JP3828614B2 - 過剰の抗原によって影響されない比濁分析および濁度分析によるタンパク質の定量 - Google Patents
過剰の抗原によって影響されない比濁分析および濁度分析によるタンパク質の定量 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は均一溶液中のタンパク質の定量の分野に属し、抗体または抗体でコーティングされたラテックス材料の使用による抗原を介した沈降およびその沈降反応の続いての比濁分析または濁度分析による光学的測定によってタンパク質を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫沈降に関するHeidelbergerとKendallのよく知られた反応プロットから明らかなように、このような反応は両義性を示す場合がある。すなわち、抗原濃度が高い場合には最高点を越えるとシグナルの低下が起こり、この場合の値は１回の測定では、抗原濃度が低い場合のシグナルの測定値と識別することができない。
【０００３】
過剰に抗原が存在する場合のこの測定上の問題が、既知の比濁分析または濁度分析測定法の決定的な限界となることから、これまで既に多くの解決方法が提案されてきた。すなわち、反応速度（一次係数）の分析によって過剰の抗原の存在を確立し、ついで適当な再測定を設定する（Anderson, US 4,157,871）かまたは適当な技術工程によりプロットの一義的な分析を可能にする（DE-A-33 47 162）速度論的方法がある。
【０００４】
さらに、被検物質の標準プレパレーションの特定量をついで添加し、以後の反応経過を記録するいわゆる「再開始法」での問題の解決も試みられてきた。
【０００５】
速度論的法の原理における欠点は、全インキュベーション時間を通じて測定値の記録が必要になるという事実である。これは、この相当する期間を通して光学的測定系を独占し、単位時間内に処理できるサンプル数は少数のみになってしまう。この分析はまた、したがって、記憶集約的である。再開始法にはこの欠点はないが、適当な明確に特定された標準を必要とするために、試験経費の増大を伴うことになる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、試験経費の増大を伴うことなく、単位時間内に多くのサンプルを処理できて、過剰の抗原によって影響されない試験スキームを可能にする測定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本質的に、請求の範囲の項に記載の実施態様の提供によって達成される。
【０００８】
本発明は、極端に高い抗原濃度を有し、したがって低すぎるシグナルを産生するサンプルでも、試験に付す以前に希釈することによって、常に正しい結果が得られるという観察に基づくものである。論理的には、一般に、臨界的なサンプルまたは臨界的な試験結果を与えるサンプルは、自動装置により異なる希釈サンプルについて数回検討し、ついでその結果の有効性をマニュアルによりチェックすればよい。しかしながら、これでは、それに応じて単位時間内に処理できるサンプル数は減少し、試験サンプルあたりの試験経費は増大する。
【０００９】
本出願の基盤となる目的は、最初に、サンプル（または試験系に添加する前に希釈されたサンプル）量のアリコートを、全試剤を含有する試験系中でインキュベーションに付し、ある反応時間後に測定値（または、一定時間後の測定における初期値との測定値差）を記録することによって達成できることが見出されたのである。その後にはじめて、サンプル（またはサンプル希釈液）の残部を同じ反応混合物に添加し、ついでこれをさらにインキュベーション工程に付し、同様に測定を行う。アリコートは、サンプルの総量の１〜２５％、好ましくは２〜２０％、とくに好ましくは５〜１０％の割合とすることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
慣用の試験法で抗原過剰効果を生じるような高い抗原濃度を有するサンプルの場合には、予備反応において言及した調整混合物により、サンプル量が明らかに少ないため、明瞭な測定シグナルが生成することになり、分析装置によって閾値検査に基づき、迅速で、簡単なかつ信頼性のある検出が可能である。慣用の試験法により、Heidelberger & Kendallのプロットの上行枝上で問題なく正確に分析できるサンプルの場合は、予備反応において弱い測定シグナルしか与えないかまたは全くシグナルを示さず、すなわち、この場合は測定値が閾値以下であることにより分析装置が正常なケースであることを認知することになる。
【００１１】
他の有利な実施態様においては、極端なサンプルの場合でも試験に対する２つ（予備反応と主反応用）の検量プロットを作成することによって再測定を行わないで分析装置により定量分析を実施することができる。一般的にそれ程頻繁には起こらないこのようなサンプルでは、利用可能な測定シグナルの定量は行われない。これに対して、再測定は、主反応が定量可能になるまで実施される。一方、予備反応における閾値の純粋な検査は、測定シグナルの定量が必要な主反応の場合に比較して、一般に、インキュベーション時間は明らかに短くて済み、したがって、分析装置による単位時間内に処理可能な試験数はわずかに低下するにすぎない（たとえば、半分にはならない）。
【００１２】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例１：
尿中アルブミンの測定
予めＮ希釈液（注文番号：ＯＵＭＴ、Behringwerke AG）で１：５に希釈した尿サンプル５μＬを、Ｎ反応緩衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）５５μＬとともに反応キューベットに加える。反応は、４０μＬの試剤（ヒトアルブミンに対するＮ抗血清、注文番号：ＯＳＡＬ、Behringwerke AG）を同様に反応緩衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）１００μＬとともにキューベットに加えて開始させる。混合物を完全に混合し、初期シグナルを記録する。正確に２分後にもう一度測定を行い、初期シグナルとの差を予備反応からのシグナルとする。さらに４分後、最後の測定を実施し、この場合の初期シグナルとの差を主反応からのシグナルとする。
【００１３】
以下のシグナルが、Behring比濁計II（Behringwerke AG, Marburg, Germany, 注文番号：Ｏ ＶＩ Ａ）により検量プロットで得られる（この場合の散乱光シグナルの測定の単位はビットである）。
【００１４】
【表１】
【００１５】
サンプル１および２は、それぞれ試験混合物の測定範囲以下および測定範囲内のサンプルの典型的な挙動を示している。サンプル３は、予備反応において明らかに異なる反応を示し、検量プロット上の最高点の値を越えるシグナルを生じている。このようにして、たとえば、さらに高いサンプル希釈度での結果の定量のために別の測定を実行するフラッグを発生させることができる。予備反応のない従来の混合物では、測定範囲に対して極端に高い被検物質濃度を有するサンプル３は、サンプル２にまたサンプル１にでも匹敵するシグナルを発生する。したがって、従来の測定では、低すぎる誤った結果が示されることになる。
【００１６】
実施例２：
血清中ＩｇＭの測定
予め１：２０に希釈した（Ｎ希釈液中）血清サンプル５０μＬを、試剤としてヒトＩｇＭに対するＮ抗血清（注文番号：ＯＳＡＴ、Behringwerke AG）４０μＬを用いて実施例１の測定と同様に操作する。
【００１７】
【表２】
【００１８】
この場合の結果も実施例１の場合と同様である。極端に被検物質濃度の高い問題のサンプルの定量は、予備反応からの値が検量プロットに相当する値内または以下で、主反応におけるサンプルの測定値が検量プロットにおいて予め測定された値内に位置するようになるまで、サンプルを逐次希釈して定量することが可能である。ＩｇＭ骨髄腫サンプル２および３ではいずれも主反応において測定値の範囲を上回っていることにより正しく同定が行われているが、ＩｇＭ骨髄腫サンプル４の場合は異なっている。この場合は、予備反応で閾値を越える結果として、自動的再測定による定量が行われている。
【発明の属する技術分野】
本発明は均一溶液中のタンパク質の定量の分野に属し、抗体または抗体でコーティングされたラテックス材料の使用による抗原を介した沈降およびその沈降反応の続いての比濁分析または濁度分析による光学的測定によってタンパク質を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫沈降に関するHeidelbergerとKendallのよく知られた反応プロットから明らかなように、このような反応は両義性を示す場合がある。すなわち、抗原濃度が高い場合には最高点を越えるとシグナルの低下が起こり、この場合の値は１回の測定では、抗原濃度が低い場合のシグナルの測定値と識別することができない。
【０００３】
過剰に抗原が存在する場合のこの測定上の問題が、既知の比濁分析または濁度分析測定法の決定的な限界となることから、これまで既に多くの解決方法が提案されてきた。すなわち、反応速度（一次係数）の分析によって過剰の抗原の存在を確立し、ついで適当な再測定を設定する（Anderson, US 4,157,871）かまたは適当な技術工程によりプロットの一義的な分析を可能にする（DE-A-33 47 162）速度論的方法がある。
【０００４】
さらに、被検物質の標準プレパレーションの特定量をついで添加し、以後の反応経過を記録するいわゆる「再開始法」での問題の解決も試みられてきた。
【０００５】
速度論的法の原理における欠点は、全インキュベーション時間を通じて測定値の記録が必要になるという事実である。これは、この相当する期間を通して光学的測定系を独占し、単位時間内に処理できるサンプル数は少数のみになってしまう。この分析はまた、したがって、記憶集約的である。再開始法にはこの欠点はないが、適当な明確に特定された標準を必要とするために、試験経費の増大を伴うことになる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、試験経費の増大を伴うことなく、単位時間内に多くのサンプルを処理できて、過剰の抗原によって影響されない試験スキームを可能にする測定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本質的に、請求の範囲の項に記載の実施態様の提供によって達成される。
【０００８】
本発明は、極端に高い抗原濃度を有し、したがって低すぎるシグナルを産生するサンプルでも、試験に付す以前に希釈することによって、常に正しい結果が得られるという観察に基づくものである。論理的には、一般に、臨界的なサンプルまたは臨界的な試験結果を与えるサンプルは、自動装置により異なる希釈サンプルについて数回検討し、ついでその結果の有効性をマニュアルによりチェックすればよい。しかしながら、これでは、それに応じて単位時間内に処理できるサンプル数は減少し、試験サンプルあたりの試験経費は増大する。
【０００９】
本出願の基盤となる目的は、最初に、サンプル（または試験系に添加する前に希釈されたサンプル）量のアリコートを、全試剤を含有する試験系中でインキュベーションに付し、ある反応時間後に測定値（または、一定時間後の測定における初期値との測定値差）を記録することによって達成できることが見出されたのである。その後にはじめて、サンプル（またはサンプル希釈液）の残部を同じ反応混合物に添加し、ついでこれをさらにインキュベーション工程に付し、同様に測定を行う。アリコートは、サンプルの総量の１〜２５％、好ましくは２〜２０％、とくに好ましくは５〜１０％の割合とすることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
慣用の試験法で抗原過剰効果を生じるような高い抗原濃度を有するサンプルの場合には、予備反応において言及した調整混合物により、サンプル量が明らかに少ないため、明瞭な測定シグナルが生成することになり、分析装置によって閾値検査に基づき、迅速で、簡単なかつ信頼性のある検出が可能である。慣用の試験法により、Heidelberger & Kendallのプロットの上行枝上で問題なく正確に分析できるサンプルの場合は、予備反応において弱い測定シグナルしか与えないかまたは全くシグナルを示さず、すなわち、この場合は測定値が閾値以下であることにより分析装置が正常なケースであることを認知することになる。
【００１１】
他の有利な実施態様においては、極端なサンプルの場合でも試験に対する２つ（予備反応と主反応用）の検量プロットを作成することによって再測定を行わないで分析装置により定量分析を実施することができる。一般的にそれ程頻繁には起こらないこのようなサンプルでは、利用可能な測定シグナルの定量は行われない。これに対して、再測定は、主反応が定量可能になるまで実施される。一方、予備反応における閾値の純粋な検査は、測定シグナルの定量が必要な主反応の場合に比較して、一般に、インキュベーション時間は明らかに短くて済み、したがって、分析装置による単位時間内に処理可能な試験数はわずかに低下するにすぎない（たとえば、半分にはならない）。
【００１２】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例１：
尿中アルブミンの測定
予めＮ希釈液（注文番号：ＯＵＭＴ、Behringwerke AG）で１：５に希釈した尿サンプル５μＬを、Ｎ反応緩衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）５５μＬとともに反応キューベットに加える。反応は、４０μＬの試剤（ヒトアルブミンに対するＮ抗血清、注文番号：ＯＳＡＬ、Behringwerke AG）を同様に反応緩衝液（注文番号：ＯＵＭＳ、Behringwerke AG）１００μＬとともにキューベットに加えて開始させる。混合物を完全に混合し、初期シグナルを記録する。正確に２分後にもう一度測定を行い、初期シグナルとの差を予備反応からのシグナルとする。さらに４分後、最後の測定を実施し、この場合の初期シグナルとの差を主反応からのシグナルとする。
【００１３】
以下のシグナルが、Behring比濁計II（Behringwerke AG, Marburg, Germany, 注文番号：Ｏ ＶＩ Ａ）により検量プロットで得られる（この場合の散乱光シグナルの測定の単位はビットである）。
【００１４】
【表１】
サンプル１および２は、それぞれ試験混合物の測定範囲以下および測定範囲内のサンプルの典型的な挙動を示している。サンプル３は、予備反応において明らかに異なる反応を示し、検量プロット上の最高点の値を越えるシグナルを生じている。このようにして、たとえば、さらに高いサンプル希釈度での結果の定量のために別の測定を実行するフラッグを発生させることができる。予備反応のない従来の混合物では、測定範囲に対して極端に高い被検物質濃度を有するサンプル３は、サンプル２にまたサンプル１にでも匹敵するシグナルを発生する。したがって、従来の測定では、低すぎる誤った結果が示されることになる。
【００１６】
実施例２：
血清中ＩｇＭの測定
予め１：２０に希釈した（Ｎ希釈液中）血清サンプル５０μＬを、試剤としてヒトＩｇＭに対するＮ抗血清（注文番号：ＯＳＡＴ、Behringwerke AG）４０μＬを用いて実施例１の測定と同様に操作する。
【００１７】
【表２】
この場合の結果も実施例１の場合と同様である。極端に被検物質濃度の高い問題のサンプルの定量は、予備反応からの値が検量プロットに相当する値内または以下で、主反応におけるサンプルの測定値が検量プロットにおいて予め測定された値内に位置するようになるまで、サンプルを逐次希釈して定量することが可能である。ＩｇＭ骨髄腫サンプル２および３ではいずれも主反応において測定値の範囲を上回っていることにより正しく同定が行われているが、ＩｇＭ骨髄腫サンプル４の場合は異なっている。この場合は、予備反応で閾値を越える結果として、自動的再測定による定量が行われている。
Claims (15)
- 以下の工程、
ａ）測定すべきサンプルのアリコートを、粒子とも結合できる少なくとも一種の被検物質特異的結合パートナーを含む全試剤に添加しインキュベーションを行い、第一の反応を行う；
ｂ）適当な測定装置によって被検物質依存性沈降反応の第一の測定を行う；
ｃ）サンプルの残部を第一の反応混合物に加えてインキュベーションを行い、第二の反応を行う；
ｄ）前記の測定装置によって被検物質依存性沈殿反応の第二の測定を行う；
ｅ）第一および第二の測定から得られる結果を分析することによって被検物質濃度を測定する；
ことよりなる、被検物質特異的結合パートナーとの被検物質誘発沈降反応によって、生物学的材料のサンプル中の被検物質を定量する免疫化学的方法。 - 被検物質特異的結合パートナーが抗体である請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が濁度分析測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が比濁分析測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が速度論的測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が固定時間速度論的測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が固定値測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質依存性沈降反応の測定が終点測定によって行われる請求項１に記載の方法。
- 被検物質濃度は、第一の反応からの測定シグナルが所定の閾値より低い場合には、第二の反応からの測定シグナルにより計算される請求項１に記載の方法。
- 被検物質濃度は、元の混合物中における第一の反応からの測定シグナルが所定の閾値より高い場合には、サンプル含量を減少させて新たに行われる分析の第二の反応からの測定シグナルより計算される請求項１に記載の方法。
- 被検物質濃度は第一の反応からの測定シグナルが閾値より高い場合には、第一の反応からの測定シグナルより計算される請求項１に記載の方法。
- サンプルを希釈せずに用いる請求項１に記載の方法。
- サンプルを予備的希釈に付す請求項１に記載の方法。
- 分析は測定結果を検量プロットと比較することによって行う請求項１に記載の方法。
- 分析は、第一の反応の条件下に記録された検量プロットおよび第二の反応の条件下に記録された第二の検量プロットの２つの検量プロットと比較することによって行われる請求項１に記載の方法。
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