JPH06167493A - 免疫測定方法 - Google Patents

免疫測定方法

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JPH06167493A
JPH06167493A JP43A JP31979992A JPH06167493A JP H06167493 A JPH06167493 A JP H06167493A JP 43 A JP43 A JP 43A JP 31979992 A JP31979992 A JP 31979992A JP H06167493 A JPH06167493 A JP H06167493A
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JP
Japan
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antigen
antibody
maltotriose
measured
polymer
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JP43A
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English (en)
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Eri Nakagawa
絵里 中川
Hiroaki Kono
弘明 河野
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Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co Ltd
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Kyowa Medex Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 非特異的凝集が生じないマルトトリオース重
合体を凝集促進剤として、用いることにより、検出感度
が高く簡便な免疫凝集測定法を提供する。 【構成】 試料中の被測定抗原または被測定抗体と該被
測定抗原に対する抗体または該被測定抗体に対する抗原
とを、マルトトリオース重合体の存在下に反応させ、反
応における抗原−抗体の凝集変化を測定することを特徴
とする抗原または抗体の免疫凝集定量法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査試薬等で多用
されている免疫凝集測定法に関する。
【0002】
【従来の技術】免疫学的測定法のひとつである免疫比濁
法は、抗原−抗体反応により抗原と抗体が結合して免疫
複合体を形成したときの濁りの変化を光学的に検出・測
定する方法である。免疫比濁法において凝集促進剤を加
えるとさらに短時間で高感度かつ広範囲な測定が可能な
ことから、凝集促進剤としてポリエチレングリコール
〔日本臨床検査自動化学会会誌、16巻、675頁、1
990年〕やポリビニルピロリドン等の合成高分子物
質、デキストラン〔特開昭59−220646号公
報〕、デキストラン硫酸〔特開平2−61561号公
報〕等の多糖類を用いることが知られているが、凝集促
進剤としてマルトトリオース重合体を用いる方法は知ら
れていない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】公知の凝集促進剤は非
特異的な凝集を引き起こし、誤った測定値を与えること
がある。そのため該凝集促進剤を用いる際には、試薬あ
るいは検体を加えない系でのブランク値を別に求め、測
定値からブランク値を引いた補正により定量値を求めて
おり、操作が簡便ではなく、必ずしも補正が充分でない
場合もある。
【0004】本発明の目的は、マルトトリオース重合体
を凝集促進剤として用いた非特異性凝集の無い簡便な免
疫凝集測定法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の被測
定抗原または被測定抗体と該被測定抗原に対する抗体ま
たは該被測定抗体に対する抗原とを、マルトトリオース
重合体の存在下に反応させ、反応における抗原−抗体の
凝集変化を測定することを特徴とする抗原または抗体の
免疫凝集定量法に関する。
【0006】本発明における免疫凝集定量法とは、抗原
−抗体反応によって抗原分子と抗体分子が結合して大き
な免疫複合体を形成し、その複合体を定量するような方
法であればどのようなものでもよいが、ラテックス凝集
比濁法、赤血球凝集法等の免疫比濁法、レーザーネフェ
ロメトリー法等があげられる。
【0007】本発明における被測定抗原または被測定抗
体としては、がん胎児性抗原(CEA)、免疫グロブリ
ン(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、補体
(C3、C4、C5、C1q)、C反応性蛋白(CR
P)、α1 −アンチトリプシン、α1 −マイクログロブ
リン、β2 −マイクログロブリン、ハプトグロブリン、
トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、ア
ルブミン、ヘモグロビンA1 、ヘモグロビンA1C、ミオ
グロブリン、ミオシン、デュパン−2、α−フェトプロ
テイン(AFP)、組織ポリペプチド抗原(TPA)、
アポリポ蛋白A 1 、アポリポ蛋白E、リウマチ因子、抗
ストレプトリジンO(ASO)、フィブリン分解産物
(FDP)、フィブリン分解産物D分画(FDP−
D)、フィブリン分解産物D−D分画(FDP−D D
imer)、フィブリン分解産物E分画(FDP−
E)、アンチトロンビン−III (AT−III)等の蛋白
質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスファターゼ(PA
P)、神経特異エノラーゼ(NSE)、フィブリノーゲ
ン、エラスターゼ、フィブリノーゲン、プラスミノーゲ
ン、クレアチンキナーゼ心筋型(CK−MB)等の酵
素、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、3,
5,3 ´−トリヨードサイロニン(T3 )、サイロキシン
(T 4 )、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、生長ホ
ルモン(GH)、黄体化ホルモン(LH)等のホルモ
ン、B型肝炎ウイルス関連抗体、B型肝炎ウイルス関連
抗原、C型肝炎ウイルス抗体、HTLV(成人T細胞白
血病ウイルス)抗体、HIV(エイズウイルス)抗体、
クラミジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各
種感染症の原因ウイルスに対する抗体等があげられる。
【0008】また被測定抗原に対する抗体は、被測定抗
原に対するポリクローナル抗体、被測定抗原に対するモ
ノクローナル抗体等通常抗原に対して反応し得る抗体が
あげられる〔「単クーロン抗体実験マニュアル」,富山
朔二ら編、講談社サイエンティフィック刊,1987
年:新生化学実験講座 第12巻,「分子免疫学 III抗
原、抗体、補体」,日本生化学会編,東京化学同人社
刊,1992年〕。該抗体は複数の抗体からなるもので
もよく、抗体を限定分解したもの、蛋白修飾したもので
もよい。
【0009】また被測定抗体に対する抗原は、天然の抗
原の抗体結合部位でもよく、遺伝子操作等により人工的
に作成されたものでもよい。例えば、被測定抗体が各種
感染症の原因ウイルスに対する抗体である場合、被測定
抗体に対する抗原は上述の感染症のウイルスのマーカー
蛋白質等を用いることができる。該抗原は複数の抗原分
子からなるものでもよく、抗原分子を限定分解したも
の、蛋白修飾したものでもよい。
【0010】また本発明の定量法を、例えばラテックス
凝集法を用いて行う場合は、ラテックスと結合した被測
定抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原を用
いればよく、赤血球凝集法を用いて行う場合は、被測定
抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原を赤血
球の表面に吸着させて用いればよい。
【0011】本発明におけるマルトトリオース重合体と
は、マルトトリオースが10〜200個重合した分子量
500〜100,000、好ましくは分子量30,00
0〜60,000のものであればどのようなものでもよ
いが,例えば、プルリアリアプルランス(Pulluriaria
pullulans )の生産するプルラン(生化学辞典、第1
版、1097頁、1984年、東京化学同人刊)、プル
ランのプルラナーゼによる分解産物、デンプンのアミラ
ーゼによる分解産物、マルトトリオースの化学合成によ
る重合体等があげられる。また上記のマルトトリオース
重合体の糖鎖をウシ血清アルブミン(BSA)等で化学
修飾したものも用いられる。
【0012】本発明における抗原または抗体の免疫凝集
定量法は、一般的な抗原抗体反応の条件下で行われ、被
測定抗原と被測定抗原に対する抗体とを、または被測定
抗体と被測定抗体に対する抗原とを、中性、弱塩基性ま
たは弱酸性に調整したリン酸緩衝液、フタル酸緩衝液、
グッドバッファー、トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液の存
在下、マルトトリオース重合体を0.5〜10%好まし
くは1〜6%添加した状態で、4〜40℃で30秒〜7
2時間反応させる。
【0013】反応系には、ゼラチンやカゼインなどの蛋
白成分、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニル
エーテル等の界面活性剤、塩化ナトリウム、塩化カルシ
ウム等の塩類、マグネシウム等の金属イオン、アルブミ
ン等の安定化剤等を適宣添加することができる。これら
の添加物は被測定物を失活させることがなく、かつ抗原
抗体結合反応および免疫凝集反応を阻害しないものであ
ればいずれも利用できる。
【0014】反応後の物質の凝集変化の測定手段自体は
いずれも公知の手段が適用でき、反応開始後の凝集速度
の変化を濁度計、吸光光度計で測定する。
【0015】
【実施例】以下実施例によって、本発明を説明する。 実施例1 免疫比濁法によるヒト血清アルブミンの測定 透明な合成樹脂を反応容器とする多項目選択機能を持つ
シングルマルチ方式の生化学用自動分析機(日立705
0自動分析機、日立工機(株)製)を用いて、標準液中
あるいは尿中の血清由来蛋白質であるアルブミン濃度を
測定した。この自動分析機の反応容器は多数のセルがお
のおの独立して円盤状に集まっており、この円盤状反応
容器が間欠的に回転し、各セルは一つずつポイントを通
過しながら最初の位置にもどってくる間に、1回の測定
操作および洗浄操作が終了する仕組みである。
【0016】第一のポイントでサンプラーからヒト尿の
検体10μlをセルに添加した。このセルを第二のポイ
ントに移送した。ここで分子量40,000のマルトト
リオース重合体(50mg/ml:林原商事)〔対照は
無添加〕、塩化ナトリウム100mM、ポリオキシエチ
レン(10)オクチルフェニルエーテル0.1%および
アジ化ナトリウム1mg/mlを含む20mMグッドの
緩衝液(pH7.2)350μlを第一試薬として添加
し、第三のポイントに移送されるまでの5分間37℃で
予備反応させた。第三のポイントで抗ヒト血清アルブミ
ン−ウサギIgG(ダコ製)6.5mg/ml、塩化ナ
トリウム100mM、ポリオキシエチレン(10)オク
チルフェニルエーテル0.1%およびアジ化ナトリウム
0.1mg/mlを含む20mMグッドの緩衝液(pH
7.2)50μlを第二試薬として添加し第四のポイン
トに移送される5分間、37℃で本反応させた。第四ポ
イントで反応を終了させた。予備反応時間、本反応時間
計10分間に約20秒間隔で32回(32ポイント)に
わたり溶液の濁度を吸光光度法(340nm、700n
m)で測定し、吸光度の変化を記録した。予備反応にお
ける吸光度変化および第2試薬添加後の抗原−抗体反応
(本反応)による吸光度変化の結果を第1表に示した。
【0017】
【表1】
【0018】第1表によれば、マルトトリオース重合体
添加により対照より吸光度が増加し、濁度の増加が記録
された。
【0019】実施例2 補体C3の測定 a,酵素処理マルトトリオース重合体の作製 13gの平均分子量200,000のマルトトリオース
重合体(林原商事)を20mMグッド緩衝液(pH6.
0)に溶解した。この溶液を4℃に冷却した後、1mg
/mlのプルラナーゼ(生化学工業製)を含む20mM
グッド緩衝液(pH6.0)を500μl加えて攪拌
反応させた。一定時間毎に反応液の一部を高速液体クロ
マトグラフィー(カラム:東ソー社製TSK−G600
0PWXL、ポンプ:島津製作所製LC−10AD、検
出器:島津製作所製示差屈折計検出器RID−6A、分
子量マーカー:東ソー社製)に付し、反応途中のマルト
トリオース重合体の分子量をモニターした。平均分子量
が40,000になった時点で反応液に6Nの水酸化ナ
トリウムを加えてpH11.5に調整し、反応を停止さ
せ、平均分子量が40,000のマルトトリオース重合
体を得た。 b,免疫比濁法による補体C3 の測定 実施例1で用いたマルトトリオース重合体または上記a
により得た酵素処理マルトトリオース重合体を第1試薬
に用い、抗ヒト血清アルブミン−ウサギIgGの代わり
に同量の抗ヒト補体C3−ウサギ血清(オリエンタル酵
母製)を第2試薬に用い、ヒト尿の代わりにヒト補体C
3(10mg/ml、300mg/ml:オリエンタル
酵母製)またはヒト血清3μlを検体として用いる以外
は実施例1と同様の方法により予備反応における吸光度
変化および第2試薬添加後の抗原−抗体反応による吸光
度変化を測定した。またこのとき比較例としてマルトト
リオース重合体の代わりにポリオキシエチレングリコー
ル6000(和光純薬製)を50mg/ml第一試薬に
添加し同様の方法で予備反応および抗原−抗体反応によ
る吸光度変化を測定した。結果を第2表に示した。
【0020】
【表2】
【0021】第2表によれば、マルトトリオース重合体
および酵素処理マルトトリオース重合体はほぼ同様の値
で対照より凝集を促進した。またPEG6000がブラ
ンクで凝集を起こし、ヒト血清を試料に用いたときに予
備反応で強い非特異的凝集を起こしたのに対し、マルト
トリオース重合体および酵素処理マルトトリオース重合
体は、どのような状態でも非特異的凝集を生じさせなか
った。
【0022】実施例3 アポリポ蛋白A1の測定 a,マルトトリオース重合体多量体の作成 モレキュラーシーブ4A(和光純薬製)10gを含む塩
化メチレン100mlに平均分子量5,000のマルト
トリオース重合体(林原商事)10gを加え、室温で一
昼夜攪拌反応させた。反応液を濾過してモレキュラーシ
ーブ4Aを取り除いた後、塩化メチレンを減圧にて除去
し、多量体を得た。 b,免疫比濁法によるアポリポ蛋白A1の測定 酵素処理マルトトリオース重合体の代わりに上記aによ
り得たマルトトリオース重合体多量体を第1試薬に用
い、抗ヒト補体C3−ウサギ血清の代わりに同量の抗ヒ
トアポリポ蛋白A1−ヤギ抗血清(オリエンタル酵母
製)を用い、検体としてヒト補体C3の代わりにヒトア
ポリポ蛋白A1(10mg/ml、400mg/ml:
オリエンタル酵母製)を用いる以外は実施例2bと同様
の方法により予備反応における吸光度変化および第2試
薬添加後の抗原−抗体反応による吸光度変化を測定し
た。結果を第3表に示した。
【0023】
【表3】
【0024】第3表によれば、マルトトリオース重合体
多量体も、PEG6000にみられた非特異的凝集が無
く対照にくらべ凝集を促進した。
【0025】実施例4 C反応性蛋白(CRP)の測定 a,マルトトリオース重合体−BSA複合体の作製 平均分子量10,000のマルトトリオース重合体(林
原商事)4gを10mlの蒸留水に溶解し、2mlの
0.1Mメタ過よう素酸ナトリウム溶液を加え、20分
間室温で攪拌した。次に、反応溶液を透析チューブに移
し、1mMの酢酸緩衝液(pH4.5)1リットルで透
析を3回繰り返し、透析終了後0.2Mの炭酸緩衝液
(pH10.0)を加えてpHを9.5に調製した。こ
の溶液に予め0.01Mの炭酸緩衝液(pH9.5)に
溶解した80mg/mlのBSA(シグマ社製)10m
lを加え、室温で2時間反応させた。反応後、溶液を氷
中で冷却しながら1mlの4mg/mlのナトリウムボ
ロハイドライド溶液を加えて2時間反応させた。反応溶
液を透析チューブに移し、1リットルの蒸留水で透析を
3回繰り返しマルトトリオース重合体−BSA複合体を
得た。 b,免疫比濁法によるCRPの測定 マルトトリオース重合体多量体の代わりに上記aで得た
マルトトリオース重合体−BSA複合体を第1試薬に用
い、抗ヒトアポリポプロテインA1−ヤギ抗血清の代わ
りに抗ヒトCRP−ウサギIgG(ダコ製)を用い、検
体としてヒトアポリポプロテインA1の代わりにCRP
(1μg/ml、15μg/ml:オリエンタル酵母
製)を用いる以外は実施例3bと同様の方法により予備
反応における吸光度変化および第2試薬添加後の抗原−
抗体反応による吸光度変化を測定した。結果を第4表に
示した。
【0026】
【表4】
【0027】第4表によれば、マルトトリオース重合体
−BSA複合体も、PEG6000にみられた非特異的
凝集が無く対照にくらべ凝集を促進した。
【0028】実施例5 ヒトアルブミンを20mMグッドの緩衝液(pH7.
2)で希釈し各2.45,4.90,7.35,9.80,12.25,14.70,17.1
5,19.60,100,200,300,400,1000,2000,4000μg/ml濃
度の溶液を作成した。各アルブミン希釈液を分子量4万
のマルトトリオース重合体の存在下または非存在下(対
照)に実施例1と同様の方法で予備反応における吸光度
変化および第2試薬添加後の抗原−抗体反応による吸光
度変化を測定し検量線を作成した。結果を図1および図
2に示した。
【0029】図1および図2によれば、マルトトリオー
ス重合体の添加により5μg/ml以下の低濃度のアル
ブミンおよび400〜1000μg/mlの高濃度のア
ルブミンの検出が可能になった。
【0030】
【発明の効果】本発明により、検出感度が高く広範囲な
濃度領域で精度の良い定量が可能な簡便な免疫凝集測定
法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 アルブミン低濃度域における検量線
【符号の説明】
−●− マルトトリオース重合体添加 −○− 対照
【図2】 アルブミン高濃度域における検量線
【符号の説明】
−●− マルトトリオース重合体添加 −○− 対照

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料中の被測定抗原または被測定抗体と
    該被測定抗原に対する抗体または該被測定抗体に対する
    抗原とを、マルトトリオース重合体の存在下に反応さ
    せ、反応における抗原−抗体の凝集変化を測定すること
    を特徴とする抗原または抗体の免疫凝集定量法。
JP43A 1992-11-30 1992-11-30 免疫測定方法 Withdrawn JPH06167493A (ja)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2002340896A (ja) * 2001-05-22 2002-11-27 Sekisui Chem Co Ltd 免疫測定試薬
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