JP2002535605A - サイトケラチンを含有するキャリブレータの安定化 - Google Patents
サイトケラチンを含有するキャリブレータの安定化Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒト血清マトリクスに基づいた、サイトケラチン検出法において使用されるキャリブレータまたはキャリブレーション溶液、これらを製造するための方法、サイトケラチンを安定化するための方法、および試料中のサイトケラチンを検出するための免疫学的方法に関する。
Description
【０００１】 本発明は、サイトケラチンを検出するための方法に使用される、ヒト血清マト
リクスに基づいたキャリブレータまたはキャリブレーション溶液、それを製造す
るための方法、ヒト血清中のサイトケラチンを安定化するための方法、および試
料中のサイトケラチンを検出するための免疫学的方法に関する。
リクスに基づいたキャリブレータまたはキャリブレーション溶液、それを製造す
るための方法、ヒト血清中のサイトケラチンを安定化するための方法、および試
料中のサイトケラチンを検出するための免疫学的方法に関する。
【０００２】 免疫学的検出法は、診断学において非常に重要となっている。この方法は、特
異性および感度が高いという特徴を有しているので、生体内の液体において低濃
度のアナライトを検出するために特に適している。免疫学的検出法は、特に、感
染症、受精能、および甲状腺診断学の分野において、代謝性疾患について、およ
び腫瘍疾患の診断に関して、非常に重要である。現在、最も重要な腫瘍マーカー
には、たとえば、がん胎児性抗原（CEA）、アルファ-フェトプロテイン（AFP）
、前立腺特異抗原（PSA）、およびサイトケラチン（CK）がある。
異性および感度が高いという特徴を有しているので、生体内の液体において低濃
度のアナライトを検出するために特に適している。免疫学的検出法は、特に、感
染症、受精能、および甲状腺診断学の分野において、代謝性疾患について、およ
び腫瘍疾患の診断に関して、非常に重要である。現在、最も重要な腫瘍マーカー
には、たとえば、がん胎児性抗原（CEA）、アルファ-フェトプロテイン（AFP）
、前立腺特異抗原（PSA）、およびサイトケラチン（CK）がある。
【０００３】 ヒトのサイトケラチンは、上皮細胞の細胞骨格の主要成分である中間フィラメ
ントの構成単位である。19以上のサイトケラチンが知られているが、それらのう
ち、サイトケラチン1から8までは塩基性サイトケラチンと呼ばれ、サイトケラチ
ン9から19までは酸性サイトケラチンと呼ばれる。サイトケラチンは細胞内で凝
集して、４量体を形成することができる。一つの４量体は、いずれの場合も、２
個の塩基性および２個の酸性サイトケラチンからなる。４量体が直線的に集合す
ることによって、フィラメントが形成される。上皮細胞の中間フィラメントを構
成する必須成分である、無処理のサイトケラチン分子は水に不溶性である。サイ
トケラチンの複雑度および組成は、さまざまな上皮組織によって異なっており、
すなわち、上皮細胞はそれぞれの組織に特徴的なサイトケラチンの組成を示す。
サイトケラチン19（CK19）の可溶性断片は、CYFRA 21-1とも称されるが、特に腫
瘍診断学に適している。CYFRA 21-1の濃度が健康な人と比較して増加すると、そ
の濃度は腫瘍疾患の存在を示唆する。下記の腫瘍、すなわち、気管支がん、卵巣
がん、子宮頸がん、膀胱がん、において、さらに頭部および頸部の腫瘍において
、値の増加がすでに明らかになっている。CYFRA 21-1の主な適用は、非小細胞気
管支がんをモニターすることである。
ントの構成単位である。19以上のサイトケラチンが知られているが、それらのう
ち、サイトケラチン1から8までは塩基性サイトケラチンと呼ばれ、サイトケラチ
ン9から19までは酸性サイトケラチンと呼ばれる。サイトケラチンは細胞内で凝
集して、４量体を形成することができる。一つの４量体は、いずれの場合も、２
個の塩基性および２個の酸性サイトケラチンからなる。４量体が直線的に集合す
ることによって、フィラメントが形成される。上皮細胞の中間フィラメントを構
成する必須成分である、無処理のサイトケラチン分子は水に不溶性である。サイ
トケラチンの複雑度および組成は、さまざまな上皮組織によって異なっており、
すなわち、上皮細胞はそれぞれの組織に特徴的なサイトケラチンの組成を示す。
サイトケラチン19（CK19）の可溶性断片は、CYFRA 21-1とも称されるが、特に腫
瘍診断学に適している。CYFRA 21-1の濃度が健康な人と比較して増加すると、そ
の濃度は腫瘍疾患の存在を示唆する。下記の腫瘍、すなわち、気管支がん、卵巣
がん、子宮頸がん、膀胱がん、において、さらに頭部および頸部の腫瘍において
、値の増加がすでに明らかになっている。CYFRA 21-1の主な適用は、非小細胞気
管支がんをモニターすることである。
【０００４】 サンドイッチ型ELISA法によってCK19を検出する方法は、たとえばEP-A-0 460
190に記載されている。この方法では、検定すべき体液試料を少なくとも２種の
レセプターR1およびR2とともにインキュベートするが、このR1およびR2はそれぞ
れCK19の異なるエピトープを検出するモノクローナル抗体である。これらの抗体
の一方はビオチンで標識され、他方は別の標識を有する。R1、CK19およびR2を含
んでなるサンドイッチ複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた固相
に結合する。液相から固相を分離した後、２相のうち一方、好ましくは固相にお
いて該標識を測定する。得られたシグナルに基づいて、試料中の腫瘍マーカーCK
19を検出することが可能である。
190に記載されている。この方法では、検定すべき体液試料を少なくとも２種の
レセプターR1およびR2とともにインキュベートするが、このR1およびR2はそれぞ
れCK19の異なるエピトープを検出するモノクローナル抗体である。これらの抗体
の一方はビオチンで標識され、他方は別の標識を有する。R1、CK19およびR2を含
んでなるサンドイッチ複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた固相
に結合する。液相から固相を分離した後、２相のうち一方、好ましくは固相にお
いて該標識を測定する。得られたシグナルに基づいて、試料中の腫瘍マーカーCK
19を検出することが可能である。
【０００５】 上記のような検査を実施する場合、得られた測定値がポジティブ（腫瘍マーカ
ーが存在する）またはネガティブ（腫瘍マーカーが存在しない）として、少なく
とも質的に分類可能であることが重要である。このことは、自動化システムによ
って得られた測定データの分類に特に当てはまる。また、多くの場合、腫瘍マー
カーの濃度を定量することが望ましく、または定量が必要である。したがって、
検査システムは、測定を行なう前に、一定濃度のアナライトを含有する試薬を用
いてキャリブレートされなければならない。このように定義された試薬を以下、
キャリブレータと称する。キャリブレーション（較正）溶液、キャリブレーショ
ン標準、標準溶液または対照という用語は、キャリブレータという用語と同義的
に使用される。
ーが存在する）またはネガティブ（腫瘍マーカーが存在しない）として、少なく
とも質的に分類可能であることが重要である。このことは、自動化システムによ
って得られた測定データの分類に特に当てはまる。また、多くの場合、腫瘍マー
カーの濃度を定量することが望ましく、または定量が必要である。したがって、
検査システムは、測定を行なう前に、一定濃度のアナライトを含有する試薬を用
いてキャリブレートされなければならない。このように定義された試薬を以下、
キャリブレータと称する。キャリブレーション（較正）溶液、キャリブレーショ
ン標準、標準溶液または対照という用語は、キャリブレータという用語と同義的
に使用される。
【０００６】 キャリブレータとして要求される重要な点は、高い安定性である。一方では、
検査の正確さ、キャリブレータ中のアナライトのほぼ100%の回収率、および良好
なシグナル対ノイズ比を保証する必要がある。他方では、測定結果の信頼できる
再現性が長期間にわたって保証されなければならない。したがって、キャリブレ
ータは数週間という期間にわたって環境条件、すなわち温度、実験台上の直射日
光、pH値、バッファー条件などに対して反応しないことが必要である。条件が好
ましくない場合には、キャリブレータの加水分解、タンパク質分解または変性の
危険がある。もはや無傷とは言えないキャリブレータを使用することは、測定の
誤りにつながると思われる。
検査の正確さ、キャリブレータ中のアナライトのほぼ100%の回収率、および良好
なシグナル対ノイズ比を保証する必要がある。他方では、測定結果の信頼できる
再現性が長期間にわたって保証されなければならない。したがって、キャリブレ
ータは数週間という期間にわたって環境条件、すなわち温度、実験台上の直射日
光、pH値、バッファー条件などに対して反応しないことが必要である。条件が好
ましくない場合には、キャリブレータの加水分解、タンパク質分解または変性の
危険がある。もはや無傷とは言えないキャリブレータを使用することは、測定の
誤りにつながると思われる。
【０００７】 血清試料について、多くの検査が行なわれる。したがって、測定の比較を保証
するためには、キャリブレータも血清マトリクスに基づくべきである。測定シス
テムの感度が高ければ高いほど、試料とキャリブレータ間のマトリクスの飛び（
jump）による測定値の相違も大きくなるであろう。サイトケラチンは血清マトリ
クス中では不安定であることが明らかになっている。サイトケラチンを含有する
キャリブレータを液体の状態で保存する場合、サイトケラチンは破壊され、変性
するので、そのようなキャリブレータを長期間使用することはできない。
するためには、キャリブレータも血清マトリクスに基づくべきである。測定シス
テムの感度が高ければ高いほど、試料とキャリブレータ間のマトリクスの飛び（
jump）による測定値の相違も大きくなるであろう。サイトケラチンは血清マトリ
クス中では不安定であることが明らかになっている。サイトケラチンを含有する
キャリブレータを液体の状態で保存する場合、サイトケラチンは破壊され、変性
するので、そのようなキャリブレータを長期間使用することはできない。
【０００８】 したがって、従来は、血清マトリクスを、血清の組成を模した人工のマトリク
スに置き換えていた。人工マトリクスは、一般に、塩およびタンパク質濃度、な
らびにpH値に関して可能な限り天然のヒト血清の環境に近づけるために、さまざ
まな塩およびタンパク質（例えばウシ血清アルブミン）を添加したバッファーを
基にしている。これによってアナライトであるサイトケラチンをキャリブレータ
中で安定化することは可能であるが、この方法の欠点は、試料のベースをなすマ
トリクスがヒト血清であるため、高感度の測定システムにとっては特に比較が最
適であるとは言えないことである。したがって、マトリクスに飛びがある。この
ことは、カットオフ値付近の低い測定範囲にある試料にとっては測定誤差につな
がる可能性がある。極端な場合には、このことによって、たとえサイトケラチン
アナライトがそれぞれの場合に類似した濃度で存在する場合でも、人工マトリク
スに基づくキャリブレータを使用したサイトケラチンのポジティブシグナルにつ
いての測定値とヒト血清試料について測定された値との間に格差を生じることも
あり得る。
スに置き換えていた。人工マトリクスは、一般に、塩およびタンパク質濃度、な
らびにpH値に関して可能な限り天然のヒト血清の環境に近づけるために、さまざ
まな塩およびタンパク質（例えばウシ血清アルブミン）を添加したバッファーを
基にしている。これによってアナライトであるサイトケラチンをキャリブレータ
中で安定化することは可能であるが、この方法の欠点は、試料のベースをなすマ
トリクスがヒト血清であるため、高感度の測定システムにとっては特に比較が最
適であるとは言えないことである。したがって、マトリクスに飛びがある。この
ことは、カットオフ値付近の低い測定範囲にある試料にとっては測定誤差につな
がる可能性がある。極端な場合には、このことによって、たとえサイトケラチン
アナライトがそれぞれの場合に類似した濃度で存在する場合でも、人工マトリク
スに基づくキャリブレータを使用したサイトケラチンのポジティブシグナルにつ
いての測定値とヒト血清試料について測定された値との間に格差を生じることも
あり得る。
【０００９】 したがって、本発明の目的は、血清マトリクス、望ましくはヒト血清マトリク
スに基づくが、好ましくない環境条件下であっても少なくとも数週間は安定なキ
ャリブレータを、サイトケラチン検出法のために提供することである。
スに基づくが、好ましくない環境条件下であっても少なくとも数週間は安定なキ
ャリブレータを、サイトケラチン検出法のために提供することである。
【００１０】 この目的は、血清、望ましくはヒト血清、サイトケラチンおよびアプロチニン
を必須成分とするキャリブレータによって達成される。驚くべきことに、プロテ
アーゼインヒビター、アプロチニンを添加することによってサイトケラチンを効
果的に安定化できることが判明した。結局、サイトケラチン検出法のために、天
然の血清マトリクスに基づいて製造されるキャリブレータ、より詳細にはヒト血
清マトリクスに基づくキャリブレータ、を提供することが可能である。これによ
って実際の血清試料を測定する際のマトリクスの飛びを回避する。
を必須成分とするキャリブレータによって達成される。驚くべきことに、プロテ
アーゼインヒビター、アプロチニンを添加することによってサイトケラチンを効
果的に安定化できることが判明した。結局、サイトケラチン検出法のために、天
然の血清マトリクスに基づいて製造されるキャリブレータ、より詳細にはヒト血
清マトリクスに基づくキャリブレータ、を提供することが可能である。これによ
って実際の血清試料を測定する際のマトリクスの飛びを回避する。
【００１１】 さらに、本発明のキャリブレータは貯蔵寿命が長く、温度安定性を有すること
が明らかになった。したがって、キャリブレータに溶解したサイトケラチンアナ
ライト（CK19が望ましい）の回収率は、凍結乾燥したキャリブレータを30-40℃
で3週間ストレスにさらした後のサンドイッチイムノアッセイにおいてほぼ100%
である。すなわち、時間-温度ストレス後であっても、サイトケラチンは破壊さ
れず、検査に用いられた抗体によって、なお免疫学的に認識される。安定性テス
トの開始時にさまざまなキャリブレータ中で測定されたサイトケラチンの測定濃
度は、ストレステスト後の濃度にほぼ相当する。したがって、本発明のキャリブ
レータの安定性および精度は、人工マトリクスに基づく相応のキャリブレータの
安定性に匹敵する。キャリブレータを液体の状態で、または再構成された状態で
2-8℃で保存した場合、この状態は冷蔵庫内での通常の試薬の保存温度に相当す
るが、10週間後でもサイトケラチン回収率はほぼ100%であることが明らかになっ
た。このことは、本発明のキャリブレータが冷蔵庫内での長期保存後も、質的に
も量的にも減損なく、なお使用可能であることを意味する。
が明らかになった。したがって、キャリブレータに溶解したサイトケラチンアナ
ライト（CK19が望ましい）の回収率は、凍結乾燥したキャリブレータを30-40℃
で3週間ストレスにさらした後のサンドイッチイムノアッセイにおいてほぼ100%
である。すなわち、時間-温度ストレス後であっても、サイトケラチンは破壊さ
れず、検査に用いられた抗体によって、なお免疫学的に認識される。安定性テス
トの開始時にさまざまなキャリブレータ中で測定されたサイトケラチンの測定濃
度は、ストレステスト後の濃度にほぼ相当する。したがって、本発明のキャリブ
レータの安定性および精度は、人工マトリクスに基づく相応のキャリブレータの
安定性に匹敵する。キャリブレータを液体の状態で、または再構成された状態で
2-8℃で保存した場合、この状態は冷蔵庫内での通常の試薬の保存温度に相当す
るが、10週間後でもサイトケラチン回収率はほぼ100%であることが明らかになっ
た。このことは、本発明のキャリブレータが冷蔵庫内での長期保存後も、質的に
も量的にも減損なく、なお使用可能であることを意味する。
【００１２】 プロテアーゼインヒビター、アプロチニンは、本発明のキャリブレータの安定
性を実質的に改善するために非常に重要である。他のプロテアーゼインヒビター
では効果がないことが判明した。アプロチニンは、58アミノ酸からなる、市販の
入手可能なポリペプチドである。これは、血液凝固因子XIIa、XIaおよびVIIIaに
対する阻害作用、ならびにプラスミンおよびプラスミンアクチベータに対する阻
害作用、さらにトリプシン、キモトリプシンおよびカリクレインに対する阻害作
用を有する。驚くべきことには、他の公知のプロテアーゼインヒビターはキャリ
ブレータを安定化するためには不適当であることが明らかになった。界面活性剤
や塩といった他の物質を用いた実験は結局望ましい安定化効果はもたらさなかっ
た。
性を実質的に改善するために非常に重要である。他のプロテアーゼインヒビター
では効果がないことが判明した。アプロチニンは、58アミノ酸からなる、市販の
入手可能なポリペプチドである。これは、血液凝固因子XIIa、XIaおよびVIIIaに
対する阻害作用、ならびにプラスミンおよびプラスミンアクチベータに対する阻
害作用、さらにトリプシン、キモトリプシンおよびカリクレインに対する阻害作
用を有する。驚くべきことには、他の公知のプロテアーゼインヒビターはキャリ
ブレータを安定化するためには不適当であることが明らかになった。界面活性剤
や塩といった他の物質を用いた実験は結局望ましい安定化効果はもたらさなかっ
た。
【００１３】 キャリブレータ中で少なくとも10 mg/lの濃度のアプロチニンを使用すること
が望ましい。可能な最大濃度は、溶解性が不足するためテストが妨害され、また
は濁り始める濃度である。25から40 mg/lまでの濃度が特に望ましい。
が望ましい。可能な最大濃度は、溶解性が不足するためテストが妨害され、また
は濁り始める濃度である。25から40 mg/lまでの濃度が特に望ましい。
【００１４】 キャリブレータは、液状または凍結乾燥品のいずれかの状態で調製される。凍
結乾燥品を調製するために、すべての液体および固体成分を最初に混合または溶
解し、次に凍結乾燥させる。最後にこの凍結乾燥品を再構成溶液として使用する
、すなわち再び液体に溶解する。通常、再構成のため、言い換えれば凍結乾燥品
を再溶解するためには蒸留水を使用するが、これは、こうすれば好ましからざる
イオンをキャリブレータに加えることもなく、特に塩濃度を変化させないためで
ある。水の量は望ましいサイトケラチン濃度によって、または望ましい総容量に
よって決まる。
結乾燥品を調製するために、すべての液体および固体成分を最初に混合または溶
解し、次に凍結乾燥させる。最後にこの凍結乾燥品を再構成溶液として使用する
、すなわち再び液体に溶解する。通常、再構成のため、言い換えれば凍結乾燥品
を再溶解するためには蒸留水を使用するが、これは、こうすれば好ましからざる
イオンをキャリブレータに加えることもなく、特に塩濃度を変化させないためで
ある。水の量は望ましいサイトケラチン濃度によって、または望ましい総容量に
よって決まる。
【００１５】 本発明のキャリブレータは、また、当業者に公知の通常の物質、たとえば塩も
しくは追加の防腐剤をさらに含有することができる。たとえば、通常の濃度であ
る約1 mg/lのＮ−メチルイソチアゾロンおよびオキシピリオンを添加することが
望ましい。
しくは追加の防腐剤をさらに含有することができる。たとえば、通常の濃度であ
る約1 mg/lのＮ−メチルイソチアゾロンおよびオキシピリオンを添加することが
望ましい。
【００１６】 本発明のキャリブレータは、好ましいことに、凍結乾燥された状態で、4℃で
数ヶ月間、品質の低下なしに保存することができる。4℃で36ヶ月までの期間保
存可能である。再構成された状態では、キャリブレータは4℃で数ヶ月間保存で
きる。
数ヶ月間、品質の低下なしに保存することができる。4℃で36ヶ月までの期間保
存可能である。再構成された状態では、キャリブレータは4℃で数ヶ月間保存で
きる。
【００１７】 血清として、サイトケラチンを含まないヒト血清を使用することが望ましい。
このような血清はアフィニティークロマトグラフィー法によって得られ、または
初めからサイトケラチンのない血清が使用されるが、これは適当なスクリーニン
グ法によって測定されなければならない。
このような血清はアフィニティークロマトグラフィー法によって得られ、または
初めからサイトケラチンのない血清が使用されるが、これは適当なスクリーニン
グ法によって測定されなければならない。
【００１８】 本発明はさらに、本発明のキャリブレータを製造するための方法に関する。キ
ャリブレータは下記の工程によって製造することが望ましい。すなわち、 a) 血清とアプロチニンとを混合する工程、 b) 溶液を濾過する工程、 c) サイトケラチンを水に溶解する工程、 d) 工程b)で得られた溶液と、工程c)で溶解したサイトケラチンとを混合する工
程、 e) d)で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f) 使用前に上記凍結乾燥品を水に溶解する工程。
ャリブレータは下記の工程によって製造することが望ましい。すなわち、 a) 血清とアプロチニンとを混合する工程、 b) 溶液を濾過する工程、 c) サイトケラチンを水に溶解する工程、 d) 工程b)で得られた溶液と、工程c)で溶解したサイトケラチンとを混合する工
程、 e) d)で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f) 使用前に上記凍結乾燥品を水に溶解する工程。
【００１９】 必要ならば、工程d)においてpH値をpH7〜8に調整することができるが、7.2が
望ましい。
望ましい。
【００２０】 また、本発明のさらなる主題は、プロテアーゼインヒビター、アプロチニンを
望ましくは精製サイトケラチンに添加することを特徴とする、安定化されたサイ
トケラチンを製造するための方法である。こうした方法で製造された安定化サイ
トケラチンをキャリブレータとして使用することが望ましい。
望ましくは精製サイトケラチンに添加することを特徴とする、安定化されたサイ
トケラチンを製造するための方法である。こうした方法で製造された安定化サイ
トケラチンをキャリブレータとして使用することが望ましい。
【００２１】 本発明の別の主題はサイトケラチン、より詳細にはCK19、を安定化するために
アプロチニンを使用することである。
アプロチニンを使用することである。
【００２２】 また、血清、望ましくはヒト血清中のサイトケラチンを安定化するための方法
も本発明の主題であって、これは、望ましい濃度として少なくとも10mg/lのアプ
ロチニンを血清に添加することを特徴とする。
も本発明の主題であって、これは、望ましい濃度として少なくとも10mg/lのアプ
ロチニンを血清に添加することを特徴とする。
【００２３】 本発明のさらに別の主題は、試料中のサイトケラチンを測定する、より詳細に
はCK19を測定するための免疫学的方法である。この方法は、試料について測定さ
れたシグナルを本発明のキャリブレータを用いて得られたシグナルと比較するこ
とを特徴とするが、ここでこのキャリブレータは試料と同じ方法を用いて測定さ
れる。
はCK19を測定するための免疫学的方法である。この方法は、試料について測定さ
れたシグナルを本発明のキャリブレータを用いて得られたシグナルと比較するこ
とを特徴とするが、ここでこのキャリブレータは試料と同じ方法を用いて測定さ
れる。
【００２４】 サイトケラチンを測定する、望ましくはCK19およびキャリブレータを測定する
ための上記の方法は、下記の工程を用いて実施することが望ましい： a) サイトケラチンを固相に結合するために使用することができる、サイトケラ
チンに対して特異的で、固相と結合可能な基を有する第１の結合パートナーと、
試料とを反応させる工程、 b) 上記溶液を、標識を有するさらなる結合パートナーと反応させる工程、 c) 生成した免疫複合体を固相に結合させる工程（したがって固相はすでに工程
a)の段階で存在してよい）、 d) 液相から固相を分離する工程、 e) 二相のうち一方において標識を検出する工程、 f) キャリブレータに関する測定値と試料に関する測定値とを比較し、定量する
工程。
ための上記の方法は、下記の工程を用いて実施することが望ましい： a) サイトケラチンを固相に結合するために使用することができる、サイトケラ
チンに対して特異的で、固相と結合可能な基を有する第１の結合パートナーと、
試料とを反応させる工程、 b) 上記溶液を、標識を有するさらなる結合パートナーと反応させる工程、 c) 生成した免疫複合体を固相に結合させる工程（したがって固相はすでに工程
a)の段階で存在してよい）、 d) 液相から固相を分離する工程、 e) 二相のうち一方において標識を検出する工程、 f) キャリブレータに関する測定値と試料に関する測定値とを比較し、定量する
工程。
【００２５】 この方法は、当業者に公知の方法によって競合試験として行なうこともできる
。
。
【００２６】 結合パートナーはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれら
のフラグメント、たとえばF(ab’)2、Fab’またはFabフラグメント、が望ましく
、これらはサイトケラチン、特にCK19、を免疫学的に特異的に認識し、結合する
ことができる。上記抗体は当業者に公知の方法によって作成される。また、たと
えば遺伝子工学によって抗体を修飾することにより作成された抗体も含まれる。
抗体という用語は、結合パートナーに関する前記のすべての意味を包含する。
のフラグメント、たとえばF(ab’)2、Fab’またはFabフラグメント、が望ましく
、これらはサイトケラチン、特にCK19、を免疫学的に特異的に認識し、結合する
ことができる。上記抗体は当業者に公知の方法によって作成される。また、たと
えば遺伝子工学によって抗体を修飾することにより作成された抗体も含まれる。
抗体という用語は、結合パートナーに関する前記のすべての意味を包含する。
【００２７】 サイトケラチンに対する第１の特異的結合パートナーは直接、固相と結合可能
であるか、あるいは間接的に特異的結合システムを介して固相と結合するか、の
いずれかである。この結合パートナーと固相との直接結合は、当業者に公知の方
法にしたがって生じる。特異的な結合システムを介した間接的な結合の場合には
、第１の結合パートナーはサイトケラチンに対する抗体および特異的結合システ
ムの一方の反応パートナーを含んでなるコンジュゲートである。この場合、特異
的結合システムは、相互に特異的に反応することができる２つのパートナーと理
解される。結合能力は免疫反応または別の特異的反応に基づくものであってよい
。ビオチンとアビジン、またはビオチンとストレプトアビジンの組み合わせを特
異的結合システムとして使用することが望ましい。他に望ましい組み合わせとし
ては、ビオチンと抗ビオチン、ハプテンと抗ハプテン、抗体のFcフラグメントと
このFcフラグメントに対する抗体、または炭水化物とレクチンがある。特異的結
合対の反応パートナーの一方がコンジュゲートの一部となる。
であるか、あるいは間接的に特異的結合システムを介して固相と結合するか、の
いずれかである。この結合パートナーと固相との直接結合は、当業者に公知の方
法にしたがって生じる。特異的な結合システムを介した間接的な結合の場合には
、第１の結合パートナーはサイトケラチンに対する抗体および特異的結合システ
ムの一方の反応パートナーを含んでなるコンジュゲートである。この場合、特異
的結合システムは、相互に特異的に反応することができる２つのパートナーと理
解される。結合能力は免疫反応または別の特異的反応に基づくものであってよい
。ビオチンとアビジン、またはビオチンとストレプトアビジンの組み合わせを特
異的結合システムとして使用することが望ましい。他に望ましい組み合わせとし
ては、ビオチンと抗ビオチン、ハプテンと抗ハプテン、抗体のFcフラグメントと
このFcフラグメントに対する抗体、または炭水化物とレクチンがある。特異的結
合対の反応パートナーの一方がコンジュゲートの一部となる。
【００２８】 第１の結合パートナーに対する、特異的結合システムのもう一方の反応パート
ナーは、固相上のコーティングとして存在する。この特異的結合システムのもう
一つの反応パートナーは、当業者に公知の常法によって不溶性担体物質と結合さ
せることができる。この場合、吸着結合だけでなく共有結合も適している。
ナーは、固相上のコーティングとして存在する。この特異的結合システムのもう
一つの反応パートナーは、当業者に公知の常法によって不溶性担体物質と結合さ
せることができる。この場合、吸着結合だけでなく共有結合も適している。
【００２９】 適当な固相は、ポリスチレン製または同様なプラスチック製の試験管またはマ
イクロタイタープレートであり、その内側表面は特異的結合システムの反応パー
トナーによってコーティングされている。他の好適で特に望ましい固相は、ラテ
ックス粒子、磁性粒子、分子ふるい物質、ガラスビーズ、プラスチックチューブ
などのような粒子状物質である。紙のような多孔層状の担体も、担体として使用
できる。磁性粒子、いわゆるビーズを使用することが特に望ましく、この粒子は
さらに上記の特異的結合システムの適当な結合パートナーでコーティングされる
。検出反応を実施するために、検査反応完了後に、例えば濾過、遠心分離、また
は磁性粒子の場合は磁気によって、このような微粒子を液相から分離することが
できる。
イクロタイタープレートであり、その内側表面は特異的結合システムの反応パー
トナーによってコーティングされている。他の好適で特に望ましい固相は、ラテ
ックス粒子、磁性粒子、分子ふるい物質、ガラスビーズ、プラスチックチューブ
などのような粒子状物質である。紙のような多孔層状の担体も、担体として使用
できる。磁性粒子、いわゆるビーズを使用することが特に望ましく、この粒子は
さらに上記の特異的結合システムの適当な結合パートナーでコーティングされる
。検出反応を実施するために、検査反応完了後に、例えば濾過、遠心分離、また
は磁性粒子の場合は磁気によって、このような微粒子を液相から分離することが
できる。
【００３０】 サイトケラチンに対する抗体と、サイトケラチンとの特異的結合反応は、様々
な方法によって検出することができる。通常、特異的結合反応の一方の結合パー
トナーは標識される。一般的な標識は、色素原、発蛍光団、化学ルミネセンスま
たは電気化学ルミネセンスを生じうる物質、ラジオアイソトープ、ハプテン、酵
素標識、またはビオチン／ストレプトアビジンのような特異的結合対をさらに形
成しうる物質である。
な方法によって検出することができる。通常、特異的結合反応の一方の結合パー
トナーは標識される。一般的な標識は、色素原、発蛍光団、化学ルミネセンスま
たは電気化学ルミネセンスを生じうる物質、ラジオアイソトープ、ハプテン、酵
素標識、またはビオチン／ストレプトアビジンのような特異的結合対をさらに形
成しうる物質である。
【００３１】 当業者に公知のあらゆる生物学的な液体を試料として用いて、サイトケラチン
検出法を行なうことができる。全血、血清、血漿、尿または唾液といった体液を
試料として使用することが望ましく、血清が特に望ましい。
検出法を行なうことができる。全血、血清、血漿、尿または唾液といった体液を
試料として使用することが望ましく、血清が特に望ましい。
【００３２】 下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【００３３】実施例１ 本発明のキャリブレータの調製 表記の識別番号(Id No.)は、Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ、のカタログ
番号に相当する。１リットルのCKキャリブレータ（CK濃度40ng/ml）を調製する
ために、下記のものを混合する。
番号に相当する。１リットルのCKキャリブレータ（CK濃度40ng/ml）を調製する
ために、下記のものを混合する。
【００３４】 A：アフィニティークロマトグラフィーによってサイトケラチンを除去した、市
販のヒト血清、 B：34 mgアプロチニン、Id. No: 0236632-001、 C：1 gのN-メチルイソチアゾロンHCL、Id. No: 1085901-105、 D：1 gのオキシピリオン、Id. No: 1085913-05、 E： 941 gのA + B + C + Dを含有する濃度0.05μg/mlの貯蔵溶液に由来する7.31
gのサイトケラチン。
販のヒト血清、 B：34 mgアプロチニン、Id. No: 0236632-001、 C：1 gのN-メチルイソチアゾロンHCL、Id. No: 1085901-105、 D：1 gのオキシピリオン、Id. No: 1085913-05、 E： 941 gのA + B + C + Dを含有する濃度0.05μg/mlの貯蔵溶液に由来する7.31
gのサイトケラチン。
【００３５】 使用されたヒトサイトケラチンCyfra 21-1は、ドイツのBoehringer Mannheim
GmbH製（Id. No: 1820974）のElecsys （登録商標）CYFRA 21-1イムノアッセイ
のキャリブレーションセット、Cyfra 21-1 Calsetのヒト細胞系MCF-7に由来する
サイトケラチンに該当する。
GmbH製（Id. No: 1820974）のElecsys （登録商標）CYFRA 21-1イムノアッセイ
のキャリブレーションセット、Cyfra 21-1 Calsetのヒト細胞系MCF-7に由来する
サイトケラチンに該当する。
【００３６】実施例２ 35℃でのキャリブレータのストレス化 手順はBoehringer Mannheim GmbH （Id. No: 1820966）製Elecsys （登録商標
）Cyfra 21-1の方法に従う。Elecsys （登録商標）テストの手順は、ビオチン／
ストレプトアビジン技法に基づく。検査原理は、アナライト（サイトケラチン）
上の異なるエピトープを認識する2つの抗体を使用した1-ステップサンドイッチE
LISAである。固相はストレプトアビジンでコーティングされた磁性ラテックスビ
ーズを含んでなるが、サイトケラチンに対して特異的なビオチニル化抗体はこの
ストレプトアビジンと結合する。結合した腫瘍マーカーは、液相から固相を分離
した後、電気化学ルミネセンスを測定することによって検出するが、この電気化
学ルミネセンスはルテニウム複合体で標識された、サイトケラチンに対する第２
特異的抗体によって生じる。
）Cyfra 21-1の方法に従う。Elecsys （登録商標）テストの手順は、ビオチン／
ストレプトアビジン技法に基づく。検査原理は、アナライト（サイトケラチン）
上の異なるエピトープを認識する2つの抗体を使用した1-ステップサンドイッチE
LISAである。固相はストレプトアビジンでコーティングされた磁性ラテックスビ
ーズを含んでなるが、サイトケラチンに対して特異的なビオチニル化抗体はこの
ストレプトアビジンと結合する。結合した腫瘍マーカーは、液相から固相を分離
した後、電気化学ルミネセンスを測定することによって検出するが、この電気化
学ルミネセンスはルテニウム複合体で標識された、サイトケラチンに対する第２
特異的抗体によって生じる。
【００３７】 下記の原料を使用する： R1（第１抗体、ビオチニル化Fabフラグメント） MAB<CK19>M-KS19.1-Fab(DE)-Bi(DDS)；濃度1.5μg/ml R2（第２抗体、ルテニル化IgG）： MAB<CK19>M-BM19.21-IgG-BPRU）；濃度2.1μg/ml ドイツのBoehringer Mannheim GmbH製の計測器Elecsys（登録商標）2010の使
用説明書にしたがって、90μlのR1および90μlのR2をストレプトアビジンでコー
ティングした磁性粒子と共にインキュベートし、測定する。
用説明書にしたがって、90μlのR1および90μlのR2をストレプトアビジンでコー
ティングした磁性粒子と共にインキュベートし、測定する。
【００３８】 新たに溶解した、サイトケラチンを含有する本発明のキャリブレータと、凍結
乾燥状態で35℃にて3週間ストレス状態とした後に再構成した本発明のキャリブ
レータを比較した。結果を表１に示す。
乾燥状態で35℃にて3週間ストレス状態とした後に再構成した本発明のキャリブ
レータを比較した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】 表より、ストレスをかけたキャリブレータも良好な、ほぼ100%の回収率を示す
ことが示される。偏差はいずれの場合も10%より小さい（最大偏差6%）。したが
って、本発明のキャリブレータは長期間にわたって高温に対して安定であり、ス
トレス後であっても信頼性のあるキャリブレーション値を与える。たとえ偶発的
に誤った状態でキャリブレータを保存しても、品質の低下なしに、無条件でその
後も使用することができる。
ことが示される。偏差はいずれの場合も10%より小さい（最大偏差6%）。したが
って、本発明のキャリブレータは長期間にわたって高温に対して安定であり、ス
トレス後であっても信頼性のあるキャリブレーション値を与える。たとえ偶発的
に誤った状態でキャリブレータを保存しても、品質の低下なしに、無条件でその
後も使用することができる。
【００４０】実施例３ 4℃でのキャリブレータの長期間ストレス化（液体） 新たに溶解したキャリブレータと、測定前に液体に再構成した状態で4℃にて1
0週間保存したキャリブレータの比較を行なった。測定は実施例2に記載したよう
に行なう。結果を表２に示す。
0週間保存したキャリブレータの比較を行なった。測定は実施例2に記載したよう
に行なう。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】 本発明のキャリブレータは、液体状態で、シグナル回収率および濃度回収率に
関して、4℃にて10週間のストレス後も良好な結果を示す。
関して、4℃にて10週間のストレス後も良好な結果を示す。
【００４２】実施例４ キャリブレータの長期安定性：4℃にて24ヶ月／−20℃にて24ヶ月 測定前に4℃で24ヶ月保存したキャリブレータと−20℃で24ヶ月保存したキャ
リブレータを比較した（いずれも凍結乾燥品として保存した）。手順は実施例２
の記載に従う。結果を表３に示す。
リブレータを比較した（いずれも凍結乾燥品として保存した）。手順は実施例２
の記載に従う。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】 いずれのストレス法においても良好な回収率を示す。サイトケラチンを含有す
るキャリブレータは、凍結乾燥状態では、+4℃または−20℃で数年間にわたって
、有意な品質低下なしに、無条件で保存可能である。
るキャリブレータは、凍結乾燥状態では、+4℃または−20℃で数年間にわたって
、有意な品質低下なしに、無条件で保存可能である。
【００４４】実施例５ 腫瘍マーカー対照の測定値の比較：人工マトリクスおよびヒト血清に基づく計測 器のキャリブレーション Elecsys（登録商標）計測器は、測定を行なう前に、人工マトリクスに基づく
サイトケラチン含有キャリブレータを用いて較正し、その後このキャリブレーシ
ョン値に基づいて腫瘍マーカー対照が測定される。この測定で得られた値は定義
にしたがって回収率100%に設定される。次に同じ計測器を本発明のヒト血清に基
づくキャリブレータを用いて較正し、再度腫瘍マーカー対照をこのキャリブレー
ション値に基づいて測定する。結果を表４に示す。
サイトケラチン含有キャリブレータを用いて較正し、その後このキャリブレーシ
ョン値に基づいて腫瘍マーカー対照が測定される。この測定で得られた値は定義
にしたがって回収率100%に設定される。次に同じ計測器を本発明のヒト血清に基
づくキャリブレータを用いて較正し、再度腫瘍マーカー対照をこのキャリブレー
ション値に基づいて測定する。結果を表４に示す。
【００４５】 腫瘍マーカー対照TMC IまたはII、およびPCT IまたはIIは、加工されたヒト血
清に基づいており、PSAおよびAFPのような別の腫瘍マーカーに加えて、二つの濃
度範囲（IおよびII）に対する指標値を有するサイトケラチンCyfra 21-1 を含有
する。
清に基づいており、PSAおよびAFPのような別の腫瘍マーカーに加えて、二つの濃
度範囲（IおよびII）に対する指標値を有するサイトケラチンCyfra 21-1 を含有
する。
【００４６】
【表４】 人工マトリクスもしくはヒトマトリクスに基づくキャリブレータを使用したキ
ャリブレーションに基づいた腫瘍マーカー対照の測定値の偏差は10%以下である
と考えられる。したがって腫瘍マーカー対照に関して得られた値は、計測器を較
正するために使用したキャリブレータに依存しない。これより、ヒト血清に基づ
くキャリブレータを、人工マトリクスに基づくキャリブレータの代替とすること
ができる。
ャリブレーションに基づいた腫瘍マーカー対照の測定値の偏差は10%以下である
と考えられる。したがって腫瘍マーカー対照に関して得られた値は、計測器を較
正するために使用したキャリブレータに依存しない。これより、ヒト血清に基づ
くキャリブレータを、人工マトリクスに基づくキャリブレータの代替とすること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 モエッスナー，エレン ドイツ連邦共和国 デー‐74426 ブーラ ルゼール，インマースベルグ ４ (72)発明者 フランケン，ノルベルト ドイツ連邦共和国 デー‐82319 スター ンベグ，ライデンゼルシュトラーセ 45 (72)発明者 ロッテマン，ミッシェル ドイツ連邦共和国 デー‐82362 ヴェー ルハイム，バルンムールベグ 52 (72)発明者 ボデンムーラー，ハインツ ドイツ連邦共和国 デー‐82327 ツッチ ング，ツーグスピッツェ １
Claims (9)
- 【請求項１】 血清、サイトケラチンおよびアプロチニンを含有する試料中
のサイトケラチンを検出する方法のためのキャリブレータ。 - 【請求項２】 血清としてヒト血清を使用する、請求項１に記載のキャリブ
レータ。 - 【請求項３】 添加されるサイトケラチンがCK19である、請求項１に記載の
キャリブレータ。 - 【請求項４】 キャリブレータが少なくとも10mg/lの濃度でアプロチニンを
含有する、請求項１に記載のキャリブレータ。 - 【請求項５】 a）血清とアプロチニンとを混合する工程、 b）その溶液を濾過する工程、 c）サイトケラチンを水に溶解する工程、 d）工程b）で得られた溶液と工程c）で溶解したサイトケラチンとを混合する工
程、 e）d）で得られた溶液を凍結乾燥する工程、 f）使用前に該凍結乾燥品を水に溶解する工程、 を含んでなる請求項１に記載のキャリブレータの製造方法。 - 【請求項６】 アプロチニンを血清に添加する、血清中のサイトケラチンを
安定化するための方法。 - 【請求項７】 アプロチニンを精製サイトケラチンに添加する、安定化され
たサイトケラチンの製造方法。 - 【請求項８】 サイトケラチンを安定化するためのアプロチニンの使用。
- 【請求項９】 試料について測定されたシグナルを、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載のキャリブレータであって、試料と同一の方法で測定されるキャリ
ブレータを用いて得られたシグナルと比較する、試料中のサイトケラチンを測定
するための免疫学的方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19855819.8 | 1998-12-03 | ||
| DE19855819A DE19855819C2 (de) | 1998-12-03 | 1998-12-03 | Stabilisierung von Cytokeratin enthaltenden Kalibratoren |
| PCT/EP1999/009407 WO2000033085A1 (de) | 1998-12-03 | 1999-12-02 | Stabilisierung von cytokeratin enthaltenden kalibratoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002535605A true JP2002535605A (ja) | 2002-10-22 |
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Family
ID=7889869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000585670A Expired - Fee Related JP3361323B2 (ja) | 1998-12-03 | 1999-12-02 | サイトケラチンを含有するキャリブレータの安定化 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6635485B1 (ja) |
| EP (1) | EP1135689B1 (ja) |
| JP (1) | JP3361323B2 (ja) |
| AT (1) | ATE260468T1 (ja) |
| DE (2) | DE19855819C2 (ja) |
| ES (1) | ES2216595T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000033085A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021517641A (ja) * | 2018-03-13 | 2021-07-26 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 免疫アッセイにおける干渉の低減 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1970709B1 (en) * | 2007-03-06 | 2013-07-10 | Roche Diagnostics GmbH | The use of BNP-type peptides for predicting the need for dialysis |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE300491C (ja) | ||||
| DE2903701C2 (de) * | 1979-01-31 | 1980-10-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Kontrollreagens für die Bestimmung der Heparinaktivität |
| DE3019612A1 (de) | 1980-05-22 | 1981-11-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisiertes thrombinpraeparat |
| GB8822857D0 (en) * | 1988-09-29 | 1988-11-02 | Patralan Ltd | Pharmaceutical formulations |
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