bereich größer als Null sind, und daß der Schritt b) nur dann durchgeführt wird, wenn das Ergebnis der Bestimmung positiv ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei auch der Schritt b1) automatisch durchgeführt wird.

6. Einrichtung zur Durchführung der Chromatographieanalyse an einer Standardprobe und anschließend an einer unbekannten Probe, enthaltend:

a) eine Vorrichtung zum Definieren erster Retentionszeitfenster, in denen das Auftreten von Peaks entsprechend den zu messenden Bestandteilen im Chromatogramm des Standardprobe erwartet wird, wobei die ersten Retentionszeitfenser definiert werden durch erste erwartete Retentionszeiten und erste Toleranzen um die ersten Retentionszeiten;
b) eine Vorrichtung zum Bestimmen, ob die detektierten Peaks und ihre jeweiligen Höhen auf die zu messenden Bestandteile schließen lassen;
c) eine Vorrichtung, die nach Feststellen eines positiven Ergebnisses von b) zweite Retentionszeitfenster vorgibt, definiert durch jeweilige zweite Retentionszeiten gleich den jeweiligen gemessenen Reten tionszeiten der detektierten Peaks, sowie durch jeweilige zweite Toleranzen um die jeweiligen zweiten Retentionszeiten, wobei die zweiten Toleranzen kleiner als die ersten Toleranzen sind, als Basis für die Chromatographieanalyse der unbekannten Probe.

7. Einrichtung nach Anspruch 6, wobei die Vorrichtungen a) bis c) auto matisch arbeiten.

8. Einrichtung zur Durchführung der Chromatographieanalyse nach An spruch 6, zusätzlich enthaltend

b1) eine Vorrichtung zum Bestimmen 1. ob die Zahl der detektierten Peaks gleich der Zahl der zu messenden Bestandteile ist und 2. ob Bereiche der detektierten Peaks wenigstens in einem vorbestimmten Bereich größer als Null sind, wobei die Vorrichtung a) nur in Tätigkeit tritt, wenn das Ergebnis dieser Bestimmung positiv ist.

9. Einrichtung nach Anspruch 8, wobei auch die Vorrichtung b1) automa tisch arbeitet.