JP2618629B2

JP2618629B2 - 特異的な免疫学的定量方法

Info

Publication number: JP2618629B2
Application number: JP62028779A
Authority: JP
Inventors: 磨里伊藤; 繁男木村; 陽一橋口
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1987-02-10
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1997-06-11
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: JPS63196855A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は主として臨床検査の分野での利用を目的とし
た特異的な免疫学的定量方法に関する。

〔従来の技術〕

従来より、抗原または抗体を免疫学的反応を用いて定
量する場合、当該反応を干渉する物質の影響を除去する
ことが重要な問題とされていた。特に臨床検査の分野の
ように生体試料中の抗原または抗体を定量する場合には
その試料中に存在する非特異的干渉物質の影響を除去す
るのが困難なことがたびたび指摘されていた。このよう
な例としてリウマチ因子の定量があげられる。一般に慢
性関節リウマチ患者の血清中には、リウマチ因子（Rheu
matoid factor）といわれる自己抗体が存在することか
ら、臨床検査においてリウマチ因子の測定はリウマチ性
疾患の診断や病勢判断に重要な役割を果たしてきた。従
来よりリウマチ因子の測定には赤血球凝集反応（Waaler
−Rose反応他）やラテックス凝集反応などによるリウマ
チ因子の検出方法が用いられており、なかでもラテック
ス凝集反応は簡易迅速にリウマチ因子が検出できるため
スクリーニング試験として広く利用されている。しか
し、このような凝集反応によるリウマチ因子の検出は、
定性反応であるため定量性に欠けるという問題がある。

これに対してリウマチ因子の定量を行う方法の例とし
ては免疫比濁法がある。しかしこの方法では非特異的な
物質、即ち干渉物質も反応に関与し、その影響のためリ
ウマチ因子を特異的に測定することができず、リウマチ
因子が陰性の血清でもリウマチ因子が存在するように測
定されてしまうという難点があった。従って、この非特
異的な干渉物質の影響を除去することが必要である。

ところで、リウマチ因子の測定ではこのような非特異
的な干渉物質が補体成分Clqであることが公知であり、
従ってこのClqの影響を除去することがリウマチ因子を
特異的に測定するための課題であった。従来よりこのCl
qの影響を除去する方法としては、試料を加熱処理して
非動化することによりClqを不活性化する方法が最も良
く知られている。この他にClqの影響を除去するための
添加剤を使用してClqを不活性化する方法もある。かか
る添加剤の例としては、塩化ナトリウムや尿素のほかDN
Aやヒアルロン酸などのポリアニオン、プロタミンなど
のポリカチオン、Ｃ−反応性蛋白（CRP）や肺炎球菌な
どのＣ多糖類、グラム陰性菌などの脂質Ａ等が例示さ
れ、これらの単独または混合物を公知の方法で試料に加
えることによりClqの不活性化が行われる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このように抗原または抗体を使用する免疫学的定量法
では、非特異的干渉物質の影響を除去することが課題で
あり、例えばリウマチ因子の定量においては前述のよう
な方法がとられていた。

しかし、従来の方法、即ち加熱処理、非特異的干渉物
質の影響を除去する添加剤による処理等の場合には次の
ような問題があった。すなわち、試料を加熱処理して非
動化する方法はその操作が煩雑で時間がかかるため（通
常56℃、30分間の加熱）、臨床検査の分野で近年注目さ
れている自動分析装置を用いて多数検体を迅速に測定す
るには不適当である。また、添加剤を用いる方法では非
特異的干渉物質（たとえば、リウマチ因子の測定におけ
る非特異的干渉物質であるClq）を完全に不活性化でき
ないという問題がしばしばあり、更に免疫比濁法では、
前述のような添加剤を用いることにより光学的な測定に
影響するため、前述の添加剤を使用する方法は免疫比濁
法には適応できないという問題点がある。

本発明の目的は、免疫学的定量法で問題となる非特異
的な干渉物質の影響を受けず、簡便、迅速、正確に抗原
または抗体を定量することのできる測定方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上述の目的を達成するために鋭意研究を
重ねた結果、その干渉物質の抗体、とりわけその抗体の
Fab又はFab′を用いることによって非特異的な干渉物質
が不活性化され、特異的な免疫学的定量が可能となるこ
とを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。

即ち、本発明は抗原又は抗体を免疫学的反応を用いて
定量する方法において、当該反応に非特異的な干渉物質
の影響を除去するため、その干渉物質の抗体を用いるこ
とを特徴とする特異的な免疫学的定量方法に関する。

本発明によれば、試料から干渉物質の影響が除去され
たため、免疫学的反応、とりわけ免疫比濁法のような定
量を正確に行うことが可能となり、また試料中の抗原又
は抗体を特異的、迅速簡便に定量することができる。

本発明で使用される干渉物質の抗体は、測定を意図す
る抗原または抗体の種類に応じて適宜選択すればよい。
たとえば、リウマチ因子の定量にあたっては非特異的な
干渉物質は前述のように補体成分Clqである。従って、
干渉物質の抗体としては、Clq抗体が使用され、とりわ
け抗ヒトClq血清を処理して得られたClq抗体が使用され
る。

ところで、免疫比濁法は抗原抗体反応に起因する免疫
沈降反応を応用したもので、抗原抗体反応によって生じ
た反応物の量を溶液中の濃度の変化としてとらえ、それ
を光学的に測定するものである。このときの吸収度は抗
原抗体反応によって生じた反応物の量に比例するため、
吸収度を測定することにより、試料中の抗原又は抗体の
量を測定することができる。

而して、本発明の方法、とりわけその干渉物質の抗体
由来のFab又はFab′を用いる方法によれば、光学的な測
定に影響することがないので、免疫比濁法による免疫学
的定量をより正確に行うことが出来る。かかる干渉物質
の抗体由来のFab又はFab′は自体既知の手段によって調
製することができる。たとえば、干渉物質の抗体を蛋白
分解酵素（ペプシン、パパインなど）によって消化する
ことによって調製することが出来る。たとえば、Clq抗
体のFab又はFab′の調製の好ましい例としては、抗ヒト
Clq血清（IgG）をペプシン又はパパインなどの蛋白質分
解酵素により消化して、元の抗体分子に存在していた２
個の活性部位のうち１個を含むそれぞれのフラグメント
Fab又はFab′を得ることができる。

本発明の定量方法は、抗原または抗体の定量に使用さ
れるものであり、特異的な抗原−抗体反応を利用する定
量方法であれば、いずれにも応用可能である。たとえ
ば、変性ヒト免疫グロブリン（熱変成、尿素変成等によ
って変成されたもの）を使用して特異的にリウマチ因子
の定量を行う方法等に応用することができる。また、そ
の試料としては、血液（特に、血清、血漿等）、髄液等
が使用される。

本発明の定量方法においては、少なくとも抗原−抗体
反応時に干渉物質が不活性化されているように干渉物質
の抗体が使用（反応系に添加）されるが、当該干渉物質
の抗体は、試料中に添加されることが好ましい。

本発明の定量方法は、上記干渉物質の抗体が使用され
る以外は、自体既知の定量方法の手順に準じて実施され
る。たとえば免疫比濁反応によるリウマチ因子の定量の
場合の好ましい実施態様としては、次の手順が例示され
る。

即ち、干渉物質の抗体を添加した試料と変成免疫グロ
ブリンとを抗原抗体反応させる。かくして得られた溶液
中の沈降物質の濃度を、分光光度計等にて、特定の波長
で測定してその濁度を測定し、これを標準血清を使用し
て作成された標準検量と比較して検体中のリウマチ因子
が定量される。

〔発明の作用・効果〕

本発明では抗原または抗体の特異的な免疫学的定量方
法において、比特異的干渉物質の影響を除去するため
に、その干渉物質の抗体を用いるものであり、かかる手
段によって干渉物質を抗原抗体反応で不活性化させると
いう方法であり、従来の方法に比べて干渉物質の影響を
除去する時に要する操作が簡便で、定量を短時間に行
え、また特異性の高い方法である。

従って、特に臨床検査の分野のように干渉物質の影響
が大きい検体を試料とするときには本発明の方法は非常
に有用である。

更に、最近臨床検査は省力化と多検体処理などの目的
のため自動化がすすみ、自動分析装置も多数導入されて
いるが、自動分析装置に応用されるためには一連の操作
の所要時間が短く、かつ操作ステップの少ないことが条
件となる。本発明の方法を免疫比濁反応で行ったとき、
反応所要時間を10分間という短時間にすることが可能で
あり、かつ操作ステップは試料に干渉物質の抗体を加え
ることと、その後主反応を起こす反応液を加えるという
２つのステップで測定ができるため、自動分析装置への
応用が可能となった。

このように本発明は臨床検査の分野での用途に多大な
効果をもたらすものである。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限
定されるものではない。

実施例１抗ヒトClq血清10mlに飽和硫安溶液5mlを加えて遠心分
離して得られた沈澱分画に生理食塩水を加えて溶解し、
更に透析して硫安を除く。これにパパイン7mg/ml溶液及
びメルカプトエタノール溶液を加えて反応後、更にヨー
ドアセトアミドを加えて反応させ、DE−52クロマトグラ
フィーによりClq抗体のFabを調製する。

実施例２実施例１のパパインの代わりにペプシンを用いて同様
に操作し、Clq抗体のFab′を調製する。

実施例３試料としてリウマチ因子が陰性のヒト血清40μに実
施例１で調製したClq抗体のFab（蛋白濃度0.4mg/mlに希
釈）800μを加え、37℃で５分間加温する。これに熱
変性したγ−グロブリン（400mg/L）溶液200μを加
え、更に37℃で５分間加温し、盲検を対照に波長340nm
における吸光度を測定した（これをＡとする）。このと
き、比較のためClq抗体のFabの代わりに精製水を用いて
同様に操作した（これをＢとする）。更にClq抗体のFab
の代わりに精製水に同一の試料をあらかじめ56℃で30分
間加熱処理して非動化したものを加えて同様に操作し吸
光度を測定した（これをＣとする）。なお盲検は試料の
代わりに精製水を用いた。その結果、次表のような測定
値が得られた。

この結果からＡとＣはＢに比べてほとんど吸光度の上
昇がなく、これはこの試料に含まれている非特異的干渉
物質であるClqの影響がＡとＣにはあらわれていないこ
とが分かった。すなわち本発明の方法が従来の試料を非
動化する方法と同様に非特異的干渉物質であるClqの影
響を除去できることが示された。

実施例４実施例３に準じてClq抗体のFabの代わりにFab′を用
いた場合、前述のＡと同様の結果が得られ、Clq抗体のF
ab′でも同様の効果があることが明らかとなった。

実施例５臨床検査における自動分析装置の１つである日立705
型の自動分析装置を用いて、リウマチ因子を含む血清を
希釈し検量線を作成した。

まず試料としてリウマチ因子90IU/mlを含むヒト血清
を希釈して系列を作り、それぞれ20μに実施例１で調
製したClq抗体のFab（蛋白濃度0.4mg/mlに１％ポリエチ
レングリコール溶液で希釈）400μを加える。５分後
に変性γ−グロブリン（400mg/L）溶液100μを加え、
更に５分後に波長340nmおよび700nmの２波長で吸光度を
測定した。このとき、対照としてClq抗体のFabの代わり
に１％ポリエチレングリコール溶液を用いて同様に操作
した。

その結果、第１図のような検量線が得られ、本発明の
方法は非特異的な干渉物質であるClqの影響を除去した
分だけ吸光度が低いことが示された。

実施例６本発明の方法が非特異的な干渉物質であるClqの影響
を受けずにリウマチ因子が定量できることは、次のよう
に非動化して非特異的な干渉物質の影響を除去した方法
との相関でも証明される、即ち、本発明の方法であるClq抗体のFabを用いて試料
としてヒト血清合計12例について実施例５と同様の操作
で吸光度を測定し、これらをこの検量線からリウマチ因
子の濃度として求めた（これをＹとする）。これらの試
料については、別にこれらをあらかじめ非動化した後、
同様にリウマチ因子の濃度を求めた（これらをＸとす
る）。このＸ群とＹ群を比較したところ、相関係数ｒ＝
0.994,回帰式Ｙ＝1.09X−19.5となり、両群には良好な
相関があることが示された。

また本発明はこのように臨床検査において自動分析装
置にも適用できる免疫学的定量法であることもわかる。

【図面の簡単な説明】第１図は縦軸に吸光度、横軸にリウマチ因子90IU/mlを
含むヒト血清の希釈率をあらわし、●印のプロットが本
発明の方法であるClq抗体のFabを用いた場合、○印のプ
ロットが対照の方法であるClq抗体のFabを含まない場合
である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リウマチ因子を免疫学的反応を用いて定量
する方法において、抗Clq抗体のFabまたはFab′を用い
ることを特徴とする免疫学的定量方法。
【請求項２】免疫学的反応を用いて定量する方法が免疫
比濁法である特許請求の範囲第（１）項記載の免疫学的
定量方法。