JP3361323B2 - サイトケラチンを含有するキャリブレータの安定化 - Google Patents
サイトケラチンを含有するキャリブレータの安定化Info
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Description
【０００１】本発明は、サイトケラチンを検出するため
の方法に使用される、ヒト血清マトリクスに基づいたキ
ャリブレータまたはキャリブレーション溶液、それを製
造するための方法、ヒト血清中のサイトケラチンを安定
化するための方法、および試料中のサイトケラチンを検
出するための免疫学的方法に関する。
の方法に使用される、ヒト血清マトリクスに基づいたキ
ャリブレータまたはキャリブレーション溶液、それを製
造するための方法、ヒト血清中のサイトケラチンを安定
化するための方法、および試料中のサイトケラチンを検
出するための免疫学的方法に関する。
【０００２】免疫学的検出法は、診断学において非常に
重要となっている。この方法は、特異性および感度が高
いという特徴を有しているので、生体内の液体において
低濃度のアナライトを検出するために特に適している。
免疫学的検出法は、特に、感染症、受精能、および甲状
腺診断学の分野において、代謝性疾患について、および
腫瘍疾患の診断に関して、非常に重要である。現在、最
も重要な腫瘍マーカーには、たとえば、がん胎児性抗原
（CEA）、アルファ-フェトプロテイン（AFP）、前立腺
特異抗原（PSA）、およびサイトケラチン（CK）があ
る。
重要となっている。この方法は、特異性および感度が高
いという特徴を有しているので、生体内の液体において
低濃度のアナライトを検出するために特に適している。
免疫学的検出法は、特に、感染症、受精能、および甲状
腺診断学の分野において、代謝性疾患について、および
腫瘍疾患の診断に関して、非常に重要である。現在、最
も重要な腫瘍マーカーには、たとえば、がん胎児性抗原
（CEA）、アルファ-フェトプロテイン（AFP）、前立腺
特異抗原（PSA）、およびサイトケラチン（CK）があ
る。
【０００３】ヒトのサイトケラチンは、上皮細胞の細胞
骨格の主要成分である中間フィラメントの構成単位であ
る。19以上のサイトケラチンが知られているが、それら
のうち、サイトケラチン1から8までは塩基性サイトケラ
チンと呼ばれ、サイトケラチン9から19までは酸性サイ
トケラチンと呼ばれる。サイトケラチンは細胞内で凝集
して、４量体を形成することができる。一つの４量体
は、いずれの場合も、２個の塩基性および２個の酸性サ
イトケラチンからなる。４量体が直線的に集合すること
によって、フィラメントが形成される。上皮細胞の中間
フィラメントを構成する必須成分である、無処理のサイ
トケラチン分子は水に不溶性である。サイトケラチンの
複雑度および組成は、さまざまな上皮組織によって異な
っており、すなわち、上皮細胞はそれぞれの組織に特徴
的なサイトケラチンの組成を示す。サイトケラチン19
（CK19）の可溶性断片は、CYFRA 21-1とも称されるが、
特に腫瘍診断学に適している。CYFRA 21-1の濃度が健康
な人と比較して増加すると、その濃度は腫瘍疾患の存在
を示唆する。下記の腫瘍、すなわち、気管支がん、卵巣
がん、子宮頸がん、膀胱がん、において、さらに頭部お
よび頸部の腫瘍において、値の増加がすでに明らかにな
っている。CYFRA 21-1の主な適用は、非小細胞気管支が
んをモニターすることである。
骨格の主要成分である中間フィラメントの構成単位であ
る。19以上のサイトケラチンが知られているが、それら
のうち、サイトケラチン1から8までは塩基性サイトケラ
チンと呼ばれ、サイトケラチン9から19までは酸性サイ
トケラチンと呼ばれる。サイトケラチンは細胞内で凝集
して、４量体を形成することができる。一つの４量体
は、いずれの場合も、２個の塩基性および２個の酸性サ
イトケラチンからなる。４量体が直線的に集合すること
によって、フィラメントが形成される。上皮細胞の中間
フィラメントを構成する必須成分である、無処理のサイ
トケラチン分子は水に不溶性である。サイトケラチンの
複雑度および組成は、さまざまな上皮組織によって異な
っており、すなわち、上皮細胞はそれぞれの組織に特徴
的なサイトケラチンの組成を示す。サイトケラチン19
（CK19）の可溶性断片は、CYFRA 21-1とも称されるが、
特に腫瘍診断学に適している。CYFRA 21-1の濃度が健康
な人と比較して増加すると、その濃度は腫瘍疾患の存在
を示唆する。下記の腫瘍、すなわち、気管支がん、卵巣
がん、子宮頸がん、膀胱がん、において、さらに頭部お
よび頸部の腫瘍において、値の増加がすでに明らかにな
っている。CYFRA 21-1の主な適用は、非小細胞気管支が
んをモニターすることである。
【０００４】サンドイッチ型ELISA法によってCK19を検
出する方法は、たとえばEP-A-0 460190に記載されてい
る。この方法では、検定すべき体液試料を少なくとも２
種のレセプターR1およびR2とともにインキュベートする
が、このR1およびR2はそれぞれCK19の異なるエピトープ
を検出するモノクローナル抗体である。これらの抗体の
一方はビオチンで標識され、他方は別の標識を有する。
R1、CK19およびR2を含んでなるサンドイッチ複合体は、
ストレプトアビジンでコーティングされた固相に結合す
る。液相から固相を分離した後、２相のうち一方、好ま
しくは固相において該標識を測定する。得られたシグナ
ルに基づいて、試料中の腫瘍マーカーCK19を検出するこ
とが可能である。
出する方法は、たとえばEP-A-0 460190に記載されてい
る。この方法では、検定すべき体液試料を少なくとも２
種のレセプターR1およびR2とともにインキュベートする
が、このR1およびR2はそれぞれCK19の異なるエピトープ
を検出するモノクローナル抗体である。これらの抗体の
一方はビオチンで標識され、他方は別の標識を有する。
R1、CK19およびR2を含んでなるサンドイッチ複合体は、
ストレプトアビジンでコーティングされた固相に結合す
る。液相から固相を分離した後、２相のうち一方、好ま
しくは固相において該標識を測定する。得られたシグナ
ルに基づいて、試料中の腫瘍マーカーCK19を検出するこ
とが可能である。
【０００５】上記のような検査を実施する場合、得られ
た測定値がポジティブ（腫瘍マーカーが存在する）また
はネガティブ（腫瘍マーカーが存在しない）として、少
なくとも質的に分類可能であることが重要である。この
ことは、自動化システムによって得られた測定データの
分類に特に当てはまる。また、多くの場合、腫瘍マーカ
ーの濃度を定量することが望ましく、または定量が必要
である。したがって、検査システムは、測定を行なう前
に、一定濃度のアナライトを含有する試薬を用いてキャ
リブレートされなければならない。このように定義され
た試薬を以下、キャリブレータと称する。キャリブレー
ション（較正）溶液、キャリブレーション標準、標準溶
液または対照という用語は、キャリブレータという用語
と同義的に使用される。
た測定値がポジティブ（腫瘍マーカーが存在する）また
はネガティブ（腫瘍マーカーが存在しない）として、少
なくとも質的に分類可能であることが重要である。この
ことは、自動化システムによって得られた測定データの
分類に特に当てはまる。また、多くの場合、腫瘍マーカ
ーの濃度を定量することが望ましく、または定量が必要
である。したがって、検査システムは、測定を行なう前
に、一定濃度のアナライトを含有する試薬を用いてキャ
リブレートされなければならない。このように定義され
た試薬を以下、キャリブレータと称する。キャリブレー
ション（較正）溶液、キャリブレーション標準、標準溶
液または対照という用語は、キャリブレータという用語
と同義的に使用される。
【０００６】キャリブレータとして要求される重要な点
は、高い安定性である。一方では、検査の正確さ、キャ
リブレータ中のアナライトのほぼ100%の回収率、および
良好なシグナル対ノイズ比を保証する必要がある。他方
では、測定結果の信頼できる再現性が長期間にわたって
保証されなければならない。したがって、キャリブレー
タは数週間という期間にわたって環境条件、すなわち温
度、実験台上の直射日光、pH値、バッファー条件などに
対して反応しないことが必要である。条件が好ましくな
い場合には、キャリブレータの加水分解、タンパク質分
解または変性の危険がある。もはや無傷とは言えないキ
ャリブレータを使用することは、測定の誤りにつながる
と思われる。
は、高い安定性である。一方では、検査の正確さ、キャ
リブレータ中のアナライトのほぼ100%の回収率、および
良好なシグナル対ノイズ比を保証する必要がある。他方
では、測定結果の信頼できる再現性が長期間にわたって
保証されなければならない。したがって、キャリブレー
タは数週間という期間にわたって環境条件、すなわち温
度、実験台上の直射日光、pH値、バッファー条件などに
対して反応しないことが必要である。条件が好ましくな
い場合には、キャリブレータの加水分解、タンパク質分
解または変性の危険がある。もはや無傷とは言えないキ
ャリブレータを使用することは、測定の誤りにつながる
と思われる。
【０００７】血清試料について、多くの検査が行なわれ
る。したがって、測定の比較を保証するためには、キャ
リブレータも血清マトリクスに基づくべきである。測定
システムの感度が高ければ高いほど、試料とキャリブレ
ータ間のマトリクスの飛び（jump）による測定値の相違
も大きくなるであろう。サイトケラチンは血清マトリク
ス中では不安定であることが明らかになっている。サイ
トケラチンを含有するキャリブレータを液体の状態で保
存する場合、サイトケラチンは破壊され、変性するの
で、そのようなキャリブレータを長期間使用することは
できない。
る。したがって、測定の比較を保証するためには、キャ
リブレータも血清マトリクスに基づくべきである。測定
システムの感度が高ければ高いほど、試料とキャリブレ
ータ間のマトリクスの飛び（jump）による測定値の相違
も大きくなるであろう。サイトケラチンは血清マトリク
ス中では不安定であることが明らかになっている。サイ
トケラチンを含有するキャリブレータを液体の状態で保
存する場合、サイトケラチンは破壊され、変性するの
で、そのようなキャリブレータを長期間使用することは
できない。
【０００８】したがって、従来は、血清マトリクスを、
血清の組成を模した人工のマトリクスに置き換えてい
た。人工マトリクスは、一般に、塩およびタンパク質濃
度、ならびにpH値に関して可能な限り天然のヒト血清の
環境に近づけるために、さまざまな塩およびタンパク質
（例えばウシ血清アルブミン）を添加したバッファーを
基にしている。これによってアナライトであるサイトケ
ラチンをキャリブレータ中で安定化することは可能であ
るが、この方法の欠点は、試料のベースをなすマトリク
スがヒト血清であるため、高感度の測定システムにとっ
ては特に比較が最適であるとは言えないことである。し
たがって、マトリクスに飛びがある。このことは、カッ
トオフ値付近の低い測定範囲にある試料にとっては測定
誤差につながる可能性がある。極端な場合には、このこ
とによって、たとえサイトケラチンアナライトがそれぞ
れの場合に類似した濃度で存在する場合でも、人工マト
リクスに基づくキャリブレータを使用したサイトケラチ
ンのポジティブシグナルについての測定値とヒト血清試
料について測定された値との間に格差を生じることもあ
り得る。
血清の組成を模した人工のマトリクスに置き換えてい
た。人工マトリクスは、一般に、塩およびタンパク質濃
度、ならびにpH値に関して可能な限り天然のヒト血清の
環境に近づけるために、さまざまな塩およびタンパク質
（例えばウシ血清アルブミン）を添加したバッファーを
基にしている。これによってアナライトであるサイトケ
ラチンをキャリブレータ中で安定化することは可能であ
るが、この方法の欠点は、試料のベースをなすマトリク
スがヒト血清であるため、高感度の測定システムにとっ
ては特に比較が最適であるとは言えないことである。し
たがって、マトリクスに飛びがある。このことは、カッ
トオフ値付近の低い測定範囲にある試料にとっては測定
誤差につながる可能性がある。極端な場合には、このこ
とによって、たとえサイトケラチンアナライトがそれぞ
れの場合に類似した濃度で存在する場合でも、人工マト
リクスに基づくキャリブレータを使用したサイトケラチ
ンのポジティブシグナルについての測定値とヒト血清試
料について測定された値との間に格差を生じることもあ
り得る。
【０００９】したがって、本発明の目的は、血清マトリ
クス、望ましくはヒト血清マトリクスに基づくが、好ま
しくない環境条件下であっても少なくとも数週間は安定
なキャリブレータを、サイトケラチン検出法のために提
供することである。
クス、望ましくはヒト血清マトリクスに基づくが、好ま
しくない環境条件下であっても少なくとも数週間は安定
なキャリブレータを、サイトケラチン検出法のために提
供することである。
【００１０】この目的は、血清、望ましくはヒト血清、
サイトケラチンおよびアプロチニンを必須成分とするキ
ャリブレータによって達成される。驚くべきことに、プ
ロテアーゼインヒビター、アプロチニンを添加すること
によってサイトケラチンを効果的に安定化できることが
判明した。結局、サイトケラチン検出法のために、天然
の血清マトリクスに基づいて製造されるキャリブレー
タ、より詳細にはヒト血清マトリクスに基づくキャリブ
レータ、を提供することが可能である。これによって実
際の血清試料を測定する際のマトリクスの飛びを回避す
る。
サイトケラチンおよびアプロチニンを必須成分とするキ
ャリブレータによって達成される。驚くべきことに、プ
ロテアーゼインヒビター、アプロチニンを添加すること
によってサイトケラチンを効果的に安定化できることが
判明した。結局、サイトケラチン検出法のために、天然
の血清マトリクスに基づいて製造されるキャリブレー
タ、より詳細にはヒト血清マトリクスに基づくキャリブ
レータ、を提供することが可能である。これによって実
際の血清試料を測定する際のマトリクスの飛びを回避す
る。
【００１１】さらに、本発明のキャリブレータは貯蔵寿
命が長く、温度安定性を有することが明らかになった。
したがって、キャリブレータに溶解したサイトケラチン
アナライト（CK19が望ましい）の回収率は、凍結乾燥し
たキャリブレータを30-40℃で3週間ストレスにさらした
後のサンドイッチイムノアッセイにおいてほぼ100%であ
る。すなわち、時間-温度ストレス後であっても、サイ
トケラチンは破壊されず、検査に用いられた抗体によっ
て、なお免疫学的に認識される。安定性テストの開始時
にさまざまなキャリブレータ中で測定されたサイトケラ
チンの測定濃度は、ストレステスト後の濃度にほぼ相当
する。したがって、本発明のキャリブレータの安定性お
よび精度は、人工マトリクスに基づく相応のキャリブレ
ータの安定性に匹敵する。キャリブレータを液体の状態
で、または再構成された状態で2-8℃で保存した場合、
この状態は冷蔵庫内での通常の試薬の保存温度に相当す
るが、10週間後でもサイトケラチン回収率はほぼ100%で
あることが明らかになった。このことは、本発明のキャ
リブレータが冷蔵庫内での長期保存後も、質的にも量的
にも減損なく、なお使用可能であることを意味する。
命が長く、温度安定性を有することが明らかになった。
したがって、キャリブレータに溶解したサイトケラチン
アナライト（CK19が望ましい）の回収率は、凍結乾燥し
たキャリブレータを30-40℃で3週間ストレスにさらした
後のサンドイッチイムノアッセイにおいてほぼ100%であ
る。すなわち、時間-温度ストレス後であっても、サイ
トケラチンは破壊されず、検査に用いられた抗体によっ
て、なお免疫学的に認識される。安定性テストの開始時
にさまざまなキャリブレータ中で測定されたサイトケラ
チンの測定濃度は、ストレステスト後の濃度にほぼ相当
する。したがって、本発明のキャリブレータの安定性お
よび精度は、人工マトリクスに基づく相応のキャリブレ
ータの安定性に匹敵する。キャリブレータを液体の状態
で、または再構成された状態で2-8℃で保存した場合、
この状態は冷蔵庫内での通常の試薬の保存温度に相当す
るが、10週間後でもサイトケラチン回収率はほぼ100%で
あることが明らかになった。このことは、本発明のキャ
リブレータが冷蔵庫内での長期保存後も、質的にも量的
にも減損なく、なお使用可能であることを意味する。
【００１２】プロテアーゼインヒビター、アプロチニン
は、本発明のキャリブレータの安定性を実質的に改善す
るために非常に重要である。他のプロテアーゼインヒビ
ターでは効果がないことが判明した。アプロチニンは、
58アミノ酸からなる、市販の入手可能なポリペプチドで
ある。これは、血液凝固因子XIIa、XIaおよびVIIIaに対
する阻害作用、ならびにプラスミンおよびプラスミンア
クチベータに対する阻害作用、さらにトリプシン、キモ
トリプシンおよびカリクレインに対する阻害作用を有す
る。驚くべきことには、他の公知のプロテアーゼインヒ
ビターはキャリブレータを安定化するためには不適当で
あることが明らかになった。界面活性剤や塩といった他
の物質を用いた実験は結局望ましい安定化効果はもたら
さなかった。
は、本発明のキャリブレータの安定性を実質的に改善す
るために非常に重要である。他のプロテアーゼインヒビ
ターでは効果がないことが判明した。アプロチニンは、
58アミノ酸からなる、市販の入手可能なポリペプチドで
ある。これは、血液凝固因子XIIa、XIaおよびVIIIaに対
する阻害作用、ならびにプラスミンおよびプラスミンア
クチベータに対する阻害作用、さらにトリプシン、キモ
トリプシンおよびカリクレインに対する阻害作用を有す
る。驚くべきことには、他の公知のプロテアーゼインヒ
ビターはキャリブレータを安定化するためには不適当で
あることが明らかになった。界面活性剤や塩といった他
の物質を用いた実験は結局望ましい安定化効果はもたら
さなかった。
【００１３】キャリブレータ中で少なくとも10 mg/lの
濃度のアプロチニンを使用することが望ましい。可能な
最大濃度は、溶解性が不足するためテストが妨害され、
または濁り始める濃度である。25から40 mg/lまでの濃
度が特に望ましい。
濃度のアプロチニンを使用することが望ましい。可能な
最大濃度は、溶解性が不足するためテストが妨害され、
または濁り始める濃度である。25から40 mg/lまでの濃
度が特に望ましい。
【００１４】キャリブレータは、液状または凍結乾燥品
のいずれかの状態で調製される。凍結乾燥品を調製する
ために、すべての液体および固体成分を最初に混合また
は溶解し、次に凍結乾燥させる。最後にこの凍結乾燥品
を再構成溶液として使用する、すなわち再び液体に溶解
する。通常、再構成のため、言い換えれば凍結乾燥品を
再溶解するためには蒸留水を使用するが、これは、こう
すれば好ましからざるイオンをキャリブレータに加える
こともなく、特に塩濃度を変化させないためである。水
の量は望ましいサイトケラチン濃度によって、または望
ましい総容量によって決まる。
のいずれかの状態で調製される。凍結乾燥品を調製する
ために、すべての液体および固体成分を最初に混合また
は溶解し、次に凍結乾燥させる。最後にこの凍結乾燥品
を再構成溶液として使用する、すなわち再び液体に溶解
する。通常、再構成のため、言い換えれば凍結乾燥品を
再溶解するためには蒸留水を使用するが、これは、こう
すれば好ましからざるイオンをキャリブレータに加える
こともなく、特に塩濃度を変化させないためである。水
の量は望ましいサイトケラチン濃度によって、または望
ましい総容量によって決まる。
【００１５】本発明のキャリブレータは、また、当業者
に公知の通常の物質、たとえば塩もしくは追加の防腐剤
をさらに含有することができる。たとえば、通常の濃度
である約1 mg/lのＮ−メチルイソチアゾロンおよびオキ
シピリオンを添加することが望ましい。
に公知の通常の物質、たとえば塩もしくは追加の防腐剤
をさらに含有することができる。たとえば、通常の濃度
である約1 mg/lのＮ−メチルイソチアゾロンおよびオキ
シピリオンを添加することが望ましい。
【００１６】本発明のキャリブレータは、好ましいこと
に、凍結乾燥された状態で、4℃で数ヶ月間、品質の低
下なしに保存することができる。4℃で36ヶ月までの期
間保存可能である。再構成された状態では、キャリブレ
ータは4℃で数ヶ月間保存できる。
に、凍結乾燥された状態で、4℃で数ヶ月間、品質の低
下なしに保存することができる。4℃で36ヶ月までの期
間保存可能である。再構成された状態では、キャリブレ
ータは4℃で数ヶ月間保存できる。
【００１７】血清として、サイトケラチンを含まないヒ
ト血清を使用することが望ましい。このような血清はア
フィニティークロマトグラフィー法によって得られ、ま
たは初めからサイトケラチンのない血清が使用される
が、これは適当なスクリーニング法によって測定されな
ければならない。
ト血清を使用することが望ましい。このような血清はア
フィニティークロマトグラフィー法によって得られ、ま
たは初めからサイトケラチンのない血清が使用される
が、これは適当なスクリーニング法によって測定されな
ければならない。
【００１８】本発明はさらに、本発明のキャリブレータ
を製造するための方法に関する。キャリブレータは下記
の工程によって製造することが望ましい。すなわち、 a) 血清とアプロチニンとを混合する工程、 b) 溶液を濾過する工程、 c) サイトケラチンを水に溶解する工程、 d) 工程b)で得られた溶液と、工程c)で溶解したサイト
ケラチンとを混合する工程、 e) d)で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f) 使用前に上記凍結乾燥品を水に溶解する工程。
を製造するための方法に関する。キャリブレータは下記
の工程によって製造することが望ましい。すなわち、 a) 血清とアプロチニンとを混合する工程、 b) 溶液を濾過する工程、 c) サイトケラチンを水に溶解する工程、 d) 工程b)で得られた溶液と、工程c)で溶解したサイト
ケラチンとを混合する工程、 e) d)で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f) 使用前に上記凍結乾燥品を水に溶解する工程。
【００１９】必要ならば、工程d)においてpH値をpH7〜8
に調整することができるが、7.2が望ましい。
に調整することができるが、7.2が望ましい。
【００２０】また、本発明のさらなる主題は、プロテア
ーゼインヒビター、アプロチニンを望ましくは精製サイ
トケラチンに添加することを特徴とする、安定化された
サイトケラチンを製造するための方法である。こうした
方法で製造された安定化サイトケラチンをキャリブレー
タとして使用することが望ましい。
ーゼインヒビター、アプロチニンを望ましくは精製サイ
トケラチンに添加することを特徴とする、安定化された
サイトケラチンを製造するための方法である。こうした
方法で製造された安定化サイトケラチンをキャリブレー
タとして使用することが望ましい。
【００２１】本発明の別の主題はサイトケラチン、より
詳細にはCK19、を安定化するためにアプロチニンを使用
することである。
詳細にはCK19、を安定化するためにアプロチニンを使用
することである。
【００２２】また、血清、望ましくはヒト血清中のサイ
トケラチンを安定化するための方法も本発明の主題であ
って、これは、望ましい濃度として少なくとも10mg/lの
アプロチニンを血清に添加することを特徴とする。
トケラチンを安定化するための方法も本発明の主題であ
って、これは、望ましい濃度として少なくとも10mg/lの
アプロチニンを血清に添加することを特徴とする。
【００２３】本発明のさらに別の主題は、試料中のサイ
トケラチンを測定する、より詳細にはCK19を測定するた
めの免疫学的方法である。この方法は、試料について測
定されたシグナルを本発明のキャリブレータを用いて得
られたシグナルと比較することを特徴とするが、ここで
このキャリブレータは試料と同じ方法を用いて測定され
る。
トケラチンを測定する、より詳細にはCK19を測定するた
めの免疫学的方法である。この方法は、試料について測
定されたシグナルを本発明のキャリブレータを用いて得
られたシグナルと比較することを特徴とするが、ここで
このキャリブレータは試料と同じ方法を用いて測定され
る。
【００２４】サイトケラチンを測定する、望ましくはCK
19およびキャリブレータを測定するための上記の方法
は、下記の工程を用いて実施することが望ましい： a) サイトケラチンを固相に結合するために使用するこ
とができる、サイトケラチンに対して特異的で、固相と
結合可能な基を有する第１の結合パートナーと、試料と
を反応させる工程、 b) 上記溶液を、標識を有するさらなる結合パートナー
と反応させる工程、 c) 生成した免疫複合体を固相に結合させる工程（した
がって固相はすでに工程a)の段階で存在してよい）、 d) 液相から固相を分離する工程、 e) 二相のうち一方において標識を検出する工程、 f) キャリブレータに関する測定値と試料に関する測定
値とを比較し、定量する工程。
19およびキャリブレータを測定するための上記の方法
は、下記の工程を用いて実施することが望ましい： a) サイトケラチンを固相に結合するために使用するこ
とができる、サイトケラチンに対して特異的で、固相と
結合可能な基を有する第１の結合パートナーと、試料と
を反応させる工程、 b) 上記溶液を、標識を有するさらなる結合パートナー
と反応させる工程、 c) 生成した免疫複合体を固相に結合させる工程（した
がって固相はすでに工程a)の段階で存在してよい）、 d) 液相から固相を分離する工程、 e) 二相のうち一方において標識を検出する工程、 f) キャリブレータに関する測定値と試料に関する測定
値とを比較し、定量する工程。
【００２５】この方法は、当業者に公知の方法によって
競合試験として行なうこともできる。
競合試験として行なうこともできる。
【００２６】結合パートナーはモノクローナルもしくは
ポリクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、た
とえばF(ab' )2、Fab' またはFabフラグメント、が望ま
しく、これらはサイトケラチン、特にCK19、を免疫学的
に特異的に認識し、結合することができる。上記抗体は
当業者に公知の方法によって作成される。また、たとえ
ば遺伝子工学によって抗体を修飾することにより作成さ
れた抗体も含まれる。抗体という用語は、結合パートナ
ーに関する前記のすべての意味を包含する。
ポリクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、た
とえばF(ab' )2、Fab' またはFabフラグメント、が望ま
しく、これらはサイトケラチン、特にCK19、を免疫学的
に特異的に認識し、結合することができる。上記抗体は
当業者に公知の方法によって作成される。また、たとえ
ば遺伝子工学によって抗体を修飾することにより作成さ
れた抗体も含まれる。抗体という用語は、結合パートナ
ーに関する前記のすべての意味を包含する。
【００２７】サイトケラチンに対する第１の特異的結合
パートナーは直接、固相と結合可能であるか、あるいは
間接的に特異的結合システムを介して固相と結合する
か、のいずれかである。この結合パートナーと固相との
直接結合は、当業者に公知の方法にしたがって生じる。
特異的な結合システムを介した間接的な結合の場合に
は、第１の結合パートナーはサイトケラチンに対する抗
体および特異的結合システムの一方の反応パートナーを
含んでなるコンジュゲートである。この場合、特異的結
合システムは、相互に特異的に反応することができる２
つのパートナーと理解される。結合能力は免疫反応また
は別の特異的反応に基づくものであってよい。ビオチン
とアビジン、またはビオチンとストレプトアビジンの組
み合わせを特異的結合システムとして使用することが望
ましい。他に望ましい組み合わせとしては、ビオチンと
抗ビオチン、ハプテンと抗ハプテン、抗体のFcフラグメ
ントとこのFcフラグメントに対する抗体、または炭水化
物とレクチンがある。特異的結合対の反応パートナーの
一方がコンジュゲートの一部となる。
パートナーは直接、固相と結合可能であるか、あるいは
間接的に特異的結合システムを介して固相と結合する
か、のいずれかである。この結合パートナーと固相との
直接結合は、当業者に公知の方法にしたがって生じる。
特異的な結合システムを介した間接的な結合の場合に
は、第１の結合パートナーはサイトケラチンに対する抗
体および特異的結合システムの一方の反応パートナーを
含んでなるコンジュゲートである。この場合、特異的結
合システムは、相互に特異的に反応することができる２
つのパートナーと理解される。結合能力は免疫反応また
は別の特異的反応に基づくものであってよい。ビオチン
とアビジン、またはビオチンとストレプトアビジンの組
み合わせを特異的結合システムとして使用することが望
ましい。他に望ましい組み合わせとしては、ビオチンと
抗ビオチン、ハプテンと抗ハプテン、抗体のFcフラグメ
ントとこのFcフラグメントに対する抗体、または炭水化
物とレクチンがある。特異的結合対の反応パートナーの
一方がコンジュゲートの一部となる。
【００２８】第１の結合パートナーに対する、特異的結
合システムのもう一方の反応パートナーは、固相上のコ
ーティングとして存在する。この特異的結合システムの
もう一つの反応パートナーは、当業者に公知の常法によ
って不溶性担体物質と結合させることができる。この場
合、吸着結合だけでなく共有結合も適している。
合システムのもう一方の反応パートナーは、固相上のコ
ーティングとして存在する。この特異的結合システムの
もう一つの反応パートナーは、当業者に公知の常法によ
って不溶性担体物質と結合させることができる。この場
合、吸着結合だけでなく共有結合も適している。
【００２９】適当な固相は、ポリスチレン製または同様
なプラスチック製の試験管またはマイクロタイタープレ
ートであり、その内側表面は特異的結合システムの反応
パートナーによってコーティングされている。他の好適
で特に望ましい固相は、ラテックス粒子、磁性粒子、分
子ふるい物質、ガラスビーズ、プラスチックチューブな
どのような粒子状物質である。紙のような多孔層状の担
体も、担体として使用できる。磁性粒子、いわゆるビー
ズを使用することが特に望ましく、この粒子はさらに上
記の特異的結合システムの適当な結合パートナーでコー
ティングされる。検出反応を実施するために、検査反応
完了後に、例えば濾過、遠心分離、または磁性粒子の場
合は磁気によって、このような微粒子を液相から分離す
ることができる。
なプラスチック製の試験管またはマイクロタイタープレ
ートであり、その内側表面は特異的結合システムの反応
パートナーによってコーティングされている。他の好適
で特に望ましい固相は、ラテックス粒子、磁性粒子、分
子ふるい物質、ガラスビーズ、プラスチックチューブな
どのような粒子状物質である。紙のような多孔層状の担
体も、担体として使用できる。磁性粒子、いわゆるビー
ズを使用することが特に望ましく、この粒子はさらに上
記の特異的結合システムの適当な結合パートナーでコー
ティングされる。検出反応を実施するために、検査反応
完了後に、例えば濾過、遠心分離、または磁性粒子の場
合は磁気によって、このような微粒子を液相から分離す
ることができる。
【００３０】サイトケラチンに対する抗体と、サイトケ
ラチンとの特異的結合反応は、様々な方法によって検出
することができる。通常、特異的結合反応の一方の結合
パートナーは標識される。一般的な標識は、色素原、発
蛍光団、化学ルミネセンスまたは電気化学ルミネセンス
を生じうる物質、ラジオアイソトープ、ハプテン、酵素
標識、またはビオチン／ストレプトアビジンのような特
異的結合対をさらに形成しうる物質である。
ラチンとの特異的結合反応は、様々な方法によって検出
することができる。通常、特異的結合反応の一方の結合
パートナーは標識される。一般的な標識は、色素原、発
蛍光団、化学ルミネセンスまたは電気化学ルミネセンス
を生じうる物質、ラジオアイソトープ、ハプテン、酵素
標識、またはビオチン／ストレプトアビジンのような特
異的結合対をさらに形成しうる物質である。
【００３１】当業者に公知のあらゆる生物学的な液体を
試料として用いて、サイトケラチン検出法を行なうこと
ができる。全血、血清、血漿、尿または唾液といった体
液を試料として使用することが望ましく、血清が特に望
ましい。
試料として用いて、サイトケラチン検出法を行なうこと
ができる。全血、血清、血漿、尿または唾液といった体
液を試料として使用することが望ましく、血清が特に望
ましい。
【００３２】下記の実施例によって、本発明をさらに説
明する。
明する。
【００３３】実施例１
本発明のキャリブレータの調製
表記の識別番号(Id No.)は、Boehringer Mannheim Gmb
H、ドイツ、のカタログ番号に相当する。１リットルのC
Kキャリブレータ（CK濃度40ng/ml）を調製するために、
下記のものを混合する。
H、ドイツ、のカタログ番号に相当する。１リットルのC
Kキャリブレータ（CK濃度40ng/ml）を調製するために、
下記のものを混合する。
【００３４】A：アフィニティークロマトグラフィーに
よってサイトケラチンを除去した、市販のヒト血清、 B：34 mgアプロチニン、Id. No: 0236632-001、 C：1 gのN-メチルイソチアゾロンHCL、Id. No: 1085901
-105、 D：1 gのオキシピリオン、Id. No: 1085913-05、 E： 941 gのA + B + C + Dを含有する濃度0.05μg/mlの
貯蔵溶液に由来する7.31 gのサイトケラチン。
よってサイトケラチンを除去した、市販のヒト血清、 B：34 mgアプロチニン、Id. No: 0236632-001、 C：1 gのN-メチルイソチアゾロンHCL、Id. No: 1085901
-105、 D：1 gのオキシピリオン、Id. No: 1085913-05、 E： 941 gのA + B + C + Dを含有する濃度0.05μg/mlの
貯蔵溶液に由来する7.31 gのサイトケラチン。
【００３５】使用されたヒトサイトケラチンCyfra 21-1
は、ドイツのBoehringer Mannheim GmbH製（Id. No: 18
20974）のElecsys （登録商標）CYFRA 21-1イムノアッ
セイのキャリブレーションセット、Cyfra 21-1 Calset
のヒト細胞系MCF-7に由来するサイトケラチンに該当す
る。
は、ドイツのBoehringer Mannheim GmbH製（Id. No: 18
20974）のElecsys （登録商標）CYFRA 21-1イムノアッ
セイのキャリブレーションセット、Cyfra 21-1 Calset
のヒト細胞系MCF-7に由来するサイトケラチンに該当す
る。
【００３６】実施例２
35℃でのキャリブレータのストレス化
手順はBoehringer Mannheim GmbH （Id. No: 1820966）
製Elecsys （登録商標）Cyfra 21-1の方法に従う。Elec
sys （登録商標）テストの手順は、ビオチン／ストレプ
トアビジン技法に基づく。検査原理は、アナライト（サ
イトケラチン）上の異なるエピトープを認識する2つの
抗体を使用した1-ステップサンドイッチELISAである。
固相はストレプトアビジンでコーティングされた磁性ラ
テックスビーズを含んでなるが、サイトケラチンに対し
て特異的なビオチニル化抗体はこのストレプトアビジン
と結合する。結合した腫瘍マーカーは、液相から固相を
分離した後、電気化学ルミネセンスを測定することによ
って検出するが、この電気化学ルミネセンスはルテニウ
ム複合体で標識された、サイトケラチンに対する第２特
異的抗体によって生じる。
製Elecsys （登録商標）Cyfra 21-1の方法に従う。Elec
sys （登録商標）テストの手順は、ビオチン／ストレプ
トアビジン技法に基づく。検査原理は、アナライト（サ
イトケラチン）上の異なるエピトープを認識する2つの
抗体を使用した1-ステップサンドイッチELISAである。
固相はストレプトアビジンでコーティングされた磁性ラ
テックスビーズを含んでなるが、サイトケラチンに対し
て特異的なビオチニル化抗体はこのストレプトアビジン
と結合する。結合した腫瘍マーカーは、液相から固相を
分離した後、電気化学ルミネセンスを測定することによ
って検出するが、この電気化学ルミネセンスはルテニウ
ム複合体で標識された、サイトケラチンに対する第２特
異的抗体によって生じる。
【００３７】下記の原料を使用する：
R1（第１抗体、ビオチニル化Fabフラグメント）
MAB〈CK19〉M-KS19.1-Fab(DE)-Bi(DDS)；濃度1.5μg/ml
R2（第２抗体、ルテニル化IgG）：
MAB〈CK19〉M-BM19.21-IgG-BPRU）；濃度2.1μg/ml
ドイツのBoehringer Mannheim GmbH製の計測器Elecsys
（登録商標）2010の使用説明書にしたがって、90μlのR
1および90μlのR2をストレプトアビジンでコーティング
した磁性粒子と共にインキュベートし、測定する。
（登録商標）2010の使用説明書にしたがって、90μlのR
1および90μlのR2をストレプトアビジンでコーティング
した磁性粒子と共にインキュベートし、測定する。
【００３８】新たに溶解した、サイトケラチンを含有す
る本発明のキャリブレータと、凍結乾燥状態で35℃にて
3週間ストレス状態とした後に再構成した本発明のキャ
リブレータを比較した。結果を表１に示す。
る本発明のキャリブレータと、凍結乾燥状態で35℃にて
3週間ストレス状態とした後に再構成した本発明のキャ
リブレータを比較した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
表より、ストレスをかけたキャリブレータも良好な、ほ
ぼ100%の回収率を示すことが示される。偏差はいずれの
場合も10%より小さい（最大偏差6%）。したがって、本
発明のキャリブレータは長期間にわたって高温に対して
安定であり、ストレス後であっても信頼性のあるキャリ
ブレーション値を与える。たとえ偶発的に誤った状態で
キャリブレータを保存しても、品質の低下なしに、無条
件でその後も使用することができる。
ぼ100%の回収率を示すことが示される。偏差はいずれの
場合も10%より小さい（最大偏差6%）。したがって、本
発明のキャリブレータは長期間にわたって高温に対して
安定であり、ストレス後であっても信頼性のあるキャリ
ブレーション値を与える。たとえ偶発的に誤った状態で
キャリブレータを保存しても、品質の低下なしに、無条
件でその後も使用することができる。
【００４０】実施例３
4℃でのキャリブレータの長期間ストレス化（液体）
新たに溶解したキャリブレータと、測定前に液体に再構
成した状態で4℃にて10週間保存したキャリブレータの
比較を行なった。測定は実施例2に記載したように行な
う。結果を表２に示す。
成した状態で4℃にて10週間保存したキャリブレータの
比較を行なった。測定は実施例2に記載したように行な
う。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
本発明のキャリブレータは、液体状態で、シグナル回収
率および濃度回収率に関して、4℃にて10週間のストレ
ス後も良好な結果を示す。
率および濃度回収率に関して、4℃にて10週間のストレ
ス後も良好な結果を示す。
【００４２】実施例４
キャリブレータの長期安定性：4℃にて24ヶ月／−20℃
にて24ヶ月 測定前に4℃で24ヶ月保存したキャリブレータと−20℃
で24ヶ月保存したキャリブレータを比較した（いずれも
凍結乾燥品として保存した）。手順は実施例２の記載に
従う。結果を表３に示す。
にて24ヶ月 測定前に4℃で24ヶ月保存したキャリブレータと−20℃
で24ヶ月保存したキャリブレータを比較した（いずれも
凍結乾燥品として保存した）。手順は実施例２の記載に
従う。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
いずれのストレス法においても良好な回収率を示す。サ
イトケラチンを含有するキャリブレータは、凍結乾燥状
態では、+4℃または−20℃で数年間にわたって、有意な
品質低下なしに、無条件で保存可能である。
イトケラチンを含有するキャリブレータは、凍結乾燥状
態では、+4℃または−20℃で数年間にわたって、有意な
品質低下なしに、無条件で保存可能である。
【００４４】実施例５
腫瘍マーカー対照の測定値の比較：人工マトリクスおよ
びヒト血清に基づく計測器のキャリブレーション Elecsys（登録商標）計測器は、測定を行なう前に、人
工マトリクスに基づくサイトケラチン含有キャリブレー
タを用いて較正し、その後このキャリブレーション値に
基づいて腫瘍マーカー対照が測定される。この測定で得
られた値は定義にしたがって回収率100%に設定される。
次に同じ計測器を本発明のヒト血清に基づくキャリブレ
ータを用いて較正し、再度腫瘍マーカー対照をこのキャ
リブレーション値に基づいて測定する。結果を表４に示
す。
びヒト血清に基づく計測器のキャリブレーション Elecsys（登録商標）計測器は、測定を行なう前に、人
工マトリクスに基づくサイトケラチン含有キャリブレー
タを用いて較正し、その後このキャリブレーション値に
基づいて腫瘍マーカー対照が測定される。この測定で得
られた値は定義にしたがって回収率100%に設定される。
次に同じ計測器を本発明のヒト血清に基づくキャリブレ
ータを用いて較正し、再度腫瘍マーカー対照をこのキャ
リブレーション値に基づいて測定する。結果を表４に示
す。
【００４５】腫瘍マーカー対照TMC IまたはII、およびP
CT IまたはIIは、加工されたヒト血清に基づいており、
PSAおよびAFPのような別の腫瘍マーカーに加えて、二つ
の濃度範囲（IおよびII）に対する指標値を有するサイ
トケラチンCyfra 21-1 を含有する。
CT IまたはIIは、加工されたヒト血清に基づいており、
PSAおよびAFPのような別の腫瘍マーカーに加えて、二つ
の濃度範囲（IおよびII）に対する指標値を有するサイ
トケラチンCyfra 21-1 を含有する。
【００４６】
【表４】
人工マトリクスもしくはヒトマトリクスに基づくキャリ
ブレータを使用したキャリブレーションに基づいた腫瘍
マーカー対照の測定値の偏差は10%以下であると考えら
れる。したがって腫瘍マーカー対照に関して得られた値
は、計測器を較正するために使用したキャリブレータに
依存しない。これより、ヒト血清に基づくキャリブレー
タを、人工マトリクスに基づくキャリブレータの代替と
することができる。
ブレータを使用したキャリブレーションに基づいた腫瘍
マーカー対照の測定値の偏差は10%以下であると考えら
れる。したがって腫瘍マーカー対照に関して得られた値
は、計測器を較正するために使用したキャリブレータに
依存しない。これより、ヒト血清に基づくキャリブレー
タを、人工マトリクスに基づくキャリブレータの代替と
することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 モエッスナー，エレン
ドイツ連邦共和国 デー‐74426 ブー
ラルゼール，インマースベルグ ４
(72)発明者 フランケン，ノルベルト
ドイツ連邦共和国 デー‐82319 スタ
ーンベグ，ライデンゼルシュトラーセ
45
(72)発明者 ロッテマン，ミッシェル
ドイツ連邦共和国 デー‐82362 ヴェ
ールハイム，バルンムールベグ 52
(72)発明者 ボデンムーラー，ハインツ
ドイツ連邦共和国 デー‐82327 ツッ
チング，ツーグスピッツェ １
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/96
G01N 33/53
Claims (9)
- 【請求項１】 血清、サイトケラチンおよびアプロチニ
ンを含有する試料中のサイトケラチンを検出する方法の
ためのキャリブレータ。 - 【請求項２】 血清としてヒト血清を使用する、請求項
１に記載のキャリブレータ。 - 【請求項３】 添加されるサイトケラチンがCK19であ
る、請求項１に記載のキャリブレータ。 - 【請求項４】 キャリブレータが少なくとも10mg/lの濃
度でアプロチニンを含有する、請求項１に記載のキャリ
ブレータ。 - 【請求項５】 a) 血清とアプロチニンとを混合する工
程、 b) その溶液を濾過する工程、 c) サイトケラチンを水に溶解する工程、 d) 工程b) で得られた溶液と工程c) で溶解したサイト
ケラチンとを混合する工程、 e) d) で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f) 使用前に該凍結乾燥品を水に溶解する工程、 を含んでなる請求項１に記載のキャリブレータの製造方
法。 - 【請求項６】 アプロチニンを血清に添加する、血清中
のサイトケラチンを安定化するための方法。 - 【請求項７】 アプロチニンを精製サイトケラチンに添
加する、安定化されたサイトケラチンの製造方法。 - 【請求項８】 サイトケラチンを安定化するためのアプ
ロチニンの使用。 - 【請求項９】 試料について測定されたシグナルを、請
求項１〜４のいずれか１項に記載のキャリブレータであ
って、試料と同一の方法で測定されるキャリブレータを
用いて得られたシグナルと比較する、試料中のサイトケ
ラチンを測定するための免疫学的方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19855819.8 | 1998-12-03 | ||
| DE19855819A DE19855819C2 (de) | 1998-12-03 | 1998-12-03 | Stabilisierung von Cytokeratin enthaltenden Kalibratoren |
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