JP2010117244A - ヘモグロビンの測定方法および測定用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の検体中のヘモグロビンを測定する方法は、検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程;および、該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程;を包含し、該被測定調製物中に、SH基を含む化学物質が含有される。
【選択図】図2
Description
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程;および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程;
を包含し、
該被測定調製物中に、SH基を含む化学物質が含有される。
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびSH基を含む化学物質を含有する。
該キットにおいて、該ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方は、SH基を含む化学物質を含有する。
本発明において、測定に供する被測定物質であるヘモグロビンを含む検体としては、唾液、尿、糞便、髄液、腹水などの生体試料;環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
本発明において、被測定調製物とは、上記検体に、必要に応じて希釈用溶液などを添加した後、以下で説明する測定用試薬を加えて、吸光度測定などの測定に供される状態にされた調製物をいう。本発明においては、被測定調製物中には、以下で説明するSH基を含む化学物質が存在する。
SH基を含む化学物質としては、1−チオグリセリン、2−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、N−アセチル−L−システイン(NAC)、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、無水グルタル酸などが挙げられる。SH基を含む化学物質は、被測定調製物中に含まれていれば、どの段階で検体に添加されてもよい。SH基を含む化学物質は、例えば、以下で説明するヘモグロビン測定試薬に含有され得るか、あるいは希釈用溶液を用いる場合には、ヘモグロビン測定試薬および希釈用溶液の少なくとも一方に含有され得る。SH基を含む化学物質は、被測定調製物中の濃度(終濃度)が、好ましくは0.01〜10mM、より好ましくは0.03〜3mMになるような濃度で含有される。
ヘモグロビンを含む検体は、必要に応じて希釈用溶液で適宜希釈してもよい。本発明の方法に使用される希釈用溶液は、通常、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。この希釈用溶液は、検体を保存あるいは希釈する目的で用いられ得る。また、希釈用溶液は、必要に応じて、SH基を含む化学物質を含んでもよい。
本発明において、ヘモグロビン測定試薬は、ヘモグロビンに特異的に結合する物質(以下、特異的結合物質という場合がある)を含む。特異的結合物質としては、例えば、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体(抗ヘモグロビン抗体)が挙げられる。抗体は、ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明のヘモグロビンの測定方法は、検体中のヘモグロビンを測定する方法、好ましくは免疫学的に測定する方法であり、検体にヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程;および該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程を包含する。必要に応じて、ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む。
検体に、希釈用溶液を添加する工程;
希釈された検体に、緩衝剤を含む第1試薬を添加する工程;
ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含む第2試薬を添加して被測定調製物を調製する工程;および
該被測定調製物中における該微小粒子の凝集反応を測定する工程;
を包含し、
ここで、希釈用溶液、第1試薬、および第2試薬の少なくとも1つは、SH基を含む化学物質を含有する。SH基を含む化学物質は、いずれか1つにのみ含まれていてもよく、あるいはいずれか2つまたはすべてに含まれていてもよい。
(1)反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で2回測定し、その差を吸光度変化とする;または
(2)反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率(その最大変化率を用いる場合もある)を吸光度変化とする。
試薬中にSH基を含む化学物質である1−チオグリセリンを含む場合の効果を、ヘモグロビン添加回収試験によって確認した。以下のようにして、唾液希釈物、第1試薬、および第2試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
10人分の唾液を採取し、それぞれの唾液1mLあたり4000ngおよび8000ngのヘモグロビンを添加した。測定時に、唾液および各ヘモグロビン添加唾液を、免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトNS−PlusC」(アルフレッサファーマ株式会社)の専用採便容器である採便容器A(アルフレッサファーマ株式会社)の便溶解液で20倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
免疫学的便潜血自動分析装置「ヘモテクトNS−PlusC」(アルフレッサファーマ株式会社)の専用試薬であるネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR1試薬に対して、1−チオグリセリンを1mMの濃度になるように加え、これを第1試薬とした。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR2試薬をそのまま第2試薬とした。
上記唾液希釈物12μLと、第1試薬130μLとを混合し、37℃にて約5分間保持した。次いで、第2試薬40μLを加えて混合し、37℃にて保持しながら、日立7170形自動分析装置により主波長546nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から34の2ポイント測定を行って、2ポイント間の吸光度の差を求めた。
種々のSH基を含む化学物質について、その効果の確認を行った。以下のようにして、唾液希釈物、第1試薬、および第2試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
唾液を採取し、採便容器A(アルフレッサファーマ株式会社)の便溶解液で10倍、20倍、および40倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR1試薬に対して、それぞれ1−チオグリセリン、2−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、N-アセチル-L-システイン(NAC)、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、または無水グルタル酸を1mMの濃度になるように加え、これを第1試薬とした。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR2試薬をそのまま第2試薬とした。
上記唾液希釈物12μLと、第1試薬130μLとを混合し、37℃にて約5分間保持した。次いで、第2試薬40μLを加えて混合し、37℃にて保持しながら、日立7170形自動分析装置により主波長546nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から34の2ポイント測定を行って、2ポイント間の吸光度の差を求めた。
SH基を含む化学物質の有効濃度を検討するために、第1試薬中の1−チオグリセリンの濃度を変化させて測定値への影響を検討した。以下のようにして、唾液希釈物、第1試薬、および第2試薬を調製し、唾液検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
唾液を採取し、採便容器A(アルフレッサファーマ株式会社)の便溶解液で20倍に希釈して測定用の唾液希釈物を調製した。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR1試薬に対して、1−チオグリセリンを0.125、0.25、0.5、1、2、および4mMの濃度になるように加え、これを第1試薬とした。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR2試薬をそのまま第2試薬とした。
上記唾液希釈物12μLと、第1試薬130μLとを混合し、37℃にて約5分間保持した。次いで、第2試薬40μLを加えて混合し、37℃にて保持しながら、日立7170形自動分析装置により主波長546nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から34の2ポイント測定を行って、2ポイント間の吸光度の差を求めた。
糞便検体について、SH基を含む化学物質の効果を検討した。以下のようにして、糞便懸濁液、第1試薬、および第2試薬を調製し、糞便検体中のヘモグロビン濃度を測定した。
糞便を採便容器A(アルフレッサファーマ株式会社)で採便し、ヘモグロビン測定用の糞便懸濁液を調製した。この糞便懸濁液を採便容器A中の便溶解液で段階的に希釈して、複数の糞便懸濁液希釈物を調製した。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR1試薬に対して、ジチオトレイトール(DTT)を1mMおよび1−チオグリセリンを2mMの濃度になるように加え、これを第1試薬とした。
ネスコートヘモPlus(アルフレッサファーマ株式会社)のR2試薬をそのまま第2試薬とした。
上記糞便懸濁液希釈物12μLと、第1試薬130μLとを混合し、37℃にて約5分間保持した。次いで、第2試薬40μLを加えて混合し、37℃にて保持しながら、日立7170形自動分析装置により主波長546nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から34の2ポイント測定を行って、2ポイント間の吸光度の差を求めた。
Claims (11)
- 検体中のヘモグロビンを測定する方法であって、
検体に、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含むヘモグロビン測定試薬を添加して被測定調製物を調製する工程;および
該被測定調製物中のヘモグロビン量を測定する工程;
を包含し、
該被測定調製物中に、SH基を含む化学物質が含有される、
方法。 - 前記ヘモグロビン測定試薬を添加する前に、前記検体に、希釈用溶液を添加する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘモグロビン測定試薬および前記希釈用溶液の少なくとも一方が、前記SH基を含む化学物質を含有する、請求項2に記載の方法。
- 前記SH基を含む化学物質が、1−チオグリセリン、2−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、N−アセチル−L−システイン、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、および無水グルタル酸からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1から3のいずれかの項に記載の方法。
- 前記被測定調製物が、前記SH基を含む化学物質を0.01〜10mMの終濃度になるような濃度で含む、請求項1から4のいずれかの項に記載の方法。
- 前記検体が、唾液または糞便である、請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。
- 前記ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体が結合された微小粒子を含有する、請求項1から6のいずれかの項に記載の方法。
- 前記微小粒子が、ラテックスまたは金属コロイドである、請求項7に記載の方法。
- 前記金属が、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項8に記載の方法。
- ヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する特異的結合物質およびSH基を含む化学物質を含有する、
キット。 - 希釈用溶液およびヘモグロビン測定試薬を含む、ヘモグロビンの測定用キットであって、
該ヘモグロビン測定試薬が、ヘモグロビンに特異的に結合する物質を含み、そして
該希釈用溶液および該ヘモグロビン測定試薬の少なくとも一方が、SH基を含む化学物質を含有する、
キット。
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