JP3432396B2 - コンジュゲートによる標準溶液の安定化 - Google Patents
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Description
するために使用することができる測定系の検定に利用さ
れる標準溶液の製造方法に関する。また、本発明は溶液
中の分析物を安定化するためのコンジュゲートの使用に
も関する。さらに、本発明は分析物とコンジュゲートと
の複合体で構成される標準溶液、および分析物の検出方
法に関する。この標準溶液は検定標準、検定溶液または
キャリブレータとも称される。
法が非常に重要になってきた。これらは高度な特異性と
感度に特徴があり、したがって生物学的溶液中の低濃度
の分析物の検出にも十分適合する。こうしたイムノアッ
セイの利用によって、代謝産物、ホルモン、抗体、抗原
その他などの多くの臨床に関係する物質を判定すること
ができる。これらの判定方法は、検出すべき分析物と少
なくとも1つの結合相手との間の免疫学的相互作用を基
礎としている。
の特異的抗体の間にサンドイッチのような形態で結合す
る、サンドイッチアッセイである(The Immunoassay Ha
ndbook, 発行者 D.Wild, The Macmillan Press Ltd.,19
94,“Immunoassay design"章、p.15-19 )。2つの抗体
の内の1つが固相に直接結合するか、または固相に結合
することを可能にする構造物に連結している。一般的な
構造物はタンパク質であるストレプトアビジンに非常に
急速に、そして堅固に結合することができるビオチン分
子である(The Immunoassay Handbook, 発行者 D.Wild,
The MacMillan Press Ltd.,1994,“Immunoassay desig
n" 章、p.76-77 )。
識を保有しており、これによって形成されるサンドイッ
チの検出が可能となる。標識の特性にしたがい、吸光
度、蛍光、発光、化学発光、放射能、その他を測定する
ことによって、検出を実施することができる。イムノア
ッセイにおいて発生したシグナルを分析物の濃度に相関
させるため、試験において、あらかじめ既知の濃度の分
析物または分析物類似体を含有する溶液によって検定し
なければならない。このような確定した溶液を以後、標
準溶液と称する。標準溶液と共通のその他の名称はキャ
リブレータ、検定標準または検定溶液である。
は、これらの検定標準の高い安定性である。一方におい
て、試験が正確であること、及び良好なシグナル−ノイ
ズ比を示すことが保証されなければならない。他方、判
定の結果がより長期間にわたって確実に再現し得るもの
でなければならない。キャリブレータとして使用される
多くの分析物は、その環境条件に対して極めて敏感であ
る。それらが存在する媒質の温度、pH値および緩衝条
件は、キャリブレータの安定性に対して主要な影響を与
える。好ましくない条件下では、キャリブレータの加水
分解、タンパク質分解または変性の危険がある。完全で
ないキャリブレータを使用すると、誤った検定および測
定に至ることになる。
めに、当業界において各種の方法が知られている。この
ように、適切な緩衝塩およびpH値の選択は重要であ
り、また界面活性剤、タンパク質、糖類、塩類その他な
どの補助物質の添加についても関連する文献に記載され
ている(論評:Shami ら、Tibtech 1989,vol.7,p.186-1
90、参照)。ここで、国際公開公報第87/00196号に、タ
ンパク質および他の巨大分子の乾燥中の変性を防止する
ための方法が記載されている。変性を避けるため、乾燥
操作をトレハロースおよび類似の糖の存在下で実施して
いる。
和な条件下での保存方法が、国際公開公報第91/18091号
に開示されている。ある種の非還元性糖類または糖誘導
体の添加によって、この方法で処理した酵素のより高い
温度安定性がもたらされる。その上、この酵素は、乾燥
状態で保存したとき、より安定である。検定標準におけ
る高濃度の糖の使用は好適な安定化方法ではない。糖を
含有する溶液は高粘性であることが多いため、特に少量
をピペットで取るときに誤差が生じることがある。この
糖濃度は希釈によって低下させることもできるが、その
代わりに希釈段階が誤差の原因となり、検定標準の濃度
を誤ることになる。
て、有機ポリマーと保護すべきタンパク質とを共有結合
によって連結する、すなわち有機ポリマーと安定化すべ
きタンパク質とのコンジュゲートを形成させることによ
って、タンパク質を安定化することもできる。この方法
で製造されるコンジュゲートは高温度、有機溶媒および
酵素によるタンパク質分解攻撃に対する高安定性を有す
る。しかし、この方法はタンパク質の本来の構造を相当
変化させ、キャリブレータとしての機能に影響を与えか
ねない。
解したオボアルブミンの添加によって、特にモノクロー
ナル抗体が熱変性に対して保護され得ることが記載され
ている。正確に確定されていないタンパク質加水分解物
の添加はキャリブレータの特性に影響を与えかねない。
抗体の酵素に対する安定化効果についての記載もある。
こうして、例えばアルカリホスファターゼへのモノクロ
ーナル抗体の結合は、この酵素がプロテアーゼであるト
リプシンによって切断されなくなるという効果を有する
(Jemmerson 及び Stigbrand,Febs.Letters 1984,vol.1
73,p.357-359)。
が熱変性に対して安定化され得ることもまた知られてい
る。この酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ(Melchers
及びMesser,Biochem.Biophys.Res.Comm.1970,vol.4
0)、ヘキサミニダーゼA(Ben-Yosephら、Immunochemi
stry 1974,vol.12,p.221-226 )および酸性ホスファタ
ーゼ PAP(前立腺酸性ホスファターゼ;Sawadaら、Che
m.Pharm.Bull.1981,vol.29,p.2934-2939 )である。例
として示したこれらの酵素の場合、特異的に結合する抗
体とともに酵素をインキュベートする。溶液を加熱した
後、この酵素の酵素活性を試験する。これらの場合、抗
体はこうして酵素の活性中心を保護する。
ちコンジュゲート、を含有する水溶液の不十分な長期安
定性の問題が知られていた。溶液中で加水分解を受けや
すい分子の安定化方法が欧州特許第0 487 301 号に開示
されている。しかし、この方法においては、酵素である
マーカーまたは標識のみが結合しており、そしてこれが
特異的に結合する抗体によって安定化される。しかし、
検定標準において、安定化すべきものは第1に分析物で
あってマーカーではない。
について同程度ではない。これらの方法によって、標準
溶液中で使用するために必要な程度まで安定化すること
ができない多数の分析物がある。加水分解を受けやすい
分子または分析物を安定化するための当業者に既知のさ
らに別の通常方法は、最適化した媒質中で分析物を凍結
乾燥するものである。この方法には、使用の前に凍結乾
燥物を再現性を保って溶解しなければならないこと、及
び分析物を一定の条件下で再構成しなければならず、こ
れには時間がかかり誤差を生じやすいこと、の欠点があ
る。この方法においては、再構成液の不正確なピペッテ
ィングによる誤差の危険がある。その上、凍結乾燥品は
後にしばしば濁りを生じる傾向があり、この結果として
臨床診断上、特に比色評価の場合において誤差が生じ得
る。検定標準においてはこれらの誤差の原因を出来るか
ぎり排除しなければならない。そうしないと、測定の全
シリーズが不正確になる。
目的は、標準溶液の製造方法を提供することである。標
準溶液に存在する分析物は長期間にわたり、また可能な
らば高温度でも安定でなければならない。標準溶液は即
時に使用し得る溶液として、液体形態で入手し得るベき
である。
度の安定性を有する標準溶液の製造方法を提供すること
によって、この目的が達成される。
析物または分析物類似体がこの分析物に特異的に結合す
る結合相手および標識で構成されるコンジュゲートと反
応することによって、この分析物とコンジュゲートとか
らなる安定化された複合体が形成されることを特徴とし
ている。分析物は正確にわかっている濃度で溶液中に存
在する。
は、キャリブレータが凍結乾燥物として存在する必要性
を要しない。また、その他のスタビライザーの添加の必
要性もないか、または少なくとも軽減される。標準溶液
の永久(permanent )冷却または氷冷すらもしなくても
よいか、あるいは少なくとも非常に軽減され、これは日
常の実験室での実用上、大きな実質的利点である。また
この方法によると、キャリブレータが、例えば標準溶液
の入っている容器が直射日光にさらされる時に生じるよ
うな長期にわたる加熱に耐え得るとともに、安定のまま
であることが保証される。
抗体断片、ペプチド、修飾ペプチド、タンパク質、修飾
タンパク質、ハプテン、ホルモン、核酸、糖類および分
析物類似体または分析物誘導体などの、特異的に結合す
ることができる物質を包含する。分析物は好ましくは抗
原、抗体もしくは抗体断片、またはそれらの類似体であ
る。
質と解釈される。これらには、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、Fab、Fab'、および F(ab)2'断片など
の抗体断片、受容体、酵素、レクチンならびに核酸が含
まれる。好ましい結合相手は抗体および抗体断片であ
り、あるいは分析物自体が抗体の場合は対応する抗原で
ある。少なくとも1つの結合相手が使用されるが、場合
によっては2以上の結合相手が分析物に結合してもよ
い。
れる組合せは当業者に知られている。例えば以下の組合
せが好適である:抗原/抗体、ハプテン/抗体、ビオチ
ン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ホルモ
ン/受容体、タンパク質/アンチプロテイン、タンパク
質−A/イムノグロブリン、ヘモグロビン/ハプトグロ
ビン、糖タンパク質/レクチン、酵素/基質または核酸
/核酸。
合相手および標識で構成される。特異的結合相手上に1
個より多くの標識を存在させることも可能である。当業
者に既知の全ての通常の標識を使用することができる。
標識として、例えば、ビオチン、ハプテン、酵素、放射
性物質、同位体、蛍光または化学発光物質を使用するこ
とができる。標識は一方においてコンジュゲートを検出
する働きをする。当業者に周知の方法にしたがって測定
を実施する。これらの中で、化学発光物質が好ましい標
識である。他方において、測定はコンジュゲートを固相
に結合させる働きをもすることができる。標識がビオチ
ンで構成される場合は、アビジンまたはストレプトアビ
ジンが結合している固相が使用される。好ましい標識
は、例えばビオチンなどの、固相に結合することができ
る物質である。
ラテックス粒子および類似の粒子もまた結合相手の標識
として好適である。この場合、検出は濁度を測定するこ
とによって、当業者に知られた方法にしたがって、実施
される。結合相手は間接的な方法で標識することもでき
る。これは、結合相手(例えば抗体)が、当業者に既知
の標識を具備しているさらに別の結合相手(例えばアン
チ抗体)に結合することを意味している。その後、当業
者に既知の方法にしたがって、第2の結合相手の標識を
介して検出を実施する。こうした間接標識の利点は、1
つのコンジュゲートをいくつかの試験に共通する標識と
して使用することができる点である。このコンジュゲー
トは既知の方法で製造される。
分析物に特異的な結合相手または分析物に特異的な複数
の結合相手に対する分析物の結合がすでに存在している
点である。これは時間の節約を意味することになる。非
標識結合相手に比較したコンジュゲートの使用のその他
の利点は、分析物を安定化するために使用する結合相手
がそのままその後形成されて検出されることになる複合
体の成分である点である。したがって、分析物を安定化
するために、形成される複合体中の結合相手または複数
の結合相手のエピトープと異なるエピトープを認識する
さらに別の結合相手を使用する必要がない。このような
さらに別の結合相手の使用は不可能であるかまたは実用
的でないことが多い。なぜならば、検出すべき免疫複合
体中の防御を行うさらに別の結合相手が妨害するからで
あり、または特に小さな分析物の場合、第2または第3
のエピトープが存在しないからである。
分析物にいくつかのコンジュゲートが結合することもで
きる。そしてこの複数の結合相手が分析物の空間的に離
れたエピトープに結合する。この場合、各特異的結合相
手が異なる標識を保有することができる。結合相手およ
びコンジュゲートに対する分析物の濃度比は1:100 か
ら1:10,000とすべきである。すなわち、分析物の好適
な安定性を確保するため、結合相手またはコンジュゲー
トは標準溶液中で大過剰にすべきである。
標識で構成されるコンジュゲートとの間で結合が形成さ
れ、完結した分析物のコンジュゲートへの結合が試験操
作を妨害しない、全ての試験において、使用することが
できる。包含される試験操作にはサンドイッチ試験など
の不均一系イムノアッセイが含まれる。サンドイッチ試
験においては少なくとも2つの特異的結合相手が必要で
ある。この特異的結合相手の中の1つを固相に直接また
は間接的に連結することができる。固相に対して結合相
手が直接連結される場合は、検定溶液として分析物と標
識された結合相手との複合体が使用される。この場合、
サンドイッチの全体が直接固相上で形成される。分析物
は検定溶液からの結合相手の標識を介して検出される。
る場合は、結合相手の1つに、固相への(例えばアビジ
ンまたはストレプトアビジンを介した)結合を可能にす
る、例えばビオチンなどの標識を具備させる。そして、
分析物と結合相手および固相への結合を媒介する標識で
構成されるコンジュゲートとの複合体、分析物と結合相
手および検出のために使用される標識で構成されるコン
ジュゲートとの複合体、または分析物と両方のコンジュ
ゲートとの複合体のいずれかがその後検定溶液として使
用される。
相を使用することができる。当業者に既知の方法を使用
してストレプトアビジンまたはアビジンを被覆すること
ができるプラスチック管が好ましい。その他、やはり当
業者に既知の方法にしたがってストレプトアビジンまた
はアビジンを被覆することができるミクロ粒子も好まし
い。
相手の固相への連結がストレプトアビジンまたはアビジ
ン/ビオチンによって達成される、サンドイッチアッセ
イである。この場合、固相は当業者に既知の方法にした
がってストレプトアビジンまたはアビジンで被覆され
る。やはり当業者に周知の方法にしたがって、1つの特
異的結合相手がビオチンと共有結合によって連結され
る。この試験操作法において検定溶液の基本的成分は、
好ましくは分析物に特異的な抗体およびビオチンで構成
されるコンジュゲートである。分析物は、コンジュゲー
トに結合した複合体として存在する。
試験などの均一系試験操作法が含まれる。この場合、標
識は例えばラテックス粒子で構成されるものが可能であ
る。いくつかの結合相手を1つの標識に連結することが
できる。そして分析物がその結合相手によって結合さ
れ、検定標準として使用される複合体を形成する。例え
ば抗体などの一定量の追加の結合相手を結合すると、結
合相手およびラテックス粒子のコンジュゲートが分析物
を介して交差結合することになる。続いて、生じる濁度
を測定し、これが存在する分析物の量の尺度となる。
保存剤、プロテアーゼ阻害剤およびBSA と同様に、当業
者に既知の普通の緩衝物質を、当業者によって容易に決
定される濃度範囲で存在させることができる。さらに、
本発明は溶液中の分析物の安定化のための、特異的結合
相手および標識で構成されるコンジュゲートの使用に関
する。
結合相手および標識で構成されるコンジュゲートとの複
合体を成分とする標準溶液である。この場合、好ましい
結合相手は分析物と特異的に結合する抗体である。好ま
しい標識の1つはビオチンである。さらに別の好ましい
標識は化学発光物質である。この検定溶液においては、
分析物は正確にわかっている既定の濃度または非常に狭
い限度内で変化する濃度で存在する。
を含む分析物の検出方法である:分析物を含有するサン
プルを、分析物に対して特異的な結合相手および標識で
構成されるとともに、場合によってはこの標識を介して
固相に結合しているコンジュゲートと反応させ、場合に
よっては、この溶液をさらに別の結合相手またはコンジ
ュゲートと反応させ、標識のシグナルによってサンプル
中に存在する分析物を検出し、この方法で得られたシグ
ナルを上記の検定溶液を使用して得られたシグナルと比
較する。
たは連続的に実施することができる。ステップの順番も
また自由である。こうして特異的結合相手および標識で
構成されたコンジュゲートを最初に固相に連結させ、そ
の後に分析物およびコンジュゲートまたは検定溶液で構
成される複合体を固相に連結した結合相手と結合させる
ことができる。
びビオチンで構成されるコンジュゲートの使用による検
定標準中の分析物 LH の安定化を示す。各場合におい
て、各種温度で3週間ストレスを加える。測定数値をも
表1に示す。図2:この図中、LH-MAB- ビオチンキャリ
ブレータに各種の期間、常に35℃にストレスを加える。
測定数値をも表2に示す。
にする。実施例1 :非安定化キャリブレータの製造 1.1 原料 −ヒトLH(黄体形成ホルモン) ヒト下垂体から単離し、Enzymun test(登録商標)LH
(Boehringer MannheimGmbH,Germany, 発注 No.1488 67
8)のために、0.05 MNH4HCO3、pH 8.0中で凍結
乾燥する;供給社:UCB-Bioproducts S.A.-Chemin du F
oriest,B-1420 Braine-l'Alleud,Belgium 。
チアゾロン(MIT)、オキシピリオンおよびフェニル−
メチル−スルホニルフルオライド(PMSF)によって安定
化する。 1.2 ヒトLHの溶解:LHを含まないヒト血清にLH 50
μgを濃度c=25μg/mlとなるように溶解し(原液
I)、2−8℃で30−60分再構成させる。
で濃度c=5 IU/ml(原液II)に、そして第2段階で以
下の表1に示す実験用標準溶液(working solution)の濃
度になるように、LHを含まないヒト血清で希釈する。
Mannheim GmbH,Germany, カタログ No.1 547 038 )、
25 mM リン酸カリウム、100 mMNaCl、 1%ウシ血清
アルブミン、pH7.0中 5 mg/ml MAB<LH>-Bi 。
ート溶液を目的の濃度になるような割合で混合する。こ
うして、例えば目的濃度が20μg/mlならば、LHを含まな
いヒト血清 1Lに MAB<LH>-Bi コンジュゲート溶液 4 m
l を混合する。混合物を30分のローリングによってホモ
ジナイズした。
lとなるように溶解し(原液I)、2−8℃で30−60分
再構成させる。 2.4 ヒトLHの希釈:原液Iを第1段階で濃度c=5
IU/ml(原液II)に、そして第2段階で以下の表2に示
す実験用標準溶液の濃度になるように、LHを含まないヒ
ト血清で希釈する。
標準溶液の測定 3.1 キャリブレータのストレス付加 実験用標準溶液を 1 ml づつ密封性ポリエチレン容器に
分配し、所定の期間所定の温度で保存する。
annheim GmbH,Germany, を使用し、製造元の使用説明書
にしたがって、実験用標準溶液を測定する。この操作法
はサンドイッチ原理にしたがっている。本発明の標準溶
液に、追加の特異的結合相手として、ルテニウム複合体
で標識された抗体を添加する。ルテニウム複合体によっ
て放射される化学発光シグナルを介して、検出を実施す
る。
(グラフについては図1参照)
(グラフについては図2参照)
安定化を示す図である。
安定化を示す図である。
Claims (6)
- 【請求項1】 溶液中に存在する分析物を該分析物に対
する特異的結合相手および標識で構成されるコンジュゲ
ートと反応させることによって、該分析物および該コン
ジュゲートを含む安定化した複合体を形成させることか
らなる、標準溶液の製造方法。 - 【請求項2】 特異的結合相手が抗体または抗体断片で
ある、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 標識によってコンジュゲートが固相に結
合することができる、請求項1または2記載の方法。 - 【請求項4】 溶液中の分析物を安定化するための、結
合相手および標識で構成されるコンジュゲートの使用。 - 【請求項5】 分析物と結合相手および標識で構成され
るコンジュゲートとを含む複合体からなる標準溶液。 - 【請求項6】 a)分析物を含有するサンプルを、該分
析物に対する特異的結合相手および標識で構成されるコ
ンジュゲートと反応させ、b)標識のシグナルによって
サンプル中に存在する分析物を検出する、工程を含む分
析物の検出方法であって、このようにして得られたシグ
ナルを請求項5記載の標準溶液を使用して得られたシグ
ナルと比較する、前記検出方法。
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