JPH0921808A - 過剰の抗原によって影響されない比濁分析および濁度分析によるタンパク質の定量 - Google Patents
過剰の抗原によって影響されない比濁分析および濁度分析によるタンパク質の定量Info
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- JPH0921808A JPH0921808A JP8174443A JP17444396A JPH0921808A JP H0921808 A JPH0921808 A JP H0921808A JP 8174443 A JP8174443 A JP 8174443A JP 17444396 A JP17444396 A JP 17444396A JP H0921808 A JPH0921808 A JP H0921808A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生物学的材料のサンプル中の被検物質を被検
物質特異的結合パートナーとの被検物質誘発沈降によっ
て定量する免疫化学的方法において、試験経費の増大を
伴うことなく、単位時間内に多くのサンプルを処理でき
て、過剰の抗原によって影響されない試験スキームを可
能にする測定方法の提供。 【解決手段】 以下の工程、 (ａ) 粒子とも結合できる少なくとも１種の被検物質特
異的結合パートナーとのサンプルのインキュベーショ
ン、 (ｂ) 被検物質依存性沈降反応の測定、 (ｃ) サンプルを次の２工程 ｉ） 第一の反応におけるサンプルのアリコート、好ま
しくは1/5〜1/100の試剤とのインキュベーションおよび
被検物質依存性沈降反応の測定、 ii） 第二の反応における工程ｉ）からの反応混合物と
残部のサンプルのインキュベーションおよび被検物質依
存性沈降反応の測定 において添加して、測定結果を分析することによる被検
物質の濃度の測定を包含する分析方法。
物質特異的結合パートナーとの被検物質誘発沈降によっ
て定量する免疫化学的方法において、試験経費の増大を
伴うことなく、単位時間内に多くのサンプルを処理でき
て、過剰の抗原によって影響されない試験スキームを可
能にする測定方法の提供。 【解決手段】 以下の工程、 (ａ) 粒子とも結合できる少なくとも１種の被検物質特
異的結合パートナーとのサンプルのインキュベーショ
ン、 (ｂ) 被検物質依存性沈降反応の測定、 (ｃ) サンプルを次の２工程 ｉ） 第一の反応におけるサンプルのアリコート、好ま
しくは1/5〜1/100の試剤とのインキュベーションおよび
被検物質依存性沈降反応の測定、 ii） 第二の反応における工程ｉ）からの反応混合物と
残部のサンプルのインキュベーションおよび被検物質依
存性沈降反応の測定 において添加して、測定結果を分析することによる被検
物質の濃度の測定を包含する分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は均一溶液中のタンパ
ク質の定量の分野に属し、抗体または抗体でコーティン
グされたラテックス材料の使用による抗原を介した沈降
およびその沈降反応の続いての比濁分析または濁度分析
による光学的測定によってタンパク質を定量する方法に
関する。
ク質の定量の分野に属し、抗体または抗体でコーティン
グされたラテックス材料の使用による抗原を介した沈降
およびその沈降反応の続いての比濁分析または濁度分析
による光学的測定によってタンパク質を定量する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫沈降に関するHeidelbergerとKendal
lのよく知られた反応プロットから明らかなように、こ
のような反応は両義性を示す場合がある。すなわち、抗
原濃度が高い場合には最高点を越えるとシグナルの低下
が起こり、この場合の値は１回の測定では、抗原濃度が
低い場合のシグナルの測定値と識別することができな
い。
lのよく知られた反応プロットから明らかなように、こ
のような反応は両義性を示す場合がある。すなわち、抗
原濃度が高い場合には最高点を越えるとシグナルの低下
が起こり、この場合の値は１回の測定では、抗原濃度が
低い場合のシグナルの測定値と識別することができな
い。
【０００３】過剰に抗原が存在する場合のこの測定上の
問題が、既知の比濁分析または濁度分析測定法の決定的
な限界となることから、これまで既に多くの解決方法が
提案されてきた。すなわち、反応速度（一次係数）の分
析によって過剰の抗原の存在を確立し、ついで適当な再
測定を設定する（Anderson, US 4,157,871）かまたは適
当な技術工程によりプロットの一義的な分析を可能にす
る（DE-A-33 47 162）速度論的方法がある。
問題が、既知の比濁分析または濁度分析測定法の決定的
な限界となることから、これまで既に多くの解決方法が
提案されてきた。すなわち、反応速度（一次係数）の分
析によって過剰の抗原の存在を確立し、ついで適当な再
測定を設定する（Anderson, US 4,157,871）かまたは適
当な技術工程によりプロットの一義的な分析を可能にす
る（DE-A-33 47 162）速度論的方法がある。
【０００４】さらに、被検物質の標準プレパレーション
の特定量をついで添加し、以後の反応経過を記録するい
わゆる「再開始法」での問題の解決も試みられてきた。
の特定量をついで添加し、以後の反応経過を記録するい
わゆる「再開始法」での問題の解決も試みられてきた。
【０００５】速度論的法の原理における欠点は、全イン
キュベーション時間を通じて測定値の記録が必要になる
という事実である。これは、この相当する期間を通して
光学的測定系を独占し、単位時間内に処理できるサンプ
ル数は少数のみになってしまう。この分析はまた、した
がって、記憶集約的である。再開始法にはこの欠点はな
いが、適当な明確に特定された標準を必要とするため
に、試験経費の増大を伴うことになる。
キュベーション時間を通じて測定値の記録が必要になる
という事実である。これは、この相当する期間を通して
光学的測定系を独占し、単位時間内に処理できるサンプ
ル数は少数のみになってしまう。この分析はまた、した
がって、記憶集約的である。再開始法にはこの欠点はな
いが、適当な明確に特定された標準を必要とするため
に、試験経費の増大を伴うことになる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、試験経費の増大を伴うことなく、単位時間内に多
くのサンプルを処理できて、過剰の抗原によって影響さ
れない試験スキームを可能にする測定方法を提供するこ
とにある。
的は、試験経費の増大を伴うことなく、単位時間内に多
くのサンプルを処理できて、過剰の抗原によって影響さ
れない試験スキームを可能にする測定方法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は、本質的に、
請求の範囲の項に記載の実施態様の提供によって達成さ
れる。
請求の範囲の項に記載の実施態様の提供によって達成さ
れる。
【０００８】本発明は、極端に高い抗原濃度を有し、し
たがって低すぎるシグナルを産生するサンプルでも、試
験に付す以前に希釈することによって、常に正しい結果
が得られるという観察に基づくものである。論理的に
は、一般に、臨界的なサンプルまたは臨界的な試験結果
を与えるサンプルは、自動装置により異なる希釈サンプ
ルについて数回検討し、ついでその結果の有効性をマニ
ュアルによりチェックすればよい。しかしながら、これ
では、それに応じて単位時間内に処理できるサンプル数
は減少し、試験サンプルあたりの試験経費は増大する。
たがって低すぎるシグナルを産生するサンプルでも、試
験に付す以前に希釈することによって、常に正しい結果
が得られるという観察に基づくものである。論理的に
は、一般に、臨界的なサンプルまたは臨界的な試験結果
を与えるサンプルは、自動装置により異なる希釈サンプ
ルについて数回検討し、ついでその結果の有効性をマニ
ュアルによりチェックすればよい。しかしながら、これ
では、それに応じて単位時間内に処理できるサンプル数
は減少し、試験サンプルあたりの試験経費は増大する。
【０００９】本出願の基盤となる目的は、最初に、サン
プル（または試験系に添加する前に希釈されたサンプ
ル）量のアリコートを、全試剤を含有する試験系中でイ
ンキュベーションに付し、ある反応時間後に測定値（ま
たは、一定時間後の測定における初期値との測定値差）
を記録することによって達成できることが見出されたの
である。その後にはじめて、サンプル（またはサンプル
希釈液）の残部を同じ反応混合物に添加し、ついでこれ
をさらにインキュベーション工程に付し、同様に測定を
行う。アリコートは、サンプルの総量の１〜２５％、好
ましくは２〜２０％、とくに好ましくは５〜１０％の割
合とすることができる。
プル（または試験系に添加する前に希釈されたサンプ
ル）量のアリコートを、全試剤を含有する試験系中でイ
ンキュベーションに付し、ある反応時間後に測定値（ま
たは、一定時間後の測定における初期値との測定値差）
を記録することによって達成できることが見出されたの
である。その後にはじめて、サンプル（またはサンプル
希釈液）の残部を同じ反応混合物に添加し、ついでこれ
をさらにインキュベーション工程に付し、同様に測定を
行う。アリコートは、サンプルの総量の１〜２５％、好
ましくは２〜２０％、とくに好ましくは５〜１０％の割
合とすることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】慣用の試験法で抗原過剰効果を生
じるような高い抗原濃度を有するサンプルの場合には、
予備反応において言及した調整混合物により、サンプル
量が明らかに少ないため、明瞭な測定シグナルが生成す
ることになり、分析装置によって閾値検査に基づき、迅
速で、簡単なかつ信頼性のある検出が可能である。慣用
の試験法により、Heidelberger & Kendallのプロットの
上行枝上で問題なく正確に分析できるサンプルの場合
は、予備反応において弱い測定シグナルしか与えないか
または全くシグナルを示さず、すなわち、この場合は測
定値が閾値以下であることにより分析装置が正常なケー
スであることを認知することになる。
じるような高い抗原濃度を有するサンプルの場合には、
予備反応において言及した調整混合物により、サンプル
量が明らかに少ないため、明瞭な測定シグナルが生成す
ることになり、分析装置によって閾値検査に基づき、迅
速で、簡単なかつ信頼性のある検出が可能である。慣用
の試験法により、Heidelberger & Kendallのプロットの
上行枝上で問題なく正確に分析できるサンプルの場合
は、予備反応において弱い測定シグナルしか与えないか
または全くシグナルを示さず、すなわち、この場合は測
定値が閾値以下であることにより分析装置が正常なケー
スであることを認知することになる。
【００１１】他の有利な実施態様においては、極端なサ
ンプルの場合でも試験に対する２つ（予備反応と主反応
用）の検量プロットを作成することによって再測定を行
わないで分析装置により定量分析を実施することができ
る。一般的にそれ程頻繁には起こらないこのようなサン
プルでは、利用可能な測定シグナルの定量は行われな
い。これに対して、再測定は、主反応が定量可能になる
まで実施される。一方、予備反応における閾値の純粋な
検査は、測定シグナルの定量が必要な主反応の場合に比
較して、一般に、インキュベーション時間は明らかに短
くて済み、したがって、分析装置による単位時間内に処
理可能な試験数はわずかに低下するにすぎない（たとえ
ば、半分にはならない）。
ンプルの場合でも試験に対する２つ（予備反応と主反応
用）の検量プロットを作成することによって再測定を行
わないで分析装置により定量分析を実施することができ
る。一般的にそれ程頻繁には起こらないこのようなサン
プルでは、利用可能な測定シグナルの定量は行われな
い。これに対して、再測定は、主反応が定量可能になる
まで実施される。一方、予備反応における閾値の純粋な
検査は、測定シグナルの定量が必要な主反応の場合に比
較して、一般に、インキュベーション時間は明らかに短
くて済み、したがって、分析装置による単位時間内に処
理可能な試験数はわずかに低下するにすぎない（たとえ
ば、半分にはならない）。
【００１２】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。 実施例１： 尿中アルブミンの測定 予めＮ希釈液（注文番号：ＯＵＭＴ、Behringwerke A
G）で１：５に希釈した尿サンプル５μＬを、Ｎ反応緩
衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）５５μ
Ｌとともに反応キューベットに加える。反応は、４０μ
Ｌの試剤（ヒトアルブミンに対するＮ抗血清、注文番
号：ＯＳＡＬ、Behringwerke AG）を同様に反応緩衝液
（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）１００μＬ
とともにキューベットに加えて開始させる。混合物を完
全に混合し、初期シグナルを記録する。正確に２分後に
もう一度測定を行い、初期シグナルとの差を予備反応か
らのシグナルとする。さらに４分後、最後の測定を実施
し、この場合の初期シグナルとの差を主反応からのシグ
ナルとする。
る。 実施例１： 尿中アルブミンの測定 予めＮ希釈液（注文番号：ＯＵＭＴ、Behringwerke A
G）で１：５に希釈した尿サンプル５μＬを、Ｎ反応緩
衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）５５μ
Ｌとともに反応キューベットに加える。反応は、４０μ
Ｌの試剤（ヒトアルブミンに対するＮ抗血清、注文番
号：ＯＳＡＬ、Behringwerke AG）を同様に反応緩衝液
（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）１００μＬ
とともにキューベットに加えて開始させる。混合物を完
全に混合し、初期シグナルを記録する。正確に２分後に
もう一度測定を行い、初期シグナルとの差を予備反応か
らのシグナルとする。さらに４分後、最後の測定を実施
し、この場合の初期シグナルとの差を主反応からのシグ
ナルとする。
【００１３】以下のシグナルが、Behring比濁計II（Beh
ringwerke AG, Marburg, Germany,注文番号：Ｏ ＶＩ
Ａ）により検量プロットで得られる（この場合の散乱光
シグナルの測定の単位はビットである）。
ringwerke AG, Marburg, Germany,注文番号：Ｏ ＶＩ
Ａ）により検量プロットで得られる（この場合の散乱光
シグナルの測定の単位はビットである）。
【００１４】
【表１】
【００１５】サンプル１および２は、それぞれ試験混合
物の測定範囲以下および測定範囲内のサンプルの典型的
な挙動を示している。サンプル３は、予備反応において
明らかに異なる反応を示し、検量プロット上の最高点の
値を越えるシグナルを生じている。このようにして、た
とえば、さらに高いサンプル希釈度での結果の定量のた
めに別の測定を実行するフラッグを発生させることがで
きる。予備反応のない従来の混合物では、測定範囲に対
して極端に高い被検物質濃度を有するサンプル３は、サ
ンプル２にまたサンプル１にでも匹敵するシグナルを発
生する。したがって、従来の測定では、低すぎる誤った
結果が示されることになる。
物の測定範囲以下および測定範囲内のサンプルの典型的
な挙動を示している。サンプル３は、予備反応において
明らかに異なる反応を示し、検量プロット上の最高点の
値を越えるシグナルを生じている。このようにして、た
とえば、さらに高いサンプル希釈度での結果の定量のた
めに別の測定を実行するフラッグを発生させることがで
きる。予備反応のない従来の混合物では、測定範囲に対
して極端に高い被検物質濃度を有するサンプル３は、サ
ンプル２にまたサンプル１にでも匹敵するシグナルを発
生する。したがって、従来の測定では、低すぎる誤った
結果が示されることになる。
【００１６】実施例２： 血清中ＩｇＭの測定 予め１：２０に希釈した（Ｎ希釈液中）血清サンプル５
０μＬを、試剤としてヒトＩｇＭに対するＮ抗血清（注
文番号：ＯＳＡＴ、Behringwerke AG）４０μＬを用い
て実施例１の測定と同様に操作する。
０μＬを、試剤としてヒトＩｇＭに対するＮ抗血清（注
文番号：ＯＳＡＴ、Behringwerke AG）４０μＬを用い
て実施例１の測定と同様に操作する。
【００１７】
【表２】
【００１８】この場合の結果も実施例１の場合と同様で
ある。極端に被検物質濃度の高い問題のサンプルの定量
は、予備反応からの値が検量プロットに相当する値内ま
たは以下で、主反応におけるサンプルの測定値が検量プ
ロットにおいて予め測定された値内に位置するようにな
るまで、サンプルを逐次希釈して定量することが可能で
ある。ＩｇＭ骨髄腫サンプル２および３ではいずれも主
反応において測定値の範囲を上回っていることにより正
しく同定が行われているが、ＩｇＭ骨髄腫サンプル４の
場合は異なっている。この場合は、予備反応で閾値を越
える結果として、自動的再測定による定量が行われてい
る。
ある。極端に被検物質濃度の高い問題のサンプルの定量
は、予備反応からの値が検量プロットに相当する値内ま
たは以下で、主反応におけるサンプルの測定値が検量プ
ロットにおいて予め測定された値内に位置するようにな
るまで、サンプルを逐次希釈して定量することが可能で
ある。ＩｇＭ骨髄腫サンプル２および３ではいずれも主
反応において測定値の範囲を上回っていることにより正
しく同定が行われているが、ＩｇＭ骨髄腫サンプル４の
場合は異なっている。この場合は、予備反応で閾値を越
える結果として、自動的再測定による定量が行われてい
る。
Claims (15)
- 【請求項１】 生物学的材料のサンプル中の被検物質を
被検物質特異的結合パートナーとの被検物質誘発沈降反
応によって定量する免疫化学的方法において、以下の工
程、 (ａ) サンプルの、粒子とも結合できる少なくとも１種
の被検物質特異的結合パートナーを含む試剤とのインキ
ュベーション； (ｂ) 被検物質依存性沈降反応の測定： (ｃ) サンプルを次の２工程 ｉ) 第一の反応におけるサンプルのアリコート、好ま
しくは1/5〜1/100の試剤とのインキュベーションおよび
被検物質依存性沈降反応の測定、 ii) 第二の反応における工程ｉ）からの反応混合物と
残部のサンプルのインキュベーションおよび被検物質依
存性沈降反応の測定 において添加して、測定結果を分析することによる被検
物質の濃度の測定を包含する方法。 - 【請求項２】 被検物質特異的結合パートナーが抗体で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 被検物質依存性沈降反応の測定が濁度分
析測定によって行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 被検物質依存性沈降反応の測定が比濁分
析測定によって行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 被検物質依存性沈降反応の測定が速度論
的測定によって行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 被検物質依存性沈降反応の測定が固定時
間速度論的測定によって行われる請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 被検物質依存性沈降反応の測定が固定値
測定によって行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 被検物質依存性沈降反応の測定が終点測
定によって行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 被検物質濃度は、第一の反応からの測定
シグナルが所定の閾値より低い場合には、第二の反応か
らの測定シグナルにより計算される請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１０】 被検物質濃度は、元の混合物中におけ
る第一の反応からの測定シグナルが所定の閾値より高い
場合には、サンプル含量を減少させて新たに行われる分
析の第二の反応からの測定シグナルより計算される請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 被検物質濃度は第一の反応からの測定
シグナルが閾値より高い場合には、第一の反応からの測
定シグナルより計算される請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 サンプルを希釈せずに用いる請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１３】 サンプルを予備的希釈に付す請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１４】 分析は測定結果を検量プロットと比較
することによって行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 分析は、第一の反応の条件下に記録さ
れた検量プロットおよび第二の反応の条件下に記録され
た第二の検量プロットの２つの検量プロットと比較する
ことによって行われる請求項１に記載の方法。
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| JPS5639465A (en) * | 1979-09-10 | 1981-04-15 | Olympus Optical Co Ltd | Detecting method of immunological agglutination |
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| US4551426A (en) * | 1983-10-03 | 1985-11-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Heterogeneous immunoassay for digoxin using ouabain as a separation means |
| DE3347162A1 (de) * | 1983-12-27 | 1985-07-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Photometrisches verfahren zur konzentrationsbestimmung bei reaktionen, die unter bildung oder verbrauch von streuzentren verlaufen |
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-
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- 1996-06-07 EP EP96109119A patent/EP0752585B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 AT AT96109119T patent/ATE239229T1/de active
- 1996-06-07 DE DE59610394T patent/DE59610394D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 US US08/674,818 patent/US5789262A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AU AU58323/96A patent/AU701226B2/en not_active Ceased
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- 1996-07-04 CA CA002180521A patent/CA2180521C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-05 KR KR1019960027174A patent/KR970007350A/ko not_active Application Discontinuation
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