JP6926907B2 - 測定用抗体分散液、その製造方法、測定用抗体分散液調製用キット、および生体物質測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定用抗体分散液、その製造方法、測定用抗体分散液調製用キット、および生体物質測定方法に関する。

ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質、その他の抗原を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、微量の目的生体物質（抗原）を特異的に検出する方法として免疫測定法が用いられている。免疫測定法として、抗原を補足するための抗体、および標識するための抗体を用いるサンドイッチ型アッセイや、放射性物質による標識を用いるラジオイムノアッセイなどが広く実施されている。

免疫測定法の一つである、サンドイッチ型アッセイについては、微量の目的生体物質（抗原）の検出を可能とした様々な検出法が知られている。このような検体検出法の一つとして、表面プラズモン共鳴現象を応用し、高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が挙げられる。

表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属薄膜表面で減衰全反射（ＡＴＲ；ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（粗密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得ている。

そして、この電場増強効果により、金属薄膜の表面近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出する方法である。

表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて、生体試料に含まれる極微量の抗原を定量するためには、抗原と蛍光標識抗体とを効率よく正確に反応させる必要がある。

そして、抗原の標識の際に用いられる抗体分散液に、界面活性剤を添加することが知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開平４−４８２６６号公報

本発明者らが鋭意検討を行ったところ、測定時に、蛍光標識抗体の凝集・分散や、折りたたみ構造を制御することで、抗原抗体反応の効率や反応性を高められ、定量の精度が上がることがわかった。しかし、蛍光標識抗体が安定に保存されている抗体分散液を用いると、蛍光標識抗体の凝集が起こり、抗原抗体反応の効率が低下してしまうことや、蛍光標識抗体同士の距離が近いことで蛍光の量子収率が低下して発光強度が低下し、定量の精度が下がることを見出した。

また、本発明者らは、界面活性剤を用いて測定時に抗体を好適に分散させることを検討したが、界面活性剤を用いる方法は、抗体の分散に時間がかかってしまうため、例えば、医療分野での救急用途など、測定を迅速に行いたい場面では使用できないという問題があった。

本発明は、このような現状に鑑み、測定に用いた際に抗体が好適に分散している測定用抗体分散液、その製造方法、測定用抗体分散液調製用キット、および生体物質測定方法を提供することを課題とする。

すなわち、本発明は、例えば下記［１］〜［１７］に示される測定用抗体分散液、その製造方法、測定用抗体分散液調製用キット、および生体物質測定方法を提供する。
［１］一価の金属塩および二価の金属塩を含み、
一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液。
［２］蛍光標識抗体を含む、［１］に記載の測定用抗体分散液。
［３］一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩を加えることにより得られる、［１］または［２］に記載の測定用抗体分散液。
［４］一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩および一価の金属塩を加えることにより得られる、［１］または［２］に記載の測定用抗体分散液。
［５］前記測定用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と、二価の金属塩の濃度の合計が、保存用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と二価の金属塩の濃度の合計よりも０．５〜２５０ｍＭ高い、［１］〜［４］のいずれかに記載の測定用抗体分散液。
［６］蛍光標識抗体を含み、測定用抗体分散液に含まれる蛍光標識抗体の濃度を、Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］とし、蛍光標識抗体を構成する蛍光物質単体の分散液（濃度Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］）の発光強度を１００％とした際に、測定用抗体分散液の発光強度が６０〜９９％である、［１］〜［５］のいずれかに記載の測定用抗体分散液。
［７］前記二価の金属塩が、マグネシウム塩およびカルシウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、［１］〜［６］のいずれかに記載の測定用抗体分散液。
［８］前記一価の金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、［１］〜［７］のいずれかに記載の測定用抗体分散液。
［９］一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩を加える工程を有する、
一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液の製造方法。
［１０］前記保存用抗体分散液が、蛍光標識抗体を含む、［９］に記載の測定用抗体分散液の製造方法。
［１１］前記二価の金属塩を加える工程が、
二価の金属塩および一価の金属塩を加える工程である、［９］または［１０］に記載の測定用抗体分散液の製造方法。
［１２］前記二価の金属塩を加える工程の後に、
一価の金属塩を加える工程を有する、［９］〜［１１］のいずれかに記載の測定用抗体分散液の製造方法。
［１３］前記二価の金属塩が、マグネシウム塩およびカルシウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、［９］〜［１２］のいずれかに記載の測定用抗体分散液の製造方法。
［１４］前記一価の金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、［９］〜［１３］のいずれかに記載の測定用抗体分散液の製造方法。
［１５］一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液と、二価の金属塩を含む溶液とからなり、
前記保存用抗体分散液に含まれる抗体が、蛍光標識抗体である、測定用抗体分散液調製用キット。
［１６］以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、目的生体物質を定量するための生体物質測定方法。
（Ａ） 蛍光標識抗体および一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩を加えて、一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液を得る工程
（Ｂ） 目的生体物質を含む検体をセンサーチップ上に供給する工程
（Ｃ） 工程（Ｂ）が行われたセンサーチップ上に、工程（Ａ）で得られた測定用抗体分散液を供給し、目的生体物質を含む検体を蛍光標識する工程
（Ｄ） 蛍光測定を行い、蛍光標識された目的生体物質を含む検体を検出する工程
［１７］前記蛍光測定を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）で行う、［１６］に記載の生体物質測定方法。

本発明によれば、測定に用いる際に抗体が好適に分散している測定用抗体分散液、その製造方法、測定用抗体分散液調製用キット、および生体物質測定方法を提供することができる。

次に本発明について具体的に説明する。
≪測定用抗体分散液≫
本発明の測定用抗体分散液は、一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液である。

例えば生体試料を検体として、極微量のアナライトを検出する際に、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）のような蛍光測定方法を行うことがあるが、アナライトを検出する際に、抗体分散液中の抗体を用いて標識が行われることがある。このような標識に用いられる抗体分散液を、本発明では測定用抗体分散液と記す。

本発明者らは、抗体分散液は、流通時、保存時等と、使用時とでは、好ましい金属塩の濃度が異なることを見出した。
本発明では、流通、保存等される抗体分散液を保存用抗体分散液と記し、測定に使用される抗体分散液を測定用抗体分散液と記す。

一価の金属塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属の塩が挙げられ、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩が好ましい。一価の金属塩は、塩化物、フッ化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩であることが好ましい。一価の金属塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムが、測定対象となり得る血液等に含まれる成分であるためより好ましい。一価の金属塩としては、一種単独で用いても、二種以上を用いてもよい。

一価の金属塩の濃度は、浸透圧、およびタンパク質の凝集性の観点から５０〜５００ｍＭの範囲であり、好ましくは、５０〜３００ｍＭの範囲である。
二価の金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属の塩、アルミニウム塩等が挙げられ、マグネシウム塩およびカルシウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩が好ましい。二価の金属塩は、塩化物、フッ化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩であることが好ましい。二価の金属塩としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウムが、浸透圧およびタンパク質の凝集性を制御しやすいためより好ましい。二価の金属塩としては、一種単独で用いても、二種以上を用いてもよい。

二価の金属塩の濃度は、浸透圧およびタンパク質の凝集性の観点から１．０〜５０ｍＭの範囲であり、好ましくは、３．０〜４０ｍＭ、より好ましくは８．０〜３５ｍＭの範囲である。

本発明の測定用抗体分散液は、例えば後述の保存用抗体分散液に、二価の金属塩、あるいは二価の金属塩および一価の金属塩を添加することにより得ることができる。金属塩の添加は、保存用抗体分散液に直接金属塩を添加することより行ってもよく、金属塩を含む溶液を添加することにより行ってもよい。

なお、二価の金属塩を前記範囲で含む抗体分散液を長時間保管すると、抗体凝集等が起こり、抗体の状態が変化してしまう場合があることから、測定用抗体分散液を得てから６０分以内、好ましくは１０分以内に、後述する蛍光測定が行われるセンサーチップ内に添加する操作を行うことが好ましい。また、操作性の観点から、通常は、測定用抗体分散液を得てから１秒以上経過した後に、後述する蛍光測定で行われるセンサーチップ内に添加することが好ましい。

本発明の測定用抗体分散液に含まれる抗体としては、蛍光標識抗体が好ましい。抗体および蛍光標識抗体については、後述の保存用抗体分散液の項で詳述する。
測定用抗体分散液に含まれる抗体の濃度としては、０．０００５〜１ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましく、０．００３〜０．０１ｍｇ／ｍＬがより好ましい。抗体の濃度が低すぎると、抗原抗体反応の速度が遅くなり、シグナルの低下が起こることや、抗体の濃度が高すぎると、測定時に基盤への抗体の非特異吸着量が多くなり、ノイズ源となることから、上述の範囲が好適である。

〈保存用抗体分散液〉
保存用抗体分散液は、検出対象物質に対する抗体が分散されていればよく、さらに、界面活性剤等が含まれていてもよい。分散媒としては、通常は水が用いられる。保存用抗体分散液は、緩衝液であることが、ｐＨが安定する観点から好ましい。緩衝液である場合には、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液の中でも、体液とほぼ等張のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水が好ましい。

保存用抗体分散液に含まれる、検出対象物質に対する抗体は、検出対象物質を抗原とした抗原抗体反応が起きるものであればよく、特に制限されるものではないが、一般的な手法により作製できる抗体であることが好ましい。抗体は、測定の安定性（再現性）からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい。モノクロナール抗体としては、例えば、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体が挙げられる。

保存用抗体分散液に含まれる、検出対象物質に対する抗体の濃度としては、０．００１〜２ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましく、０．００６〜０．０２ｍｇ／ｍＬが蛍光シグナル量の確保、および、測定時の基板への抗体の非特異吸着を抑制できるためより好ましい。

また、抗体は、蛍光物質と結合した蛍光標識抗体であることが好ましい。
蛍光物質とは、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、蛍光は、燐光など各種の発光も含む。本発明で用いられる蛍光物質は、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光物質のいずれであってもよい。

一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルターを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光物質が好ましい。

このような蛍光物質としては、
・例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、
・ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、
・ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、
・クマリン・ファミリーの蛍光物質（インビトロジェン（株）製）、
・ローダミン・ファミリーの蛍光物質（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、
・シアニン・ファミリーの蛍光物質、
・インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光物質，オキサジン・ファミリーの蛍光物質、
・チアジン・ファミリーの蛍光物質，スクアライン・ファミリーの蛍光物質、
・キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光物質，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）
・ファミリーの蛍光物質（インビトロジェン（株）製）、
・ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光物質、
・ピレン・ファミリーの蛍光物質、
・トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光物質、
・Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）
などが挙げられる。

保存用抗体分散液に含まれる、界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｓｐａｎ ８０（ソルビタンモノオレアート）などの界面活性剤が挙げられる。保存用抗体分散液に含まれる界面活性剤の量としては、保存用抗体分散液１００質量％中に、界面活性剤を０．００００１〜１質量％含有することが好ましい。

また、保存用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の量は、通常は１０〜５００ｍＭであり、好ましくは３０〜２５０ｍＭである。
なお、保存用抗体分散液に含まれる二価の金属塩の量は、通常は０〜０．８ｍＭであり、好ましくは０〜０．６ｍＭである。

また、前記測定用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と、二価の金属塩の濃度の合計が、保存用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と二価の金属塩の濃度の合計よりも０．５〜２５０ｍＭ高いことが、抗原抗体反応時にも抗体の凝集を抑制し、蛍光体の発光強度を低下させないようにできるため好ましい。
保存用抗体分散液に含まれる一価の金属塩および二価の金属塩としては、前記測定用抗体分散液の項で例示したものが挙げられる。

〈金属塩を含む溶液〉
本発明に用いられる金属塩を含む溶液は、二価の金属塩を含む溶液であり、二価の金属塩および一価の金属塩を含む溶液であってもよい。保存用抗体分散液に金属塩を含む溶液を加えることにより、本発明の測定用抗体分散液を得ることができる。

金属塩を含む溶液には、金属塩以外に、水などの溶媒、界面活性剤等が含まれていることが好ましい。また、金属塩を含む溶液が、緩衝液であることが、ｐＨが安定する観点から好ましい。緩衝液である場合には、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液の中でも、体液とほぼ等張のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水が好ましい。

金属塩を含む溶液に含まれる二価の金属塩および一価の金属塩としては、上述の測定用抗体分散液の項で例示した二価の金属塩および一価の金属塩が挙げられる。
金属塩を含む溶液に含まれる二価の金属塩の濃度としては、１．０〜８０ｍＭであることが好ましく、１．０〜６５ｍＭであることがより好ましい。

発明者は、保存用抗体分散液に、抗体としてタンパク質などの高分子化合物が含まれている場合、保存用抗体分散液に、二価の金属塩を特定量混合すると、高分子化合物の溶解度が増し、「塩溶」と呼ばれる現象が起こっているのではないかと推察しており、さらに、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ（ホフマイスターシリーズ）による影響があるのではないかと考えている（ホフマイスターシリーズとは、沈殿誘起能力のイオン順列のことを指す。）。特に、一定濃度の二価の金属塩は、タンパク質などの高分子化合物の表面にある水和水に影響して、分子間の距離を適度に保ち、溶解安定性に影響しているのではないかと推察している。

金属塩を含む溶液に含まれる一価の金属塩は、保存用抗体分散液と金属塩を含む溶液とを混合して測定用抗体分散液を作成する際に、一価の金属塩の濃度が極端に薄まらないようにするために加えるもの、あるいは、一価の金属塩の濃度を調整するためのものである。金属塩を含む溶液中の、一価の金属塩の濃度としては、保存用抗体分散液の一価の金属塩濃度に合わせて、あるいは、測定用抗体分散液中の一価の金属塩の濃度を特定範囲にするために、適宜調整すればよく、特に制限は無いが、通常は１００〜６００ｍＭであり、好ましくは１５０〜５００ｍＭである。

金属塩を含む溶液に含まれる界面活性剤は、上記保存用抗体分散液に含まれる界面活性剤と同様のものが挙げられる。保存用抗体分散液に含まれる界面活性剤と、金属塩を含む溶液に含まれる界面活性剤とは、同一であっても、異なる物でもよい。

≪蛍光標識抗体の発光率≫
本発明の測定用抗体分散液が、蛍光標識抗体を含む場合には、優れた発光効率を有することが好ましい。
具体的には、測定用抗体分散液に含まれる蛍光標識抗体の濃度を、Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］とし、蛍光標識抗体を構成する蛍光物質単体の分散液（濃度Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］）の発光強度を１００％とした際に、測定用抗体分散液の発光強度が６０〜９９％であることが好ましい。なお、ここでいう蛍光標識抗体の濃度とは、蛍光標識抗体を構成する蛍光体の濃度である。

測定用抗体分散液と、蛍光標識抗体を構成する蛍光物質を、測定用抗体分散液中の蛍光標識抗体と同濃度で含む分散液を別途用意し、両者の発光強度を比較した際に、蛍光物質単体の分散液の発光強度を１００％とした際に、測定用抗体分散液の発光強度が前記範囲であることが好ましい。

測定用抗体分散液の発光強度は、下記式により算出することが可能であり、７０〜９９％であることがより好ましく、８０〜９９％であることがさらに好ましい。
（蛍光標識抗体の発光強度）／（蛍光物質単体の発光強度）×１００
なお、発光強度の測定方法は特に限定されるものではなく、一般的な蛍光光度計を用いて、適切な測定条件において測定すればよい。

≪測定用抗体分散液の製造方法≫
本発明の測定用抗体分散液の製造方法は、一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩を加える工程を有する、一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液の製造方法である。

保存用抗体分散液には、蛍光標識抗体が含まれることが好ましい。保存用抗体分散液および測定用抗体分散液の詳細は、前述の保存用抗体分散液の項および測定用抗体分散液の項で述べた通りである。

前記二価の金属塩を加える工程が、二価の金属塩および一価の金属塩を加える工程であることが好ましく、前記二価の金属塩を加える工程の後に、一価の金属塩を加える工程を有していてもよい。

本発明の製造方法において、二価の金属塩を加える工程は、保存用抗体分散液に直接金属塩を添加することより行ってもよく、金属塩を含む溶液を添加することにより行ってもよい。

また、一価の金属塩を加える工程は、二価の金属塩を加える工程が行われた保存用抗体分散液に、直接金属塩を添加することより行ってもよく、金属塩を含む溶液を添加することにより行ってもよい。一価の金属塩を加える工程に用いられる金属塩を含む溶液としては、例えば前述の金属塩を含む溶液の項で説明した金属塩を含む溶液から、二価の金属塩を除いた溶液が挙げられる。

≪測定用抗体分散液調製キット≫
本発明の測定用抗体分散液調製キットは、一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液と、二価の金属塩を含む溶液とからなり、前記保存用抗体分散液に含まれる抗体が、蛍光標識抗体である。

≪生体物質測定方法≫
本発明の生体物質測定方法は、目的生体物質を定量するために、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含めばよい。
（Ａ） 蛍光標識抗体および一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩を加えて、一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液を得る工程
（Ｂ） 目的生体物質を含む検体をセンサーチップ上に供給する工程
（Ｃ） 工程（Ｂ）が行われたセンサーチップ上に、工程（Ａ）で得られた測定用抗体分散液を供給し、目的生体物質を含む検体を蛍光標識する工程
（Ｄ） 蛍光測定を行い、蛍光標識された目的生体物質を含む検体を検出する工程

本発明の生体物質測定方法による定量では、例えば、市販の生体試料（血液等）に測定対象化合物の標準品を添加して上記の工程を実施して検量線を作成し、測定する生体試料から得られるシグナル強度をあてはめて、測定する生体試料中の測定対象化合物の濃度を知ることができる。

なお、抗体に二価の金属塩を添加した状態で長時間保管すると、抗体凝集等が起こり、抗体の状態が変化してしまうことから、工程（Ａ）の後、６０分以内、好ましくは１０分以内に、工程（Ｃ）を実施することが好ましい。

本発明の生体物質測定方法は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）のような蛍光測定方法を行う際に適用することができる。

≪検体≫
本発明の測定用抗体分散液を用いて分析される検体について、以下詳細に説明する。
検体は、検出対象物質および夾雑物を含む可能性のある検体を用いる。検出対象物質および夾雑物を含む可能性のある検体は、現実にそれらを含む検体であってもよいし、現実にはそれらを含まない検体であってもよい。具体的には、例えば、検出対象物質を含む可能性の高い特定の疾患の患者に由来する検体であってもよいし、検出対象物質を含む可能性の低い健常者に由来する検体であってもよい。また、検体を採取する対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物、たとえばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルといったヒト以外の哺乳動物であってもよい。

検体としては、例えば、血液、尿、髄液、唾液、細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの調製物（例えば、生検標本）等の生体試料および生体由来試料を挙げることができる。たとえば血液や尿は、診断マーカーとして利用できる糖タンパク質を含む可能性がある検体であるため、本発明に用いる検体として好ましい。

血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液などの液性の検体は、そのまま検体として使用してもよく、適当な検体希釈用液により希釈したものを検体として使用してもよい。また、細胞、組織、または器官などの固形の検体は、固形の検体の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液またはその上清を、そのまま、またはさらに検体希釈用液で希釈したうえで、検体として使用することができる。

実施形態の好適な一例では、血液を検体とする。ここで血液は、全血であってもよいし、全血から調製された血清または血漿であってもよい。たとえば、測定を迅速に行うことを目的とする場合は全血を検体として用いてもよいし、正確な定量を目的とする場合は、全血から遠心分離等により血球成分を除去し、血清、あるいは血漿を調製してから検体として用いてもよい。また、採血時には通常全血に抗凝固剤が添加され、全血、血清および血漿には、後述する表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）等を利用した測定に供する際には適切な濃度に調整するために検体希釈用液で希釈され、さらに必要な試薬等が添加される。本発明書では、必要に応じてそのような抗凝固剤、その他の試薬等が添加されていてもよい。

〈検体希釈用液〉
検体希釈用液の主成分として、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）を用いることができる。

本発明に係る検体希釈用液は、例えば、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を含むことが望ましい。検体中の夾雑物がリガンドなどに非特異吸着することを抑制し、抗原の定量精度を向上させることができるためである。

本発明に係る検体希釈用液は、界面活性剤を含有することが望ましい。界面活性剤を含有することによって、例えば夾雑物が脂質の場合に界面活性剤が作用してミセルを形成等することから、検体中の夾雑物の凝集を抑制することができるためである。

この場合、界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、ＣＭＤと同じ帯電状態にしてクーロン斥力を利用する観点から、アニオン性界面活性剤が好ましく、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、モノアルキル硫酸塩、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩などが使用可能である。

この場合、界面活性剤は、検体希釈用液１００質量％中に、０．００００１〜１質量％含有されていることが望ましい。また、希釈後の検体中の界面活性剤濃度が０．０００００５〜０．５質量％であることが好ましい。Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ １００などの界面活性剤を用いる場合には、検体希釈液１００質量％中に、界面活性剤を０．００００１〜１質量％含有するものが好ましい。

次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
≪センサーチップの作成≫
屈折率（ｎｄ）１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の誘電体部（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ １０」）をプラズマ洗浄し、この支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した。

その後、その表面にさらに金薄膜を形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。このようにして得られた基板を、１ｍＭに調製した１０−アミノ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。この基板を、エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１ｍＭとを含むｐＨ７．４の２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝生理食塩水（ＭＥＳ）（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。

次に、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＦ４；２．５μｇ／ｍＬ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに１次抗体を固相化した。

≪検体の調製≫
標準抗原である心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に検体希釈液を加えて検体を調製した。
検体希釈液による希釈後のｃＴｎＩの濃度が１００ｐｇ／ｍＬとなるよう、ｃＴｎＩと検体希釈液とを混合し、検体を得た。
検体希釈液は、１０×トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン製）を１０ｍＬ、カルボキシメチルデキストランナトリウム（重量平均分子量１００００、東京化成工業株式会社製）を０．１ｍｇ、および界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を混合した。界面活性剤は、検体希釈液中に０．０５質量％となる量を使用した。

≪蛍光標識抗体分散液の調製≫
蛍光標識抗体分散液を調製した。
抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（４Ｃ２；２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）の溶液とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）標識キットを用い、キット使用方法の手順に従い、室温（２５℃）で６０分間、攪拌混合することで反応させた。その後、分子量カットフィルター（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を得た。

［実施例１〜７、比較例１］
≪保存用抗体分散液の調製≫
上記のように調製した蛍光標識抗体分散液の吸光度を測定し、抗体濃度を得た。得られた抗体濃度をもとに、最終的な抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を検体希釈液で調整した。

実施例１〜７、比較例１については、上記の１ｍｇ／ｍＬの蛍光標識抗体分散液を２００μＬ、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳの１０倍濃度のストックソリューション）（株式会社ニッポンジーン製）を１ｍＬ、アルブミン（ウシ血清由来 ＩｇＧ／プロテアーゼ不含）（和光純薬工業株式会社製）を８００ｍｇ、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を５ｍｇに超純水を加え、１０ｍＬになるようにメスアップし、保存用抗体分散液を得た。
保存用抗体分散液の金属塩の濃度を表１に示す。なお、ＮａＣｌおよびＫＣｌについては、ＰＢＳ由来の濃度である。

≪洗浄液の調製≫
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を０．０５質量％溶解させ、洗浄液を得た。

≪測定用抗体分散液の調製≫
上記の保存用抗体分散液５０μＬと、下記金属塩を含む溶液５０μＬを混合して、測定用抗体分散液を得た。なお、測定用抗体分散液は、センサーチップ内に添加する５分前に調製した。

金属塩を含む溶液は、実施例および比較例ごとに、表２に記載の濃度になるよう、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）に超純水を加え、１０ｍＬにメスアップしたものを使用した。
前記溶液に含まれる金属塩の濃度を表２に示す。

得られた測定用抗体分散液の金属塩の濃度を表３に示す。

≪抗原の定量≫
上述のようにして得られた測定用抗体分散液をセンサーチップに送液してそれぞれに蛍光測定を行った。

〈蛍光測定〉
センサーチップの流路に、試料溶液（検体）０．１ｍＬを２５分間循環送液し、その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を１０分間循環送液して洗浄した。

次に、測定用抗体分散液０．１ｍＬを５分間循環送液し、その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを１０分間循環送液して洗浄した。その後、プラズモン励起センサーに、ガラス製の誘電体部材の、金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザー光（６４０ｎｍ，４０μＷ）を照射し、励起された蛍光物質から発光された蛍光量を光電子増倍管（ＰＭＴ）で検出した光量（シグナル値）を計測し、抗原を含む試料溶液のシグナル値（Ｓ）とした。
標準抗原である心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含まない試料溶液について、同様に計測し、バックグラウンド値（Ｂ）を測定した。

〈抗原の定量性評価〉
上記で得られたシグナル値（Ｓ）とバックグラウンド値（Ｂ）から、Ｓ／Ｂ比を算出した。比較例１のＳ／Ｂ値を基準とし、実施例１〜７の抗原定量性を評価した。結果を、下記表４に示す。

≪蛍光標識抗体の発光率の測定≫
上述のようにして得られた測定用抗体分散液の発光強度を蛍光光度計（ｎａｎｏｄｒｏｐ３０００、サーモフィッシャー社製）にて測定した。同様に、以下の方法で調製した蛍光体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の分散液の発光強度を測定し、蛍光標識抗体の発光率を、式（Ｉ）のように算出した。
（測定用抗体分散液の発光強度）／（蛍光体の発光強度）×１００・・・式（Ｉ）

なお、抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体の分子量（Ｍｗ）は約１５０００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の分子量（Ｍｗ）は約１２００であり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体は、抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体一つあたり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７が二つ存在する。このため、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ｃＴｎＩ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体の分子量（Ｍｗ）は約１７４００である。保存用抗体分散液中の蛍光標識抗体の量は、０．０２ｍｇ／ｍＬ、測定用抗体分散液中の蛍光標識抗体の量は、０．０１ｍｇ／ｍＬであるので、測定用抗体分散液中に含まれるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の濃度は、１．１４９μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）である。

前記Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の分散液は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の濃度が１．１４９μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）であり、ＮａＣｌの濃度が１５７ｍＭ、ＫＣｌの濃度が５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２の濃度０ｍＭとなるように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳの１０倍濃度のストックソリューション）（株式会社ニッポンジーン製）と、超純水とを混合することにより調製した。
蛍光標識抗体の発光率を表５に示す。

Claims (13)

1. 一価の金属塩および二価の金属塩を含み、
   一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭであり、蛍光標識抗体を含む、測定用抗体分散液。
2. 一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩および一価の金属塩を加えることにより得られる、請求項１に記載の測定用抗体分散液。
3. 前記測定用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と、二価の金属塩の濃度の合計が、保存用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度と二価の金属塩の濃度の合計よりも０．５〜２５０ｍＭ高い、請求項２に記載の測定用抗体分散液。
4. 蛍光標識抗体を含み、測定用抗体分散液に含まれる蛍光標識抗体の濃度を、Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］とし、蛍光標識抗体を構成する蛍光物質単体の分散液（濃度Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］）の発光強度を１００％とした際に、測定用抗体分散液の発光強度が６０〜９９％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定用抗体分散液。
5. 前記二価の金属塩が、マグネシウム塩およびカルシウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定用抗体分散液。
6. 前記一価の金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定用抗体分散液。
7. 一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭであり、蛍光標識抗体を含む保存用抗体分散液に、二価の金属塩および一価の金属塩を加える工程を有する、
   一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭであり、蛍光標識抗体を含む、測定用抗体分散液の製造方法。
8. 前記二価の金属塩および一価の金属塩を加える工程が、
   二価の金属塩を加えた後に、一価の金属塩を加える工程である、請求項７に記載の測定用抗体分散液の製造方法。
9. 前記二価の金属塩が、マグネシウム塩およびカルシウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、請求項７または８に記載の測定用抗体分散液の製造方法。
10. 前記一価の金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩から選択される少なくとも一種の金属塩である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の測定用抗体分散液の製造方法。
11. 一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液と、二価の金属塩および一価の金属塩を含む溶液とからなる、測定用抗体分散液を調製するためのキットであって、
    前記保存用抗体分散液に含まれる抗体が、蛍光標識抗体であり、
    前記測定用抗体分散液に含まれる一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである、測定用抗体分散液調製用キット。
12. 以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、目的生体物質を定量するための生体物質測定方法。
    （Ａ） 蛍光標識抗体および一価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が１０〜３００ｍＭである保存用抗体分散液に、二価の金属塩および一価の金属塩を加えて、一価の金属塩および二価の金属塩を含み、一価の金属塩の濃度が５０〜５００ｍＭであり、二価の金属塩の濃度が１．０〜５０ｍＭである測定用抗体分散液を得る工程
    （Ｂ） 目的生体物質を含む検体をセンサーチップ上に供給する工程
    （Ｃ） 工程（Ｂ）が行われたセンサーチップ上に、工程（Ａ）で得られた測定用抗体分散液を供給し、目的生体物質を含む検体を蛍光標識する工程
    （Ｄ） 蛍光測定を行い、蛍光標識された目的生体物質を含む検体を検出する工程
13. 前記蛍光測定を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）で行う、請求項１２に記載の生体物質測定方法。