JPWO2019171967A1 - 検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、検体に含まれる検出対象物質を定量するために、夾雑物に由来する影響、すなわち検出対象物の定量値に対するノイズが低減でき、シグナルの感度が良好となる検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法を提供することを課題とする。本発明の検体希釈液は、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる検体希釈液。

Description

本発明は、検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法に関する。
近年の研究により、生体内の大部分のタンパク質は糖鎖による修飾を受けており、タンパク質に付加した糖鎖がタンパク質の安定性、ホルモンとの結合、毒素との結合、ウイルスの感染、マイコプラズマの感染、細菌の感染、原虫の寄生、受精、発生分化、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが明らかとなった。そして、同じアミノ酸配列の、同一名称のタンパク質であっても、修飾している糖鎖は多種多様であり、タンパク質を産生する細胞の状態によって、その糖鎖構造が異なることや、生体内での役割が異なることがわかっている。
糖鎖構造と疾病の関係性については、例えば、細胞の癌化に伴い、さまざまな糖鎖構造に変化が起こることが報告されており、糖鎖は癌を特定するマーカーの１つとして、期待されている。
糖鎖をマーカーとして、糖タンパク質を特異的に検出するためには、糖鎖中の特定の糖残基を特異的に認識して結合する能力を持つ、レクチンと呼ばれるタンパク質が広く利用されている。しかしながら、レクチンは、抗体よりも結合力が低く、また糖鎖に対する結合の特異性が低いなどの問題があった。そこで、レクチンと抗体を組み合わせて用いて特異性を高め、検出対象物質として特定の糖鎖を有するタンパク質（糖タンパク質）を、定量解析することができるサンドイッチ法が行われている。
サンドイッチ法では、糖タンパク質のタンパク質部分に特異的に結合する抗体は、基板に固定化されて固相化抗体として用いられ、糖タンパク質の糖鎖部分に含まれる糖残基を主要な結合対象とするレクチンは、標識剤に連結されて標識化レクチンとして用いられている。
しかしながらこの手法は、通常の臨床診断において検体として用いられる血液や尿のように、検出対象物質以外の糖タンパク質や糖脂質といった夾雑物が大量に含まれる系では、検出対象物質の糖鎖だけでなく夾雑物の糖鎖にも標識化レクチンが結合してしまうため、ノイズ（バックグラウンド）が大きくなり、感度および定量性において性能が落ちていた。そのため、血液等を検体とする一般的な臨床診断で用いるための改良が行われてきた。
これまでに、本出願人らは、検体として用いられる血液（血清）中に含まれるＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）等の数種類の糖タンパク質が、夾雑物として測定領域に非特異的に結合することがノイズの大きくなる要因であることをつきとめ、夾雑物とレクチンとのジスルフィド結合を、還元剤を用いて切断することにより、ノイズの低減を行っている。（例えば、特許文献１）
国際公開ＷＯ２０１５／１９４３５０号公報
本発明は、特許文献１等に基づき、更に鋭意検討を行い、検体に含まれる検出対象物質を定量するために、夾雑物に由来する影響、すなわち検出対象物の定量値に対するノイズが低減でき、シグナルの感度が良好となる検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、例えば下記［１］〜［１４］に示される検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法を提供する。
［１］下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる検体希釈液。
Figure 2019171967
 式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
［２］ｐＨが６．０〜９．０である、［１］に記載の検体希釈液。
［３］前記サンドイッチ法が、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、または、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行われる、［１］または［２］に記載の検体希釈液。
［４］前記サンドイッチ法が、抗体およびレクチンの少なくとも一つを用いるサンドイッチ法である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の検体希釈液。
［５］前記サンドイッチ法が、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、凝集ナノ粒子、磁気ビーズ、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質の少なくとも一つを用いるサンドイッチ法である、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の検体希釈液。
［６］前記チオール基を有する化合物が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、チオグリコール酸、またはＬ−システインから選択される少なくとも１種である、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の検体希釈液。
［７］前記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）およびこれらの塩から選択される少なくとも１種である、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の検体希釈液。
［８］無機還元剤を含む、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の検体希釈液。
［９］前記無機還元剤が、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）、ハイドロサルファイト、および二酸化チオ尿素から選択される少なくとも１種である、［８］に記載の検体希釈液。
［１０］検体１μｇあたり、検体希釈液を１〜１００μｇ混合する工程を有し、前記検体希釈液が、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる試料の製造方法。
Figure 2019171967
 式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
［１１］検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質として糖タンパク質を含む、［１０］に記載の試料の製造方法。
［１２］検体と、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の検体希釈液とから成る試料であり、検体１μｇあたりの検体希釈液量が、１〜１００μｇである、サンドイッチ法で用いるための試料。
［１３］検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質として糖タンパク質を含む、［１２］に記載の試料。
［１４］［１２］または［１３］に記載の試料を用いて、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、または、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行われる、サンドイッチ法。
本発明によれば、検体に含まれる検出対象物質を定量するために、夾雑物に由来する影響、すなわち検出対象物の定量値に対するノイズが低減でき、シグナルの感度が良好となる検体希釈液、試料の製造方法、試料、およびサンドイッチ法を提供することができる。
比較例１および実施例１の結果を示す。横軸にノイズ成分のシグナル値、縦軸にシグナル成分のシグナル値を示す。 比較例２および実施例２の結果を示す。横軸にノイズ成分のシグナル値、縦軸にシグナル成分のシグナル値を示す。
次に本発明について具体的に説明する。
≪検体希釈液≫
本発明の検体希釈液は、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる検体希釈液である。
Figure 2019171967
 式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
本発明の検体希釈液は、シグナル関連成分のタンパク質を失活させないことが必要なことから、上記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭ含み、３０ｍＭ〜１００ｍＭ含むことが好ましい。また、本発明の検体希釈液は、ノイズ関連成分のタンパク質を失活させることが必要なことから、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭ含み、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含むことが好ましい。
さらに、本発明の検体希釈液は、任意成分として無機還元剤を含むことも好ましい態様の一つである。本発明の検体希釈液が無機還元剤を含む場合には、無機還元剤を１０ｍＭ〜８００ｍＭ含むことが好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭ含むことがより好ましい。
例えば、検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）等のサンドイッチ法を用いて定量する際に、検体を希釈して測定試料を得ることがある。このような希釈に用いる溶液を、本発明では検体希釈液と記す。
検体希釈液は、緩衝液であることが、ｐＨが安定する観点から好ましい。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、体液とほぼ等張の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）、ＭＥＳ緩衝生理食塩水が好ましい。
検体希釈液のｐＨは、６．０〜９．０であることが好ましく、ｐＨ６．５〜８．５がより好ましい。
なお、ｐＨの測定方法は特に限定されるものではなく、一般的なｐＨの測定法（例えばガラス電極法）を用いて、適切な測定条件において測定すればよい。
検体希釈液は、検体の溶解安定性を向上させるために界面活性剤等を含んでいてもよい。界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール）、Ｓｐａｎ ８０（ソルビタンモノオレアート）などの界面活性剤が挙げられる。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０が好ましい。また、検体希釈液中に界面活性剤が含まれる場合には、界面活性剤の濃度は、検体希釈液１００質量％中に、０．００００１〜０．１質量％含有されていることが好ましい。
検体希釈液は、検体が生体由来物質である場合、検体１μｇに対して、１〜１００μｇ加えることが好ましい。
本発明者らは、本発明の検体希釈液を用いることにより、検出対象物質を定量する際に、定量値に対するノイズが低減でき、シグナルの感度が良好となる理由は以下の通りであると推定した。
チオール基を有する化合物を用いた場合には、ＩｇＭ等の夾雑物が有するジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）を還元的に開裂させることで、ＩｇＭ等の夾雑物に由来するノイズを低減できることは知られていたが、同時に測定感度も低下することを本発明者らは見出した。
本発明者らは測定感度が低下する原因を、チオール基を有する化合物を用いた場合には、ＩｇＭ等の夾雑物のジスルフィド結合のみではなく、サンドイッチ法を行う際の固相を構成する、検出対象物質を捕捉するための捕捉物質（例えば抗ＰＳＡ抗体等のＩｇＧ）中のジスルフィド結合も同時に開裂してしまうことにあると推定した。本発明ではチオール基を有する化合物に加えて、式（Ｉ）で示される構造を有する化合物を用いることにより、以下の機構により、捕捉物質におけるジスルフィド結合の開裂を抑制することができ、結果としてシグナルの感度が良好になると推定した。
式（Ｉ）で示される構造を有する化合物が、チオール基を有する化合物と相互作用することにより、複合体を形成し、複合体を形成することにより、チオールによるジスルフィド結合の開裂の反応性を低下させ、より表面にジスルフィド結合を有するＩｇＭ等の夾雑物については、開裂が起こるが、捕捉物質ではジスルフィド結合の開裂が起こらないと推定した。なお、本発明の検体希釈液は、式（Ｉ）で示される構造を有する化合物を用いない場合と比べて、チオールの臭気が劇的に低減することも、式（Ｉ）で示される構造を有する化合物が、チオール基を有する化合物と相互作用をすることにより複合体を形成していると推定する根拠の一つである。
このようなことから、サンドイッチ法で本発明の検体希釈液を用いることにより、シグナル劣化を起こさず、感度が優れた定量を行うことができると、本発明者らは考えている。
〈式（Ｉ）で表される構造を有する化合物〉
本発明の検体希釈液は、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が含まれる。本発明者らは、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が、後述するチオール基を有する化合物と相互作用することによってノイズを低減し、かつシグナル劣化を起こさないのではないかと推察している。また、検出対象物質を定量する際の各種物質（例えば、金属イオン、イオン成分、検出対象物質、捕捉物質、夾雑物）が共存する複雑な測定系において、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が、これらの物質の溶解安定性を高めることにも寄与しているため、ノイズを低減し、かつシグナル劣化を起こさないのではないかと推察している。
Figure 2019171967
 式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
Ｒ1としては、例えば、メチレン基およびエチレン基が挙げられ、メチレン基がより好ましい。
Ｒ2としては、例えば、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｎａ+、−ＣＯＯ-Ｋ+、−ＣＯＯ-ＮＨ4+であり、各Ｒ2としては同一であっても異なっていてもよい。
Ｘ+としては、例えば、Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+、ＮＨ4+であり、各Ｘ+は同一のものでも、異なっていてもよい。
波線は、他の原子との結合部位であり、他の原子としては、例えば、炭素原子が挙げられる。
上記のような、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物としては、式（Ｉ）で表される構造を分子内に１個以上有していればよく、１〜２個有することが好ましい。
式（Ｉ）で表される構造を有する化合物の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミノ三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、これらの塩から選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）およびこれらの塩から選択される少なくとも１種が挙げられ、より好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびこれらの塩から選択される少なくとも１種が好ましい。前記塩としては、例えばアルカリ金属塩、およびアンモニウム塩が挙げられ、アルカリ金属塩が好ましく、溶解安定性の観点から、ナトリウム塩がより好ましい。
式（Ｉ）で表される構造を有する化合物としては、一種単独で用いても、二種以上を用いてもよい。
〈チオール基を有する化合物〉
本発明の検体希釈液は、チオール基を有する化合物が含まれる。
上記チオール基を有する化合物としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、チオグリコール酸、またはＬ−システインから選択される少なくとも１種が挙げられ、ＤＴＴ、メルカプトエタノールから選択される少なくとも１種が好ましく、ＤＴＴがより好ましい。
チオール基を有する化合物としては、一種単独で用いても、二種以上を用いてもよい。
本発明者らは、以下の機構により、チオール基を有する化合物が夾雑物、特にＩｇＭ中の−Ｓ−Ｓ−結合を還元し、開裂させると推定した。
チオール基を有する化合物と、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が複合体を形成し分子が巨大化することで、移動速度が低下したと推定した。そして、検出対象物質を捕捉するための捕捉物質（例えば抗ＰＳＡ抗体等のＩｇＧ）より大きい分子の夾雑物（特にＩｇＭ）に、選択的に還元作用が働くようになり、無差別に還元せず、夾雑物のみを還元してノイズを低減しているのではないかと推定した。
〈無機還元剤〉
本発明の検体希釈液は、任意で、無機還元剤を含んでいてもよい。
上記無機還元剤としては、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）、ハイドロサルファイト、および二酸化チオ尿素から選択される少なくとも１種が挙げられ、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）から選択される少なくとも１種が好ましい。
無機還元剤としては、一種単独で用いても、二種以上を用いてもよい。
本発明者らは、無機還元剤が夾雑物、特に水和性の高いタンパク質の表面の−Ｓ−Ｓ−結合を還元し開裂させるため、ノイズを低減しているのではないかと推察している。
≪サンドイッチ法≫
抗体を用いたタンパク質の定性・定量法の一つとして、サンドイッチ法がある。サンドイッチ法とは、ウェルプレートや磁性粒子、センサーチップ等の測定領域に、あらかじめ検出対象物質（抗原）に対する補足物質（抗体、例えば抗ＰＳＡ抗体等のＩｇＧ）を固相化しておき、免疫反応によって検出対象物質を捕捉した後、続いて、検出対象物質に特異的に結合する、標識化した物質を結合させて検出する方法である。
抗体は検出対象物質を捕捉できる物質であればよく、特に限定されない。検出対象物質については後述で詳細に述べるが、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出対象物質とする場合は、抗ＰＳＡ抗体を用いることができる。
検出対象物質に特異的に結合する物質であれば、標識化した物質は特に限定されない。例えば、検出対象物質が糖鎖を有する場合、レクチンを標識化した物質を用いることができる。
レクチンは、種々のものがあるが、目的にあったものを用いればよく、標識化には、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、凝集ナノ粒子、磁気ビーズ、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等を用いることができる。例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出対象物質とする場合は、ＷＦＡ（ノダフジレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン）等のレクチンを標識化して用いればよい。
本発明は、このようなサンドイッチ法で用いることができる検体希釈液である。
本発明のサンドイッチ法は、例えば表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、または、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行われる、サンドイッチ法である。
本発明のサンドイッチ法による定量では、検体として濃度が既知の生体由来物質から得られるシグナル強度を用いて検量線を作成し、検出対象物質から得たシグナル強度をあてはめて濃度を求めることができる。
本発明のサンドイッチ法は、極微量の検出対象物質を特異的に検出することができることから、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）のような高感度な蛍光測定方法を行う際に適用することが好ましい。
例えば、ＳＰＦＳを用いて定量する場合のサンドイッチ法は、まず、センサーチップ等の測定領域に、あらかじめ検出対象物質（抗原）に対する抗体を固相化しておき、免疫反応によって検出対象物質を捕捉することが好ましい。そして、検出対象物質と特異的に結合反応する物質に標識剤を連結させた物質を検出して定量を行うサンドイッチ法が好ましい。
〈表面プラズモン励起増強蛍光分光法〉
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属薄膜表面で減衰全反射（ＡＴＲ；ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（粗密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得ている。
金属薄膜の表面近傍に抗体などのリガンド分子を固定し、そこで免疫反応により抗原を捕捉した後、蛍光標識分子を結合させる。そして、上記の電場増強効果により、蛍光標識した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度の抗原を検出することが可能である。
本発明の実施形態の好適な一例としては、例えば、検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質として糖タンパク質を含む場合である。検体に、本発明の検体希釈液を混合して測定溶液を得て、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）により定量することができる。
例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて、上記のような測定試料に含まれる、極微量の抗原として糖タンパク質を定量するには、金属薄膜表面の測定領域に、固相化抗体として糖タンパク質のタンパク質部分に特異的に結合する抗体を適宜選択して捕捉に用いればよく、特に制限されない。また、捕捉した糖タンパク質の糖鎖部分に含まれる糖残基を主要な結合対象とする物質に、蛍光等の標識剤を連結させて検出に用いることが好ましく、標識方法は特に制限されない。例えば、蛍光色素で標識化したレクチン（蛍光標識化レクチンと呼ぶ）を用いることができ、市販の蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名） ６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）等を利用して作製し、蛍光標識化レクチンを得ることができる。
〈酵素免疫測定法〉
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で用いることのできる酵素としては、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が代表的であり、それぞれに対応した適切な基質と組み合わせて用いればよい。
≪検体≫
本発明では、検体が生体由来物質であることが好ましく、検出対象物質および夾雑物を含む可能性のある検体を用いることが好ましい。検出対象物質および夾雑物を含む可能性のある検体は、現実にそれらを含む検体であってもよいし、現実にはそれらを含まない検体であってもよい。具体的には、例えば、検出対象物質（および夾雑物）を含む可能性の高い特定の疾患の患者に由来する検体であってもよいし、検出対象物質（および夾雑物）を含む可能性の低い健常者に由来する検体であってもよい。また、検体を採取する対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルといったヒト以外の哺乳動物であってもよい。
検体としては、例えば、血液、尿、髄液、唾液、細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの調製物（例えば、生検標本）等を挙げることができる。例えば血液や尿は、診断マーカーとして利用できる糖タンパク質を含む検体であるため、好ましい。
血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液などの液性の検体は、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、または器官などの固形の検体は、固形の検体の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液またはその上清を、そのまま、またはさらに希釈して使用することができる。
本発明の検体希釈液を用いて、血液、血清等の検体を希釈し、測定試料としてサンドイッチ法で用いることができる。
本発明の実施形態の好適な一例としては、血液を検体とする。ここで血液は、全血であってもよいし、全血から調製された血清または血漿であってもよい。また、抗凝固剤、希釈液（緩衝液等）、試薬等が添加されていてもよい。
〈検出対象物質〉
検体に含まれる検出対象物質として、糖タンパク質が好ましい。検出対象物質としての糖タンパク質としては、例えば、検体中に含まれる、病理診断に用いられるマーカー分子である。例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん抗原／腫瘍マーカーが好適であり、その他にもシグナル伝達物質、ホルモンなどの糖タンパク質を検出対象物質とすることも可能である。例えば、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞培養株）から、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を得ることができる。
検出対象物質は、蛍光色素等で標識化した物質との結合部位および捕捉物質（例えば抗体）との結合部位を同一のドメインに含む、つまり蛍光色素等で標識化した物質との結合部位を含むドメインと、捕捉物質との結合部位を含むドメインとが、検体希釈液中の成分の作用により分離されない糖タンパク質であることが好ましい。
≪試料の製造方法≫
本発明の試料の製造方法は、検体１μｇあたり、検体希釈液を１〜１００μｇ混合する工程を有し、前記検体希釈液が、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる試料の製造方法である。
式（Ｉ）で表される構造を有する化合物、およびチオール基を有する化合物については、前述した通りである。
本製造方法において、検体と検体希釈液の他に、緩衝剤、界面活性剤などを加える工程を有していてもよい。
なお、試料は室温（１５〜２５℃）で製造することが好ましく、製造してから、１秒〜３０分で測定に供することが、夾雑物由来のノイズを低減できることから好ましい。
≪試料≫
本発明で用いる試料は、検体と、検体希釈液とから成る試料であり、検体１μｇあたりの検体希釈液量が、１〜１００μｇである、サンドイッチ法で用いるための試料である。
本発明の試料は前述の本発明の検体希釈液を用いて調製されるため、夾雑物に由来する影響、すなわち検出対象物の定量値に対するノイズが低減でき、シグナルの感度が良好となるため好ましい。
≪実験１≫
［比較例１、実施例１］
（検体希釈液の調製）
ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、またはＥＤＴＡとＤＴＴの両方を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を、表１に記載の濃度に調製して、検体希釈液を得た。なお、コントロールは、ＰＢＳのみの検体希釈液とした。
表１に、各比較例、実施例ごとの検体希釈液の種類および濃度を示す。
（測定試料の調製）
上記の検体希釈液１００μＬに、ＰＳＡフリープール血清（正常ヒトプール血清、コージンバイオ社、ＥＬＩＳＡにてＰＳＡ濃度が１ｐｇ／ｍＬ（０．００１ｎｇ／ｍＬ）以下であることを確認）２０μＬを加えて混合し、ノイズ成分のシグナル測定試料として用いた。
ＰＳＡフリープール血清に、全ＰＳＡ濃度が２ｎｇ／ｍＬとなるようにＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞培養株、ＤＳファーマバイオメディカル社）培養上清を添加し、ＰＳＡ含有血清を調製した。なお、ＰＳＡ濃度の調製は、ＰＳＡ測定キット（トータルＰＳＡ・アボット、アボット ジャパン株式会社）を用いた。
上記の検体希釈液１００μＬに、上記ＰＳＡ含有血清２０μＬを加えて混合し、シグナル成分のシグナル測定試料として用いた。
（ＳＰＦＳ用センサーチップの調製）
ＳＰＦＳ用のセンサーチップに、カルボキシメチルデキストランからなる膜（ＣＭＤ膜）を形成するために、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水および１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）を０．８ｍＬ滴下し、２０分間反応させた。
上記ＭＥＳ緩衝生理食塩水は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．５ｍＭとカルボキシメチルデキストラン「ＣＭＤ-５００−０６Ｉ４」（名糖産業株式会社：平均分子量５０万，置換度０．５１）１ｍｇ/ｍＬとを混合して調製した。
センサーチップ上の流路に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）５０ｍＭおよび水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）１００ｍＭを含むＰＢＳ溶液５ｍＬを導入し、２０分間、流量５００μＬ／分で循環送液させて、ＣＭＤのカルボキシル基を活性エステル化させた。その後、抗ＰＳＡ抗体の溶液２．５ｍＬを３０分間、流量５００μＬ／分で循環送液させて、ＣＭＤの活性エステル基に抗体を結合させることで、センサーチップに抗ＰＳＡ抗体を固相化し、測定領域を構築した。
抗ＰＳＡ抗体を固相化させたセンサーチップ内に上記の測定試料を注入して、３０分間往復送液しながら測定領域と反応させた。
その後、流路にＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５ｗｔ％含有する、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）溶液を導入し、３分間ピペッティングで往復送液して測定領域を洗浄した。
（蛍光標識化レクチンの調製）
蛍光標識化レクチン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ）を、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）を利用して作製した。ＷＦＡ（ノダフジレクチン）「Ｌ-１３５０」（Ｖｅｃｔｏｒ社）１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識化ＷＦＡを回収した。得られた蛍光標識化ＷＦＡ溶液の吸光度を測定して濃度を定量し、ＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍＬの濃度となるよう調整した。
（シグナル値の測定）
センサーチップ内に、上記で調製した１μｇ／ｍＬ蛍光標識化レクチン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ）溶液１００μＬを導入した。導入した溶液を、ピペッティングで１０分間往復送液し、測定領域と反応させた。
その後、測定領域に、ＴＢＳ−Ｔ溶液を導入し、３分間往復送液した後、流路およびセンサーチップ内を洗浄した。そして、このＴＢＳ−Ｔ溶液で流路を満たした状態で励起光を照射し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光の発光強度を測定した。その測定値をシグナル値として用いた。
（Ｓ／Ｎ比の算出）
下記式（ＩＩ）を用いて、得られたシグナル値から、Ｓ／Ｎ比を算出した。
［シグナル成分（ＰＳＡ濃度 ２ｎｇ／ｍＬ）のシグナル値］／［ノイズ成分（ＰＳＡ濃度 ０ｎｇ／ｍＬ）のシグナル値］・・・式（ＩＩ）
表１に、比較例１および実施例１ごとのシグナル値およびＳ／Ｎ比を示す。
Figure 2019171967
 なお、表１のシグナル値をグラフにしたものを、図１に示す。
図１は、横軸にノイズ成分のシグナル値、縦軸にシグナル成分のシグナル値を示している。実施例１の１〜４については、ＤＴＴ＋ＥＤＴＡ複合系として、図中に三角印で示している。比較例１の１〜３については、ＤＴＴ単独系として、図中に米印で示している。比較例１の４〜６については、ＥＤＴＡ単独系として、図中に黒丸で示している。
表１および図１の結果を考察する。ＤＴＴは１００ｍＭ以上の場合、ノイズ成分のシグナル値が下がらず、シグナル成分のシグナル値が大幅に下がり、感度が悪くなった。また、ＥＤＴＡは、１００ｍＭ以上の場合、ノイズ成分のシグナル値を低減する効果は改善されず、シグナル成分のシグナル値も下がり、感度が悪くなった。一方、ＤＴＴとＥＤＴＡを両方用いた場合は、驚くべきことに、優れたシグナル成分のシグナル値を有しつつ、かつ、ノイズ成分のノイズ値を充分に低減させる効果がみられた。
以上のことから、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物、または、チオール基を有する化合物をそれぞれ単独で用いる場合と比較して、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物とチオール基を有する化合物を両方用いる場合のほうが、ノイズ成分のシグナル値が低く、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物とチオール基を有する化合物の驚くべき複合効果により、ノイズが低減され、シグナルの感度が良好となったことが示唆された。
≪実験２≫
［比較例２、実施例２］
（検体希釈液の調製）
ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＮＴＡ、または、ＤＴＰＡを含有するＰＢＳ溶液を、表２に記載の濃度に調製して、比較例２の検体希釈液とした。
ＤＴＴと、ＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡのいずれか１つとを組み合わせて含有するＰＢＳ溶液を、表２に記載の濃度に調製して、実施例２の検体希釈液とした。なお、コントロールは、ＰＢＳのみの検体希釈液とした。
Figure 2019171967
上記の検体希釈液の調製以外は、実験１と同様に行い、シグナル値およびＳ／Ｎ比を得た。
表２に、その結果を示す。
なお、表２のシグナル値をグラフにしたものを、図２に示す。
図２は、横軸にノイズ成分のシグナル値、縦軸にシグナル成分のシグナル値を示している。実施例２の１〜４については、ＤＴＴ＋式（Ｉ）で表される構造を有する化合物複合系として、図中に三角印で示している。比較例２の１については、ＤＴＴ単独系として、図中に米印で示している。比較例２の２〜５については、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物単独系として、図中に黒丸で示している。
≪実験３≫
［比較例３、実施例３］
（検体希釈液の調製）
ＤＴＴ、Ｌ−システイン、チオグリコール酸、またはメルカプトエタノールを含有するＰＢＳ溶液を、表３に記載の濃度に調製して、比較例３の検体希釈液とした。
ＥＤＴＡと、ＤＴＴ、Ｌ−システイン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールのいずれか１つとを組み合わせて含有するＰＢＳ溶液を、表３に記載の濃度に調製して、実施例３の検体希釈液とした。なお、コントロールは、ＰＢＳのみの検体希釈液とした。
Figure 2019171967
 上記の検体希釈液の調製以外は、実験１と同様に行い、シグナル値およびＳ／Ｎ比を得た。
また、下記式（ＩＩＩ）を用いて、得られたＳ／Ｎ比から、Ｓ／Ｎ改善効果％を算出した。
Ｓ／Ｎ改善効果％＝（チオール基を有する化合物＋ＥＤＴＡのＳ／Ｎ比）／（チオール基を有する化合物のＳ／Ｎ比）×１００・・・式（ＩＩＩ）
表３に、その結果を示す。
≪実験４≫
［比較例４、実施例４］
（検体希釈液の調製）
メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）、または、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）を含有するＰＢＳ溶液を、表４に記載の濃度に調製して、比較例４の検体希釈液とした。
ＤＴＴおよびＥＤＴＡと、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）または、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）のどちらか１つとを組み合わせて含有するＰＢＳ溶液を、表４に記載の濃度に調製して、実施例４の検体希釈液とした。なお、コントロールは、ＰＢＳのみの検体希釈液とした。
Figure 2019171967
上記の検体希釈液の調製以外は、実験３と同様に行い、シグナル値、Ｓ／Ｎ比、およびＳ／Ｎ改善効果％を得た。表４に、その結果を示す。
表４の結果を考察する。ＤＴＴおよびＥＤＴＡと、ＳＭまたは、ＳＳのどちらか１つとを組み合わせて含有する場合、ノイズ成分のシグナル値を低減する効果が非常に優れているため、感度が良好になったことが示唆された。

Claims (14)

  1. 下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる検体希釈液。
    Figure 2019171967
     式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
  2. ｐＨが６．０〜９．０である、請求項１に記載の検体希釈液。
  3. 前記サンドイッチ法が、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、または、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行われる、請求項１または２に記載の検体希釈液。
  4. 前記サンドイッチ法が、抗体およびレクチンの少なくとも一つを用いるサンドイッチ法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検体希釈液。
  5. 前記サンドイッチ法が、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、凝集ナノ粒子、磁気ビーズ、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質の少なくとも一つを用いるサンドイッチ法である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検体希釈液。
  6. 前記チオール基を有する化合物が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、チオグリコール酸、またはＬ−システインから選択される少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検体希釈液。
  7. 前記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）およびこれらの塩から選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検体希釈液。
  8. 無機還元剤を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検体希釈液。
  9. 前記無機還元剤が、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭ）、亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）、ハイドロサルファイト、および二酸化チオ尿素から選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の検体希釈液。
  10. 検体１μｇあたり、検体希釈液を１〜１００μｇ混合する工程を有し、
    前記検体希釈液が、下記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭと、チオール基を有する化合物を１０ｍＭ〜５００ｍＭとを含む、サンドイッチ法で用いられる試料の製造方法。
    Figure 2019171967
     式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に、Ｒ1は炭素数１〜２のアルキレン基であり、Ｒ2は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ-Ｘ+、−ＯＨ、または−Ｏ-Ｘ+で表される基であり、Ｘ+は独立に、無機カチオンもしくは有機カチオンであり、波線は他の原子との結合部位である。
  11. 検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質として糖タンパク質を含む、請求項１０に記載の試料の製造方法。
  12. 検体と、請求項１〜９のいずれか一項に記載の検体希釈液とから成る試料であり、
    検体１μｇあたりの検体希釈液量が、１〜１００μｇである、サンドイッチ法で用いるための試料。
  13. 検体が生体由来物質であり、検体に含まれる検出対象物質として糖タンパク質を含む、請求項１２に記載の試料。
  14. 請求項１２または１３に記載の試料を用いて、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、または、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行われる、サンドイッチ法。
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