JP2001255325A - 免疫学的測定法及び試薬 - Google Patents

免疫学的測定法及び試薬

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泰史 白波瀬
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 干渉物質の影響を軽減し得る免疫学的測定法
及びそれに使用される試薬を提供する。 【解決手段】 本発明の免疫学的測定法は、還元剤の存
在下に免疫学的測定法を行うことからなる。本発明によ
れば、リウマチ因子のように構成物質同士がジスルフィ
ド結合した構造をもつ干渉物質による非特異反応を、還
元剤でジスルフィド結合を切断し干渉物質を分解するこ
とにより抑制することができるので、測定精度の向上な
どを図ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は免疫学的測定法及び
測定試薬に関する。より詳細には、臨床化学、薬物化
学、生化学及び食品化学などの分野で利用され、干渉物
質の影響を軽減し得る免疫学的測定法及びそれに用いら
れる試薬に関するものである。
【0002】
【従来の技術】臨床検査などの分野では試料中の測定対
象物質の測定法として、従来から測定対象物質と当該対
象物質と抗原抗体反応可能な物質との抗原抗体反応を利
用した免疫学的測定法が汎用されている。係る測定法と
しては、例えば免疫拡散法(SRID法)、免疫比濁
法、赤血球凝集法、ラテックス等の担体を用いた方法、
RIA法、EIA法などが挙げられる。このような免疫
学的測定法では、目的とする抗原抗体反応の他に非特異
反応を生じることがあり、それが原因で測定精度及び信
頼性に欠けるという問題があった。従来、非特異反応を
抑える方法としては、試料検体を加熱処理する方法、デ
キストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、
コンドロイチン硫酸等のポリアニオンを反応系に添加す
る方法が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の加熱処
理する方法であれば加熱する操作が煩雑であり、さらに
検体試料の濃縮・ゼラチン化などの問題があった。また
ポリアニオンを使用する方法では、非特異反応を抑制す
るためにはポリアニオンの濃度を高める必要があるので
反応液の粘度が高くなり、そのため試薬の分注量が不正
確となり正確な測定値が得られない原因ともなってい
た。この現象は臨床化学の分野で広く用いられている自
動分析装置を用いた測定でも見られる欠点でもある。本
発明は、このような従来技術の欠点を解決するためにな
されたもので、本発明者らが鋭意研究した結果、従来の
免疫学的測定法の欠点を改良して非特異反応を抑制でき
る方法を見出して完成したものである。すなわち、本発
明は測定精度に優れ、臨床検査の分野などで有用に利用
できる免疫学的測定法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべくな
された本発明は、免疫学的測定法において当該反応を還
元剤の存在下に行うことからなり、前記の非特異反応を
引き起こす干渉物質を構成している構成物質間のジスル
フィド結合を還元剤で切断して干渉物質を分解し、非特
異反応を抑制することにある。干渉物質としては、係る
構成物質がジスルフィド結合したものであれば特に限定
されないが、リウマチ因子(以下RFという)、クリオ
グロブリン、M蛋白質を例示することができる。これら
はジスルフィド結合を持っており、このジスルフィド結
合を切断することにより干渉物質を分解し、非特異反応
を抑えるものである。更に、RFは、IgG型、IgM
型の2種類があるが、本発明は特にIgM型に効果がみ
られる。また、ジスルフィド結合を切断する物質として
は、ジスルフィド結合を切断できる物質であれば特に限
定されないが、α―チオグリセロール、2−メルカプト
エチルアミンン塩酸塩、臭化2−アミノエチルイソチオ
ウロニウム臭化水素酸塩及び/又はトリス(2−カルボ
キシエチル)ホスフィンを用いるのが好ましい。
【0005】
【発明の実施の形態】本発明において、免疫学的測定法
としては、測定対象物と当該対象物と抗原抗体反応可能
な物質との抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法であ
れば特に限定されないが、例えば、免疫拡散法(SRI
D法)、免疫比濁法、赤血球凝集法、ラテックス法等の
担体を用いた方法、EIA法、RIA法などが挙げられ
る。本発明の方法における測定対象物としては免疫学的
測定法で測定される物質であれば特に限定されるもので
はないが、種々の物質、例えば、抗原、ハプテン、抗
体、ホルモン、薬剤などが挙げられる。より具体的に
は、例えばCRP(C反応性蛋白質)、α−フェトプロ
テイン、CEA(カルシノエンブリオニツク抗原)、ト
ランスフェリン、ハプトグロビン、α1−アンチトリプ
シン、α1−アシドグリコプロテイン、免疫グロブリン
類等の血清蛋白質、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、
成長ホルモン等のホルモン類、HBs抗原等のウイルス
抗原、カナマイシン、テオフィリン等の薬剤などが例示
できる。これらの物質を含む検体としては、例えば、血
清、血漿、尿、髄液、リンパ液などを挙げることができ
る。
【0006】上記測定対象物質と抗原抗体反応しうる物
質(以下、免疫反応物質という)としては、測定対象物
が抗原、ハプテン等の場合はその抗体が、測定対象物が
抗体の場合にはその抗原が用いられる。免疫反応物質と
しての抗原及び抗体は慣用の方法にて調製することがで
きる。また、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体のいずれでもよく、更にF(ab)画分、F
(ab’)画分などであってもよい。また、係る免疫
反応物質は、測定法に応じて、標識物質(例えば酵素、
放射性物質、蛍光性物質等)、不溶性担体(例えばポリ
スチレンラッテックス、赤血球等)などが結合していて
もよい。
【0007】本発明で使用される還元剤は、慣用の還元
剤を使用することができ、例えばチオール化合物、チオ
尿素誘導体、ホスフィン誘導体などが挙げられる。より
具体的には、例えばα―チオグリセロール、2−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩、臭化2−アミノエチルイソチ
オウロニウム臭化水素酸塩、トリス(2−カルボキシエ
チル)ホスフィンなどが例示でき、これらの還元剤は2
種類以上を併用してもよい。また、他の物質と組み合わ
せて用いてもよい。係る還元剤は、例えばジチオスレイ
トール(DTT)などの他の還元性物質と比較して安定
性がよいことなどから好適に用いられ、特にα―チオグ
リセロールが好適に使用される。更に、EDTAなどの
キレート剤を用いることにより安定性を向上させてもよ
い。
【0008】上記の還元剤の使用量は検体中の干渉物質
量、測定方法などにより適宜設定でき、その量は干渉物
質の影響を軽減できる量であればよい。通常、反応系に
おける終濃度として10mmol/L程度以上、好まし
くは15〜60mmol/L程度、より好ましくは20
〜50mmol/L程度に調整される。更に、反応系に
は、必要に応じて、ポリエチレングリコール、デキスト
ラン、ゼラチン、塩化ナトリウムなどの慣用の添加剤を
加えてもよい。
【0009】本発明の方法の一例を免疫比濁法において
試料中のCRPを測定する例をもって説明すると、ま
ず、適当な緩衝液(例えばHEPES緩衝液のようなグ
ッド緩衝液)に還元剤(好ましくはα―チオグリセロー
ル)を適当濃度(通常50mM)になるように添加し、
更に必要に応じてポリエチレングリコール、塩化ナトリ
ウム、EDTAなどの添加剤を適宜添加した第一試薬を
調製する。一方、適当な緩衝液(例えばHEPES緩衝
液のようなグッド緩衝液)に抗CRP抗体(例えば、抗
ヒトCRPヤギ血清)を添加し、更に必要に応じてポリ
エチレングリコール、塩化ナトリウム、EDTAなどの
添加剤を適宜添加した第二試薬を調製する。そして、C
RPを含有する試料(例えば血清等)に第一試薬を添加
後、20〜40℃程度(通常37℃程度)で2〜10分
間程度(通常5分間程度)加温する。次いで、適当量の
第二試薬を添加し、20〜40℃程度(通常37℃程
度)で2〜10分間程度(通常5分間程度)加温した
後、波長340nmでの吸光度を測定し、予め作成した
検量線に基づきCRP濃度を求めることができる。吸光
度の測定は、エンドポイント法、レートアッセイ法のい
ずれで行ってもよい。
【0010】なお、本発明の方法は上記の方法に限定さ
れるものではなく、使用する免疫学的測定方法に応じて
適宜変更して実施することができ、使用する緩衝液、測
定条件なども適宜変更することができる。
【0011】本発明は、上記の方法に使用される試薬で
あって、当該試薬が還元剤を含有することからなる。上
記の試薬は、免疫学的測定法の種類に応じて適宜設定す
ることができ、また、複数の構成試薬からなるキットで
あっても良く、この場合には構成試薬の少なくとも1種
が還元剤を含有すればよい。
【0012】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【0013】実施例1 1W/V%塩化ナトリウム、1mmol/L EDT
A、4W/V%PEG6000、0.1W/V%アジ化
ナトリウム及び0〜60mmol/Lのα―チオグリセ
ロールを含むヘペス緩衝液(pH=7.5)を調製し、
第一試薬とした。抗ヒトCRPヤギ血清15mlを1W
/V%塩化ナトリウム、0.1W/V%アジ化ナトリウ
ムを含むヘペス緩衝液(pH=7.5)で100mlに
調製し、第二試薬とした。検体15μL、第一試薬25
0μL及び第二試薬50μLを混合し、主波長340n
m、副波長700nm、エンドポイントアッセイの分析
条件で日立7150型自動分析装置を用いて測定を行
い、予め作成した検量線からCRP濃度を算出した。検
体として500U/mLのRF含む2.00mg/dL
のCRP溶液、及び対照としてRFを含まない2.00
mg/dLのCRP溶液を調製し、非特異反応回避の検
討を行った。その結果を表1に示す。表1に示されるよ
うに、α―チオグリセロールの添加により非特異反応が
回避できることが明らかとなった。
【0014】
【表1】
【0015】実施例2 実施例1で作製した試薬で0〜60mmol/Lのα―
チオグリセロールの代わりに5mmol/L DTT、
50mmol/L α―チオグリセロール、10mmo
l/L臭化2−アミノエチルイソチオウロニウム臭化水
素酸塩(AETと略す)及び無添加のものを調製し,R
Fの影響回避の検討を行った。その他の試薬組成、操作
法,検体の調製は実施例1と同様に行った。その結果を
表2に示す。表2に示すように還元剤の添加によりRF
の非特異反応の回避が可能であることが明らかとなっ
た。
【0016】
【表2】
【0017】実施例3 実施例2で作製した第一試薬を30℃で保存したときの
試薬の安定性をRF干渉回避能より検討した。検体は5
00U/mLのRFを含む2.00mg/dLのCRP
溶液を用いた。操作法は実施例1と同様に行った。その
結果を図1に示す。図1から明らかなようにDTTと比
較して、α―チオグリセロール、臭化2−アミノエチル
イソチオウロニウム臭化水素酸塩(AET)は30℃で
長期間保存してもRFの影響をほとんど受けず安定であ
ることが明らかとなった。
【0018】
【発明の効果】本発明においては、試料中のRFのよう
に構成物質同士がジスルフィド結合した構造をもつ干渉
物質による非特異反応を、還元剤でジスルフィド結合を
切断し干渉物質を分解することにより抑制することがで
きる。特に、反応系の粘度を上昇させないので、自動分
析装置を用いた測定に好適に使用することができる。従
って、本発明によれば、免疫学的測定法の測定精度・信
頼性を著しく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】DTT、α―チオグリセロール又はAETを含
有する試薬の保存安定性を示す図である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 干渉物質の影響を軽減し得る免疫学的
    測定法であって、当該反応を還元剤の存在下に行うこと
    を特徴とする免疫学的測定法。
  2. 【請求項2】 干渉物質がリウマチ因子及び/又はク
    リオグロブリン及び/又はM蛋白質である請求項1に記
    載の免疫学的測定法。
  3. 【請求項3】 還元剤がα―チオグリセロール、2−
    メルカプトエチルアミンン塩酸塩、臭化2−アミノエチ
    ルイソチオウロニウム臭化水素酸塩、トリス(2−カル
    ボキシエチル)ホスフィンから選ばれる少なくとも1の
    化合物である請求項1又は2に記載の免疫学的測定法。
  4. 【請求項4】 免疫学的測定法に使用される試薬であ
    って、当該試薬が還元剤を含有することを特徴とする免
    疫学的測定用試薬。
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