DE4204853A1 - Verfahren zum durchfuehren einer chromatographieanalyse von proben und system zur anwendung desselben - Google Patents

Verfahren zum durchfuehren einer chromatographieanalyse von proben und system zur anwendung desselben

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Description

Die am 20. September 1991 eingereichte US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/7 63 203 bezieht sich auf die vorliegende Anmeldung, und die Gegenstände in der Anmeldung sind in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben und ein System zur Anwendung desselben, und insbesondere ein Verfahren, das einen Analysator benutzt. Die Chromatographie umfaßt eine Trennsäule, einen Detektor und einen Probenehmer zum automatischen Einführen von Proben in den Chromatograph.
Im allgemeinen werden, wenn ein Analysator benutzt wird, Analysebedingungen durch einen Analytiker bzw. Labortechniker bestimmt und werden durch ein Eingeben numerischer Werte und ähnlichem von einer Tastatur und durch Einstellen eines variablen Widerstandes bzw. Resistors eingestellt. Insbesondere in dem Fall, wo eine Vielzahl von Bestandteilen analysiert werden, müssen zuerst die Analysebedingungen zum Identifizieren der einzelnen Bestandteile eingestellt werden. Beispielsweise werden eine Retentionszeit und ihre Toleranz beim Identifizieren von Bestandteilen durch eine Chromatographie auf der Basis der Meßergebnisse von Versuchsproben durch einen Analytiker beurteilt und werden dann in eine Datenverarbeitungseinheit gegeben. Auch bei JP-A-63-2 90 958, die auf die Peaknachführung gerichtet ist, werden die Rententionszeiten der Peaks auf einem Chromatogramm als Bezug durch einen Analytiker eingegeben.
Weiterhin wird in der JP-A-60-2 39 669 die Konversion der Zeitbasis von einem Chromatogramm zu einem anderen Chromatogramm mit den Hauptpeaks durchgeführt, die als der Bezug zwischen den zwei Chromatogrammen benutzt werden. Dies steht zur Verfügung, wenn Verfahren zum Identifizieren eines Peaks zwischen den Chromatogrammen, bei denen die Retentionszeiten geändert werden, aber die Retentionszeiten der Peaks auf dem Chromatogramm werden als der Bezug auch durch den Bediener beurteilt.
Darüberhinaus mußte der Bediener beim Stand der Technik, wie den oben genannten JP-A-63-2 90 958 und JP-A-60-2 39 669, vor der Analyse unbekannter Proben immer die Analysebedingungen einmal einstellen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben zu schaffen, und ein System, das dasselbe verwendet, wobei ein Analysator selbst fähig ist, in den Proben enthaltene Bestandteile, die zu erfassen sind, automatisch zu bestimmen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben zu schaffen, und ein System, das dasselbe verwendet, wobei ein Bediener Retentionszeiten der zu analysierenden einzelnen Bestandteile nicht in einen Analysator eingeben muß.
Die vorliegende Erfindung kann folgende Schritte aufweisen:
Einführen einer bekannten Probe, wie einer Standardprobe, in eine Chromatographievorrichtung durch Betätigen eines Probennehmers, der eine Probe auf der Basis eines Operationsstartsignals in die Chromatographievorrichtung einführen kann, um ein Chromatogramm der bekannten Probe zu erhalten;
Erhalten eines Peaks, der einem zu messenden Bestandteil entspricht, auf der Basis des Chromatogramms der bekannten Probe, um eine Breite eines Zeitfensters des Peaks einzustellen;
Einführen einer unbekannten Probe in die Chromatographievorrichtung, um ein Chromatogramm der unbekannten Probe zu erhalten; und
Anwenden des eingestellten Zeitfensters auf das Chromatogramm der unbekannten Probe, um einen in der bekannten Probe enthaltenen Bestandteil zu identifizieren.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden folgende Schritte ausgeführt:
Achtgeben auf ein oder mehrere Peaks, die in einem Zeitfenster mit einer großen Breite existieren, die auf ein Chromatogramm einer bekannten Probe angewandt ist, um zu bestimmen, daß der Peak oder mehrere Peaks Peaks sind, die zu messenden Bestandteilen entsprechen, aufgrund einer Bedingung, daß Bereiche und Höhen der einzelnen Peaks zu den zu messenden Bestandteilen passen; und
Einstellen einzelner Zeitfenster, wobei jedes eine kleine Breite hat, auf die Peaks, die verwendet werden, nachdem eine Beziehung zwischen den Bestandteilen und den Peaks aufgestellt worden ist.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnung, wobei
Fig. 1 ein Blockdiagramm ist, das eine Systemanordnung eines Katecholamin- Analysators als ein erstes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt,
Fig. 2 eine Ansicht ist, teilweise diagrammäßig und teilweise blockdiagrammäßig, die beim Erklären eines Flußprinzips bei dem System der Fig. 1 nützlich ist;
Fig. 3 eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines Peakidentifizierungsverfahrens ist, das in dem System der Fig. 1 verwendet wird,
Fig. 4A eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines anderen Peakidentifizierungsverfahrens ist;
Fig. 4B ein Flußdiagramm eines anderen Ausführungsbeispiels ist;
Fig. 4C ein anderes Flußdiagramm ist, das ein anderes Verfahren zum Steuern von Meßbedingungen zeigt;
Fig. 5 ein Blockdiagramm ist, das eine Systemanordnung eines Analysators für glykosyliertes Hämoglobin als ein zweites Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 6 eine Ansicht ist, die nützlich beim Erklären eines Peakidentifizierungsverfahrens ist, das bei dem System der Fig. 5 verwendet wird; und
Fig. 7 eine Ansicht ist, die ein Beispiel eines Chromatogramms von dem System der Fig. 5 zeigt.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Chromatogramm als das Meßergebnis einer bekannten Probe, wie beispielsweise einer Standardprobe, benutzt, um Retentionszeiten von in einer Reihe unbekannter Proben enthaltenen zu erfassenden Bestandteilen zu bestimmen.
Zuerst wird die Information für qualitative und quantitative Analysen von dem Meßergebnis der Standardprobe extrahiert. Dann wird beurteilt, ob diese Information ausreichend ist oder nicht. Wenn die Information nicht ausreichend ist, werden die Analysebedingungen für die Kontrolle nochmals geprüft, und die Messung der Standardprobe wird fortgeführt, bis die Information ausreichend wird. In dem anderen Fall, wenn die Information ausreichend ist, wird der Bezug für die qualitativen und quantitativen Analysen durch einige Werte ausgedrückt, um die Analysebedingungen für eine Identifizierung, eine Datenanalyse und ähnliches zu bestimmen.
Um die vorliegende Erfindung auszuführen, werden vorbestimmte Komponenten, die den Analysator bilden, und vorbestimmte Reagenzien benutzt. Im Falle eines Chromatographiesystems entsprechen eine Säule, ein Extraktionsmittel bzw. Eluierungsmittel und die Standardprobe jenen Komponenten und Reagenzien. Die Komponente und das Reagenz sind nicht notwendigerweise ein Paar. Das bedeutet, daß eine Vielzahl von Kombination möglich sein kann, solange wie der Analysator das interessierende Paar aus den Kombinationen erkennen kann.
Das erste Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird im nachfolgenden unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis Fig. 4 beschrieben.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das eine Systemanordnung eines Flüssigchromatographiesystems zum Analysieren von Katecholamin zeigt, auf das die vorliegende Erfindung angewandt ist. Bei diesem Analysator wird das Katecholamin vor einem Trennen von Katecholamin mit einem Fluoreszenzlabel bzw. -Indikator vorderivatisiert, und wird dann in einer Vorsäule, die in einem Reaktionsbereich vorgesehen ist, einmal absorbiert, um Unreinheiten zu eliminieren, und wird danach als eine Probe in eine Trennsäule eingeführt. An einen Mechanismus-Steuerbereich 6 ist ein Eingabebereich 15 angeschlossen, der mit einer Starttaste versehen ist. Ein Auto-Probennehmer 5 ist mit einer beweglichen Pipettennadel 38 ausgestattet. In diesem Zusammenhang ist die Nadel 38 entlang einer Linie beweglich, die der Aufstellung eines Containers 10, der eine dahinein gestellte Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reagenzlösung aufweist, eines Standardprobencontainers 11, einer Mischkammer 12 und Containern 9 für eine unbekannte Probe entspricht.
Wenn ein Bediener für den Analysator die Starttaste drückt, die in dem Eingabebereich 15 des Analysators vorgesehen ist, saugt der Probennehmer 5 400 µl der Standardprobe ein, um sie in die Mischkammer 12 abzugeben, und zwar aufgund des Befehls von dem Mechanismus-Steuerbereich 6. In der Standardprobe 11 sind drei Arten von Katecholamin enthalten, d. h. 1000 pg/ml Noradrenalin (NE), 1000 pg/ml Adrenalin (E) und 1000 pg/ml Dopamin (DA). Nachfolgend wird eine wäßrige Lösung 10 eines Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reagenzes, das aus 400 µl 60 mM 1,2-Diphenylethylendiamin (DPE) besteht, angesaugt, um zu der Mischkammer abgegeben zu werden, um mit der Standardprobe 11 gemischt zu werden. 400 µl der resultierenden gemischten Flüssigkeit wird zu einem Meßrohr 64 in dem Reaktionsbereich 2 geführt, um die Fluoreszenz-Derivatisierungs-Reaktion zu beginnen.
Nach Ablauf von drei Minuten wird das derivatisierte Katecholamin einmal in einer Vorsäule 65 in dem Reaktionsbereich 2 absorbiert. Nach Ablauf weiterer drei Minuten wird das derivatisierte Katecholamin zusammen mit einem Eluierungsmittel, das von einer Eluierungsmittelzuführpumpe 1 durch eine Ventilschaltung zugeführt ist, zu der Trennsäule 3 geführt, um getrennt zu werden und durch eine "Reverse Phase" Chromatographie vorbereitet zu werden. Schließlich wird es durch einen Fluoreszenzdetektor 4 erfaßt. Das Chromatogramm wird als die erfaßten Daten in einem Datenanalysebereich 7 gespeichert.
Nachfolgend wird das Flußprinzip in dem System der Fig. 1 unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschrieben.
Ein entfernbares Probengestell 27 ist auf einer Bühne 28 in dem Auto- Probennehmer 5 des Katecholamin-Analysators montiert. Das Probengestell 27 hält eine Vielzahl von Probencontainern 9 mit Blutplasma-Proben, die dorthineingetan sind. Darüberhinaus sind in dem Probengestell 27 der Reaktionsreagenzcontainer 10 für die Fluoreszenz-Derivatisierung und Standardprobencontainer 11a und 11b angeordnet. In diesem Auto- Probennehmer 5 sind die Mischkammer 12, ein Düsenreinigungsgefäß 34, ein Ablaufanschluß 35 und ein Injektionsanschluß 36 in der festen Position neben der Bühne 28 vorgesehen.
Die Pipettendüse 38 dient, um die Probe oder das Reagenz in die Mischkammer 12 durch Pipettieren hinein zu pipettieren, oder überträgt die gemischte Probe von der Mischkammer 12 zu dem Injektionsanschluß 36. Ein Antriebsmechanismus 37 hat X-, Y- und Z-Antriebsfunktionen, so daß er die Pipettendüse 38 in Längs-, Breiten- oder Vetikalrichtung frei antreiben kann, um die Düse 38 zu der Position über irgendeinem Container oder Anschluß in dem Probennehmer zu bewegen. Das obere Ende der Pipettierdüse 38 ist durch ein Dreiwegeventil 26 mit einer Pipettenpumpe 17 und einem Reinigungsflüssigkeitsgefäß 18 durch eine Kapillarverbindung 39, wie beispielsweise ein Plastikrohr, gekoppelt. Ein Halteabschnitt 19 zum Halten der Pipettendüse 38 kann auf einer Schiene bewegt werden. Die Pipettenpumpe 17 ist eine Pumpe von zylindrischem Typ, die durch einen Impulsmotor angetrieben wird.
Bei dem Flußprinzipsystem, das eine Vorsäule 65 aufweist, wird eine Reinigungsflüssigkeit von einem Flüssigkeitsgefäß 61 durch ein Probeneinführungsventil 63 durch eine Pumpe 62 zu der Vorsäule 65 bei einer festen Flußrate geführt. Ein Meßrohr 64, das zusätzlich in dem Probeneinführungsventil 63 vorgesehen ist, mißt die Probe, die mit einer von dem Injektionsanschluß 36 injizierten Flüssigkeit gemischt ist.
Das Eluierungsmittel von einem Eluierungsmittelgefäß 66 wird zu der Trennsäule 3 durch die Pumpe 1 bei einer festen Flußrate geführt. In diesem Zusammenhang wird dieses Eluierungsmittel durch ein Säulenschaltventil 67 zu einer Trennsäule 65 geführt. Durch Umlegen des Säulenschaltventils 67 wird das Eluierungsmittel über die Vorsäule 65 geführt. In dieser Hinsicht wird die Probe, die in der Vorsäule 65 verarbeitet worden ist, zu der Trennsäule 3 geführt.
Die Probenbestandteile, die von der Trennsäule 3 eluiert worden sind, fließen durch eine Flußzelle 59 eines Fluorphotometers. Das durch das Fluorphotometer 4 erhaltene Meßsignal wird durch einen Analog/Digitalwandler 55 zu einer Signalverarbeitungseinheit 56 eingegeben. Die Signalverarbeitungseinheit enthält den Datenanalysebereich 7 und den Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14, gezeigt in Fig. 1, und kann das Ergebnis der Signalverarbeitung an einen Drucker 13 und einen CRT 8 ausgeben. Schaltventile 57 und 58 sind derart vorgesehen, um die Flüssigkeit in den Pumpen 62 und 1 wie erforderlich leeren zu können.
Als nächstes wird das Verfahren zum Identifizieren des auf der Basis des Chromatogramms der Standardprobe zu analysierenden Bestandteile unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben.
Dieses Identifizierungsverfahren ist ein Verfahren, bei dem die Breite des Zeitfensters als die Identifizierungstoleranz auf der Basis des Chromatogramms der Standardprobe 11 begrenzt ist. Dann wird dieses Verfahren Verfahren mit reduziertem Fenster genannt, wenn es anwendbar ist. Dieses Verfahren nutzt aus, daß die Peaks der drei Katecholaminbestandteile, die in der Standardprobe 11 enthalten sind, so gefaßt sind, daß sie viel größer als jene sind, die auf den Unreinheiten basieren. Der Datenanalysebereich 7 wendet zuerst die Zeitfenster, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, auf das Chromatogramm 20 an und identifiziert drei Peaks 23, 22 und 21 als DA, E bzw. NE, und zwar in der Reihenfolge abnehmender Retentionszeit. In dem Fall, wo eine Vielzahl von Peaks in einem Zeitfenster vorhanden ist, werden weitere Peaks näher identifiziert, die jeweils eine größere Retentionszeit haben.
Tabelle 1
Der Datenanalysebereich 7 überträgt die Information der Retentionszeit tR, des Peakbereichs A und der Peakhöhe h, die sich auf die Peaks 21, 22 und 23 bezieht, die von dem Chromatogramm 20 erhalten sind, zu dem Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14. Der Bereich 14 beurteilt, ob die Information, die jene Peaks betrifft, zu den in Tabelle 2 aufgelisteten Bedingungen paßt oder nicht. Dann, wenn sie paßt, gibt der Bereich 14 einen Befehl zu dem Datenanalysebereich 7 aus, um die Breite des Zeitfensters zu reduzieren. Dann werden die Zeitfenster, die jeweils eine kleine Breite entsprechend den Peaks 21, 22 bzw. 23 aufweisen, eingestellt. Das Zentrum jedes Zeitfensters mit einer kleinen Breite wird als die Retentionszeit jedes Peak benutzt. Die Toleranz von dem Zentrum besteht, wie in Tabelle 3 gezeigt, in einer kleinen Zeitbreite. Dies resultiert in dem Fehler beim Identifizieren, wenn solche reduzierten Zeitfenster auf die Chromatogramme unbekannter Proben angewendet werden, die reduziert werden. Wenn der Datenanalysebereich 7 das Chromatogramm 20 analysiert, wird eine vorbestimmte Schwelle auf die Peakhöhe angewandt. Dann wird, in dem Fall, wo drei Peaks, die die Schwelle überschreiten, nicht in dem Chromatogramm 20 erhalten werden können, die Identifizierung beurteilt, daß sie ein Fehler ist.
Fig. 4B zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel. Bei einem Schritt 100 wird jeder Peak gegen die in Tabelle 2 aufgelisteten Bedingungen geprüft. Wenn irgendein Peak nicht zu den Bedingungen paßt, wird eine Anleitung (I) auf dem CRT 8 gezeigt wie folgt (Schritt 101):
"Peak (s) ist (sind) außerhalb des normalen Bereichs. Bitte Säule und Reagenzien prüfen."
Im anderen Fall, wenn alle Peaks zu den Bedingungen passen, wird die Korrelation zwischen den Peaks im Schritt 102 beurteilt. Die Korrelation wird durch das Verhältnis von Retentionszeiten der Peaks angezeigt, und das Verhältnis beschreibt die Balance zwischen den jeweiligen Retentionszeiten. Wenn das Verhältnis außerhalb der im Schritt 102 aufgelisteten Bedingungen liegt, wird eine Anleitung (II) auf dem CRT 8 gezeigt wie folgt (Schritt 103):
"Balance jeweiliger Retentionszeiten der Peaks ist nicht normal. Bitte Säule und Reagenzien prüfen."
In der Tat wird die Balance unter den Retentionszeiten durch Berechnen ihrer Differenzen beurteilt. In diesem Fall werden die im Schritt 102 aufgelisteten Bedingungen durch die folgenden ersetzt.
tE-tNE<0,30 Min.
und
tDA-tE<0,60 Min.?
Wenn die durch den Auto-Probennehmer 5 in den Chromatographieanalysator eingeführte unbekannte Probe getrennt ist und das Meßergebnis in der Form des Chromatogramms erhalten ist, werden die individuellen Zeitfenster, die jeweils eine in Tabelle 3 aufgelistete kleine Breite haben, auf das Chromatogramm der unbekannten Probe angewendet, so daß die Bestandteile, die in der unbekannten Probe enthalten sind, identifiziert werden.
Tabelle 2
Tabelle 3
Als nächstes wird unter Bezugnahme auf Fig. 4 ein weiteres Peakidentifizierungsverfahren beschrieben. Dieses Identifizierungsverfahren ist ein Verfahren, bei dem ein einzelnes Zeitfenster zuerst auf ein Chromatogramm der Standardprobe angewendet wird, um die Peaks einer Vielzahl zu erfassender Bestandteile zu identifizieren.
Der Datenanalysebereich 7 zählt die Peaks, die in dem einzelnen Zeitfenster in dem Chromatogramm 20 vorhanden sind, und von welchen Bereichen größer als oder gleich wie 100 000 µV.s sind. Nur im Falle eines Vorhandenseins von drei Peaks überträgt der Bereich 7 die Retentionszeit tR, den Peakbereich A und die Peakhöhe h zu dem Analysebedingungs- Entscheidungsbereich 14. Andererseits wird die Identifizierung beurteilt, daß sie ein Fehler ist. Das einzelne Zeitfenster kann den ganzen Bereich des Chromatogramms abdecken. Der Analysebedingungs- Entscheidungsbereich 14 diagnostiziert das Meßergebnis auf der Basis der Tabelle 2 auf die gleiche Art, wie oben beschrieben. Wenn das Ergebnis akzeptabel ist, gibt der Bereich 14 einen Befehl zu dem Datenanalysebereich 7 aus, um die reduzierten Zeitfenster von Tabelle 3 für die Analyse der unbekannten Proben zu benutzen.
Die Zeitfenster von Tabelle 3, die automatisch auf der Basis des Verfahrens der Fig. 3 oder der Fig. 4 bestimmt werden, werden durch den Drucker 13 auf das Chromatogramm 20 überschrieben. Darüberhinaus können jene Zeitfenster auf dem Chromatogramm auf dem CRT 8 angezeigt werden. Danach werden bei der Analyse der unbekannten Probe 9, wie beispielsweise Blutplasma, jene Zeitfenster benutzt, um die Daten zu analysieren. Die quantitative Analyse der unbekannten Probe wird durch die proportionale Berechnung unter Verwendung der Peakbereiche der Standardprobe als der Bezug durchgeführt. Genauer gesagt wird der Bereich jedes Peaks, von dem ein Bestandteil auf der Basis der individuellen Zeitfenster von Tabelle 3 identifiziert ist, mit dem Bereich jedes Peaks der Standardprobe verglichen. Dann wird die Konzentration jedes Bestandteils der unbekannten Probe proportional berechnet, und zwar aufgrund einer Bedingung, daß der Peakbereich jedes Bestandteils der Standardprobe 1000 pg/ml ist.
Während des Durchführens der Analyse kann in einigen Fällen ein Fehler auftreten. Für einen derartigen Fehler können einige Gründe in Erwägung gezogen werden. In dem Fall, wo die Säule, das Reagenz oder die Komponente fehlerhaft bzw. degradiert wird, wird der Analytiker von dieser Information informiert, so daß der Austausch der degradierten Säule, des Reagenzes oder der Komponente erforderlich ist. Zusätzlich dazu kann ein Fall auftreten, wo der Analysator selbst die Steuerbedingungen ändert, so daß die Analyse ohne irgendeine Behinderung ausgeführt werden kann. Wenn die Peaks allgemein klein sind, ist es beispielsweise praktisch, den Verstärkungsfaktor des Fluoreszenzdetektors 4 zu erhöhen, die Reaktionstemperatur des Reaktionsbereichs 2 anzuheben oder ihre Reaktionszeit auszudehnen. Wenn die Retentionszeiten der Peaks kurz sind, ist es darüberhinaus praktisch, die Flußrate der Pumpe 1 zu verringern oder die Temperatur der Säule 3 zu reduzieren. Wenn die Fehler auftreten, befiehlt der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14 dem Mechanismus-Steuerbereich 6, die Steuerbedingungen der individuellen Antriebsbereiche zu ändern, und zwar unter Verwendung der Regeln, die auf der Basis der Daten von dem Chromatogramm 20 und den Sensoren aufgestellt sind. Beispielsweise in dem Fall, wo die Retentionszeit des letzten Peaks länger ist als jene des Bezugs, wird zuerst die Grenze der Trennung jedes Peaks auf der Basis der Auflösung Rs, des Intervalls der Retentionszeit ΔTR und der theoretischen Bodenzahl N abgeschätzt. Wenn die Trennung die Grenze hat und der Druck geringer als der Referenzwert ist, wird die Berechnung derart durchgeführt, daß die Retentionszeit des letzten Peaks innerhalb des Referenzwertes liegt, wodurch die Flußrate der Pumpe 1 erhöht wird. Sogar wenn die Trennung die Grenze hat, wenn der Druck größer als oder gleich dem Referenzwert ist, wird die Berechnung in Übereinstimmung mit den Regeln durchgeführt und es wird gleichzeitig empfohlen, die Temperatur der Säule 3 anzuheben und die Flußrate der Pumpe 1 zu erhöhen. Der Mechanismus-Steuerbereich 6 ändert die Bedingungen der Steuerung in der Art, wie oben beschrieben ist, und steuert den Betrieb jedes Antriebsbereichs derart, daß die Standardprobe 11 wieder gemessen wird.
Weiterhin ist zum Zwecke der Messung des Zustands der Reaktion ein Verfahren vorgeschlagen, wobei zwei Arten von Proben benutzt werden, von denen die Konzentration bekannt ist. Genauer ausgedrückt, werden die Standardprobe 11a, die 1000 pg/ml NE, 1000 pg/ml E und 1000 pg/ml DA enthält, und die Standardprobe 11b, die 500 pg/ml NE, 1000 pg/ml E und 2000 pg/ml DA enthält, individuell gemessen. Wenn die Linearität der Reaktion normal ist, hat das Meßergebnis der Probe 11b den Bestimmungswert, der proportional zu der Konzentration ist. Wenn die Linearität der Reaktion geringer als oder gleich dem Bezug ist, führt der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14 die Berechnung in Übereinstimmung mit vorbestimmten Regeln durch und befiehlt dem Mechanismus- Steuerbereich 6, die Bedingungen der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit des Reaktionsbereichs 2 zurückzusetzen.
Weiterhin können die Temperatur der Säule 3 und die Flußrate der Pumpe 1 gemäß der Retentionszeit tDA des letzten Peaks DA gesteuert werden. Fig. 4C zeigt ein Ausführungsbeispiel dafür. Bei diesem Ausführungsbeispiel werden die letzte Retentionszeit tDA und deren Toleranz als 2,50 Min. bzw. ±0,50 Min. unter normalen Bedingungen angenommen.
Wenn die letzte Retentionszeit tDA geringer als 2,00 Min. ist, sollte die Flußrate der Pumpe 1 erniedrigt werden. Die Flußrate der Pumpe 1 wird durch den Bereich 6 gesteuert. Konkret ausgedrückt, wird der Druck der Pumpe unterdrückt, so daß die laufende Flußrate F sich auf F x (tDA/2,50) erniedrigt.
Wenn die letzte Retentionszeit tDA größer als 3,00 Min. ist (Schritt 114), werden ein Intervall ΔtR zwischen den Peaks DA und E (Schritt 116) und ein Index einer Anzahl von theoretischen Böden (Schritt 118) beurteilt. In den Schritten 116 und 118 bezeichnet tE die Retentionszeit (Min.) des Peaks E, hDA bezeichnet die Höhe (in µV) des Peaks DA und ADA bezeichnet den Bereich (in µV×Min.) des Peaks DA.
Wenn das Intervall ΔtR größer als 1,00 Min. ist und der Index auch größer als 1000 ist, wird Schritt 120 durchgeführt. In den anderen Fällen wird der gegenwärtige Algorithmus beendet und eine unbekannte Probe wird in das Flußprinzip eingeführt, weil die letzte Retentionszeit tDA innerhalb der Toleranz angenommen wird.
Beim Schritt 120 wird der vorhandene Druck der Pumpe 1 mit ihrem spezifizierten Druck verglichen und der Spielraum dazwischen bestimmt. Aufgrund der Annahme, daß der Druck der Pumpe proportional zu der Flußrate ist, ist der Druck nämlich auch umgekehrt proportional zu der letzten Retentionszeit tDA. Dadurch wird der Druck P′ der Pumpe, der die letzte Retentionszeit tDA 2,50 Min. ergibt, berechnet, und der Druck P′ wird beurteilt, ob er innerhalb des spezifizierten Drucks der Pumpe, z. B. 100 bar, liegt. In dem Fall, wo der Druck P′ außerhalb der Spezifikation ist, wird die Temperatur der Säule erhöht (um 2°K), um die Retentionszeit zu verkürzen (Schritt 122). Wenn im Gegensatz dazu der Druck P′ innerhalb der Spezifikation liegt, wird der Druck der Pumpe erhöht, um die derzeitige Flußrate F auf F×(tDA/2,50) zu erhöhen.
Die oben beschriebene Korrektur für die Meßbedingung wird wiederholt, bis die letzte Retentionszeit tDA innerhalb der Toleranz liegt (Schritt 126).
Wenn zum Zwecke des Analysierens von Blutplasma und Urin die Standardproben mit den verschiedenen Konzentrationen oder die Standardproben mit den verschiedenen Konzentrationsverhältnissen vorbereitet werden, führt der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 14 weiterhin die Beurteilung auf der Basis der Schwelle des Peakbereichs oder des Bereichsverhältnisses der drei Bestandteile durch. Somit ist es ohne irgendeine Eingabe von dem Analytiker möglich, zu erkennen, was zu analysieren ist. Der Bereich 14 kann das erkannte Analyseverfahren zu dem Steuerbereich 6 einstellen.
Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist unter der Annahme beschrieben, daß das Katecholamin drei Bestandteile NE, E und DA hat. Die Analyse kann jedoch auch in Hinsicht auf den spezifischen Fall durchgeführt werden, wo das Katecholamin sechs Bestandteile einschließlich DOPA, DOPAC und DOPEG zusätzlich dazu aufweist. In diesem Fall ist es möglich, die Analysebedingung auszuwählen, bei der die Analyse für drei Bestandteile in einer kürzeren Zeit beendet werden kann als jene Analyse für sechs Bestandteile. Der in Fig. 1 gezeigte Analysator kann das Analyseverfahren bestimmen, indem er nur entweder die Standardprobe von drei Bestandteilen oder jene von sechs Bestandteilen auswählt, ohne eine Eingabeoperation von dem Bediener. Während der Einstelloperation des Chromotographiesystems wird die Standardprobe gemessen, und das Vielfachpeaks-Identifizierungsverfahren wird durch das oben angeführte einzelne Fenster angewendet. Der Analysebedingungs- Entscheidungsbereich 14 zählt die Zahl der Peaks, von welchen Bereiche die Referenzschwelle überschreiten. Wenn die Anzahl der Peaks drei ist, befiehlt dann der Bereich 14 dem Mechanismus-Steuerbereich 6 die Analyse für drei Bestandteile auszuführen, während, wenn ihre Anzahl sechs ist, der Bereich 14 dem Bereich 6 befiehlt, die Analyse für sechs Bestandteile auszuführen. Danach geht die Analyse zu der Standardprobe weiter, und dann zu den unbekannten Proben. Auch wenn keine Messung während der Einstelloperation durchgeführt wird, kann weiterhin ein Verfahren derart durchgeführt werden, daß die Standardprobe durch das Analyseverfahren für sechs Bestandteile mit einer langen Analysezeit gemessen wird, und auf Erfassen der drei Peaks hin das Analyseverfahren zu dem Analyseverfahren für drei Bestandteile umgeschaltet wird.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird im nachfolgenden unter Bezugnahme auf Fig. 5 und Fig. 6 beschrieben. Das in Fig. 5 gezeigte System ist ein Flüssigchromatographieanalysator, der glykosyliertes Hämoglobin durch die Ionenaustauschchromatographie analysiert. Eine Eluierungsmittel-Zuführpumpe 40 führt die Eluierungsmittel A 48, B 49 und C 50 derart zu, daß A 48, B 49, und C 50 geschaltet werden, um jeweils für 1,9 Min., 1,0 Min. und 0,4 Min. für jede Probe zugeführt zu werden. Somit führt die Pumpe 40 die schrittweise Eluierung durch. Demgemäß wird mit jeder unbekannten Probe 51 die schrittweise Eluierung in einem Zyklus von 3,3 Min. aufeinanderfolgend durchgeführt.
Vor der Chromatographietrennung der unbekannten Proben 51 saugt ein Auto-Probennehmer 43 mit einer beweglichen Nadel 5 µl einer Standardprobe 52 von Hämoglobin (Hb) an, das eine Vielzahl von zu erfassenden Bestandteilen enthält, um es der Verdünnungsbehandlung auszusetzen, und danach führt er die resultierende Flüssigkeitslösung zu dem Chromatographie- Flußprinzip mit einer Trennsäule 41. Die Standardprobe wird zusammen mit dem Eluierungsmittel A 48 in die Trennsäule 41 eingeführt, so daß die Bestandteile, die darin enthalten sind, getrennt und verstreut werden. Jeder Bestandteil, der von der Trennsäule 41 eluiert worden ist, wird durch einen Detektor 42 mit Absorptionsvermögen im sichtbaren Bereich erfaßt. Das Chromatogramm wird als die erfaßten Daten in einem Datenanalysebereich 45 gespeichert.
Eine Signalverarbeitungseinheit, die den Datenanalysebereich 45 und einen Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 enthält, erhält die Peaks, die den Bestandteilen entsprechen, die auf der Basis des Chromatogramms der Standardprobe zu erfassen sind, stellt die Breiten der Zeitfenster der Peaks ein und wendet die so eingestellten Zeitfenster auf das Chromatogramm jeder unbekannten Probe an, um dadurch die in jeder unbekannten Probe enthaltenen Bestandteile zu identifizieren. Ein Mechanismus-Steuerbereich 44 betätigt den Probennehmer 43, wenn das Operationsstartsignal von einem Eingabebereich 15 angelegt ist, um den Probennehmer 43 das Abtasten der Standardprobe 53 durchführen zu lassen. Nachdem die Zeitfenster gesetzt worden sind, betätigt der Bereich 44 den Probennehmer 43 wieder, um den Probennehmer 43 das Abtasten jeder unbekannten Probe 51 durchführen zu lassen. Die Chromatogramme der Standardprobe und der unbekannten Proben werden zu einem Drucker 47 und einem CRT 46 ausgegeben.
Im nachfolgenden wird das Verfahren zum Identifizieren der Peaks der Bestandteile unter Verwendung des Chromatogramms der Standardprobe unter Bezugnahme auf Fig. 6 beschrieben. Der Datenanalysebereich 45 wählt die Peaks, von denen Bereiche größer als oder gleich 3000 µV.s sind, aus dem Chromatogramm 60 der Standardprobe aus, das von dem Detektor 42 erhalten ist, und wendet die in Tabelle 4 gezeigten Zeitfenster darauf an. Als ein Ergebnis wird erkannt, daß die Retentionszeit des Peaks Ao 2,50 Min. beträgt, die Retentionszeit des Peaks A1c, 1,66 Min. beträgt, und jene des Peaks A1a 0,41 Min. beträgt. In Tabelle 4 ist die Retentionszeit des gemessenen Peaks A1c gezeigt. Die Peaks L · A1c, F und A1b werden auf der Basis Des Berechnungsausdrucks der Tabelle 4 berechnet. Das bedeutet, daß der Peak L · A1c unter Verwendung von (1,46±0,15) Min. gesucht wird, ausgedrückt durch das Berechnungsergebnis von (1,00×1,66-0,20) ihrer Toleranz als das Zeitfenster. In Fig. 6 ist der entsprechende Peak nicht identifiziert. Auf ähnliche Weise wird das Zeitfenster des Peaks F berechnet, um in dem Bereich von (0,97±0,15) Min. zu sein, und jenes des Peaks A1b wird berechnet, um in dem Bereich (0,56±0,20) Min. zu sein. Im Falle der Fig. 6 beträgt die Retentionszeit des Peaks F 0,97 Min. und jene des Peaks A1b beträgt 0,64 Min.
Tabelle 4
Die einzelnen Zeitfenster, die in Hinsicht auf die Peaks Ao und A1c reduziert sind, werden auf die Chromatogramme der unbekannten Proben 51 angewendet. Das bedeutet, daß das Zeitfenster für den Peak Ao auf (2,50±0,15) Min. eingestellt wird, und das Zeitfenster für den Peak A1c wird auf (1,66±0,15) Min. eingestellt.
Der Peak L · A1c oder F als der Unterpeak kann in einigen Fällen nicht von der Hb-Standardprobe 52 getrennt und erfaßt werden. Daher ist das oben angegebene Verfahren verfügbar. Der Datenanalysebereich 45 führt die Identifizierung in bezug auf das Chromatogramm in Übereinstimmung mit dem Verfahren durch, wie es oben beschrieben ist. Zuerst werden die Peaks ausgewählt, von denen Bereiche die Schwelle überschreiten. Nachfolgend werden Ao und A1c unter Verwendung des oben angegebenen Verfahrens mit reduziertem Zeitfenster identifiziert. Der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 reduziert die Toleranzen der Peaks Ao und A1c auf ±0,15 für die unbekannte Probe 51 des Blutes. Dann wird das Zeitfenster jedes restlichen Peaks auf der Basis der Retentionszeit von A1c berechnet und dem Datenanalysebereich 45 wird befohlen, die Identifizierung durchzuführen.
Das Zeitfenster jedes Peaks ist eine Funktion, die der Retentionszeit von A1c innewohnt. Dies kann als das weiterentwickelte Identifizierungsverfahren betrachtet werden, und zwar aufgrund der relativen Retentionszeit in der die Retentionszeit des Unterpeaks proportional zu der Retentionszeit des Hauptpeaks ist. Anders ausgedrückt wird in diesem Fall die proportionale Berechnung auf die allgemeine Funktion erstreckt, und die Zeitfenster werden als die Funktionen benutzt, die den zugeordneten Peaks innewohnen. Dieses Verfahren ist der Chromatographie verfügbar, die das Eluierungsverfahren anwendet, bei dem die proportionale Beziehung nicht einfach unter den Retentionszeiten errichtet wird. Die Peaks L · A1c, F, A1b und A1a werden in der Reihenfolge abnehmender Retentionszeit identifiziert. Mit dem Bestimmungswert des Bestandteils wird das Verhälnis, das durch seinen Peakbereich gebildet wird, in der Form einer Prozentangabe durch den Steuerbereich 44 auf dem CRT 46 angezeigt. Darüberhinaus wird das identifizierte Chromatogramm durch den Drucker 47 gedruckt, wie es in Fig. 7 gezeigt ist. Wenn kein Peak in dem berechneten Zeitfenster vorhanden ist, wird die Suchzeit gedruckt und der Bestimmungswert wird 0,0%. Danach werden, wenn die unbekannten Proben 51 analysiert sind, Ao und A1c unter Verwendung des Verfahrens eines reduzierten Zeitfensters identifiziert, während die Peaks L · A1c, F, A1b und A1a unter Verwendung des Verfahrens jeweiliger variabler Zeitfenster identifiziert werden.
Fig. 7 zeigt die so erhaltenen beobachteten Daten.
Es wird im weiteren ein anderes Peakidentifizierungsverfahren beschrieben. Bei diesem Identifizierungsverfahren wird ein Verfahren zum Identifizieren der Peaks von vielen zu erfassenden Bestandteilen angewendet, die durch die Chromatographietrennung unter Verwendung des o. g. einzelnen Zeitfensters erhalten werden.
Bei diesem Identifizierungsverfahren werden die Bestandteile der Standardprobe zuerst durch die Trennsäule getrennt, und dann werden die Peaks, deren Bereiche größer als oder gleich 3000 µV.s sind, ausgewählt. Als nächstes werden unter Verwendung der Zeitfenster von Tabelle 5 die Peaks, deren Scheitelpunkte in dem zugehörigen Zeitfenster vorhanden sind, erfaßt.
Nachfolgend werden mit dem Zeitfenster A von Tabelle 5 zwei Peaks in der Reihenfolge eines abnehmenden Bereichs ausgewählt. In diesem Fall, (1), wenn alle zwei Peaks ausgewählt werden, werden die Peaks als A1a und A1b in der Reihenfolge anwachsender Retentionszeit identifiziert, und (2), wenn nur ein Peak ausgewählt wird, wird der Peak als A1b identifiziert.
Zeitfenster
(Min)
A
0,0-1,0
B 1,1-2,3
C 2,4-3,0
Als nächstes werden mit dem Zeitfenster B der Tabelle 5 drei Peaks in der Reihenfolge eines abnehmenden Bereichs ausgewählt. In diesem Falle, (1) wenn alle drei Peaks ausgewählt werden, werden die Peaks als F, L · A1c und A1c in der Reihenfolge anwachsender Retentionszeit identifiziert, und (2), wenn zwei Peaks ausgewählt werden, wird der Peak mit größerer Retentionszeit als A1c identifiziert. Ein weiterer Peak wird als L · A1c identifiziert, wenn seine Retentionszeit innerhalb 0,4 Min. nahe A1c ist. Andererseits wird er als F identifiziert. (3) Wenn nur ein Peak ausgewählt wird, wird er als A1c identifiziert.
Weiterhin wird mit dem Zeitfenster C der Tabelle 5 der Peak mit dem größten Bereich als Ao identifiziert.
Um dieses Identifizierungsverfahren auszuführen, erfaßt der Datenanalysebereich 45 der Fig. 5 zuerst die Peaks, deren Bereiche größer als oder gleich 3000 µV.s sind, aus dem Chromatogramm 60, wie es in Fig. 6 gezeigt ist. Dann wird das Chromatogramm 60 in drei Zeitfenster aufgeteilt. Mit jedem Zeitfenster werden die Peaks, die jeweils einen großen Bereich aufweisen, ausgewählt und danach in Übereinstimmung mit den Regeln identifiziert. Der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 empfängt das Identifizierungsergebnis. Dann, wenn Ao und A1c nicht identifiziert sind, wird das Identifizierungsergebnis als Fehler beurteilt. Wenn Ao und A1c identifiziert sind, befiehlt der Bereich 53 dem Steuerbereich 44, die Analyse der nachfolgenden unbekannten Probe 51 fortzuführen.
Bei dem Analysator für glykosyliertes Hämoglobin kann, auf die gleiche Art wie bei dem Katecholamin-Analysator, die Retentionszeit der individuellen Peaks von dem Referenzwert abweichen. In einem derartigen Fall wird die Änderung der Pumpenflußrate und der Säulentemperatur wie oben beschrieben eine effektive Maßnahme. Da der Analysator für glykosyliertes Hämoglobin die schrittweise Eluierung durchführt, kann darüber hinaus der Analysebedingungs-Entscheidungsbereich 53 die Berechnung in Übereinstimmung mit den Regeln durchführen, um dem Steuerbereich 44 zu befehlen, die Schaltzeit jedes Eluierungsmittels zu ändern. In diesem Fall ändert der Steuerbereich 44 die Bedingungen der Steuerung und mißt wieder die Standardprobe.
Wie hierin vorgestellt ist, stellt gemäß der vorliegenden Erfindung der Bediener des Analysators nur die Proben ein, um die Operation zu starten, und die Analysebedingungen werden automatisch von dem Analysator selbst bestimmt. Daher ist der Bediener des Analysators frei von der Schwierigkeit, die Analysebedingungen zu untersuchen.

Claims (10)

1. Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben unter Verwendung einer Chromatographievorrichtung mit einer Trennsäule (3, 41) und einem Detektor (4, 42) und eines Probennehmers (5, 43) zum Einführen der Proben in den Chromatograph, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
Betätigen des Probennehmers (5, 43) auf der Basis eines Operationsstartsignals, um eine bekannte Probe in den Chromatograph einzuführen, um dadurch ein Chromatogramm der bekannten Probe zu erhalten;
Erhalten eines Peaks, der einem zu messenden Bestandteil entspricht, auf der Basis des Chromatogramms der bekannten Probe, um eine Breite eines Zeitfensters der Spitze einzustellen;
Einführen einer unbekannten Probe in den Chromatographen, um ein Chromatogramm der unbekannten Probe zu erhalten; und
Anwenden des eingestellten Zeitfensters auf das Chromatogramm der unbekannten Probe, um einen in der unbekannten Probe enthaltenen Bestandteil zu identifizieren.
2. Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 1, wobei eine Konzentration des in der unbekannten Probe enthaltenen Bestandteils durch Vergleichen eines Peakbereiches in dem Chromatogramm der bekannten Probe und einem Peakbereich in dem Chromatogramm der unbekannten Probe miteinander erhalten wird.
3. Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 1, das weiterhin die Schritte umfaßt:
Achtgeben auf einen oder mehrere Peaks, die in einem Zeitfenster mit einer großen Breite vorhanden sind, das auf ein Chromatogramm der bekannten Probe angewendet wird, um zu bestimmen, daß der eine Peak oder mehrere Peaks den zu messenden Bestandteilen entsprechen, und zwar aufgrund einer Bedingung, daß die Bereiche und Höhen der Peaks zu den zu messenden Bestandteilen passen; und
Einstellen individueller Zeitfenster, wobei jedes eine kleine Breite hat, zu den Peaks, die verwendet werden, nachdem die Beziehung zwischen den Bestandteilen und den Peaks aufgebaut worden ist.
4. Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 1, wobei die eingestellten Zeitfenster zusammen mit dem Chromatogramm angezeigt werden.
5. Verfahren zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 1, wobei entsprechend der Anzahl von Peaks, deren Bereiche eine Referenzschwelle überschreiten, unter den Peaks, die in dem Chromatogramm der bekannten Probe auftreten, die Anzahl der zu messenden Bestandteile für die unbekannte Probe bestimmt wird.
6. System zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben, wobei das System einen Chromatograph mit einer Trennsäule (3, 41) und einem Detektor (4, 42) und einen Probennehmer (5, 43) enthält, der eine bekannte Probe und eine unbekannte Probe in den Chromatograph einführen kann, wobei das System aufweist:
eine Eingabeeinrichtung (15) zum Bereitstellen eines Operationsstartsignals für das Analysesystem;
eine Mechanismus-Steuereinrichtung (6, 44) zum Betätigen des Probennehmers (5, 43) auf der Basis des Operationsstartsignals von der Eingabeeinrichtung (15), um die bekannte Probe in den Chromatograph einzuführen; und
eine Signalverarbeitungseinrichtung (7, 45) zum Bestimmen eines Peaks, der einem zu analysierenden Bestandteil entspricht, um eine Breite eines Zeitfensters des Peaks einzustellen,
wobei die Mechanismus-Steuereinrichtung (6, 44) dazu dient, die unbekannte Probe in den Chromatograph nach einer Einführung der bekannten Probe einzuführen, und
die Signalverarbeitungseinrichtung (7, 45) dazu dient, das eingestellte Zeitfenster auf das Chromatogramm der unbekannten Probe anzuwenden, um dadurch einen in der unbekannten Probe enthaltenen Bestandteil zu identifizieren.
7. System zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 6, wobei das System weiterhin aufweist:
eine Anzeigeeinrichtung (8, 46) zum Anzeigen des eingestellten Zeitfensters zusammen mit dem Chromatogramm.
8. System zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 6, das ein System zum ausschließlichen Analysieren von Katecholamin oder glykosyliertem Hämoglobin ist.
9. System zum Durchführen einer Chromatographieanalyse nach Anspruch 6, das weiterhin eine Einrichtung (8) zum Zeigen einer vorbestimmten Anleitung gemäß dem Chromatogramm der bekannten Probe aufweist.
10. System zum Durchführen einer Chromatographieanalyse von Proben nach Anspruch 6, wobei das System weiterhin eine Einrichtung zum Korrigieren der Meßbedingung des Systems (1, 3) aufweist.
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