DE2847176A1

DE2847176A1 - Kolorimetrie-verfahren

Info

Publication number: DE2847176A1
Application number: DE19782847176
Authority: DE
Inventors: Mito Nomura; Hisayuki Sagusa; Ryohei Yabe
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1977-10-31
Filing date: 1978-10-30
Publication date: 1979-06-07
Also published as: US4263512A; DE2847176C2

Description

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HITACHI, LTD., Tokio - Japan

Kolorimetrie-Verfahren

Die Erfindung betrifft ein Kolorimetrie-Verfahren, das ini'.hesonds re bei der Analyse von Blutproben einset::bar ist, dl ( durch f'hyluis (Hi lehsaf't ) , Hämolyse (Auflösung der roten Blut \vv\ ι 1'-'I](Hi durch Austritt des roten Blut farbstoff s infolge Kinvirkung von Blutgiften) und Iktcrus (Gelbsucht) be-( iiil'.luli rind.

Ill·· h< ufige Tendenr; zur Automatisierung auf den Gebirt t.iv.i' Piochemio .ist beträchtlich. Verschiedene Arten autonat i !jeher lrlini scher Analysat oi-en oder Heßr.ellen einschließlich in l'ont j nuif rl i eher Strömung arbeitender Analysatoren !■jnd I ' rf i t i? früh<-r fiitviicl:elt worden; in letzter Zeit wurde auf ' i-'if π tin gesondei'ter Analysatoi' angegeben. Diese automatir'clun 11 ini scluti Analysat -oren haben bfträchtlich r,ur ottigei uiif. dt ι Gf raint ::ahl an Vei'suchrdat en und r.xiv Verl-ecBerung der Hf f ffMiaui f 1 ι i t beiget i'agen . Unter dem Grr.icht spunkt der Geluiu i gl:( i t df r Ilesf-ungcn viei'fen jedoch die gegenwärtig verfügbai f η aul ersat i sehen klinischen Analysat oi-en noch einige Trol leine auf und nfallen bei weitem nicht dir Anfordei'unpen der Be-

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nutzer. Unter anderem führen verschiedene Chromogene wie z. B. das bei Hämolyse auftretende Hämoglobin, das bei Ikterus auftretende Bilirubin oder die durch den Chylus hervorgerufene Trübung zu einem Verlust der Meßgenauigkeit bei automatischen klinischen Analysatoren.

Der Einfluß störender Chromogene ist insbesondere bei der kolorimetrischen Methode und der nephelometrisehen Methode beträchtlich, die nach dem Endpunkt-Verfahren arbeiten, jedoch bei der Geschwindigkeitsmethode (Messung der Reaktionsgeschwindigkeit) sehr klein. Zwar ist die Verwendung der Geschwindigkeitsmethode für alle biochemisch zu untersuchenden Materialien grundsätzlich möglich, jedoch treten Probleme in den Preisen der Reagenzien, in der Kompliziertheit der Durchführung und in der Durchführungsgeschwindigkeit auf. Entsprechend wird in jüngster Zeit ein sehr hoher Anteil aller Versuche nach kolorimetrischen Verfahren ausgeführt.

Die Entwicklung einer kolorimetrischen Methode (einschließlich einer nephelometrischen Methode), die frei von der Beeinflussung durch die Chromogene ist und zu einer hohen Genauigkeit führt, wäre demgemäß für die Automatisierung von Analysatoren von großer Bedeutung.

Eine Methode, die bisher für eine Verhinderung der Störung durch diese Chromogene als am grundlegendsten angesehen wurde, besteht in der Messung einer Blindprobe für jede Versuchsprobe und jeden Test. Obwohl dabei zahlreiche Probleme zu diskutieren sind, wie z. B. die Zusammensetzung des Reagens, wird grundsätzlich der Proben-Leerversuch mit einem Reagens gemessen, das keine bestimmten Materialien umfaßt, die für die Meßreaktion wesentlich sind, und die Versuchsprobe wird aus

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dem Unterschied zwischen der Messung mit diesem Reagens und dor HuHiJung mit der I!f;aktions lösung für die Versuchsprobe bestimmt. Hit dieser Methode ist es möglich, genaue Analysünergebnissej :ui erhalten, die nahe beim richtigen Wert liegen und frei- von Beeinflussung durch das störende Material :;ind. Wenn jedoch eine derartige Korrekturmethode mit Proben-Leerversueh bei einem automatischen klinischen Analysator verwendet wird, ;;ind ::wei Messungen für jede Probe erforderlich, und die Verarbeitungsgeschwhidigkeit des Analysators ist notwendig auf die Hälfte herabgesetzt, während eine erhöhte Anzahl von Reagenzien erforderlich ist. Entsprechend wird diese Methode gegenwärtig mit Ausnahme bestimmter Versuche für Spezialversuchsposten nicht verwendet.

Ein anderer Faktor, der zu einem Verlust der Meßgenauigkeit bei der kolorimetrischen Methode führt, besteht im Auftreten von Luftblasen und Feststoffen. Diese werden sowohl bei der kolorimetrischen Methode mit Strömungszelle als auch bei der direkten kolorimetrischen Methode mit Reagenzglas oder Probenküvette beobachtet.

Es gibt mehr als 'IO Arten von Materialien, die durch ko-Lorimetrische Verfahren in biochemischen Tests bestimmbar sind. Bisher wird ein Einweilenlängen- oder ein Zweiwellenlängen-Vorfahren bei der Kolorimetrie verwendet. Bei der erstgenannten Verfahrensweise wird die Lichtextinktion bei einer bestimmten Wellenlänge nahe dem Extinktionsmaximum eines reagierenden Materials entsprechend der Versuchsprobe oder einem Reaktionsprodukt und bei der an zweiter Stelle genannten Methode die Different zwischen den Lichtextinktionen bei einer Wellenlänge nahe d-?r.i Extinktionsmaximum und bei einer anderen geeigneten Wellenlänge gemessen. Jedoch sind beide Methoden dem Einfluß durch die störenden Chromogene ausgesetzt.

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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Vorfahren anzugeben, durch das der Einfluß der störenden L'liromogene auf die Messungen bestimmt werden kann; außerdem noil durch dieses Verfahren das Ausmaß der Trübung durch Ohylus sowie die Menge an aus Hämolyse stammendem Hämoglobin und ikterusbedingtem Bilirubin in einer Versuchsprobe bestimmbar sein; dieses Analysierverfahren soll weiterhin genaue Messungen ergeben, die frei von Störungen durch die störenden Chrornogene sind; schließlich soll bei diesem Analysierverfahren die Verarbeitung einer Versuchsprobe nicht beeinträchtigt werden, selbst wenn in einem gesonderten Verfahrensschritt der Einfluß durch die störenden Komponenten ausgeschaltet wird.

Gemäß der Erfindung wird Licht auf eine Versuchsprobe eingestrahlt, die störende Chromogene enthält-, und die Liehtextinktionen werden bei einer langen Wellenlänge, einer mittleren Wellenlänge und einer kurzen Wellenlänge im sichtbaren Wellenlängenbereich gemessen; der Gehalt an (Uiylus wird aus den Messungen bei der langen Wellenlänge bestimmt, der Grad der Hämolyse aus den Messungen bei der mittleren V/el lenlänge und der Gehalt an Bilirubin aus den Messungen bei der kurz en Wellenlänge.

Weiterhin wird bei der Erfindung ein iiir dir "ur?ammenset-zurig der Probe geeigneter Farbbildner d<v Probe zugeset z\ , um diese zu färben, und abhängig vom Grad der Fartfiit v/i cklung

werden die Lichtextinktionen oder die Di ff er« ii" der Farbextinktionen durch die Einwellenlängen-ru thodr odi r die Zweiwellenlängen-Methode gemessen; die Mei'ergobiidsse uorden durch die Chylus-Trübung, den Grad der Hämolyse und die Bilirubinmenge (Bilirubingrad) korrigiert, die für die gleiche Probe durch die oben erläuterte Methode⁵ bestimmt rind, um den Meßfehler zu verringern.

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Bei (Jc¹I- Erfindung wird also ein Farbbildner einer Blutsorumprobe zugesetzt, um diese zu färben, und Messungen für bestimmte Komponenten werden aufgrund der durch die Färbung hervorgerufenen Lichtextinktionen vorgenommen. Für eine Probe wird die Differenz-Lichtextinktion zwischen zwei Wellenlängen in jeweils einem Bereich langer Wellenlängen, einem Bereich mittlerer Wellenlängen und einem Bereich kurzer Wellenlängen im sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt. Die Chylus-Menge wird aus den Messungen für den Bereich langer Wellenlängen ermittelt; dor Grad der Hämolyse wird aus den Messungen für den Bereich mittlerer Wellenlängen ermittelt, und die Bilirubinmonge wird aus den Messungen für den Bereich kurzer Wellenlängen ermittelt. Diese Meßwerte für die bestimmten Komponenten v/erden dann durch entsprechende Vierte für Chylus, den Grad der Hä'moüyoe und den Grad an Bilirubin korrigiert, um sehr genaue Messungen zu erzielen.

nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung beispielhaft nälinr erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 schematische Kurven mit den Fehlerfaktoren bei der kolorimotrisehen Methode,

Fi f. < typische Blutnerum-Absorptionsspektren im sichtbaren Wellen!ängenbereich bei einer GOT-Heal:t ion (vgl. unten),

I'if'. '"· Be::u("r.spf l:t i>f ti für Cliylur·, Hämolyse und Ikteruc- in drr GOT-Rc alrt ion,

Γ j I'. ^fl c-inr rehciri-'ii i ο ehr- I'ai'st f-llung eines erfindungs-

l'imvU ( η f-ivdlyvni oiv _s und

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Fig. 5 die lichtempfindliche Einheit des in Pig. ¹I dargestellten Analysators.

Bevor das bevorzugte Ausführungsbeispiel der Erfindung näher beschrieben wird, soll die Beziehung zwischen den störenden Komponenten und den Absorptionsspektren bei der kolorimetrischen Methode anhand der Fig. 1 erläutert werden.

In Fig. 1 zeigt ein Spektrum 10 ein Absorptionsspektrum für ein ideales Blutserum-Reagens, das frei von störendem Material ist, und ein Spektrum 12 zeigt ein Absorptionsspektrum für ein tatsächliches Blutserum-Reagens, das störende Materialien enthält, wie z. B. Chylus, Hämolyse- und Ikterusprodukte. Ein Spektrum 13 zeigt ein Absorptionsspektrum für das gleiche Reagens wie für das Spektrum 10, wobei jedoch Luftblasen oder Feststoffe zugemischt sind. Wenn in Fig. 1 eine Einwellenlängen-Kolorimetrie-Methode bei einer Wellenlänge λ ο zugrundegelegt wird, sollten die Konzentrationen der Versuchskomponente in diesen drei Versuchsproben ungefähr gleich sein; tatsächlich sind jedoch die Messungen vom Spektrum 12 ungefähr zweimal so hoch wie die Messungen vom Spektrum 10, und die Messungen vom Spektrum 13 sind ungefähr viermal so hoch wie die Messungen vom Spektrum 10. Wenn eine Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-

Methode verwendet wird, verschieben die kleinen Luftblasen oder Feststoffe im allgemeinen die Spektren parallel entlang der Ordinate, und die Fehler sind nicht so groß wie die Fehler, die bei der Einwellenlängen-Kolorimetrie-Methode eingeführt werden. Jedoch ist bei der Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode die Störung durch die Chromogene kompliziert, wie dies durch das Spektrum 12 gezeigt ist, und wenn Wellenlängen X₂ und λ, bzw. λ ₂ und λ ₁ verwendet werden, wird ein positiver Fehler von 50 % bzw. ein negativer Fehler von 30 % eingeführt.

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- .rff-

Die Absorptionsspektren für die störenden Chromogene aus κ. D. Chylus, Ilämolyse und Ikterus, die oft im tatsächlichen Blutserum enthalten sind, ändern sich abhängig von den Flussigkeitseigenschaften, und in zahlreichen Fällen überlappen sie einander. Daher ist deren Spektralanalyse schwierig. Wenn die Absorption durch die Versuchsprobe diesen Absorptionsspektren überlagert wird, ist deren Analyse unter anderem schwieriger, und selbst wenn diese möglich ist, wird die Genauigkeit tatsächlich gering. Wenn zahlreiche Substanzen gleichzeitig in der gleichen Versuchsprobe, wie bei einem automatischen Vielfach-Analysator, zu untersuchen sind, ist es daher einfacher, ein Spektrum für eine Substanz zu analysieren, die am einfachsten zu analysieren ist, die Mengen der drei störenden Materialien aus dem sich ergebenden Spektrum zu bestimmen und die Messungen für die anderen Substanzen mittels der bestimmten Mengen des störenden Materials zu korrigieren als ein Spektrum für jede zu bestimmende

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Substanz zu analysieren. Die Substanzen, die am einfachsten für die Analyse der störenden Chromogene sind, sind solche, die mittels ultravioletter Absorption bestimmbar sind, wie z. B. Glutaminsäure-Oxyaroessigsäure-Transaminase (GOT), Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase (GPT), Lactatdehydrogenase (LDH) oder Hydroxybuttersäure-dehydrase (HBDH). Bei der Messung dieser Substanzen tritt eine Lichtabsorption der Testprobe, d. h. Nicotinamid-adenindinucleotid (NAD.H), lediglich im ultravioletten Bereich auf, und im sichtbaren Wellenlängenbereich überlappt es nicht das Absorptionsspektrum der störenden Materialien. Da weiterhin das Reagens kein Material enthält, das mit Hämoglobin, Ikterus-Bilirubin oder Lipoprotein (al3 Ursache für Trübung) reagiert, und es eine neutrale Pufferflüssigkeit (pH = 7,4) ist, sind die Spektren für die störenden Materialien relativ einfach in ihrem Verlauf und damit leicht zu analysieren.

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Fig. 2 zeigt ein Absorptionsspektrum im sichtbaren Wellenlängenbereich für die Ultraviolett-Messung eines typischen Blutserums durch eine GOT-Reaktion. In Fig. 2 zeigt die Kurve I^ ein NAD.H-Absorptionsspektrum, im Vergleich zu Wasser, von einem idealen normalen Rlutserum, das vollständig frei von störenden Chromogenen ist; die Kurve 16 zeigt ein Absorptionsspektrum im Vergleich zum Leer-Reagens, von einem Blutserum-Reagens einschließlich eines hohen Gehalts an Chylus; die Kurve 18 zeigt ein Absorptionsspektrum, im Vergleich zu einem Leer-Reagens, von einem Blutserum-Reagens mit einem hohen Gehalt an Ikterus-Bilirubin. Für die Wellenlängen gilt

11 12 ⁼ -^ ^nm> ^ 13 ⁼ ''¹^ ^nrn' ^m

nm, λ - 480 nm, λ _l6 = 505 nm, λ ^ - 5^Γ> rim,

λ „ = 570 nm, λ. .„ = 600 nm, λ „„ = 66θ rim, ^·?ι ⁼ 700 nm und λ ₂ρ ⁼ ^^0 nm. Durch Analyse der Spektren des Reagens im sichtbaren 'Wellenlangenbereich bei der GOT-flessung können die Mengen der störenden Chromogene bestimmt werden.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden näher erläutert, das einen automatischen Vielwellenlängen-Analysator mit 12 Wellenlängen als Meßwellenlängen verwendet. Fig. 3 zeigt Absorptionsspektren der störenden Komponenten, die durch den automatischen Vielwellenlängen-Arialysator erhalten sind. I'ie Kurve 20 zeigt ein Spektrum einer Bezugs-Chylus-Flüssigkeit, die mit einer GOT-neßflüssip.keit verdünnt ist, die Kurve 22 zeigt ein Spektrum für eine Bezugn-HUmolyse-Flüssigkeit, die mit einer GOT-Hefii lilnsigkeil verdünnt int, und die Kurve 2¹I zeigt ein Spektrum für eine Bezugs-Ikterus-Flüssigkeit, die mit einer GOT-MeßflüKsigkeit verdünnt ist. Die Bezugs-Chylus-Flüasigkeit wird durch Verdünnen und Emulgieren kleiner Polystyrol-Fart ikel in dc-r Größenordnuriß von 20 Kunkel-Einheiten mit einem GOT-Reaexrn? vorbereitet; die

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Be::ugi;-Hämolyse-Flüssigkeit wird durch Verdünnen und Auflösen ein^r Bezugs-Hämoglobin-Flüssigkeit von 1000 mg/dl mit ο j nor GOT-Ileßflüssigkeit bei gleichen Bedingungen wie das Blutserum beim Versuch vorbereitet; und die Bezugs-Ikterus-Flüssigkoit wird durch Verdünnen und Auflösen eines Bilirubin-Kontroll-Blutserums von 10 mg/dl mit einer GOT-Meßflüssigkeit bei gleichen Bedingungen wie das Blutserum beim Versuch erhalten. I'io Spektren 20, 22 und 2H sind im Vergleich zu einem Lenr-Reagen;· aufgetragen. Die verwendeten Wellenlängen sind gleich wie in Fig. 2.

Aus Fig. 3 folgt, daß von der Absorption im Proben-Leervoi'puch, die im sichtbaren Wellenlängenbereich im Bereich des GOT-Roagonn auftritt-, die Absorption im langen Wellenlängenbereich ( λ_o~ bis λ _o?) auf Chylus beruht, die Absorption im mittleren Wellenlängenbereich (A₁₇ bis Λ-,ρ) auf Chylur·. und IHnmlyse beruht, und die Absorption im kurzen Wellenlätifcnl f reich ( A₁₁ bis A₁^₁) auf den drei Komponenten Chylus, Ilänif Iy:-f und IkteruK beruht-. Damit können diese drei Komponenten p-t i'( nut in der folgenden Weise unterschieden werden.

Ii' Al rorptionsfipektren für das Versuchsproben-Reagens in Ί< r (Jt¹T-IIf.sir-ung vrerden über den gesamten Wellenlängenber < ich i'!i t li'.n Viel\.'r] .lf.nlängen-Siiekti'oniet er gemessen, und df ι 'ί'Ί-υ·ι·1 (lor Vei'iHiclipprc'l.e wird durch die UV-Absorption I f .-1 inn) . CIf i οΙϊγλ it ig wci'den die Mengen an Chylus, Hämolyse- und Il't r I¹Ur ι i'''dukt cn im Vei-Fuchsproben-Blutserum durch die r.i clit I ή ( η \,^r'. 1 ] f nlängennpekt ren in der folgenden Weise fest-

I ii r. J₁J-,. _an Chylun X wird aus dem Unterschied zwischen den Li chirxfinktion^n bei swei Wellenlängen (ζ. Β. λ „„ und λ -J₁) ornittf It , die zv/isehen λ _on und λ _oo liegen ^. I₁.

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χ = (D

φ
^χ2Ο-21

mit Ap_0-21 = Differenz der Lichtextinktion der Versuchsprobe bei den Wellenlängen λ _2Q und A₂₁ und

T_20-21 = Konstante, die eine Lichtextinktionsdifferenz je Einheit der Trübung anzeigt, die aus dem Spektrum 20 bestimmt ist.

Der Grad an Hämolyse Y wird aus der Lichtextinktionsdifferenz A₁^_-1Q für zwei Wellenlängen (z. B. X₁^ und X^ im mittleren Wellenlängenbereich bestimmt, d. h.:

_{γ =}- J48-19 " ^X * ^Tl8-19 ,^

^Hl8-19

mit T_18-19 = Konstante, die eine Lichtextinktionsdifferenz je Einheit der Trübung anzeigt, die aus dem Spektrum 20 bestimmt ist, und

Η_ι8-1ο = Konstante, die eine Lichtextinktionsdifferenz je Einheit an Hämolyseprodukt anzeigt, die aus dem Spektrum 22 bestimmt ist.

Der Grad an Ikterusprodukt Z wird aus der Lichtextinktionsdiff erenzA^.g für zwei Wellenlängen (z. B. λ ₁₍- und λ ^) im kurzen Wellenlängenbereich bestimmt. D. h.:

Z ^Ä15-16 - ^X ' ^T15-16 - ^Y * ⁿi5-l6

^B15-l6

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- Ill -

mit T₁^_-16 = Konstante, die eine Lichtextinktionsdifferenz je Einheit der Trübung anzeigt, die aus dem Spektrum 20 bestimmt ist,

fLf-.g = Konstante, die eine Lichtextinktionsdifferenz je Einheit der Hämolyse darstellt, die aus dem Spektrum 22 bestimmt ist, und

^B15-l6 ^{= Konsfcante}J ^{die eine} Lichtextinktionsdifferenz je Einheit an Ikterusprodukt darstellt, die aus dem Spektrum 24 bestimmt ist.

Mittels des Gehalts an Chylus X, des Grades an Hämolyse produkt Y und des Gehalts an Ikterusprodukt-Z, die in der obigen Weise bestimmt sind, werden die mit der kolorimetrischen Methode erhaltenen Messungen S mittels der folgenden Gleichung korrigiert, um genauere Messungen S' zu erzielen:

mit ot, β und γ = Koeffizienten, die durch Messen von

Bezugs-Chylus-, -Hämolyse- und -Ikterus-Flüssigkeiten unter gleichen Meßbedingungen wie bei der Versuchsprobe bestimmt sind.

Die Konstanten T_30-31, T_18-19, T_15-16, H_18-19, H_15-16, B_15-1^-, Ot, ß und Y in den obigen Gleichungen sind für einen gegebenen Analysator und ein gegebenes Reagens konstant. Sobald sie daher einmal bestimmt sind, brauchen sie nicht für jeden Lauf festgelegt zu werden.

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Die Auswirkung der Korrektur ist in Tabelle 1 geneigt.
Der verwendete Analysator ist ein automatischer Analysator,
der 16 zu bestimmende Substanzen bei einer Geschwindigkeit
von 120 Bestimmungen/h verarbeiten kann, und ein Vielwo]lenlängen-Spektrometer aufweist, das die Extinktion bei 12 Wellenlängen von 3^0 nm bis 850 um messen kann, wie die;; in Fig. 3
gezeigt ist.

Tabelle 1

Bestim mung	Zweiwellenlängen- Messungen	Korrektur wert	X = 0,1 (Kunkel-Einheit) Y = 950 (mg/dl) (Hämoglobin) Z = 0,««5 (mn/dl) (Bilirubin)
CHE	-O₅IiJ (Δρϊί)	0,l»q (ΔρΙΙ)
ALP	1,93 (K.A.-Einheit)	12,1 (K.A.-Einheit)
LAP	137 (Takahashi-Einheit)	55 (Takahashi-Ein heit )
TG	-15 (mg/dl)	97 (mn/dl)

In Tabelle 1 wurden Cholinesterase (CHI) 'lurch pine l.olorimetrische Zweiwellenlängnn-Hethode mit 57° ~ ^(<fl" ^nvl l'^mverrn Alkaliphosphatase (ALP) bei 5^If - (.00 mn, Lf ■u'n'nauiinoiK jt i dnra (LAF) bei libü - 505 nm, Trielyceride (TG) bei 3^J<" - 37^f; rim. I·'?)

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Versuchsproben-Blutserum enthielt einen hohen Gehalt an Hämolyseprodukt, wie aus den Messungen des Gehalts an Chylus X, des Grades der Hämolyse Y und der Bilirubinmenge Z zu ersehen ist. Wie aus der Tabelle 1 folgt, werden die Messungen von der Zweiwellen]ängen-Kolorimetrie-Methode, die von der Theorie abweichende Messungen mit negativem Wert für CHE und TG aufgrund der Störung durch hohen Anteil an Hämolyseprodukt enthalten, mittels des Gehalts an Chylus X, des Hämolysegrads bzw. der Menge an Hämolyseprodukt Y und des Ikterusgrads bzw. der Bilirubinmenge Z korrigiert, die aus den Spektren für die gleiche Versuchsprobe erhalten sind, die durch eine GOT-Messung gemessen ist.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Menge an Chylus, der eines der störenden Chromogene in der Versuchsprobe ist, aus der Differenz zwischen den Lichtextinktionen bei zwei Wellenlängen im langen Wellenlängenbereich der sichtbaren Wellenlängen-Extinktionsspektren bestimmt; der Grad der Hämolyse ward aus dem Gehalt an Chylus und der Differenz der Lichtextinktionen bei zwei Wellenlängen im mittleren Wellenlängenbereich ermittelt, und der Ikterusgrad wird aus dem Gehalt an Chylus, dem Grad der Hämolyse und der Differenz zwischen den Lichtextinktionen bei zwei Wellenlängen im kurzen Wellenlängenbereich ermittelt. Entsprechend können die Mengen oder Anteile der jeweiligen störenden Chromogene getrennt und genau festgelegt werden.

Während das Spektrum für die GOT-Meßflüssigkeit beim obigen Ausführungsbeispiel verwendet wird, um die Mengen an störenden Chromogenen zu bestimmen, können Spektren für Ultraviolett-Meßflüssigkeiten wie z. B. GPT, LDH oder HBDH vorgesehen sein, um die Mengen der störenden Chromogene festzulegen.

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Während weiterhin das obige Ausführungsbeispiel die Anwendung der Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode auf die Erfindung zeigt, ist diese auch bei einer Einwellenlängen-Kolorimetrie-Methode vorteilhaft einsetzbar', die die Extinktion bei einer einzigen geeigneten Wellenlänge verwendet.

Der Aufbau eines automatischen klinischen Analysators nach der Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. Ί näher erläutert.

In Fig. 4 hat ein Probenehmer 71 einen Probenträger, _aUf dem eine Reihe von Probenbechern 72 angebracht ist. Die Reihe der Probenbecher wird durch einen Durchgang transportiert, der auf dem Träger vorgesehen ist. Im Verlauf des Durchganges ist eine Probensaugstation vorgesehen. Eine Kette, die an die Probenbecher angepaßt ist, wird um eine Entfernung entsprechend dem Abstand der Probenbecher fortbewegt. Daher laufen die Probenbecher nacheinander durch die Probensaugstation. .

Eine Probe 73 in jedem der auf dem Probenehmer 71 angeordneten Probenbecher wird bei der Probensaugstation in ein Probensaugrohr 75 gesaugt, das an einem Probenblock 7** befestigt ist, und wird an der Spitze des Probensaugrohres 75 gehalten. Der Probenblock Jh ist horizontal beweglich. Zwei derartige Probenblöcke sind vorgesehen, deren jeder sechs Probensaugrohre 75 aufweist.

Jedes der Probensaugrohre 75 entspricht einer anderen zu untersuchenden Substanz. Wenn z. B. drei Substanzbestimmungen für eine bestimmte Probe benötigt werden, werden drei Probensaugrohre, und zwar jeweils eines, nacheinander in den

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Probenbecher eingeführt, der diese Probe enthält. Jedes Probensaugrohr 75 ist mit einer Mikropipette (Mikrocylinze) 82 einer Pipette 76 verbunden, die die Mikropipette 82, eine Pipette (Cylinze) 83, ein Ventil 84, ein Ventil 85 und eine Reagenzflasche 77 aufweist. Um die Probe im Probenbecher 72 in das Probensaugrohr 75 zu saugen, wird ein Kolben oder Schieber der Mikropipette 82 abgesenkt. In diesem Zeitpunkt wird das Ventil 84 geschlossen gehalten, und das Ventil 85 wird offen gehalten. Gleichzeitig wird ein Kolben oder Schieber der Pipette 83 abgesenkt, so daß das Reagens in der Reagenzflasche 77 in den Hahn 83 gesaugt wird. Die Art des Reagens ändert sich abhängig von der zu bestimmenden Substanz.

Nachdem die Probe in den Probensaugrohren gehalten wurde, die in der Anzahl der Anzahl der für diese Probe zu untersuchenden Substart?^ee\itsprechen, wird der Probenblock 74 auf eine Reaktionsstrecke ■ 100 gefahren. Leere Reaktionsbehälter 78 werden nacheinander zu einer Entleerstation auf der Reaktionsstrecke transportiert. Die Probe in einem Probensaugrohr 75 wird in einen Reaktionsbehälter abgegeben, worauf das Reagens vom gleichen Saugrohr in den Reaktionsbehälter gegeben wird.Anschließend wird der Reaktionsbehälter weggeführt, und der nächste leere Reaktionsbehälter 78 kommt zur Entleerstation. Die Probe im zweiten Probensaugrohr und das Reagens für die gewünschte Analyse werden in den zweiten Reaktionsbehälter gegeben. Nachdem die Probe in allen Probensaugrohren für die gewünschten Analysen abgelassen wurde, werden die Saugrohre 75 in einem Reinigungsbad 22 gereinigt.

Wenn die Probe in den Reaktionsbehälter 78 gegeben wird, ist das Ventil 85 der Pipette 76 geschlossen, während das Ventil 84 geöffnet ist. Der Kolben oder Schieber der Mikropipette 82 und der Kolben oder Schieber der Pipette 83 fahren hoch, um die Flüssigkeiten in den jeweiligen Pipetten zum Saugrohr 75 zu

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treiben. Als Ergebnis wird die am Ende des Saugrohres 75 gehaltene Probe abgegeben, worauf dann das Reagens zudosiert wird.

Nachdem die Probensaugrohre 75 gereinigt wurden, wird der Block 7U zur Probensaugstation des Probenehmers 71 gefahren. Der Probenbecher, der die nächste Probe enthält, ist an der Probensaugstation angekommen. Der gleiche Vorgang wiederholt sich anschließend.

In der Reaktionsstrecke 100 wird eine Endloskette 10 intermittierend bewegt. Eine Anzahl von Reaktionsbehältern 78 ist vertikal gleitend an der Endloskette 10 angebracht. Die Reaktionsbehälter 78, die eine Probe enthalten, werden transportiert, während sie in ein Wasserbad 11 konstanter Temperatur eingetaucht werden. Die Reaktionsbehälter 78 werden intermittierend in das Wasserbad 11 konstanter Temperatur durch die Endloskette "20 gefahren, die durch Transportrollen oder Kettenzahnräder 79 angetrieben ist. Das für die Reaktion notwendige Reagens wird den Reaktionsbehältern durch einen Dosierer 12 an geeigneter Stelle auf der Reaktionsstrecke zugesetzt. Wenn die Probe, die im Reaktionsbehälter 78 reagiert hat, eine Meßstation 13 erreicht, wird die Lichtextinktion der reagierten Probe in einem weiter unten beschriebenen Verfahren gemessen. Die reagierte Probe wird nach der Messung aus dem Wasserbad 11 konstanter Temperatur gefahren, und der Reaktionsbehälter wird am Ende der Reaktionsstrecke 100 umgekippt, um den Inhalt zu entleeren. Die entleerte Probe fällt in einen ■Auslaßprobentank I¹I und wird dann in einen geeigneten (nicht dargestellten) Speichertank geführt. Der Reaktionsbehälter wird dann weiter auf einer Führung 15 gefahren und einer Spülung mit warmem Wasser aus einer Düse 16 und destilliertem Wasser aus einer Düse 17 sowie einer Heißluft-Trocknung aus einer Düse 18 ausgesetzt und anschließend wiederum in die normale Stellung umgekippt sowie für erneuten Gebrauch zur Probenent-

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nahmestation gefahren. Die abgegebene SpUlflüssigkeit tropft auf die Führung 15 und wird in einem Spülflüssigkeit_sabfalltank 19 gesammelt und von dort über ein (nicht dargestelltes) Auslaßrohr abgegeben. Das Wasser im Wasserbad 11 konstanter Temperatur wird durch ein Bad 20 konstanter Temperatur umgewälzt.

Fig. 5 zeigt die Lichtmeßeinheit in Fig. ¹J. Eine Reihe von Proben la bis Id, 2a bis 2d, Ja ..., die in den Reaktionsbehältern 78 enthalten sind, sind auf der Reaktionsstrecke 100 vorgesehen. Beim dargestellten Ausführungsbeispiel wird die Reihe der Reaktionsbehälter 78 intermittierend bewegtj die reagierte Probe la kommt an einer Stelle an, durch die ein Lichtstrahl 25 von einer Lichtquelle 24 verläuft und hält dort kurzzeitig an. In diesem Zeitpunkt wird der Lichtstrahl 25 einer Lichtextinktion durch die reagierte Probe la ausgesetzt. Der Lichtstrahl 25 wird auf ein konkaves Beugungsgitter 26 eines Vielwellenlängen-Photometers 23 gerichtet, wo er spektral zerlegt wird, und die Lichtstrahlen der jeweiligen Wellenlängen werden auf einem Rowland-Kreis 27 gesammelt. Mehrere Fühler 28 für wenigstens die in Fig. 2 und 3 gezeigten Wellenlängen sind auf dem Rowland-Kreis 27 vorgesehen. Die Ausgangssignale von den Fühlern 28 werden zu zwei Wellenlängenwählern 29a und 29b geleitet, um die Wellenlänge zu messen. Diese wählen die Signale von dem Fühler, der die Wellenlänge entsprechend der zu bestimmenden Substanz a erfaßte, und leiten diese Signale zu logarithmischen Umsetzverstärkern 30a und 30b. Ein Differenzverstärker 31 erzeugt die Differenz zwischen den Ausgangssignalen der beiden logarithmischen Umsetzverstärker 30a und 30b und gibt diese an einen Analog/Digital-Umsetzer 32 ab, dessen Ausgangssignal in eine Zentralsteuereinheit 87 eingespeist wird, wo es arithmetisch verarbeitet wird.

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Nach Abschluß der Messung für die Probe la wird der Reaktionsbehälter 78 für die nächste Probe Ib zur Lichtstrahl-Stelle gefahren, wo die Probe Ib auf gleiche Weise gemessen wird. Die beiden Meßwellenlängen werden entsprechend der zu bestimmenden Substanz b durch die Wellenlängenwähler 29a und 29b gewählt.

Bei der Messung der Probe wählen die Wellenlängenwähler 29a und 29b, nachdem sie zwei Wellenlängen gewählt haben, um eine Information über die zu bestimmende Substanz zu erhalten, weiterhin sequentiell zwei Wellenlängen im langen Wellenlängenbereieh, im mittleren Wellenlängenbereich und im kurzen Wellenlängenbereieh des sichtbaren Wellenlängenbandes. Die Information über die Lichtextinktion für diese beiden Wellenlängen liegt auch an der Zentralsteuereinheit 87, um die notwendige Rechenoperation auszuführen. Das Ergebnis der Rechenoperation wird durch einen (nicht dargestellten) Drucker ausgedruckt, d. h. die Extinktionen und damit Konzentrationen der zu bestimmenden Substanzen, die bezüglich des Einflusses durch Chylus, Hämolyse- und Ikterusprodukt kompensiert wurden, werden ausgedruckt. Die Grade an Chylustrübung, Hämolyse und Ikterus bzw. die entsprechenden Substanzkonzentrationen werden auch zusammen mit den Meßergebnissen ausgedruckt.

Im folgenden wird ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel erfolgt die kolorimetrische Analyse für eine Probe durch die Einwellenlängen-Kolorimetrie-Methode und durch die Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode,· wenn das Verhältnis der sich ergebenden Meßwerte durch beide Methoden innerhalb eines vorbestimmten Bereiches nahe bei 1 ist, werden die Messungen als Endwerte verwendet; wenn, das Verhältnis nicht innerhalb des vorbestimmten Bereiches liegt, werden die Messungen durch beide Methoden entsprechend der Menge an störenden Kom-

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ponenten in der Probe korrigiert. Wenn das Verhältnis der korrigierten Messungen innerhalb eines vorbestimmten Bereiches nahe bei 1 liegt, werden die korrigierten Messungen als Endwerte verwendet, und wenn das Verhältnis nicht innerhalb des vorbestimmten Bereiches liegt, werden die durch die Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode korrigierten Messungen als Endwerte verwendet, oder es wird eine Anforderung für einen erneuten Versuch oder ein Warnsignal abgegeben.

Die Erfindung nützt die Tatsache aus, daß die Messungen durch die Einwellenlängen-Methode und die Zweiwellenlängen-Methode lediglich für eine ideale Versuchsprobe genau sind, die frei von störendem Material, Luftblasen und Feststoffen ist, wobei die Messungen durch beide Methoden gleich sind, während die Messungen durch beide Methoden nicht gleich sind, wenn die■Versuchsprobe störendes Material, Luftblasen oder Feststoffe enthält.

Das vorliegende Ausführungsbexspiel wird in Einzelheiten näher erläutert, wobei sechs Substanzen A-F gleichzeitig untersucht werden. Die kolorimetrisch^ Analyse wird ausgeführt, indem die Probe in gleicher Weise wie beim herkömmlichen automatischen Mehrfach-Analysator umgesetzt und durch die Einwellenlängen-Methode und die Zweiwellenlängen-Methode vermessen wird, wonach das Verhältnis der Meßwerte beider Methoden bestimmt wird. Wenn die Messungen für die Substanzen A'- F durch die Einwellenlängen-Kolorimetrie-Methode durch a₁ - f. und die Messungen durch die Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode durch a„ - f₂ gegeben sind, sind die Verhältnisse K. - K„ hiervon durch die folgenden Gleichungen bestimmt:

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K =	^KF =	Jl
^A	^a2
• % =	^bl
^Kc *	^b2
\ ^KD =	^cl
-	^C2
	Jl
Jl
^e2

(5) (6) (7) (8)

(9) (10).

Wenn die entsprechend den obigen Gleichungen bestimmten Verhältnisse K. - K« innerhalb eines vorbestimmten Bereiches nahe bei 1 liegen, z. B. zwischen 0,95 und 1,05, wird als Endwert die Messung durch eine der Methoden oder der Mittelwert von beiden Messungen verwendet. Bei der obigen Analyse werden der Gehalt an Chylus X, der Grad der Hämolyse bzw. der Hämoglobingehalt Y und der Ikterusgrad bzw. der Bilirubingehalt Z, die die Störungen in der Blutserum-Versuchsprobe darstellen, aus einem Spektrum der am einfachsten spektralanalytisch zu untersuchenden Substanz ermittelt.'

Wenn eines der Verhältnisse K. - K_p nicht innerhalb des vorbestimmten Bereiches liegt, werden die entsprechenden Messungen mittels der Werte von Chylus. X, des Grades der Hämolyee Y und des Ikterusgrads Z korrigiert.

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Wenn ζ. B. das Verhältnis K_n nicht innerhalb des vorbestimmten Bereiches liegt, werden die korrigierten Messungen C₁' und C₂' entsprechend den folgenden Gleichungen (11) und (12) ermittelt:

C₁- otX-ßY-

(11)

C₂ - OC ' X - β' Y - Jf ' Z

(12)

mit OL, κ.', β, β¹,

und ^' = durch die verwendeten

Reagenzien und den verwendeten Analysator vorbestimmte Konstanten.

Dann wird das Verhältnis gen C₁' und C₂' bestimmt aus:

der korrigierten Messun

C '

—i-

pt

^C2

(13).

Wenn das Verhältnis K_c' innerhalb eines vorbestimmten Bereiches nahe bei 1 liegt, z. B. zwischen 0,95 und 1,05, werden die Messungen C₁ ¹ und C₂' oder der Mittelwert von diesen als Endwerte für den Versuchsposten C für die Blutserum-Versuchsprobe verwendet.

Wenn das Verhältnis K_c' der durch die Gleichung (13) bestimmten korrigierten Messungen nicht innerhalb des vorbestimmten Bereiches nach der Korrektur durch die Gleichungen (11) und (12) liegt, besteht die Möglichkeit, daß Luftblasen oder Feststoffe, wie z. B. Staub, in der Versuchsprobe vor-

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handen sind. Daher werden die Messungen a₂ - f"₂ durch die Zweiwellenlängen-Kolorimetrie-Methode, die als relativ zuverlässig angesehen werden, versuchsweise als Endwerte verwendet, aber gleichzeitig wird ein Wiederholungsversuch angefordert.

Auf diese Weise wird durch Messen des Grades an Chylustrübung, des Grades der Hämolyse und des Ikterusgrads für jede Versuchsprobe und durch Verarbeiten der Messungen mit diesen Daten die Genauigkeit der kolorimetrischen Methode wesentlich verbessert. Da außerdem Luftblasen und Feststoffe, wie z. B. Staub, unterscheidbar sind, ist die Zuverlässigkeit der Messungen sehr hoch.

Beim obigen Ausführungsbeispiel wurde für das Verhältnis der Meßwerte der Bereich von 0,95 bis 1,05 festgelegt; es können erfindungsgemäß jedoch auch beliebige andere Bereiche gewählt werden.

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Claims

Ansprüche

1. J Kolorimetrie-Verfahren, bei dem ein Lichtstrahl auf eine flüssige Probe mit Gehalt an störenden Chromogenen eingestrahlt wird,

gekennzeichnet durch

Messen der durch die flüssige Probe verursachten Extinktionen im Bereich langer Wellenlängen, im Bereich mittlerer Wellenlängen und im Bereich kurzer Wellenlängen im sichtbaren Spektralbereich und

Bestimmen des Grades an Chylustrübung aus den Messungen für den Bereich langer Wellenlängen, Bestimmen des Grades der Hämolyse aus den Messungen für den Bereich mittlerer Wellenlängen und Bestimmen des Ikterusgrads aus den Messungen für den Bereich kurzer Wellenlängen.

Kolorimetrie-Verfahren, bei dem ein Lichtstrahl auf eine flüssige Probe mit Gehalt an störenden Chromogenen eingestrahlt wird,

gekennzeichnet durch

Messen der Differenz zwischen den Lichtextinktionen bei zwei Wellenlängen jeweils im Bereich langer Wellenlängen, im Bereich mittlerer Wellenlängen und im Bereich kurzer Wellenlängen im sichtbaren Spektralbereich und

Bestimmen des Grades an Chylustrübung aus der Lichtextinktionsdifferenz im Bereich langer Wellenlängen, Bestimmen des Grades der Hämolyse aus der Lichtextinktionsdifferenz im Bereich mittlerer Wellenlängen und aus dem Grad

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an Chylustrübung und der Bestimmung des Ikterusgrads aus der Lichtextinktionsdifferenz für den Bereich kurzer Wellenlängen, aus dem Grad an Chylustrübung sowie dem Grad der Hämolyse.

Kolorimetrie-Verfahren, bei dem ein Lichtstrahl auf eine flüssige Probe mit Gehalt an störenden Chromogenen und zu bestimmenden Substanzen eingestrahlt wird,

gekennzeichnet durch

Messen der Lichtextinktionen bei Wellenlängen, bei denen die zu bestimmenden Substanzen Absorptionen aufweisen, unter Erhalt unkorrigierter Messungen,

Bestimmen des Grades an Chylustrübung aus der Lichtextinktion der flüssigen Probe bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum, bei der eine kleine Lichtextinktion aufgrund Hämolyse und'Ikterus auftritt,

Bestimmen des Grades der Hämolyse aus der Lichtextinktion der flüssigen Probe bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum, bei der eine kleine Lichtextinktion aufgrund Ikterus auftritt bzw. große Lichtextinktionen aufgrund Chylus und Hämolyse auftreten,

Bestimmen des Ikterusgrads aus der Lichtextinktion der flüssigen Probe bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum, bei der große Lichtextinktionen aufgrund Chylus, Hämolyse bzw. Ikterus auftreten, uni

Korrigieren der unkorrigierten Messungen durch den Grad an Chylustrübung, den Grad der Hämolyse und den Ikterusgrad.

Kolorimetrie-Verfahren, bei dem ein Lichtstrahl auf eine flüssige Probe mit Gehalt an störenden Chromogenen

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und zu bestimmenden Substanzen eingestrahlt wird, gekennzeichnet durch

Messung der Lichtabsorption eines Lichtstrahls einer Wellenlänge beim Durchgang durch die flüssige Probe unter Erhalt erster Meßwerte der Lichtextinktion und damit der Mengen der zu bestimmenden Substanzen ,

Messung der Lichtabsorption eines Lichtstrahls bei zwei Wellenlängen beim Durchgang durch die flüssige Probe unter Erhalt zweiter Meßwerte der Differenz der auf die Mengen der zu bestimmenden Substanzen bezogenen Lichtextinktionsdifferenz und

Vergleichen der ersten Meßwerte mit den zweiten Meßwerten und einerseits Korrigieren der ersten und zweiten Meßwerte, wenn das Vergleichsergebnis nicht innerhalb eines vorgegebenen zulässigen Bereiches liegt, sowie andererseits Weiterleitung der ersten oder zweiten Meßwerte oder deren Mittelwerte, wenn das Vergleichsergebnis innerhalb des zulässigen Bereiches liegt,

wobei die Korrektur der ersten und der zweiten Meßwerte durch den Grad der Chylustrübung,, den Grad der Hämolyse und den Ikterusgrad erfolgt und

der Grad an Chylustrübung aus der Lichtexlinktion im Bereich langer Wellenlängen im sichtbarem .'5pekt rum,

der Grad der Hämolyse aus der Lichtextinktion im Bereich mittlerer Wellenlängen im sichtbaren Spektrum und

der Ikterusgrad aus der Lichtextinktion im Bereich kurzer Wellenlängen im sichtbaren Spektrum bestimmt werden.

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