JP3481015B2 - 免疫比濁測定法 - Google Patents
免疫比濁測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応の妨
害物質であるリウマチ因子の影響を回避することができ
る免疫比濁測定法に関する。 【０００２】 【従来の技術】免疫測定法は、尿、血清、組織片等のヒ
トから採取した生体成分を検体として分析、同定し、そ
の中の微量成分を検出することにより、疾病等の生体の
異常を診断する臨床検査法の一つとして広く用いられて
おり、抗原抗体反応の反応特異性、結合強度等を利用す
る方法である。 【０００３】免疫測定法の一つである免疫比濁測定法
は、抗原又は抗体を含有する検体と、該抗原又は抗体に
対する抗体又は抗原とを混合して抗原抗体反応せしめ、
生成した免疫凝集物の量を、得られた反応液の濁度を測
定することにより求め、その測定値から該抗原又は抗体
を測定する方法であり、従来より臨床検査や実験室での
免疫学的研究に用いられてきた。 【０００４】しかし、免疫測定法の測定対象となる検体
中には、ヒトの個体特性、採取条件等により、生体成分
であるリウマチ因子（以下「ＲＦ」という）等が混在し
ており、これらが抗原抗体反応を妨害して測定値に異常
をきたすので、これら妨害物質の影響を解消、軽減する
種々の手法が検討されている。 【０００５】生体成分を検体とする免疫測定法では、抗
原抗体反応を起こす条件を生体内の状態に近づける目的
で、試薬系のｐＨを６．０〜８．０の中性付近に調整す
ることが通例であった。しかし、こうした条件下では、
稀に検体中のＲＦが、試薬系に含まれる抗原又は抗体と
反応し、自己凝集を引き起こすことがあった。 【０００６】ＲＦは、自己抗体であり、変性ヒト抗体分
子のＦｃ部分に対して反応することが知られているが、
ヒト検体中のＲＦの濃度や純度等が特定の条件になると
（ヒトとは異なる種類の動物から得られた）異種抗体分
子に対して反応する場合があり、これが一般に異種抗体
である動物抗体を試薬の構成成分とする臨床検査におい
て抗原抗体の特異的反応を妨害する。こうしたＲＦによ
る測定の妨害を回避するため、検定の前に血清中の内因
性のＲＦを不活性化するか、又は、除去する等の前処理
が通常必要で、この前処理をしなければ測定の結果は著
しい誤差を生じる場合がある。 【０００７】特開昭５４−１１９２９２号公報には、こ
の妨害反応を回避する目的で、異種抗体分子のＦｃ部分
を酵素反応で取り除いたＦ（ａｂ′）2 分子を、抗体と
して用いる免疫測定法が開示されている。しかしなが
ら、このような免疫測定法は、酵素反応、精製等の原料
調製のための煩雑な工程が加わるため、コストアップ、
製造ロット間差につながる場合があった。 【０００８】上述のように、従来の免疫測定法では、検
体の前処理は検査の煩雑さ、遅延化につながり、Ｆ（ａ
ｂ′）2 分子を用いた試薬にあっては試薬製造工程を繁
雑にし、製造ロット間差を引き起こす等の問題があっ
た。そこで、これら問題を回避するため、検体の前処理
を必要とせず、抗体分子を酵素処理しない試薬を用い
て、採取した生体成分を測定する方法の確立が望まれて
いた。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、リウマチ因子と異種抗体分子との相互作用を軽減
し、リウマチ因子の測定への影響を回避することができ
る免疫比濁測定法を提供することを目的とする。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、抗原又
は抗体を含有する検体と、該抗原又は抗体に対するヤギ
由来の抗体とを混合して抗原抗体反応せしめ、得られた
反応液の濁度を測定することにより該検体中の抗原又は
抗体を測定する免疫比濁測定法において、検体がリウマ
チ因子を含有し得るものであり、かつ、反応液のｐＨ
を、４．０以上６．０未満に維持するところに存する。 【００１１】本発明で測定される抗原又は抗体として
は、特に限定されず、従来から免疫測定法で測定され得
る抗原又は抗体のいずれも測定可能である。上記抗原又
は抗体としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（以下、ＣＲＰ
とする。）、ヒトアルブミン、抗ストレプトリジンＯ抗
体等の高分子量蛋白質や、薬物、ペプチド等の低分子量
抗原性物質等が挙げられる。 【００１２】本発明で使用する抗体は、上記測定対象と
なる抗原又は抗体に対するヤギ由来の抗体である。 【００１３】抗原又は抗体を含有する検体と、該抗原又
は抗体に対するヤギ由来の抗体とを混合して抗原抗体反
応せしめる際の反応液のｐＨは、低くなると、抗原抗体
の変性や抗原抗体反応の抑制などがおこり、目的とする
反応性を得ることができず、ｐＨが高くなると、ＲＦが
抗原又は抗体の測定値に影響を与えて正確な測定ができ
なくなるので、４．０以上６．０未満に限定される。 【００１４】上記反応液は、検体とヤギ由来の抗体溶液
と、必要に応じて試薬の反応性やｐＨなどを調整する目
的で反応に添加される緩衝液とからなる。上記緩衝液と
しては、測定条件により適宜選択されるが、例えば、リ
ン酸緩衝液、リン酸−クエン酸緩衝液、酢酸−酢酸ナト
リウム緩衝液等が挙げられる。 【００１５】反応液に使用するヤギ由来の抗体溶液や緩
衝液には、保存安定性を向上させる目的で、牛血清アル
ブミン；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩；糖類等
の安定化剤等を添加することができる。 【００１６】また、上記抗原抗体反応を促進する目的
で、上記の緩衝液中に、ポリエチレングリコール、デキ
ストラン等の水溶性高分子を添加することも有効であ
る。 【００１７】上記反応における反応温度は、４〜５０℃
が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。 【００１８】本発明の免疫比濁測定法において、得られ
た反応液の濁度を測定するには、通常の光学的測定法を
適用でき、例えば、吸光度、散乱光強度、又は分子数の
いずれを測定してもよい。測定波長は、一般に３００〜
８００ｎｍを使用することができる。 【００１９】 【発明の実施の形態】以下に実施例を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。 【００２０】実施例１、２及び比較例１〜４ 日水製薬社製、ヒトＣＲＰ測定用試薬キット「オートＴ
ＩＡ ＣＲＰ ニッスイ」を使用して、その反応液のｐ
Ｈを変えた場合に、ヒトＣＲＰ測定値に与えるＲＦの影
響を調べた。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製 上記試薬キット中の抗血清液（ヤギ由来抗ヒトＣＲＰ抗
体を含有）をそのまま使用した。 【００２１】２）緩衝液の調製 上記抗血清液を用いて、ヒト血清検体中のヒトＣＲＰを
測定する場合、反応性や反応時のｐＨ等を調整する目的
で反応時に緩衝液を使用することがあり、上記キットに
は緩衝液が用意されている。本実施例及び比較例では、
上記キット中の緩衝液に１規定塩酸を添加することによ
り該緩衝液のｐＨを調整し、得られた緩衝液を反応時に
添加することにより反応液のｐＨが３．５（比較例
１）、４．５（実施例１）、５．５（実施例２）、６．
５（比較例２）、７．５（比較例３）、８．２（比較例
４、本キットの緩衝液に１規定塩酸を添加しなかった場
合）となるようにした。 【００２２】３）測定方法 測定には、日立７１５０形自動分析装置（日立製作所社
製）を用い、吸光度の測定波長は主波長３４０ｎｍ、副
波長７００ｎｍで行った。以下にその測定手順を示し
た。先ず、水ブランクの吸光度を測定し、次いで検体
（Ｓ）２０μｌと第１試薬〔上記２）で調製した緩衝液
をさす。以下、Ｒ１という。〕３５０μｌとを添加し、
Ｒ１添加後、測定終了までの１０分間の反応液の吸光度
を２０秒間隔で測定し、水ブランク値を差し引いた値を
吸光度として用いた。Ｒ１の添加５分後に、第２試薬
〔上記１）の抗血清液をさす。以下、Ｒ２という。〕５
０μｌを添加した。即ち、Ｒ１の添加から５分間以内の
吸光度測定は、ＳとＲ１を含む反応液について、一方、
Ｒ１の添加から５分後以降の吸光度測定は、ＳとＲ１と
Ｒ２とを含む反応液について行った。 【００２３】ここでは、０濃度標準品（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ １）に生理食塩水、ＣＲＰ標準品（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ ２）に４．５ｍｇ／ｄｌＣＲＰ標準血清（日水製薬
社製、オートＴＩＡ ＣＲＰIII ニッスイ ＣＲＰ標準
血清）を用いて出力の更正を行った。即ち、４．５ｍｇ
／ｄｌＣＲＰ標準血清による吸光度の上昇分を演算処理
により求め、これを４．５〔ｍｇ／ｄｌ〕と読み替え、
更正後に出力するデータ（打出し値）は、検体と標準血
清の吸光度上昇分の比から、濃度換算した値となる。例
えば、検体による吸光度上昇分が、標準血清の１／２で
あれば、出力データ（打出し値）は、４．５×１／２＝
２．２５〔ｍｇ／ｄｌ〕となる。 【００２４】４）ＲＦの影響確認試験 ＲＦの影響の有無の確認試験は、ＲＦの添加試験により
行った。即ち、既知濃度のＣＲＰ陽性血清（約０．５ｍ
ｇ／ｄｌ）にＲＦを添加し、ＣＲＰ測定値の変化の有無
を確認した。日常の臨床検査でＲＦ陽性検体が測定値に
影響を与えるケースは非常に稀であるが、高度に精製さ
れたＲＦ溶液を用いると、同じような現象を再現するこ
とができるため、今回の試験では、精製ＲＦとして干渉
チェックＲＦ（国際試薬社製）を使用した。精製水によ
り復元した干渉チェックＲＦを、ＣＲＰ陽性血清４容に
対し、ＲＦ溶液（５濃度）１容の割合で添加し、最終的
にＲＦが０、１００、２００、３００、４００ＩＵ（国
際単位）／ｍｌ含まれる被験検体を調製し、標準品によ
る更正後ＣＲＰ濃度を測定した。得られたＣＲＰ濃度
（ｍｇ／ｄｌ）を表１に示した。 【００２５】 【表１】 【００２６】表１から分かるように、比較例２〜４（ｐ
Ｈ６．５〜８．２）の測定条件では、ＲＦ添加濃度の上
昇に伴い、ＣＲＰ測定値の上昇が認められた。即ち、Ｒ
ＦがＣＲＰ測定値に影響を与えていることがわかった。
一方、比較例１、実施例１及び実施例２（ｐＨ３．５〜
５．５）では、ＣＲＰ測定値はほとんど変わらなかっ
た。 【００２７】実施例３、４及び比較例５〜８ 反応液のｐＨを変えたときの試薬性能を希釈直線性試験
により確認した。確認試験の手順は以下の通りに行っ
た。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製、および２）緩衝液の
調製は、実施例１と同様にして行った。反応液のｐＨを
３．５にする緩衝液を比較例５で使用し、ｐＨ４．５に
する緩衝液を実施例３で、ｐＨ５．５にする緩衝液を実
施例４で、ｐＨ６．５にする緩衝液を比較例６で、ｐＨ
７．５にする緩衝液を比較例７で、ｐＨ８．２にする緩
衝液を比較例８でそれぞれ使用した。 【００２８】検体として、約２５ｍｇ／ｄｌのＣＲＰ陽
性血清（ＡＴＡＢ社製）を、生理食塩水により希釈し、
１／５〜５／５ＣＲＰ濃度の５段階ＣＲＰ希釈列を調製
した。この希釈列のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を実施例
１の３）の測定方法に従って測定した。すなわち、標準
品による更正後、０濃度（生理食塩水）及び５段階濃度
ＣＲＰ希釈列をｎ＝３にて測定し、その平均値を算出
し、グラフにプロットした。結果を図１に示した。 【００２９】比較例５（ｐＨ３．５）の反応液ではＣＲ
Ｐ高値における測定値の低下が認められ、通常の反応性
を得ることができなかった。こうした劣化は、抗原抗体
の変性、抗原抗体反応の抑制等によるものと考えられ
る。一方、実施例３、４及び比較例６〜８（ｐＨ４．５
〜８．２）の測定条件では、ほぼ同等の希釈直線性性能
を示した。 【００３０】実施例５、６及び比較例９〜１１ 関東化学社製、ヒトＣＲＰ測定用試薬キット「サイアス
ＣＲＰ」を使用して、その反応液のｐＨを変えた場合
に、ヒトＣＲＰ測定値に与えるＲＦの影響を調べた。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製 上記試薬キット中の反応開始剤（ヤギ由来抗ヒトＣＲＰ
抗体を含有）をそのまま使用した。 【００３１】２）緩衝液の調製 上記反応開始剤を用いて、ヒト血清検体中のヒトＣＲＰ
を測定する場合、反応性や反応時のｐＨ等を調整する目
的で反応時に緩衝液を使用することがあり、上記キット
には緩衝液が用意されている。本実施例及び比較例で
は、上記キット中の緩衝液に１規定塩酸を添加すること
により該緩衝液のｐＨを調整し、得られた緩衝液を反応
時に添加することにより反応液のｐＨが３．５（比較例
９）、４．５（実施例５）、５．５（実施例６）、６．
５（比較例１０）、７．１（比較例１１。本キットの緩
衝液に１規定塩酸を添加しなかった場合）となるように
した。 【００３２】３）測定方法 第１試薬Ｒ１として上記２）で調製した緩衝液を使用
し、第２試薬Ｒ２として上記１）の反応開始剤を使用
し、ＣＲＰ標準品（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ２）に４．８ｍ
ｇ／ｄｌＣＲＰ標準血清（関東化学社製、サイアスＣＲ
Ｐ用標準血清）を使用したことの他は、実施例１の３）
と同様に行った。 【００３３】４）ＲＦの影響確認試験 実施例１の４）と同様にして、ＲＦが０、１００、２０
０、３００、４００ＩＵ（国際単位）／ｍｌ含まれる被
験検体を調製し、標準品による更正後ＣＲＰ濃度を測定
した。得られたＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を表２に示し
た。 【００３４】 【表２】 【００３５】表２から分かるように、比較例１０、１１
（ｐＨ６．５〜７．１）の測定条件では、ＲＦ添加濃度
の上昇に伴い、ＣＲＰ測定値の上昇が認められた。即
ち、ＲＦがＣＲＰ測定値に影響を与えていることがわか
った。一方、比較例９、実施例５及び実施例６（ｐＨ
３．５〜５．５）では、ＣＲＰ測定値はほとんど変わら
なかった。 【００３６】実施例７、８及び比較例１２〜１４ 反応液のｐＨを変えたときの試薬性能を希釈直線性試験
により確認した。確認試験の手順は以下の通りに行っ
た。１）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製、および２）緩衝
液の調製は、実施例５と同様にして行った。反応液のｐ
Ｈを３．５にする緩衝液を比較例１２で使用し、ｐＨ
４．５にする緩衝液を実施例７で、ｐＨ５．５にする緩
衝液を実施例８で、ｐＨ６．５にする緩衝液を比較例１
３で、ｐＨ７．１にする緩衝液を比較例１４でそれぞれ
使用した。 【００３７】検体として、実施例３と同様にして得られ
たＣＲＰ希釈列を使用し、この希釈列のＣＲＰ濃度（ｍ
ｇ／ｄｌ）を実施例５の３）の測定方法に従って測定し
た。その結果を図２に示した。 【００３８】比較例１２（ｐＨ３．５）の反応液ではＣ
ＲＰ高値における測定値の低下が認められ、通常の反応
性を得ることができなかった。こうした劣化は、抗原抗
体の変性、抗原抗体反応の抑制等によるものと考えられ
る。一方、実施例７、８及び比較例１３、１４（ｐＨ
４．５〜７．１）の測定条件では、ほぼ同等の希釈直線
性性能を示した。 【００３９】 【発明の効果】本発明の免疫比濁測定法は、上述の構成
よりなるので、検体の前処理、試薬原料の加工を行うこ
となく、目的とする抗原又は抗体を特異的に精度よく測
定することができる。
害物質であるリウマチ因子の影響を回避することができ
る免疫比濁測定法に関する。 【０００２】 【従来の技術】免疫測定法は、尿、血清、組織片等のヒ
トから採取した生体成分を検体として分析、同定し、そ
の中の微量成分を検出することにより、疾病等の生体の
異常を診断する臨床検査法の一つとして広く用いられて
おり、抗原抗体反応の反応特異性、結合強度等を利用す
る方法である。 【０００３】免疫測定法の一つである免疫比濁測定法
は、抗原又は抗体を含有する検体と、該抗原又は抗体に
対する抗体又は抗原とを混合して抗原抗体反応せしめ、
生成した免疫凝集物の量を、得られた反応液の濁度を測
定することにより求め、その測定値から該抗原又は抗体
を測定する方法であり、従来より臨床検査や実験室での
免疫学的研究に用いられてきた。 【０００４】しかし、免疫測定法の測定対象となる検体
中には、ヒトの個体特性、採取条件等により、生体成分
であるリウマチ因子（以下「ＲＦ」という）等が混在し
ており、これらが抗原抗体反応を妨害して測定値に異常
をきたすので、これら妨害物質の影響を解消、軽減する
種々の手法が検討されている。 【０００５】生体成分を検体とする免疫測定法では、抗
原抗体反応を起こす条件を生体内の状態に近づける目的
で、試薬系のｐＨを６．０〜８．０の中性付近に調整す
ることが通例であった。しかし、こうした条件下では、
稀に検体中のＲＦが、試薬系に含まれる抗原又は抗体と
反応し、自己凝集を引き起こすことがあった。 【０００６】ＲＦは、自己抗体であり、変性ヒト抗体分
子のＦｃ部分に対して反応することが知られているが、
ヒト検体中のＲＦの濃度や純度等が特定の条件になると
（ヒトとは異なる種類の動物から得られた）異種抗体分
子に対して反応する場合があり、これが一般に異種抗体
である動物抗体を試薬の構成成分とする臨床検査におい
て抗原抗体の特異的反応を妨害する。こうしたＲＦによ
る測定の妨害を回避するため、検定の前に血清中の内因
性のＲＦを不活性化するか、又は、除去する等の前処理
が通常必要で、この前処理をしなければ測定の結果は著
しい誤差を生じる場合がある。 【０００７】特開昭５４−１１９２９２号公報には、こ
の妨害反応を回避する目的で、異種抗体分子のＦｃ部分
を酵素反応で取り除いたＦ（ａｂ′）2 分子を、抗体と
して用いる免疫測定法が開示されている。しかしなが
ら、このような免疫測定法は、酵素反応、精製等の原料
調製のための煩雑な工程が加わるため、コストアップ、
製造ロット間差につながる場合があった。 【０００８】上述のように、従来の免疫測定法では、検
体の前処理は検査の煩雑さ、遅延化につながり、Ｆ（ａ
ｂ′）2 分子を用いた試薬にあっては試薬製造工程を繁
雑にし、製造ロット間差を引き起こす等の問題があっ
た。そこで、これら問題を回避するため、検体の前処理
を必要とせず、抗体分子を酵素処理しない試薬を用い
て、採取した生体成分を測定する方法の確立が望まれて
いた。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、リウマチ因子と異種抗体分子との相互作用を軽減
し、リウマチ因子の測定への影響を回避することができ
る免疫比濁測定法を提供することを目的とする。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、抗原又
は抗体を含有する検体と、該抗原又は抗体に対するヤギ
由来の抗体とを混合して抗原抗体反応せしめ、得られた
反応液の濁度を測定することにより該検体中の抗原又は
抗体を測定する免疫比濁測定法において、検体がリウマ
チ因子を含有し得るものであり、かつ、反応液のｐＨ
を、４．０以上６．０未満に維持するところに存する。 【００１１】本発明で測定される抗原又は抗体として
は、特に限定されず、従来から免疫測定法で測定され得
る抗原又は抗体のいずれも測定可能である。上記抗原又
は抗体としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（以下、ＣＲＰ
とする。）、ヒトアルブミン、抗ストレプトリジンＯ抗
体等の高分子量蛋白質や、薬物、ペプチド等の低分子量
抗原性物質等が挙げられる。 【００１２】本発明で使用する抗体は、上記測定対象と
なる抗原又は抗体に対するヤギ由来の抗体である。 【００１３】抗原又は抗体を含有する検体と、該抗原又
は抗体に対するヤギ由来の抗体とを混合して抗原抗体反
応せしめる際の反応液のｐＨは、低くなると、抗原抗体
の変性や抗原抗体反応の抑制などがおこり、目的とする
反応性を得ることができず、ｐＨが高くなると、ＲＦが
抗原又は抗体の測定値に影響を与えて正確な測定ができ
なくなるので、４．０以上６．０未満に限定される。 【００１４】上記反応液は、検体とヤギ由来の抗体溶液
と、必要に応じて試薬の反応性やｐＨなどを調整する目
的で反応に添加される緩衝液とからなる。上記緩衝液と
しては、測定条件により適宜選択されるが、例えば、リ
ン酸緩衝液、リン酸−クエン酸緩衝液、酢酸−酢酸ナト
リウム緩衝液等が挙げられる。 【００１５】反応液に使用するヤギ由来の抗体溶液や緩
衝液には、保存安定性を向上させる目的で、牛血清アル
ブミン；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩；糖類等
の安定化剤等を添加することができる。 【００１６】また、上記抗原抗体反応を促進する目的
で、上記の緩衝液中に、ポリエチレングリコール、デキ
ストラン等の水溶性高分子を添加することも有効であ
る。 【００１７】上記反応における反応温度は、４〜５０℃
が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。 【００１８】本発明の免疫比濁測定法において、得られ
た反応液の濁度を測定するには、通常の光学的測定法を
適用でき、例えば、吸光度、散乱光強度、又は分子数の
いずれを測定してもよい。測定波長は、一般に３００〜
８００ｎｍを使用することができる。 【００１９】 【発明の実施の形態】以下に実施例を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。 【００２０】実施例１、２及び比較例１〜４ 日水製薬社製、ヒトＣＲＰ測定用試薬キット「オートＴ
ＩＡ ＣＲＰ ニッスイ」を使用して、その反応液のｐ
Ｈを変えた場合に、ヒトＣＲＰ測定値に与えるＲＦの影
響を調べた。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製 上記試薬キット中の抗血清液（ヤギ由来抗ヒトＣＲＰ抗
体を含有）をそのまま使用した。 【００２１】２）緩衝液の調製 上記抗血清液を用いて、ヒト血清検体中のヒトＣＲＰを
測定する場合、反応性や反応時のｐＨ等を調整する目的
で反応時に緩衝液を使用することがあり、上記キットに
は緩衝液が用意されている。本実施例及び比較例では、
上記キット中の緩衝液に１規定塩酸を添加することによ
り該緩衝液のｐＨを調整し、得られた緩衝液を反応時に
添加することにより反応液のｐＨが３．５（比較例
１）、４．５（実施例１）、５．５（実施例２）、６．
５（比較例２）、７．５（比較例３）、８．２（比較例
４、本キットの緩衝液に１規定塩酸を添加しなかった場
合）となるようにした。 【００２２】３）測定方法 測定には、日立７１５０形自動分析装置（日立製作所社
製）を用い、吸光度の測定波長は主波長３４０ｎｍ、副
波長７００ｎｍで行った。以下にその測定手順を示し
た。先ず、水ブランクの吸光度を測定し、次いで検体
（Ｓ）２０μｌと第１試薬〔上記２）で調製した緩衝液
をさす。以下、Ｒ１という。〕３５０μｌとを添加し、
Ｒ１添加後、測定終了までの１０分間の反応液の吸光度
を２０秒間隔で測定し、水ブランク値を差し引いた値を
吸光度として用いた。Ｒ１の添加５分後に、第２試薬
〔上記１）の抗血清液をさす。以下、Ｒ２という。〕５
０μｌを添加した。即ち、Ｒ１の添加から５分間以内の
吸光度測定は、ＳとＲ１を含む反応液について、一方、
Ｒ１の添加から５分後以降の吸光度測定は、ＳとＲ１と
Ｒ２とを含む反応液について行った。 【００２３】ここでは、０濃度標準品（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ １）に生理食塩水、ＣＲＰ標準品（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ ２）に４．５ｍｇ／ｄｌＣＲＰ標準血清（日水製薬
社製、オートＴＩＡ ＣＲＰIII ニッスイ ＣＲＰ標準
血清）を用いて出力の更正を行った。即ち、４．５ｍｇ
／ｄｌＣＲＰ標準血清による吸光度の上昇分を演算処理
により求め、これを４．５〔ｍｇ／ｄｌ〕と読み替え、
更正後に出力するデータ（打出し値）は、検体と標準血
清の吸光度上昇分の比から、濃度換算した値となる。例
えば、検体による吸光度上昇分が、標準血清の１／２で
あれば、出力データ（打出し値）は、４．５×１／２＝
２．２５〔ｍｇ／ｄｌ〕となる。 【００２４】４）ＲＦの影響確認試験 ＲＦの影響の有無の確認試験は、ＲＦの添加試験により
行った。即ち、既知濃度のＣＲＰ陽性血清（約０．５ｍ
ｇ／ｄｌ）にＲＦを添加し、ＣＲＰ測定値の変化の有無
を確認した。日常の臨床検査でＲＦ陽性検体が測定値に
影響を与えるケースは非常に稀であるが、高度に精製さ
れたＲＦ溶液を用いると、同じような現象を再現するこ
とができるため、今回の試験では、精製ＲＦとして干渉
チェックＲＦ（国際試薬社製）を使用した。精製水によ
り復元した干渉チェックＲＦを、ＣＲＰ陽性血清４容に
対し、ＲＦ溶液（５濃度）１容の割合で添加し、最終的
にＲＦが０、１００、２００、３００、４００ＩＵ（国
際単位）／ｍｌ含まれる被験検体を調製し、標準品によ
る更正後ＣＲＰ濃度を測定した。得られたＣＲＰ濃度
（ｍｇ／ｄｌ）を表１に示した。 【００２５】 【表１】 【００２６】表１から分かるように、比較例２〜４（ｐ
Ｈ６．５〜８．２）の測定条件では、ＲＦ添加濃度の上
昇に伴い、ＣＲＰ測定値の上昇が認められた。即ち、Ｒ
ＦがＣＲＰ測定値に影響を与えていることがわかった。
一方、比較例１、実施例１及び実施例２（ｐＨ３．５〜
５．５）では、ＣＲＰ測定値はほとんど変わらなかっ
た。 【００２７】実施例３、４及び比較例５〜８ 反応液のｐＨを変えたときの試薬性能を希釈直線性試験
により確認した。確認試験の手順は以下の通りに行っ
た。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製、および２）緩衝液の
調製は、実施例１と同様にして行った。反応液のｐＨを
３．５にする緩衝液を比較例５で使用し、ｐＨ４．５に
する緩衝液を実施例３で、ｐＨ５．５にする緩衝液を実
施例４で、ｐＨ６．５にする緩衝液を比較例６で、ｐＨ
７．５にする緩衝液を比較例７で、ｐＨ８．２にする緩
衝液を比較例８でそれぞれ使用した。 【００２８】検体として、約２５ｍｇ／ｄｌのＣＲＰ陽
性血清（ＡＴＡＢ社製）を、生理食塩水により希釈し、
１／５〜５／５ＣＲＰ濃度の５段階ＣＲＰ希釈列を調製
した。この希釈列のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を実施例
１の３）の測定方法に従って測定した。すなわち、標準
品による更正後、０濃度（生理食塩水）及び５段階濃度
ＣＲＰ希釈列をｎ＝３にて測定し、その平均値を算出
し、グラフにプロットした。結果を図１に示した。 【００２９】比較例５（ｐＨ３．５）の反応液ではＣＲ
Ｐ高値における測定値の低下が認められ、通常の反応性
を得ることができなかった。こうした劣化は、抗原抗体
の変性、抗原抗体反応の抑制等によるものと考えられ
る。一方、実施例３、４及び比較例６〜８（ｐＨ４．５
〜８．２）の測定条件では、ほぼ同等の希釈直線性性能
を示した。 【００３０】実施例５、６及び比較例９〜１１ 関東化学社製、ヒトＣＲＰ測定用試薬キット「サイアス
ＣＲＰ」を使用して、その反応液のｐＨを変えた場合
に、ヒトＣＲＰ測定値に与えるＲＦの影響を調べた。 １）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製 上記試薬キット中の反応開始剤（ヤギ由来抗ヒトＣＲＰ
抗体を含有）をそのまま使用した。 【００３１】２）緩衝液の調製 上記反応開始剤を用いて、ヒト血清検体中のヒトＣＲＰ
を測定する場合、反応性や反応時のｐＨ等を調整する目
的で反応時に緩衝液を使用することがあり、上記キット
には緩衝液が用意されている。本実施例及び比較例で
は、上記キット中の緩衝液に１規定塩酸を添加すること
により該緩衝液のｐＨを調整し、得られた緩衝液を反応
時に添加することにより反応液のｐＨが３．５（比較例
９）、４．５（実施例５）、５．５（実施例６）、６．
５（比較例１０）、７．１（比較例１１。本キットの緩
衝液に１規定塩酸を添加しなかった場合）となるように
した。 【００３２】３）測定方法 第１試薬Ｒ１として上記２）で調製した緩衝液を使用
し、第２試薬Ｒ２として上記１）の反応開始剤を使用
し、ＣＲＰ標準品（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ２）に４．８ｍ
ｇ／ｄｌＣＲＰ標準血清（関東化学社製、サイアスＣＲ
Ｐ用標準血清）を使用したことの他は、実施例１の３）
と同様に行った。 【００３３】４）ＲＦの影響確認試験 実施例１の４）と同様にして、ＲＦが０、１００、２０
０、３００、４００ＩＵ（国際単位）／ｍｌ含まれる被
験検体を調製し、標準品による更正後ＣＲＰ濃度を測定
した。得られたＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を表２に示し
た。 【００３４】 【表２】 【００３５】表２から分かるように、比較例１０、１１
（ｐＨ６．５〜７．１）の測定条件では、ＲＦ添加濃度
の上昇に伴い、ＣＲＰ測定値の上昇が認められた。即
ち、ＲＦがＣＲＰ測定値に影響を与えていることがわか
った。一方、比較例９、実施例５及び実施例６（ｐＨ
３．５〜５．５）では、ＣＲＰ測定値はほとんど変わら
なかった。 【００３６】実施例７、８及び比較例１２〜１４ 反応液のｐＨを変えたときの試薬性能を希釈直線性試験
により確認した。確認試験の手順は以下の通りに行っ
た。１）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液の調製、および２）緩衝
液の調製は、実施例５と同様にして行った。反応液のｐ
Ｈを３．５にする緩衝液を比較例１２で使用し、ｐＨ
４．５にする緩衝液を実施例７で、ｐＨ５．５にする緩
衝液を実施例８で、ｐＨ６．５にする緩衝液を比較例１
３で、ｐＨ７．１にする緩衝液を比較例１４でそれぞれ
使用した。 【００３７】検体として、実施例３と同様にして得られ
たＣＲＰ希釈列を使用し、この希釈列のＣＲＰ濃度（ｍ
ｇ／ｄｌ）を実施例５の３）の測定方法に従って測定し
た。その結果を図２に示した。 【００３８】比較例１２（ｐＨ３．５）の反応液ではＣ
ＲＰ高値における測定値の低下が認められ、通常の反応
性を得ることができなかった。こうした劣化は、抗原抗
体の変性、抗原抗体反応の抑制等によるものと考えられ
る。一方、実施例７、８及び比較例１３、１４（ｐＨ
４．５〜７．１）の測定条件では、ほぼ同等の希釈直線
性性能を示した。 【００３９】 【発明の効果】本発明の免疫比濁測定法は、上述の構成
よりなるので、検体の前処理、試薬原料の加工を行うこ
となく、目的とする抗原又は抗体を特異的に精度よく測
定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応液のｐＨを変化させた時の、希釈直線性試
験結果を表すグラフ。縦軸は、打出し値（ｍｇ／ｄｌ）
を、横軸は、ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、それぞれ表
す。 【図２】反応液のｐＨを変化させた時の、希釈直線性試
験結果を表すグラフ。縦軸は、打出し値（ｍｇ／ｄｌ）
を、横軸は、ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、それぞれ表
す。
験結果を表すグラフ。縦軸は、打出し値（ｍｇ／ｄｌ）
を、横軸は、ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、それぞれ表
す。 【図２】反応液のｐＨを変化させた時の、希釈直線性試
験結果を表すグラフ。縦軸は、打出し値（ｍｇ／ｄｌ）
を、横軸は、ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、それぞれ表
す。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 抗原又は抗体を含有する検体と、該抗原
又は抗体に対するヤギ由来の抗体とを混合して抗原抗体
反応せしめ、得られた反応液の濁度を測定することによ
り該検体中の抗原又は抗体を測定する免疫比濁測定法に
おいて、検体がリウマチ因子を含有し得るものであり、
かつ、反応液のｐＨを、４．０以上６．０未満に維持す
ることを特徴とする免疫比濁測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20085595A JP3481015B2 (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 免疫比濁測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20085595A JP3481015B2 (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 免疫比濁測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949838A JPH0949838A (ja) | 1997-02-18 |
| JP3481015B2 true JP3481015B2 (ja) | 2003-12-22 |
Family
ID=16431350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20085595A Expired - Lifetime JP3481015B2 (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 免疫比濁測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3481015B2 (ja) |
-
1995
- 1995-08-07 JP JP20085595A patent/JP3481015B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0949838A (ja) | 1997-02-18 |
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