JPH09508707A - 改善された直線性を有する競合結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 競合アッセイの標準曲線の簡略化された較正及び改善された用量−応答直線性は、抗−分析物を含む第１試薬に所定量のラベル化していない競合結合性化合物（通常は分析物そのもの）を、その試薬を既知量の分析物を含む試料と反応させる前に加えることにより、得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 改善された直線性を有する競合結合アッセイ 試料中の生物学的又は医学的に関連する化学物質又はタンパク質（例えば酵素 、ホルモン、血液タンパク質）の量を決定するための競合結合原理を利用する数 多くのイムノアッセイが開発されている。イムノアッセイにおけるデーターの処 理及び結果の報告は、一定の生物学的因子についての試料中の用量−応答関係の 本質の基礎的な相違を決定するときに明らかに重要である。アッセイの結果は往 々にして、分析値（例えば吸光度）が既知濃度の分析物を利用して作製した「標 準曲線」上のどこに載っているかを決定することによって計算される。 一般に、競合型のアッセイは（免疫測定法又は試薬過剰法と比べ）非直線性の 用量−応答曲線を示す。曲線の形態はマス反応(massaction)原理、並びに抗体及 びラベルに対する抗体のアフィニティーにより表わされる。その結果、高精度の 標準曲線の作製は多数の標準品の試験を必要とし、このことは著しい技術者の時 間、めんどうな品質管理及び一般的に試薬の費用を費やす高消費量を必要とする 。様々な数学的モデルが少ないデーター数を必要とする標準曲線によって高精度 な結果が得られるよう曲線フィッティングの精度を改善することができるが、非 直線性標準曲線の数学的フィッティングは、検出装置と接続したコンピューター 及び複雑なソフトウェアー又はマイクロプロセッサー並びにデーターの多大なる 数学的変換を必要とする。不精度性は実際のデーターに対しての数学的にフィッ ティングさせた標準曲線のフィッティングの悪さに由来することがあり、それは 特に非直線性標準曲線が分析学的に臨界の医学的判 定値において又はその付近において劣った精度及び感度を示すときである。 従って、（１）２つの標準品のみを使用する、（２）複雑な数学的曲線フィッ ティング手順を利用しない、及び（３）分析物の濃度域にわたって一層一慣した 精度を供する競合アッセイの直線標準曲線を供する方法は、現在利用されている 技術よりもはるかに優れた進歩であろう。かかる方法は再現性のあるデーター処 理による明瞭な定性的及び直線性定量的情報を供し、且つ応答曲線の変換に由来 するエラー（即ち、データーのみかけ上の改善に伴うエラーの圧縮）、点間の直 線外挿に由来するエラーの機会を少なくするであろう。 本発明は試料中に存在している分析物の量を決定するための方法であって、競 合結合アッセイについての、特に今まで直線性の用量−応答曲線の得られなかっ た競合結合アッセイについての直線用量−応答曲線を供する方法を提供する。こ の方法は（ａ）試料と、抗−分析物抗体、ラベル化形態の検出すべき分析物、及 ひラベル化していない形態の予め選定しておいた量の又は所定量（一般の試料の 中に存在しているものと予測される量よりも少ない量）の分析物又は競合結合性 化合物を含む１又は複数種の試薬とを混合することによって反応媒体において混 合物を形成し；（ｂ）得られる混合物をインキュベートして結合反応が生ずるよ うにし；そして（ｃ）結合又は未結合のラベル化分析物の量を測定する；ことを 含んで成る。この反応媒体中の混合物に加えるラベル化していない分析物又は競 合結合性化合物の量は、試料中の分析物の濃度に対して測定されたラベル化分析 物をプロッティングすることにより形成される直線性標準曲線を供する（又は少 なくとも曲線の直線性を改善する）のに十分な量となるように選定する。検出は 酵素活性、蛍光、又はラベ ルの種類に適する任意のその他の検出可能なシグナルの測定によって行うことが でき、そして本発明は均質又は不均質な任意の競合結合アッセイに利用できる。 ラベル化していない分析物又は競合結合性化合物の所定の量は、ラベル化してい ない分析物又は競合結合性化合物の非存在下でのかかる標準曲線に対し、予測さ れる値の範囲にわたってこの標準曲線の直線性を改善せしめるような量である。 かかる量は当業界において公知の技術を利用して本明細書に記載の通りにして実 験的に決定できうる。 本発明は、１又は複数種の試薬を試料と接触せしめる前にイムノアッセイ試薬 混合物に（又は試薬が別々に供されるなら１又は複数種の試薬に）有効な量の分 析化合物（又は抗−分析物抗体への結合に関してその分析物と競合する、構造的 に類似の化合物）を加えることにより、較正を簡略化し、且つ競合結合アッセイ の用量−応答曲線を改善せしめる。種々の試料用量で実際のアッセイにおいて本 発明の方法を試験することにより、若干からひどく非直線性である標準曲線は、 少なくともその標準曲線のうちの医学的に重要な判定が下される領域において効 果的に直線化されうる。 本法は、均質又は不均質な方法を利用し、１又は複数種の試薬を用い、且つ当 業界に公知の全てのラベル及び検出方法を用いる任意の競合結合アッセイに適用 される。例えば、検出方法には放射能法；あらゆるタイプのインタクト酵素、例 えばβ−ガラクトシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ 性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ を利用する酵素技法；酵素フラグメントを利用する技法、例えばβ−ガラクトシ ダーゼ補完アッセイ；発色性基質を含む検出系；直接蛍光、経時分解蛍光、蛍光 局在又は蛍光エネルギー転移により検出する蛍光法；及びケミー又はバイオルミ ネッセンス検出系が含まれ うる。この方法は競合結合アッセイ法により決定できる全ての分析物を定量する のに利用できうる。 本発明の方法は任意の競合アッセイ、例えばその分析物が治療薬（例えばフェ ノバルビタール、ゲンタマイシン、ジゴキシン）、ホルモン（例えばエストリオ ール、チロキシン、インスリン）乱用薬物又は医薬（例えばモルヒネ、アンフェ タミン）、代謝物（例えばベンゾイルエクゴニン）又は血清タンパク質（例えば IgG，Ｃ−反応性タンパク質）であるアッセイに利用できうる。 本明細書において用いる「分析物」とは、分析によりその存在又は量が決定さ れる特定の化学物質もしくは生化学化合物又はその他の物質をいう。 「試料」とは、分析物を含み（又はネガティブ試料では、含むものと予測され る）、且つ通常ではあるが必須ではなく生物起源である原材料をいうが、しかし ながら予備処理がその分析物に通常一体化している正常な生物学的化合物の一部 を除いていることもある（例えば全血液試料中の血漿から分離された赤血球）。 「競合結合アッセイ」は、分析物と、別の分子、いわゆる競合結合性化合物と の、特異的結合性分子の上の、通常は抗体の上の限定数の結合性部位に対する競 合を利用し、分析物が存在している又はどれぐらい存在しているかを決定する。 「抗−分析物抗体」とは、特異的結合会合により分析物と結合する抗体をいい 、それは一般ではあるが必須でなく少なくとも10⁸の会合定数を有している。こ の抗体は、もし分析物が同一の試料の中に存在しているものと予測されるあらゆ る全ての化合物に対して優先的に注目の特定の抗体に結合するなら、その抗体に 対して「特異的」である。抗体ではないその他の特異的結合性化合物（例えば特 定の炭水化物に結合するレクチン）を抗体と同じようにして競合結 合アッセイに利用してよい。しかしながら、かかる化合物を全て列挙するのに必 要な表現法は説明を複雑なものとし、且つ当業者の理解の助けとならないので、 本明細書で用いる表現「抗−分析物」抗体はかかる特異的結合性化合物の全てを 包括することを意図している。 「競合結合性化合物」とは、抗−分析物抗体に対する結合に関して分析物と競 合する化合物をいい、そして分析物分子自体であるか、又は抗体もしくは特異的 結合性分子に対する結合能を保持している分析物の構造的に近縁している類似体 もしくは誘導体であってよい。即ち、本明細書において用いている語「競合結合 性化合物」は「分析物」以外の化合物を包括する。それは分析物、及び抗−分析 物抗体に対する結合に関して分析物と競合する分子の双方を含む。「ラベル化競 合結合性化合物」は競合結合アッセイに共通する検出可能なラベルも含んで成る （以下に詳細）。「ラベル化されていない競合結合性化合物」は、利用する特定 のアッセイにおいて検出されるラベルを有さないが、しかしながらその他の技法 によっては検出されるものであってもよい。 化合物は以下の場合に第１化合物の「誘導体」であるという（本明細書におい て好適な態様のために利用）。その誘導化合物が、第１化合物とその他の分子又 は試薬との反応により、第１化合物よりも小さいか又は大きく、しかも第１化合 物の構造の少なくとも一部を保持している新たな化合物を成すように形成される とき（又は形成されうるとき）である。 「成分」は表示のオリジナル成分に由来する複合誘導分子の一部である。例え ば、分析物／ラベル複合分子の「分析成分」とは、完全分析分子に由来する複合 物の一部である。 本明細書において用いる「標準曲線」とは、個々の試料用量の分 析物に対応する少なくとも２種の試料用量データー点をつなげるように引いた曲 線型又は実質的に直線の線分に基づく試料用量−応答曲線を意味する。曲線型の 線分は試料分析値の範囲にわたって非直線性の用量応答曲線を有するアッセイに 関して存在する。本発明は標準曲線を頼りとするアッセイについての満足たる結 果が、試料中の予測の分析物濃度域に由来するたった２つのデーター点を利用し て直線線分を引くことによって達成できるという方法を提供する。 本発明の一態様において、抗−分析物抗体及び予備選定しておいた（即ち所定 の）量のラベル化していない分析物又はラベル化していない結合性化合物を含む 第１試薬を未知の量の分析物を含む試料と反応させて第１反応混合物を形成する 。この混合物をインキュベートして（通常は25℃〜42℃；好ましくは37℃で）結 合させ、次いでラベル化分析物又はラベル化競合結合性化合物を含む第２試薬を 加え、そしてインキュベーションを続けて更なる結合反応を起こさせる。次いで 、この抗−分析物抗体及びそれに結合した何らかのものを沈殿せしめる第３試薬 を加える。この第３試薬の例には不均質アッセイにおいて利用される任意の数多 くの沈殿試薬、例えば第２抗体（即ち、第１抗−分析物抗体に対する抗体）が含 まれる。この混合物を遠心分離し、そして沈殿物又は上清画分のいづれかのラベ ル化分析物の量を測定する。この試薬は任意の有用な追加の成分、例えば溶媒、 バッファー、安定剤（例えばエチレンジアミン四酢酸、２−メルカプトエタノー ル等）、殺菌剤、界面活性剤等を含みうる。ラベル及び検出法の形態は上記のも のに限定されない。いく通りかのラベル化／検出法（例えば酵素ラベル）は検出 が可能となるように更なる試薬、例えば酵素基質の添加を必要とするであろう。 本態様において、試料中の分析物は、ラベル化分析物と、限定された数の抗− 分析物抗体結合性部位について競合する。試料中の分 析物の量が増えると、沈殿物中で回収されるラベル化分析物の量は減り、一方上 清画分中で回収されるラベル化分析物の量は増える。それぞれの曲線は、試料中 の分析物濃度に対する回収されたラベル化分析物の標準曲線を作製するのに利用 できる；この標準曲線は未知の試料の中に存在する分析物を定量するのに利用で きる。 本発明のこの態様において必要とされる添加分析物抜きのこのタイプの競合を 利用するアッセイにおいては、用量−応答曲線は往々にして低分析物濃度におい て上方に向って凹型となり、低分析物濃度での劣った感度及び精度をもたらす。 ラベル化していない分析物又はラベル化していない競合結合性化合物の抗−分析 物抗体第１試薬への添加は、標準曲線の当初の湾曲をなくし、直線上の標準曲線 をもたらす。 その他の態様には均質法、例えば第１試薬が酵素基質、抗−分析物抗体及びラ ベル化されていない分析物又は競合結合性化合物を含み、そして第２試薬が酵素 −分析物コンジュゲートを含む方法が含まれる。かかる態様において、試料由来 の分析物と酵素ラベル化コンジュゲートとは、限定された数の抗−分析物抗体結 合性部位について競合する。試料中の分析物の量が増えると、抗体に結合した酵 素の量は減り、上昇した酵素活性をもたらし、なぜなら酵素−分析物コンジュゲ ートに対する抗体の結合は酵素活性を阻害するからである。この酵素活性は酵素 とその基質との化学反応により生成される光学的に検出できる最終生成物の速度 として光学的に測定される。最初の例における通り、第１試薬を含む抗−分析物 に対するラベル化していない分析物又はラベル化していない競合結合性化合物の 添加は標準曲線の当初の曲線をなくし、直線上の標準曲線をもたらす。 第３の態様は均質酵素イムノアッセイのためのラベルとしての酵 素フラグメントを利用する。ラベルとして有用な酵素フラグメントは米国特許第 4,708,929号に開示されている。酵素ドナー及び酵素アクセプターと称される２ 種類の酵素フラグメントは、試料の中に独立に存在しているときは酵素活性をほ とんど又は全く有さないが、一緒に組合さって酵素活性を復活することができる （補完と呼ぶ）。この態様において、この第１試薬は酵素アクセプター、抗−分 析物抗体及びラベル化していない分析物又はラベル化していない競合結合性化合 物を含み、そして第２試薬は酵素ドナー分析物コンジュゲート及び酵素基質を含 む。試料由来の分析物と酵素ドナー分析物コンジュゲートとは、限定された数の 抗−分析物抗体結合性部位に競合する。試料中の分析物の量が増えると、抗体に 結合した酵素ドナーの量は減る。この場合、酵素ドナーは自由に酵素アクセプタ ーに結合して活性β−ガラクトシダーゼを生成でき、それは発色性酵素基質の加 水分解により生成される検出可能な最終生成物のレートとして比色測定される。 先の態様と同様に、抗−分析物抗体第１試薬へのラベル化していない分析物又は ラベル化していない競合結合性化合物の添加は標準曲線の当初の湾曲をなくし、 直線上の標準曲線をもたらす。 ラベル化していない分析物は配合又は製造の際に第１試薬に加えることができ る。最適量は、試料中の分析物の量が既知である試験試料中の反応媒体における ラベル化していない分析物又はラベル化していない競合結合性化合物の量を様々 に増やしなから一連のアッセイを行い、そして一連の標準用量−応答曲線を作る ことにより実験的に決定される。試験するラベル化していない分析物又は競合結 合性化合物の上昇していく量は最大に到達し、既知の分析試験量に相当する量と なる。ラベル化していない分析物又はラベル化していない競合結合性化合物の最 適量は標準曲線を直線性が所望される領 域で直線化させるうえで最も有効な量である。最適量は分析物の物理的及び化学 的性質、試料中に存在しているものと予測される分析物の濃度域、抗−分析物抗 体の特性（例えば分析物及びラベル化分析物に対する結合アフィニティー）、イ ムノアッセイにおいて用いるその他の試薬の性質、並びに利用するアッセイ法の タイプに依存して変わりうる。最適量は上記の実験的試験抜きでは絶対的な精度 を伴って決定できないが、ラベル化分析物／競合結合性化合物の濃度を変えてい く予備実験は、任意の特定のイムノアッセイにおける標準曲線の直線性を改善す るであろうラベル化されていない分析物の量を決定するために簡単に実施できる 。本発明はアッセイについての標準曲線を一層直線性にするラベル化していない 分析物又は競合結合性化合物の任意の量、例えば用量−応答曲線の直線性を最大 にするような最適量及び直線性を改善するだけのような最適量より少ない量の利 用を包括する。 限定でない例示として、分析物がゲンタマイシンであるとき（そしてそのアッ セイが上記のタイプの均質酵素補完アッセイであるとき）、第１試験に添加する ラベル化していないゲンタマイシンの量は、約0.05：１〜50：１、好ましくは約 0.5：１〜10：１、そして特に約２：１〜６：１のゲンタマイシン、対、抗−ゲ ンタマイシンモノクローナル抗体のモル比が供されるのに十分な量となるであろ う。 このアッセイ法は分析物を含む任意の水性試料を用いて利用されうる。粒状物 の除去の外には、本発明の目的のための試料の予備処理は通常行われないであろ うが、予備処理はその他の目的のために行ってよい。試料の量は通常総反応混合 物の容量の少なくとも１容量％〜12容量％を占めるであろう。 実施例 本実施例において利用している略語は以下の意味を有する： EGTA＝エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｂ′ ，Ｎ′−四酢酸 EA22＝酵素アクセプター＃22、米国特許第 4,708,929号に記載 MOPS＝３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸 例Ｉ−フェノバルビタールアッセイ 以下に記載の及び図１（これは試薬１へのフェノバルビタールの添加の結果を 示す）に示したデーターは以下の試薬により得た：試薬１は、5.3nMのコンジュ ゲート（ED28−ジ−［フェノバルビタール−１−カルボキシプロピル−エチレン ジアミン−］マレイミドベンゾイルスクシニミド］）、1.4mg／mlのｍ−シアノ ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Molecular Probes）、並びに４ 00mMの塩化ナトリウム、60mMのリン酸カリウム、10mMのEGTA、２mMの酢酸マグネ シウム、0.05％のTWEEN-20（ICI Americas，Inc.のポリオキシエチレンソルビタ ンについての登録商標）及び20mMのアシ化ナトリウム、pH6.9を含むバッファー 中の腹水としての0.8容量％の抗−フェノバルビタールモノクローナル抗体(Kall estad Diagnostics)を含ませた。以下の表Ｉに表示の場合、本発明を例証するた めに試薬１に0.24μｇ／mlのフェノバルビタールも加えた。試薬２は 400mMの塩 化ナトリウム、60mMのリン酸カリウム、10mMのEGTA、２mMの酢酸マグネシウム、 0.05％のTWEEN 20及び20mMのアジ化ナトリウム、pH6.9を含むバッファー中に 46 7単位／mlのEA22及び４.7容量％のヤギ抗−マウスIgG（Bios Pacific）を含む。アッセイプロトコール フェノバルビタールアッセイは HITACHI 704臨床分析機(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN）で、以下の工程を利用し て実施した： １．４μ１の試料（ヒト血清中の試験量のフェノバルビタールを各キュベットに 加えた。 ２．200μｌの試薬１を各キュベットに加えた。 ３．試薬１を加えてから約40秒後において、機械撹拌しなから反応を37℃で５分 実施した。 ４．150μｌの試薬２を各キュベットに加えた。 ５．試薬２を加えてから約40秒後において、機械撹拌しなから反応を37℃で 4.5 分実施した。 ６．試薬２を加えてから 4.5分と 5.5分との間で20秒の間隔で 415nmでの４回の 吸収測定を行った。２回目の吸収測定は 660nmの波長でも行い、415nmと660nmと の吸収の差を計算した。 ７．Hitachi分析機により、基質加水分解の速度を、４つの吸収測定値の最少二 乗法回帰フィットを利用し、１分間当りの正味吸収（A415nm−A660nm）の変化と して計算した。結果 図１は試薬１にフェノバルビタールを加えることによる曲線直線性に及ぼされ る効果を示す。フェノバルビタール抜きでは、標準曲線の直線性（最少二乗法回 帰分析により計算される相関係数「γ」）はわずか0.9981であるのに対し、フェ ノバルビタールを伴うと、相関係数は0.99996であった。また、フェノバルビタ ールの添加は、以下の表１に示す通り、２点較正を利用する分析外挿の不精度性 を劇的に低める。即ち、試薬１の中にフェノバルビタールがないと、５，20及び 40μｇ／mlのフェノバルビタールを含む試料は２点標準曲線を利用して不正確に 測定されてしまうであろうが、一方試薬の中に表示の量フェノバルビタールがあ ると、全てのエラーは実質的に10％及び 0.5μｇ／mlより小さいであろう。 例II−ゲンタマイシンアッセイ 以下に記載の及び図２（これは試薬１にゲンタマイシンを加えた結果を示すグ ラフである）に示すデーターは以下の試薬により得た：試薬１は 154単位／mlの EA22、並びに400mMの塩化ナトリウム、100mMの３−Ｎ−モルホリノプロパンスル ホン酸（MOPS）、10mMのEGTA、２mMの酢酸マグネシウム、0.05％のTWEEN-20及び 20mMのアジ化ナトリウム、pH6.9を含むバッファー中の腹水としての0.05容量％ の抗−ゲンタマイシンモノクローナル抗体（Beckmann）を含ませた。以下の表II に表示の場合、ゲンタマイシンは表示の濃度でも試薬１に加えてある。試薬２は 2.13nMのコンジュゲート（ED28−ジ−［ゲンタマイシン−ベンゾイルホモシステ イン−ビス−マレイミドヘキサン］）、2.36mg／mlのクロロフェノールレッド− β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Boehringer Mannheim Biochemicals）、並びに 400mMの塩化ナトリウム、100mMのMOPS、10mのEGTA、２mMの酢酸マグネシウム、0 .05％のTWEEN-20及び20mMのアジ化ナトリウム、pH6.9を含むバッファー中の2.4 容量％のヤギ抗−マウス IgG（Bios Pacific）を含ませた。アッセイプロトコール ゲンタマイシンアッセイは HITACHI 704臨床分析機で、以下の工程を利用して 実施した： １．４μｌの試料（ヒト血清中の試験量のゲンタマイシンを各キュベットに加え た。 ２．200μｌの試薬１を各キュベットに加えた。 ３．試薬１を加えてから約40秒後において、機械撹拌しながら反応を37℃で５分 実施した。 ４．150μｌの試薬２を各キュベットに加えた。 ５．試薬２を加えてから約40秒後において、機械撹拌しながら反応を37℃で 4.5 分実施した。 ６．試薬２を加えてから 4.5分と 5.5分との間で20秒の間隔で 570nmでの４回の 吸収測定を行った。２回目の吸収測定は 660nmの波長でも行い、570nmと 660nm との吸収の差を計算した。 ７．Hitachi分析機により、基質加水分解の速度を、４つの吸収測定値の最少二 乗法回帰フィットを利用し、１分間当りの正味吸収（A570nm-A660nm）の変化と して計算した。結果 以下の図２は試薬１へのゲンタマイシンの添加の曲線直線性に及ぼす効果を示 す。ゲンタマイシン抜きでは、標準曲線はかなり非直線性であった。（γ＝0.95 ）。ゲンタマイシンの濃度を増やすと、標準曲線は一層直線上となり、そして試 薬１中の0.16〜0.18μｇ／mlの濃度では、その曲線は 0.999以上の相関係数を示 した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェンキンス，ディーン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94546, カストロ バレー，シドニー サークル 19732

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中に存在する分析物を定量するためのアッセイ方法であって、 （ａ）前記試料を、抗−分析物抗体、所定量のラベル化していない競合結合性 化合物及びラベル化競合結合性化合物と混合することにより混合物を形成し； （ｂ）前記混合物をインキュベートし；そして （ｃ）抗体−結合化又は結合していないラベル化競合結合性化合物を測定する ； ことを含んで成る方法。 ２．前記ラベル化していない競合結合性化合物が前記分析物と同一のものであ る、請求項１記載のアッセイ方法。 ３．前記アッセイが均質イムノアッセイである、請求項１記載のアッセイ方法 。 ４．前記ラベル化競合結合性化合物が酵素フラグメントでラベル化された分析 成分を含んで成る、請求項１記載のアッセイ方法。 ５．前記アッセイが、前記ラベル化していない競合結合性化合物及び酵素−ド ナー／分析物コンジュゲートと抗−分析物抗体との予め形成しておいた免疫複合 体を含む、請求項１記載のアッセイ方法。 ６．前記分析物がフェノバルビタールである、請求項５記載のアッセイ方法。 ７．前記アッセイが、酵素アクセプター、抗−分析物抗体及びラベル化してい ない競合結合性化合物を含む第１試薬と、酵素−ドナー／分析物コンジュゲート を含む第２試薬とを利用する、請求項１記載のアッセイ方法。 ８．前記分析物がゲンタマイシンである、請求項７記載のアッセイ方法。 ９．試料中の分析物を定量するためのアッセイ方法であって、 （ａ）前記試料と、抗−分析物抗体及び所定量のラベル化していない競合結合 性化合物を含む第１試薬を含む第１反応混合物とをインキュベートし； （ｂ）前記第１試薬混合物を、第２反応混合物の形成に適する結合条件下でラ ベル化競合結合性化合物を含む第２試薬とインキュベートし；そして （ｃ）前記第２反応混合物中の前記抗−分析物抗体に結合したラベル化分析物 の量を測定する； ことを含んで成る方法。 10．試料中の分析物を定量するためのアッセイ方法であって、 （ａ）前記試料と、酵素基質、抗−分析物抗体及び所定量のラベル化していな い競合結合性化合物を含む第１試薬とを含む第１反応混合物を適当な結合条件下 でインキュベートし； （ｂ）前記第１反応混合物を、第２反応混合物の形成に適する結合条件下で酵 素−分析物コンジュゲートを含む第２試薬とインキュベートし；そして （ｃ）前記第２反応混合物中の酵素活性の量を測定する； ことを含んで成る方法。 11．試料中の分析物を定量するためのアッセイ方法であって、 （ａ）前記試薬と、酵素アクセプター、抗−分析物抗体及び所定量のラベル化 していない競合結合性化合物を含む第１試薬とを含む第１反応混合物を適当な結 合条件下でインキュベートし； （ｂ）前記第１反応混合物を酵素ドナー−分析物コンジュゲート及び酵素基質 を含む第２試薬とインキュベートし； （ｃ）前記第２反応混合物中の酵素活性の量を測定する； ことを含んで成る方法。