TW202246774A - 免疫學測定方法、免疫學測定用試劑及其套組、非特異性反應抑制方法以及非特異性反應抑制劑 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於抑制免疫反應測定方法中之非特異性反應。
本發明提供一種免疫學測定方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。又，本發明提供一種非特異性反應抑制方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法中之非特異性反應抑制方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。
Description
本發明係關於一種免疫學測定方法。尤其是關於一種於抗C3抗體存在下進行免疫反應之免疫學測定方法。
作為診斷試藥領域中之測定方法，可例舉：利用免疫反應測定生物試樣中所存在之測定對象物質之免疫學測定方法。由於免疫學測定方法利用抗原抗體反應，故為特異性非常高之測定方法。
生物試樣中存在各種物質，其中常包含有被稱為非特異性因子之引發非特異性反應之物質。非特異性反應係指促進不基於特異性反應之結合或阻礙特異性免疫反應之現象，會引起測定誤差。作為非特異性因子，已知存在嗜異性抗體及類風濕因子（RF）。嗜異性抗體係指對於作為免疫學測定方法之主成分之來自動物的抗體顯示反應性之人類抗體之總稱，已知HAMA（人類抗小鼠免疫球蛋白抗體）是作為代表性者。類風濕因子已知在類風濕性關節炎患者中出現，於對來自動物的抗體顯示反應性之性質方面與HAMA有共通性，其實體均為人類之免疫球蛋白G或免疫球蛋白M（非專利文獻1）。
作為免疫學測定方法中之抑制非特異性反應之技術，例如已知有專利文獻1。專利文獻1中揭示有一種方法，其藉由預先用足夠量之與人類類風濕因子（RF）之反應部位具有結合能力之來自動物的抗體對試樣進行預處理，抑制由RF引起之非特異性反應。作為來自動物的抗體，可例舉：抗人類IgG抗體、抗人類IgA抗體及/或抗人類IgM抗體。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本特開平07-012818號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：臨床化學；第23卷增補編175a-1～175a-10(1994）
[發明所欲解決之課題]
專利文獻1係一種藉由抗人類IgM抗體、抗人類IgG抗體、抗人類IgA抗體抑制由自然抗體或RF引起之非特異性反應之方法。現在，其係已藉由各種試劑被實用化之方法，但根據本發明人等之試驗可知，即便藉由該等抗體，仍存在無法抑制之非特異性反應。本發明之課題在於抑制免疫學測定方法中之非特異性反應。
[解決課題之技術手段]
本案發明人等為解決上述課題而對各種物質之非特異性反應抑制效果進行了研究，結果發現，藉由於抗C3抗體存在下進行免疫反應，可抑制非特異性反應，從而完成本案發明。即，本案發明具有以下構成。
再者，已知抗C3抗體於免疫學測定方法中用於測定對象物質之檢測，但關於其於免疫反應中之非特異性反應抑制效果一切不為人所知。
＜1＞
一種免疫學測定方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。
＜2＞
如＜1＞所記載之免疫學測定方法，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
＜3＞
如＜1＞或＜2＞所記載之免疫學測定方法，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集測定方法。
＜4＞
如＜3＞所記載之免疫學測定方法，其包括：
使試樣中之測定對象物質與抗C3抗體於溶液中接觸之步驟；
向上述溶液中添加乳膠粒子之步驟，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴；及
對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測之步驟。
＜5＞
如＜1＞至＜4＞中任一項之免疫學測定方法，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
＜6＞
一種非特異性反應抑制方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法中之非特異性反應抑制方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。
＜7＞
如＜6＞所記載之非特異性反應抑制方法，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
＜8＞
如＜6＞或＜7＞所記載之非特異性反應抑制方法，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集測定方法。
＜9＞
如＜8＞所記載之非特異性反應抑制方法，其包括：
使試樣中之測定對象物質與抗C3抗體於溶液中接觸之步驟；
向上述溶液中添加乳膠粒子之步驟，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴；及
對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測之步驟。
＜10＞
如＜6＞至＜9＞中任一項之免疫學測定方法，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
＜11＞
一種免疫學測定用試劑，其包含抗C3抗體。
＜12＞
如＜11＞所記載之免疫學測定用試劑，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
＜13＞
如＜12＞所記載之免疫學測定用試劑，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集法。
＜14＞
如＜11＞至＜13＞中任一項之免疫學測定用試劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
＜15＞
一種免疫學測定用試劑套組，其包含抗C3抗體。
＜16＞
如＜14＞所記載之免疫學測定用試劑套組，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
＜17＞
如＜16＞所記載之免疫學測定用試劑套組，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集法，且上述免疫學測定用試劑套組包含以下成分。
（1）包含抗C3抗體之第1試劑
（2）包含乳膠粒子之第2試劑，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴
＜18＞
如＜15＞至＜17＞中任一項之免疫學測定用試劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
＜19＞
一種免疫學測定方法中之非特異性反應抑制劑，其包含抗C3抗體作為有效成分。
＜20＞
如＜19＞所記載之免疫學測定方法中之非特異性反應抑制劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
[發明之效果]
根據本發明，能夠於免疫學測定方法中，藉由於抗C3抗體存在下進行免疫反應，而抑制試樣中所含之非特異性因子所引起之非特異性反應，從而實現準確之測定。尤其是能夠藉由本發明對即便利用市售之非特異性反應抑制劑仍無法抑制之非特異性反應進行抑制，這具有重要意義。
（免疫學測定方法）
本發明之免疫學測定方法係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。換言之，係於作為非特異性抑制劑之抗C3抗體之存在下，使用抗C3抗體以外之特異性結合同伴對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法。
免疫學測定方法可進一步大致分為均質法及異質法。
均質法係「於不進行B/F（結合/非結合）分離之情況下，特異性地檢測在試樣與試劑液之混合溶液（反應液）中利用測定對象物質而進行之反應」之測定方法，異質法係「藉由B/F分離操作將與結合反應無關之剩餘成分洗淨、去除後，進行主反應而檢測」之測定方法。
異質法會經過洗淨步驟，故存在步驟較多而測定較為耗時之課題，另一方面，具有受非特異性反應物質之影響相對較小之優點。相對於此，均質法不經過洗淨步驟，故存在容易受到非特異性反應之影響之課題，另一方面，由於步驟較少而較為簡便，測定所需時間亦較短，故成為臨床診斷之領域中廣泛使用之方法。
作為均質法，可例舉：利用免疫凝集法之測定方法（TIA）、免疫層析法（側流（lateral flow）式、流通（flow through）式）。TIA係基於免疫複合體之凝集程度定性或定量地對試樣中之分析物（測定對象物質）進行檢測之方法，該免疫複合體藉由抗體等特異性結合同伴與分析物之交聯作用而形成，其中，使用乳膠粒子作為不溶性載體以放大凝集訊號之乳膠免疫凝集法（以下有時會稱為LTIA）適於光學檢測，自動化亦容易實現，故為應用於各種檢查項目之通用性較高之測定方法。
作為異質法，可例舉：使用孔盤之ELISA法、化學發光法等。
本發明可利用上述中之任一種免疫學測定方法，但比較容易受到非特異性反應之影響之均質法可預期獲得更顯著之效果，故較佳。
（抗C3抗體）
於本發明中，用以抑制非特異性反應之抗C3抗體係針對C3之抗體，只要是可識別與C3中之C3d對應之部分之抗體即可。
C3係Classical pathway（典型途徑）之補體蛋白之一，亦被稱為補體第3成分或因電性移動性而被稱為β1C球蛋白。C3係分子量為180 kDa之蛋白質，具有由分子量110 kDa之α鏈與分子量70 kDa之β鏈藉由-s-s-鍵交聯而成之結構，係補體系統之中心蛋白質。如圖4所示，C3經由C3b、iC3b，分解為C3dg，進而分解為C3d。本發明所用之抗C3抗體只要是識別與C3中之分解而生成之C3d對應之部分之抗體即可，因此，可使用抗iC3b抗體、抗C3b抗體、抗C3dg抗體或抗C3d抗體中之任一者。其中，特佳為抗C3d抗體。
本發明所用之抗C3抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體。更佳為單株抗體。
又，作為本發明所用之抗C3抗體，除整個抗體分子以外，亦可使用具有抗原抗體反應活性之抗體之功能性片段。
本發明所用之抗C3抗體係經由針對一般動物（小鼠、山羊、綿羊等）之免疫步驟所得者，除此以外，亦可為藉由基因重組技術等變化為「對免疫原（測定對象物質）免疫之動物以外之動物種類之胺基酸序列」之抗體（嵌合抗體、人源化抗體、或完全人源化抗體等）。作為抗體之功能性片段，可例舉：作為具有抗原抗體反應活性之片段之F(ab')
2、Fab'或單鏈抗體（scFv）、VHH（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗體、IgNAR（new antigen receptor）抗體等。該等抗體之功能性片段可藉由利用蛋白分解酶（例如胃蛋白酶或木瓜酶等）對如上所述所得之抗體進行處理而製造。於本發明中，作為抗C3抗體之功能性片段，只要為如上所述包含與C3d對應之部分之片段即可。於本發明中，只要無特別聲明，抗C3抗體中亦包含功能性片段。
本發明所用之針對C3之抗體可使用選自由抗C3b抗體、抗iC3b抗體、抗C3dg抗體及抗C3d抗體所組成之群中之任一種，又，亦可組合使用選自該等中之任意兩種以上。
雖於本說明書中，抗體和抗原「發生反應」、抗體「識別」抗原係以同義被使用，但不限於該等例示，必須最廣義地解釋。抗體是否與抗原（化合物）「發生反應」除了可藉由抗原固相化ELISA法、競爭ELISA法、三明治ELISA法等確認，亦可藉由利用表面電漿子共振（surface plasmon resonance）之原理的方法（SPR法）等進行確認。SPR法可使用以Biacore（註冊商標）之名稱市售之裝置、感測器、試劑種類而進行。
本發明所用之針對C3之抗體可藉由將作為抗原（免疫原）而市售之人源C3d蛋白質等C3溶解於磷酸鹽緩衝生理食鹽水等溶劑中，將該溶液投予至動物進行免疫而製造。亦可視需要向上述溶液中添加適當之佐劑後，使用乳化液進行免疫。作為佐劑，除油中水型乳劑、水中油中水型乳劑、水中油型乳劑、脂質體、氫氧化鋁凝膠等通用之佐劑以外，亦可使用來自生物成分之蛋白質或肽性物質等。例如，可適宜使用弗氏不完全佐劑或弗氏完全佐劑等。佐劑之投予路徑、投予量、投予時期並無特別限定，較理想為於抗原免疫之動物中，以可增強所需之免疫反應之方式進行適當選擇。
用於免疫之動物之種類亦無特別限定，較佳為哺乳動物，例如可使用：小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、綿羊、羊駝等，更佳為使用小鼠或大鼠。動物之免疫依據一般之方法進行即可，例如可藉由將抗原之溶液，較佳為該溶液與佐劑之混合物注射至動物之皮下、皮內、靜脈或腹腔內而進行免疫。免疫反應通常根據需免疫之動物之種類及系統而異，故免疫排程較理想為根據所用之動物進行適當設定。抗原投予較佳為於最初之免疫後反覆進行多次。
為了獲得單株抗體而繼續進行以下操作，但並不僅限於此，單株抗體本身之製造方法係業界所周知且通用者，故業者可藉由使用上述抗原而輕易製造本發明之免疫學分析方法中所用之抗體（例如參照Antibodies, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, （1988）第6章等）。
可於最終免疫後，自已免疫之動物取出作為抗體產生細胞之脾臟細胞或者淋巴結細胞，使其與具有較高之增殖能力之來自骨髓瘤之細胞株進行細胞融合，而製作融合瘤。於細胞融合中，較佳為使用抗體產生能力（質、量）較高之細胞，又，較佳為來自骨髓瘤之細胞株與所融合之抗體產生細胞的來源動物具有相容性。細胞融合可依據該領域中公知之方法進行，例如可採用：聚乙二醇法、使用仙台病毒之方法、利用電流之方法等。所得之融合瘤可依據業界中所通用之條件進行增殖，可一面確認所產生之抗體之性質，一面選擇所需之融合瘤。融合瘤之選殖例如可藉由極限稀釋法或軟瓊脂法等周知之方法進行。
融合瘤之選擇可考慮所產生之抗體用於實際測定時之條件，而於選擇之階段有效率地進行。例如，可使動物產生免疫而獲得之抗體於欲確認交叉反應性之化合物之存在下與已固定化於固相之C3反應，將其與於不存在欲確認交叉反應性之化合物下之反應性進行比較，藉此更高效率地選拔產生所需抗體之融合瘤。又，亦可使動物產生免疫而獲得之抗體於來自生物試樣之成分之存在下與已固定化於固相之C3進行反應，將其與於不存在來自生物試樣之成分下之反應性進行比較，藉此更高效率地選擇產生所需抗體之融合瘤。
選殖步驟後，可藉由使用ELISA法、RIA法、螢光抗體法等方法對所產生之抗體與C3之結合能力進行分析，確認所選中之融合瘤是否產生了具有所需之性質之單株抗體。
可藉由大量培養如上所述篩選出之融合瘤，製造具有所需之特性之單株抗體。大量培養之方法並無特別限定，例如可例舉：於適當之培養基中培養融合瘤而於培養基中產生單株抗體之方法；向哺乳動物之腹腔內注射融合瘤使其增殖，而於腹水中產生抗體之方法等。單株抗體之純化可適當組合上述從抗血清中純化抗體之方法而進行，例如可適當組合DEAE陰離子交換層析法、親和層析法、硫酸銨份化法、PEG份化法、乙醇份化法等而進行。
作為使抗C3抗體存在於免疫反應系統內之方法，可例舉：將其用作免疫測定試劑之試劑組成之一的方法、將其添加至試樣之稀釋液或預處理液等中之方法。
關於免疫反應系統內，例如於免疫測定試劑為液狀試劑之情形時，是指試樣與液狀免疫測定試劑混合而進行免疫反應之液相。
例如於LTIA法之情形時，可將試樣與包含抗C3抗體之LTIA測定試劑混合，亦可預先將試樣與包含抗C3抗體之預處理液混合後，再與免疫測定試劑混合。
又，於ELISA法之情形時，可預先將試樣與包含抗C3抗體之預處理液混合後，再滴加至微量盤，亦可將試樣與包含抗C3抗體及檢測用抗體之溶液混合後再滴加至微量盤。
又，於化學發光法試劑之情形時，可預先將試樣與包含抗C3抗體之預處理液混合後，再與免疫測定試劑混合，亦可使免疫測定試劑（例如包含檢測用抗體或者抗原、磁性粒子之溶液）包含抗C3抗體。
進而，又，於免疫層析法等在固相中進行免疫反應之情形時，免疫反應系統內係指液狀試樣與結合性同伴進行免疫反應之固相。於此情形時，可預先將試樣與包含抗C3抗體之預處理液混合後，再滴加至免疫層析試片，亦可預先使抗C3抗體於樣品墊上進行乾燥並保持，於滴加試樣時使抗C3抗體溶解而展開固相，藉此成為存在於反應系統中之狀態。
於本發明中，抗C3抗體之濃度只要為可發揮所需之非特異性反應抑制效果而不對測定對象物質與特異性結合同伴之免疫反應產生較強影響之濃度即可，業者可根據測定對象物質或檢體之種類適當進行設定。免疫反應系統內之抗C3抗體之濃度因免疫反應系統之試劑組成而異，相對於檢體10 μL之抗C3抗體之重量為0.1～1000 μg，較佳為1.0～750 μg，更佳為2.0～500 μg，進而較佳為3.0～250 μg，最佳為5.0～150 μg，但並不限定為該濃度。例如亦存在以5.0～120 μg、5.0～110 μg、5.0～100 μg、5.0～80 μg、5.0～60 μg、5.0～50 μg為佳之情形。又，上述範圍之下限亦存在以10.0 μg以上、15.0 μg以上、20.0 μg以上為佳之情形。
抗C3抗體可單獨使用，亦可為複數種抗C3抗體之混合物，亦可併用單株抗體及多株抗體，亦可使用與不溶性載體結合之抗C3抗體。又，於併用複數種抗C3抗體之情形時，只要兩者合計之濃度處於上述濃度範圍內即可。
於預先使本發明之測定試劑中含有抗C3抗體之情形時，可使其以成為上述反應系統內之濃度之方式預先含於測定試劑中。
（乳膠免疫凝集法（LTIA法））
對作為本發明之免疫學測定方法之一的LTIA法進行說明。利用LTIA法對測定對象物質進行測定之方法大致可分為兩種。
第一種方法係使固定有與測定對象物質特異性結合之同伴的乳膠粒子、以及測定對象物質進行反應，形成三明治型免疫複合體，根據隨著形成免疫複合體而產生之該乳膠粒子凝集之程度，對測定對象物質進行測定之方法。
第二種方法係預先向試劑中添加固定有複數個測定對象物質或其類似物（包括該等之片段）之蛋白質等，使該等與試樣中之測定對象物質競爭，而對免疫複合體之形成進行抑制，上述免疫複合體係試劑中所含之測定對象物質與固定有與測定對象物質特異性結合之同伴之乳膠粒子的免疫複合體，根據隨著抑制免疫複合體之形成而抑制該乳膠粒子之凝集之程度，對測定對象物質（抗原）進行測定之方法。
測定對象物質以及與測定對象物質特異性結合之同伴可根據目的選擇任意物質。例如，當測定對象物質為抗原時，作為與測定對象物質特異性結合之同伴，可選擇多株抗體、單株抗體（包括重組型抗體及各抗體之功能性片段）等抗體。當測定對象物質為抗體時，作為與測定對象物質特異性結合之同伴，可選擇天然型及重組型抗原等抗原。本案發明可用於上述任一種方法，具體而言，可例示以下之步驟。
（1）使試樣中之測定對象物質與抗C3抗體於溶液中接觸之步驟
（2）於步驟（1）後，向上述溶液中添加乳膠粒子之步驟，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴
（3）於步驟（2）後，對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測之步驟
此處，步驟（3）意指「於步驟（2）之進行時，或者步驟（2）之後，並不經由洗淨、分離步驟而測定該測定對象物質與該乳膠粒子之凝集反應之步驟」。
作為LTIA法，可藉由對所產生之凝集程度進行光學觀察或者電化學觀察，而測定受檢物質。作為光學觀察之方法，可例舉：以光學機器測定散射光強度、吸光度或透射光強度之方法（終點法、比率法等）。將對試樣進行測定而獲得之吸光度等之測定值與對標準物質（測定對象物質之濃度已知之試樣）進行測定而獲得之吸光度等之測定值進行比較，計算試樣中所含之測定對象物質之濃度（定量值）。再者，透射光或散射光等之吸光度等之測定可對一個波長進行測定，或者亦可對兩個波長進行測定（兩波長之差或比）。測定波長一般自500 nm至900 nm中選擇。
本發明之試樣中之測定對象物質之測定可藉由手工作業進行，或者亦可使用測定裝置等裝置進行。測定裝置可為通用之自動分析裝置，亦可為專用之測定裝置（專用機）。又，該測定較佳為藉由兩步法（兩試劑法）等利用複數個操作步驟進行之方法而實施。
（載持有特異性結合同伴之乳膠粒子）
與測定對象物質特異性結合之同伴可藉由物理吸附法、化學鍵結法或該等之併用等公知之方法進行固定化而載持於乳膠粒子。
於利用物理吸附法之情形時，可依據公知之方法，藉由使與測定對象物質特異性結合之同伴與乳膠粒子於緩衝液等溶液中混合而接觸，或者使溶解於緩衝液等中之與測定對象物質特異性結合之同伴與載體接觸等而進行。
又，於利用化學鍵結法之情形時，可根據日本臨床病理學會編之「臨床病理臨時增刊特集第53號 用以臨床檢查之免疫分析-技術及應用-」，臨床病理刊行會，1983年出版；日本生化學會編之「新生化學實驗講座1 蛋白質IV」，東京化學同人，1991年出版等中所記載之公知之方法，藉由使與測定對象物質特異性結合之同伴及載體與戊二醛、碳二醯亞胺、醯亞胺酯或馬來醯亞胺等二元性交聯試劑混合、接觸，使與測定對象物質特異性結合之同伴及載體的各自之胺基、羧基、硫醇基、醛基或羥基等與上述二元性交聯試劑發生反應等而進行。
構成本發明之乳膠粒子之合成高分子並無特別限定，例如可例舉：聚苯乙烯；苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物；甲基丙烯酸聚合物；丙烯酸聚合物；伊康酸聚合物；苯乙烯-親水性羧基單體共聚物：例如可例舉苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-伊康酸共聚物等。其中，較佳為苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-伊康酸共聚物、苯乙烯及苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物。特佳為苯乙烯及苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物。
為了形成三明治型，乳膠粒子所載持之與特定物質特異性結合之同伴較佳為複數種。於特定物質中存在複數種抗體識別部位之情形時，特異性結合同伴亦可為一種。例如，於特異性結合同伴為單株抗體之情形時，使用識別部位不同之複數種單株抗體。又，例如，於特異性結合同伴為多株抗體之情形時，可為來自一種抗血清之多株抗體，亦可為來自複數種抗血清者。又，亦可組合使用單株抗體及多株抗體。
再者，當需要進行處理以抑制乳膠粒子之自然凝集、或非特異性反應等時，可藉由使乳膠粒子之表面與牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、明膠、卵白蛋白或者其鹽等蛋白質，界面活性劑或脫脂乳粉等接觸而被覆其表面等公知之方法進行處理，從而進行載體之阻斷處理（遮蔽處理）。
（免疫學測定用試劑）
本發明之免疫學測定方法之免疫反應之特徵在於：使用免疫學測定用試劑進行，該試劑中除反應主成分以外，亦包含上述抗C3抗體。反應之主成分包含與測定對象物質特異性結合之同伴（抗C3抗體以外），此外可例舉：免疫測定用粒子、免疫層析試片、微量盤等不溶性載體等。
於本發明之免疫學測定用試劑中，可於不阻礙其非特異性反應抑制效果之範圍內含有：緩衝物、蛋白質、肽、胺基酸、核酸、脂質、磷脂質、醣、無機鹽、高分子化合物、界面活性劑、其他非特異性反應抑制劑、防腐劑等。作為對試樣之pH、離子強度、滲透壓等進行緩衝、調整之成分，例如可包含：乙酸、檸檬酸、磷酸、Tris、甘胺酸、硼酸、碳酸、鄰苯二甲酸、琥珀酸、馬來酸、咪唑等緩衝液；及古德緩衝液；該等之鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等。又，作為增強凝集形成之成分，可包含聚乙烯氫吡咯酮、磷脂質聚合物等高分子。
作為抗C3抗體之各組成試劑中之濃度因各試劑型而異，以於測定時的試劑與試樣之混合狀態下，可調整為上述免疫反應系統內之濃度之形態含有即可。
（試劑套組）
本發明之試劑套組之特徵在於套組組成中至少包含抗C3抗體。作為套組組成，除與免疫測定相關之試劑以外，可例舉試樣稀釋液、試樣萃取液等，於本發明中，抗C3抗體可添加至該等中之任一種之中，或者添加至該等中之兩種以上之中。套組之組成除上述以外，可例舉：使用說明書、試樣採集用具（採集吸量管、注射器、棉花棒、過濾濾片等）。
以下，對採用各免疫測定方法之試劑組成分別進行說明。
＜乳膠免疫凝集測定方法＞
例示免疫學測定方法為乳膠免疫凝集測定方法之情形時之試劑（LTIA試劑）。
（1）包含抗C3抗體之第1試劑
（2）包含乳膠粒子之第2試劑，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴
第1試劑典型的是包含緩衝液，抗C3抗體之緩衝液中之濃度以「於測定時之試劑與試樣之混合狀態下，可調整至上述較佳之抗C3抗體濃度」之形態含有即可，濃度因各試劑型而異。抗C3抗體除第1試劑以外，亦可含於第2試劑中。
於LTIA試劑中，一般之第1試劑中所含之抗C3抗體之濃度為1～2000 μg/mL，較佳為5～1500 μg/mL，更佳為10～1000 μg/mL，進而較佳為15～500 μg/mL，最佳為25～500 μg/mL，但並不限定於該濃度。
又，於供於LTIA法之前，向檢體中添加檢體稀釋液或預處理液等之情形時，抗C3抗體亦可含於預處理液中，預處理液中之抗C3抗體濃度為1～2000 μg/mL，較佳為5～1500 μg/mL，更佳為10～1000 μg/mL，進而較佳為15～500 μg/mL，最佳為25～500 μg/mL，但並不限定於該濃度。
對於抗C3b抗體、抗iC3b抗體、抗C3dg抗體及抗C3d抗體，亦可以與上述抗C3抗體同樣之濃度範圍使用。
本發明所用之免疫測定用粒子除上述乳膠粒子以外，只要是可載持與測定對象物質特異性結合之同伴者即可，可使用公知之粒子。例如金屬膠體、二氧化矽、碳等無機物粒子亦可用作本發明之免疫測定用粒子。
免疫測定用粒子之尺寸可考慮所用之光學測定方法（例如：測定透射光之比濁法（turbidimetry）、測定散射光之散射比濁法（nephelometry）等），自0.05～1 μm之範圍內適當選擇以獲得所需之測定感度、測定範圍等。再者，於自動分析裝置中之光學測定中，通用的是平均粒徑0.1～0.4 μm，但並不限定於此。
＜ELISA法＞
ELISA法係指利用各種抗原抗體反應之組合，最終將酵素標記之抗原或者抗體併入反應系統中，檢測酵素活性之方法。於酵素活性之檢測中，使用吸光光譜隨著反應而變化之受質，根據抗原抗體反應之組合，可例舉：直接法、間接法、三明治法、競爭法等。
例示本發明之免疫學測定方法為三明治ELISA法之情形時之試劑。
（a）使與測定對象物質反應之抗體固定化之不溶性載體
（b）經標記物質標記且與測定對象物質反應之抗體
作為（a）之不溶性載體，較佳為盤，標記物質可適當選擇而使用。固定化於不溶性載體之抗體捕捉包含試樣之溶液中之測定對象物質，於不溶性載體上形成複合體。經標記物質標記之抗體與上述捕獲之測定對象物質結合而與上述複合體形成三明治型。可藉由與標記物質對應之方法測定標記物質之量，藉此測定試樣中之測定對象物質。抗體固定化於不溶性載體之方法、抗體與標記物質結合之方法等具體之方法可無特別限制地使用業者所周知之方法。
於本ELISA法中，本發明所用之抗C3抗體例如可藉由添加至試樣稀釋液或預處理液等中，或者添加至進行抗原抗體反應之溶液中，而存在於免疫反應系統中。
＜免疫層析法＞
對本發明之免疫學測定方法為免疫層析法之情形時之試劑組成（試片組成）進行說明。
免疫層析試片：
於使用抗體作為特異性結合同伴之情形時，係於多孔性膜片等片狀不溶性載體上沿含試樣之溶液之展開方向依序具備「1.試樣供給部位」、「2.保持標記抗體之部位（標記抗體保持部位）」、「3.使抗體固定化以捕捉藉由標記抗體及針對測定對象物質之抗體而形成之複合體的部位（捕捉抗體部位）」之試片。
於免疫層析法中，若至少包含如上所述之試片且將包含測定對象物質之試樣以特定量添加至試樣供給部位，則試樣由於毛細管現象滲入至標記保持部位，測定對象物質與標記抗體結合而形成複合體。關於該複合體，若使膜片展開，而滲入至捕捉抗體部位，則會被固定化於膜片之抗體（捕捉抗體）捕捉，形成捕捉抗體-測定對象物質-標記抗體之複合體。而且，可利用任意之方法（例如，金膠體等可實現可視化之標記之情形時，為其凝集圖像；於酵素之情形時，為藉由添加受質而發生之顯色反應）檢測標記，藉此檢測出測定對象物質。
於本免疫層析法中，本發明所用之抗C3抗體例如可藉由添加至試樣稀釋液或預處理液等中，或者含於試樣供給部位或標記保持部位中預先進行乾燥而保持於其中，從而存在於反應系統內。
＜化學發光法＞
該方法係使結合有抗原或抗體之磁性粒子與測定對象物質反應而形成複合體後，藉由磁力將未反應物質去除。進而，添加包含標記抗體之試劑，藉由磁力將未反應物質去除後，添加發光試劑而測定發光量。將酵素用於標記之情形稱為化學發光酵素免疫測定方法（CLEIA法：Chemiluminescent enzyme immunoassay）。又，將釕吡啶錯合物等金屬錯合物用於標記，藉由電化學反應測定發光強度之情形稱為電化學發光免疫測定方法（ECLIA法：Electro chemiluminescence immunoassay）。又，將化學發光性物質用於標記之情形稱為化學發光免疫測定方法（CLIA法：Chemiluminescent immunoassay）。
例示本發明之免疫學測定方法為CLEIA法之情形時之試劑。
（a）固定化有與測定對象物質反應之抗體（或抗原）之磁性粒子
（b）經酵素標記且與測定對象物質反應之抗體（或抗原）
（c）發光試劑
固定化於磁性粒子之抗體捕捉包含試樣之溶液中之測定對象物質，形成複合體。經酵素標記物質標記之抗體與上述捕獲之測定對象物質結合而與上述複合體形成三明治型。可使酵素標記物質與發光試劑反應而測定發光量，藉此測定試樣中之測定對象物質。
於本CLEIA法中，本發明所用之抗C3抗體例如可藉由添加至試樣稀釋液或預處理液等中，或者添加至進行抗原抗體反應之溶液中，而存在於免疫反應系統中。
（特異性結合同伴）
於本發明中，作為與測定對象物質特異性結合之同伴，可例舉抗C3抗體以外之蛋白質、肽、胺基酸、脂質、醣、核酸、半抗原等，分子量之高低以及天然、合成等來源並無特別限制，可例舉：利用免疫反應之免疫學測定方法中可使用之抗體或抗原。
上述抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體。更佳為單株抗體。
於本發明中，作為抗體，除整個抗體分子以外，亦可使用具有抗原抗體反應活性之抗體之功能性片段。除經由針對一般之動物（小鼠、山羊、綿羊等）之免疫步驟所得者以外，亦可為藉由基因重組技術等變化為「對免疫原（測定對象物質）免疫之動物以外之動物種類之胺基酸序列」的抗體（嵌合抗體、人源化抗體、或完全人源化抗體等）。作為抗體之功能性片段，可例舉：作為具有抗原抗體反應活性之片段之F(ab')
2、Fab'或單鏈抗體（scFv）、VHH（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗體、IgNAR（new antigen receptor）抗體等。該等抗體之功能性片段可藉由利用蛋白分解酶（例如胃蛋白酶或木瓜酶等）對如上所述所得之抗體進行處理而製造。
（試樣）
作為包含本發明之測定對象物質之試樣，例如可例舉：人類或動物之血液、血清、血漿、培養上清液、尿、髓液、唾液、汗、腹水、或者細胞或組織之萃取液等。
又，本發明中之試樣除自生物獲得之試樣本身以外，亦包含經稀釋、純化等預處理之試樣。
（測定對象物質）
關於本發明之免疫測定試劑，可將上述試樣所含之各種物質作為測定對象物質。測定對象物質為不與用以抑制非特異性之抗C3抗體反應之物質即可，可例舉：蛋白質、肽、胺基酸、脂質、醣、核酸、半抗原等，只要為理論上可測定之物質即可，並無特別限制。例如可例舉：CRP（C反應性蛋白質）、Lp(a)、MMP3（基質金屬蛋白酶3）、抗磷脂質抗體、IV型膠原蛋白、PSA、BNP（腦排鈉利尿肽）、胰島素、白蛋白、胱抑素C、RF（類風濕因子）、KL-6、前降鈣素（procalcitonin）、FDP、D二聚物、SF（可溶性血纖維蛋白）、TAT（凝血酶-抗凝血酶III複合體）、PAI-1、苯妥英、苯巴比妥、卡巴馬平、丙戊酸、茶鹼、TARC（Thymus and activation-regulated chemokine（胸腺活化調節趨化因子））、sIL-2R（可溶性介白素-2受體）等。
（非特異性反應之抑制方法）
因生物試樣中所含之某些成分，而時常會導致固定化有與測定對象物質特異性結合之同伴的免疫測定用粒子所不應產生之凝集出現（正測定誤差），或者應產生之凝集未出現（負測定誤差）。該等被稱為非特異性反應，已知會引發各種測定誤差。
於本發明中，抑制非特異性反應係指作用於促使生物試樣中之上述非特異性反應發生之因子（非特異性因子），抑制免疫反應以外之反應對測定產生之影響。本發明可藉由於抗C3抗體存在下進行免疫反應，而抑制非特異性反應。
（非特異性反應抑制劑）
本發明之非特異性反應抑制劑只要包含來自免疫學測定方法中之試樣的可抑制非特異性反應之物質即可，至少包含抗C3抗體作為有效成分。本發明之非特異性反應抑制劑可直接使用上述試劑組成中之包含抗C3抗體之組成。關於本發明之非特異性反應抑制劑，可於不阻礙其非特異性反應抑制效果之範圍內含有：緩衝物、蛋白質、肽、胺基酸、核酸、脂質、磷脂質、醣、無機鹽、高分子化合物、界面活性劑、其他非特異性反應抑制劑、防腐劑等。
以下，藉由實施例詳細地對本發明進行說明，但本發明並不限定於以下實施例。
[實施例]
[實施例I：LTIA法中之非特異性反應抑制：TARC之測定]
以下表示使用添加有本案發明之抗C3d多株抗體及其他非特異性反應抑制劑之LTIA法之試劑，進行試樣中之TARC濃度測定之試驗。再者，作為試樣，使用：顯示出與化學發光酵素免疫測定方法（CLEIA法）之測定值（比較例1）接近之值之試樣（對照檢體：檢體1～3）、及呈現出非特異性反應且與比較例1之測定值大程度地背離之試樣（背離檢體：檢體4～10）。
[比較例1]（利用CLEIA法之測定）
1.測定方法
1-1.測定試劑
HISCL（註冊商標）TARC（Sysmex股份有限公司）
1-2.試樣
生理食鹽水（大塚生食注）、檢體（血清）1-10
1-3.測定順序
藉由HISCL（註冊商標）-5000（Sysmex股份有限公司），根據上述試劑之隨附文件進行測定。
2.測定結果
將測定結果示於表1中。
本比較例1所示之CLEIA法實施B/F分離操作，具有洗淨步驟。因此，由於是不易受到來自試樣之非特異性反應之影響的測定方法，故用作比較例。
[比較例2]（利用LTIA法之測定：未添加非特異性反應抑制劑）
1.測定方法
1-1.測定試劑
製備由以下所示之第1試劑、第2試劑所組成之LTIA測定試劑。
（1）第1試劑
100 mM MOPS-NaOH（pH7.5）
500 mM NaCl
0.5%BSA
（2）第2試劑
抗人類TARC單株抗體致敏乳膠（2種）
5 mM MOPS-NaOH（pH7.0）
再者，關於抗人類TARC單株抗體，使用市售之TARC抗原，藉由業者周知之方法取得。作為市售之TARC抗原，可例舉：CCL17, thymus and activation regulated chemokine（Shenandoah Biotechnology, Inc.）、CCL17/TARC, Human（LifeSpan Biosscience, Inc.）、Human TARC (CCL17)（Abeomics, Inc.）。進而，藉由業者周知之方法選定可對TARC抗原進行三明治測定之單株抗體之組合。關於抗人類TARC單株抗體致敏乳膠，參考日本特開2017-181377所記載之方法而製備。
1-2.試樣
與比較例1之試樣相同
1-3.測定順序
組合第1試劑與第2試劑，使用日立自動分析裝置3500，測定試樣中之TARC濃度。具體而言，向試樣2.4 μL中添加第1試劑120 μL，於37℃保溫5分鐘後，添加第2試劑40 μL加以攪拌。其後5分鐘時，以主波長570 nm、副波長800 nm測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化，將該吸光度變化量應用於對濃度已知之標準物質進行測定而獲得之校準曲線中，計算測定值。
2.測定結果
將測定結果示於表1中。又，將本比較例2之測定值對於比較例1之測定值之相關性示於圖1中。
[比較例3]（利用LTIA法之測定：添加HBR-1）
向比較例2所示之第1試劑中，以成為100 μg/mL之方式添加作為市售之非特異性抑制劑之HBR-1（SCANTIBODIES LABORATORY，INC.），除此以外以與比較例2同樣之方法進行測定。將測定結果示於表1中。又，將本比較例3之測定值對於比較例1之測定值之相關性示於圖2中。
[實施例1]（利用LTIA法之測定：添加抗C3d多株抗體）
向比較例2所示之第1試劑中，以成為100 μg/mL之方式添加抗C3d多株抗體（Bio-Rad公司），除此以外以與比較例2同樣之方法進行測定。將測定結果示於表1中。又，將本實施例1之測定值對於比較例1之測定值之相關性示於圖3中。
[表1]
| 試樣之TARC測定值（pg/mL） | |||||
| 檢體序號 | TARC測定值（pg/mL） | ||||
| 比較例1 CLEIA法 | 比較例2 LTIA法 | 比較例3 LTIA法 | 實施例1 LTIA法 | ||
| - | 無添加劑 | HBR-1 添加100 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加100 μg/mL | ||
| 對照檢體 | 生理食鹽水 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | 537 | 561 | 645 | 531 | |
| 2 | 843 | 884 | 963 | 759 | |
| 3 | 1604 | 1800 | 2037 | 1741 | |
| 背離檢體 | 4 | 205 | 669 | 634 | 271 |
| 5 | 284 | 606 | 700 | 450 | |
| 6 | 366 | 591 | 696 | 415 | |
| 7 | 441 | 705 | 891 | 512 | |
| 8 | 468 | 796 | 1347 | 626 | |
| 9 | 553 | 717 | 906 | 545 | |
| 10 | 594 | 768 | 960 | 628 |
（結果及探討）
根據比較例1～3、實施例1及參考例1之結果探討本案發明之效果。
（1）驗證對照檢體（檢體序號1～3）之測定結果。
於對照檢體中，CLEIA法之測定值（比較例1）與未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例2）大致相同。又，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例1）亦與比較例1、2大致相同。因此可知抗C3d多株抗體之添加不影響未呈現出非特異性反應之檢體之測定值。再者，於比較例3中，檢體3之測定值背離於比較例1。認為由於添加HBR-1，會產生不希望之反應。
（2）驗證背離檢體（檢體序號4～10）之測定結果。
關於檢體序號4，CLEIA法之測定值（比較例1）為205 pg/mL，對此，未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例2）成為669 pg/mL，測定值大程度地背離。進而，添加了HBR-1之LTIA法之測定值（比較例3）為634 pg/mL，與比較例1相比大程度地背離。另一方面，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例1）成為271 pg/mL，顯示出接近比較例1之趨勢。於檢體5～10中亦獲得了同樣之結果。
根據以上，於免疫測定方法中，可藉由使本案發明之抗C3d抗體存在於免疫反應系統內，抑制源自試樣之非特異性反應。藉由本發明，能夠對「即便利用了作為市售之非特異性反應抑制劑之HBR-1仍無法抑制之非特異性反應」進行抑制，此為出乎意料之結果。
再者，本試驗中所使用之背離檢體係以較廣範圍之濃度包含RF之檢體，但未發現RF之多寡與測定值之背離度之關聯性（資料未顯示）。因此提示了本案發明之抗C3d抗體之非特異性抑制效果可能不受RF之多寡之影響。
[實施例II：LTIA法中之非特異性反應抑制：sIL-2R之測定]
以下表示使用添加了本案發明之抗C3d多株抗體及其他非特異性反應抑制劑之LTIA法之試劑，進行試樣中之sIL-2R濃度測定之試驗。再者，作為試樣，使用：顯示出與化學發光酵素免疫測定方法（CLEIA法）之測定值（比較例4）接近之值之試樣（對照檢體：檢體11～15）、及呈現出非特異性反應且與比較例4之測定值大程度地背離之試樣（背離檢體：檢體16、17）。
[比較例4]（利用CLEIA法之測定）
1.測定方法
1-1.測定試劑
Lumipulse Presto（註冊商標）IL-2R（Fujirebio股份有限公司）
1-2.試樣
檢體（血清）11-17
1-3.測定順序
藉由Lumipulse（註冊商標）-L2400（Fujirebio股份有限公司），根據上述試劑之隨附文件進行測定。
2.測定結果
將測定結果示於表2中。
本比較例4所示之CLEIA法實施B/F分離操作，具有洗淨步驟。因此，由於是不易受到來自試樣之非特異性反應之影響的測定方法，故用作比較例。
[比較例5]（利用LTIA法之測定：未添加非特異性反應抑制劑）
1.測定方法
1-1.測定試劑
根據日本特開2017-181377所記載之方法，製備第1試劑及第2試劑。
1-2.試樣
與比較例4之試樣相同
1-3.測定順序
組合第1試劑及第2試劑，使用日立7180型自動分析裝置，測定試樣中之sIL-2R濃度。具體而言，向試樣5.6 μL中添加第1試劑120 μL，於37℃保溫5分鐘後，添加第2試劑40 μL加以攪拌。其後5分鐘時，以主波長570 nm、副波長800 nm測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化，將該吸光度變化量應用於對濃度已知之標準物質進行測定而獲得之校準曲線中，計算測定值。
2.測定結果
將測定結果示於表2中。
[比較例6]（利用LTIA法之測定：添加HBR-1）
向比較例5所示之第1試劑中，以成為100 μg/mL之方式添加HBR-1（SCANTIBODIES LABORATORY，INC.），除此以外以與比較例5同樣之方法進行測定。將測定結果示於表2中。
[實施例2]（利用LTIA法之測定：添加抗C3d多株抗體）
向比較例5所示之第1試劑中，以成為100 μg/mL之方式添加抗C3d多株抗體（Bio-Rad公司），除此以外以與比較例5同樣之方法進行測定。將測定結果示於表2中。
[表2]
| 試樣之sIL-2R測定值（U/mL） | |||||
| 檢體序號 | sIL-2R測定值（U/mL） | ||||
| 比較例4 CLEIA法 | 比較例5 LTIA法 | 比較例6 LTIA法 | 實施例2 LTIA法 | ||
| - | 無添加劑 | HBR-1 添加100 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加100 μg/mL | ||
| 對照檢體 | 11 | 405 | 444 | 488 | 446 |
| 12 | 1400 | 1441 | 1501 | 1484 | |
| 13 | 449 | 494 | 514 | 485 | |
| 14 | 611 | 710 | 728 | 704 | |
| 15 | 1050 | 1057 | 1099 | 1089 | |
| 背離檢體 | 16 | 346 | 1401 | 1216 | 409 |
| 17 | 171 | 500 | 392 | 297 |
（結果及探討）
根據比較例4～6、實施例2之結果，探討本案發明之效果。
（1）驗證對照檢體（檢體序號11～15）之測定結果。
於對照檢體中，CLEIA法之測定值（比較例4）與未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例5）大致相同。又，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例2）亦與比較例4、5大致相同。因此可知抗C3d多株抗體之添加不影響未呈現出非特異性反應之檢體之測定值。
（2）驗證背離檢體（檢體序號16、17）之測定結果。
於檢體序號16中，CLEIA法之測定值（比較例4）為346 U/mL，對此，未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例5）成為1401 U/mL，測定值大程度地背離。進而，添加了HBR-1之LTIA法之測定值（比較例5）為1216 U/mL，與比較例4相比大程度地背離。
另一方面，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例2）成為409 U/mL，顯示出接近比較例4之趨勢。於檢體17中亦獲得同樣之結果。
根據以上，於免疫測定方法中，可藉由使本案發明之抗C3d抗體存在於免疫反應系統內，抑制源自試樣之非特異性反應。藉由本發明，能夠對「即便利用了作為市售之非特異性反應抑制劑之HBR-1仍無法抑制之非特異性反應」進行抑制，故本發明之抗C3d抗體之非特異性抑制效果為出乎意料之結果。
[實施例III：ELISA法中之非特異性反應抑制：sIL-2R之測定]
以下表示使用添加了本案發明之抗C3d多株抗體及其他非特異性反應抑制劑之ELISA法之試劑，進行試樣中之sIL-2R濃度測定之試驗。再者，作為試樣，使用：顯示出與化學發光酵素免疫測定方法（CLEIA法）之測定值（比較例7）接近之值之試樣（對照檢體：檢體18～22）、及呈現出非特異性反應且與比較例7之測定值大程度地背離之試樣（背離檢體：檢體23）。
[比較例7]（利用CLEIA法之測定）
1.測定方法
1-1.測定試劑
Lumipulse Presto（註冊商標）IL-2R（Fujirebio股份有限公司）
1-2.試樣
血清檢體18-23
1-3.測定順序
藉由Lumipulse（註冊商標）L2400（Fujirebio股份有限公司），根據上述測定試劑之隨附文件進行測定。
2.測定結果
將測定結果示於表3中。
[比較例8]（利用ELISA之測定：未添加非特異性反應抑制劑）
1.測定方法
1-1.試樣
與比較例7之試樣同樣
1-2.測定順序
使用與比較例5所用之抗體相同之抗體。
使抗sIL-2R單株抗體以成為10 μg/mL之方式溶解於包含150 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液（pH7.2；以下稱為PBS）中，將該溶解液100 μL分注至96孔微量盤之各孔中，於4℃靜置1晩。
以包含0.05%Tween（註冊商標）20之PBS（以下稱為PBST）400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含1%牛血清白蛋白之PBST（以下稱為BSA-PBST）200 μL，於室溫阻斷1小時。將其作為ELISA用盤。
以PBST 400 μL對上述ELISA用盤之各孔進行3次洗淨後，將藉由檢體稀釋液（BSA-PBST）稀釋至40倍之試樣100 μL添加至上述各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，將100 μL之藉由BSA-PBST稀釋至0.50 μg/mL之生物素標記抗sIL-2R單株抗體分注至上述各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，將100 μL之藉由BSA-PBST稀釋至0.20 μg/mL之HRP標記卵白素（streptavidin）（Thermo Fishier Scientific公司）分注至上述各孔中，於室溫靜置30分鐘。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含0.2%鄰苯二胺（orthophenylene diamine）及0.02%過氧化氫之檸檬酸緩衝液（pH5.0）50 μL，於室溫放置10分鐘後，添加4.5 N硫酸50 μL，使酵素反應停止，測定波長492 nm之吸光度。
使用濃度已知之標準物質作為校準物，計算受檢試樣中之sIL-2R值。將測定結果示於表3中。
[比較例9]（利用ELISA之測定：添加HBR-1）
向比較例8所示之檢體稀釋液（BSA-PBST）中，以成為100 μg/mL之方式添加HBR-1（SCANTIBODIES LABORATORY，INC.），除此以外以與比較例8同樣之方法進行測定。將測定結果示於表3中。
[實施例3]（利用ELISA之測定：添加抗C3d多株抗體）
向比較例8所示之檢體稀釋液（BSA-PBST）中，以成為100 μg/mL之方式添加抗C3d多株抗體（Bio-Rad公司），除此以外以與比較例8同樣之方法進行測定。將測定結果示於表3中。
[表3]
| 試樣之sIL-2R測定值（U/mL） | |||||
| 檢體序號 | sIL-2R測定值（U/mL） | ||||
| 比較例7 CLEIA法 | 比較例8 ELISA法 | 比較例9 ELISA法 | 實施例3 ELISA法 | ||
| - | 無添加劑 | HBR-1 添加100 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加100 μg/mL | ||
| 對照檢體 | 18 | 379 | 389 | 372 | 379 |
| 19 | 568 | 557 | 622 | 579 | |
| 20 | 1021 | 985 | 1036 | 953 | |
| 21 | 2009 | 2096 | 2056 | 2101 | |
| 22 | 3782 | 3529 | 3674 | 3623 | |
| 背離檢體 | 23 | 1534 | 2132 | 2155 | 1338 |
（結果及探討）
根據比較例7～9、實施例3之結果，探討本案發明之效果。
（1）驗證對照檢體（檢體序號18～22）之測定結果。
於對照檢體中，CLEIA法之測定值（比較例7）與未添加非特異性反應抑制劑之ELISA法之測定值（比較例8）大致相同。又，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例3）亦與比較例7，8大致相同。因此可知抗C3d多株抗體之添加不影響未呈現出非特異性反應之檢體之測定值。
（2）驗證背離檢體（檢體序號23）之測定結果。
於檢體序號23中，CLEIA法之測定值（比較例7）為1534 U/mL，對此，未添加非特異性反應抑制劑之ELISA法之測定值（比較例8）成為2132 U/mL，測定值大程度地背離。進而，添加了HBR-1之ELISA法之測定值（比較例9）為2155 U/mL，與比較例7相比大程度地背離。
相對於此，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之ELISA法之測定值（實施例3）成為1338 U/mL，顯示出接近比較例4之趨勢。據此可知，可藉由添加抗C3d多株抗體以抑制比較例8、9中所產生之某些非特異性反應。
根據以上，於免疫測定方法中，可藉由使本案發明之抗C3d抗體存在於免疫反應系統內，抑制非特異性反應。藉由本發明，能夠對「即便利用了作為市售之非特異性反應抑制劑之HBR-1仍無法抑制之非特異性反應」進行抑制，故本發明之抗C3d抗體之非特異性抑制效果為出乎意料之結果。而且可知此種非特異性反應抑制效果並不僅限於實施例I、II之均質之測定系統，於實施例III之異質之測定系統中亦有效果。
[實施例IV：LTIA法中之非特異性反應抑制：sIL-2R之測定]
以下表示使用添加了本案發明之抗C3d多株抗體及其他非特異性反應抑制劑之LTIA法之試劑，進行試樣中之sIL-2R濃度測定之試驗。再者，作為試樣，使用：顯示出與化學發光酵素免疫測定方法（CLEIA法）之測定值（比較例10）接近之值之試樣（對照檢體：檢體12、24、25）、及呈現出非特異性反應且與比較例10之測定值有較大背離之試樣（背離檢體：檢體16、17）。
[比較例10]（利用CLEIA法之測定）
1.測定方法
1-1.測定試劑
Lumipulse Presto（註冊商標）IL-2R（Fujirebio股份有限公司）
1-2.試樣
檢體（血清）12、16、17、24、25
1-3.測定順序
藉由Lumipulse（註冊商標）-L2400（Fujirebio股份有限公司），根據上述試劑之隨附文件進行測定。
2.測定結果
將測定結果示於表4中。
[比較例11]（利用LTIA法之測定：未添加非特異性反應抑制劑）
1.測定方法
1-1.測定試劑
使用比較例5中所製備之第1試劑及第2試劑。
1-2.試樣
與比較例10之試樣相同
1-3.測定順序
藉由與比較例5同樣之方法進行測定。
2.測定結果
將測定結果示於表4中。
[比較例12]（利用LTIA法之測定：添加HBR-1）
使用與比較例6相同之試劑。將測定結果示於表4中。
[實施例4]（利用LTIA法之測定：添加抗C3d多株抗體）
向比較例5所示之第1試劑中，以成為25 μg/mL（實施例4-1）、50 μg/mL（實施例4-2）、100 μg/mL（實施例4-3）、200 μg/mL（實施例4-4）、500 μg/mL（實施例4-5）之方式添加抗C3d多株抗體（Bio-Rad公司），除此以外以與比較例5同樣之方法進行測定。將測定結果示於表4中。
[表4]
| 試樣之sIL-2R測定值（U/mL） | |||||||||
| 檢體序號 | sIL-2R測定值（U/mL） | ||||||||
| 比較例10 CLEIA法 | 比較例11 LTIA法 | 比較例12 LTIA法 | 實施例4-1 LTIA法 | 實施例4-2 LTIA法 | 實施例4-3 LTIA法 | 實施例4-4 LTIA法 | 實施例4-5 LT1A法 | ||
| - | 無添加劑 | HBR-1 添加100 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加25 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加50 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加100 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加200 μg/mL | 抗C3d多株抗體 添加500 μg/mL | ||
| 對照檢體 | 12 | 1400 | 1378 | 1421 | 1356 | 1414 | 1375 | 1408 | 1412 |
| 24 | 450 | 513 | 528 | 526 | 542 | 507 | 536 | 558 | |
| 25 | 718 | 756 | 782 | 753 | 758 | 773 | 758 | 794 | |
| 背離檢體 | 16 | 346 | 1419 | 1216 | 352 | 395 | - | - | 374 |
| 17 | 171 | 474 | 349 | 285 | 257 | 285 | 274 | 243 | |
| -：未測定 |
（結果及探討）
根據比較例10～12、實施例4-1～4-5之結果，探討本案發明之效果。
（1）驗證對照檢體（檢體序號12、24、25）之測定結果。
於對照檢體中，CLEIA法之測定值（比較例10）與未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例11）大致相同。又，添加了本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例4-1～4-5）亦與比較例10、11大致相同。因此可知抗C3d多株抗體之添加不影響未呈現出非特異性反應之檢體之測定值。
（2）驗證背離檢體（檢體序號16、17）之測定結果。
於檢體序號16中，CLEIA法之測定值（比較例10）為346 U/mL，對此，未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法之測定值（比較例11）成為1419 U/mL，測定值大程度地背離。進而，添加了HBR-1之LTIA法之測定值（比較例12）為1216 U/mL，與比較例10相比大程度地背離。另一方面，添加了25 μg/mL之本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例4-1）成為352 U/mL，顯示出接近比較例10之趨勢。同樣地，於添加了50及500 μg/mL之本案發明之抗C3d多株抗體之LTIA法之測定值（實施例4-2及4-5）中，測定值成為395及374 U/mL，顯示出接近比較例10之趨勢。進而，於檢體17中亦獲得同樣之結果。本案發明之抗C3d多株抗體至少於25～500 μg/mL之範圍內表現出非特異性反應抑制效果。
[參考例1]（補體C3d特異性單株抗體之製造）
1.材料
（1）弗氏完全佐劑：富士膠片和光純藥製造，014-09541
（2）弗氏不完全佐劑：富士膠片和光純藥製造，011-09551
（3）骨髓瘤細胞（SP2/O）
（4）RPMI1640、GlutaMAX：GIBCO公司製造，61870-036
（5）胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）：BIOLOGICAL INDUSTRIES公司製造，04-001-1A
（6）HAT培養基：Cosmo Bio公司製造，16213004
（7）96孔盤：NUNC，167008
（8）HRP標記山羊抗小鼠IgG（H&L）：Southern Biotech公司製造，1031-05
（9）補體C3d，人類：Sigma-Aldrich公司製造，204870
（10）補體C3d山羊抗人類多株抗體（Complement C3d Goat anti-Human Polyclonal Antibody）：LifeSpan BioSciences公司製造，LS-C147220
（11）生物素標記套組-NH2（Biotin Labeling Kit-NH2）：Dojindo Molecular Technologies公司製造，LK03
（12）C3d，人類，選殖3：Hycult Biotech公司製造，HM2198
2.針對人源補體C3d之單株抗體產生融合瘤之製作
（2-1）對動物之免疫
作為免疫原，使用市售之人源補體C3d（Sigma-Aldrich公司製造）。使經包含150 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液（pH7.2；以下稱為PBS）稀釋之免疫原與弗氏完全佐劑等量地混合而製備乳化液，使用該乳化液，對每隻Balb/cAJcl小鼠注射20 μg。進而，第2次之後使用弗氏不完全佐劑，對每隻注射10 μg，該操作以2週之間隔重複4次（加初次免疫共計5次）。藉由下述抗原固相化ELISA法測定自尾部靜脈採血而獲得之抗血清中之抗體效價。
（2-2）免疫動物血清中抗體效價之評價（抗原固相化ELISA法）
藉由使免疫原固相化之ELISA法（抗原固相化ELISA法）確認上述免疫動物血清中之針對補體C3d之抗體是否存在。抗原固相化ELISA法之詳情如下所述。
（2-2-1）抗原固相化ELISA用盤之製作
使作為免疫原之補體C3d以成為0.5 μg/mL之方式溶解於PBS中，將該溶解液50 μL分注至96孔微量盤之各孔中，於室溫靜置2小時。
以包含0.05%Tween（註冊商標）20之PBS（以下稱為PBST）400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含1%牛血清白蛋白之PBST（以下稱為BSA-PBST）100 μL，於室溫阻斷1小時。將其作為ELISA用盤。
（2-2-2）抗原固相化ELISA法
自上述ELISA用盤之各孔中去除BSA-PBST後，將經BSA-PBST階段性稀釋之免疫動物抗血清及非免疫動物血清50 μL添加至上述各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，將藉由BSA-PBST稀釋9500倍之HRP標記抗小鼠IgG（H&L）50 μL分注至上述各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含0.2%鄰苯二胺及0.02%過氧化氫之檸檬酸緩衝液（pH5.0）50 μL，於室溫放置10分鐘後，添加1.5 N硫酸50 μL，使酵素反應停止，測定波長492 nm之吸光度。測定之結果，自確認了抗體效價上升之小鼠摘除脾臟及淋巴結，製備來自脾臟及淋巴結之細胞，用於細胞融合。
（2-3）細胞融合
以細胞數量1比1之比例將上述來自脾臟之細胞或者來自淋巴結之細胞中之任一者與骨髓瘤細胞混合，藉由電脈波法進行細胞融合。使該經融合之細胞懸浮於HAT培養基，於CO
2培養箱內，以37℃、5%CO
2培養8天，獲得融合細胞（融合瘤）。
（2-4）融合瘤之篩選（三明治ELISA法）
藉由使用了抗補體C3d多株抗體之三明治ELISA篩選融合瘤。三明治ELISA法之詳情如下所述。
（2-4-1）三明治ELISA用盤之製作
使抗小鼠IgG抗體以成為5 μg/mL之方式溶解於PBS中，將該溶解液50 μL分注至96孔微量盤之各孔中，於室溫靜置2小時。
以包含0.05%Tween（註冊商標）20之PBS（以下稱為PBST）400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含1%牛血清白蛋白之PBST（以下稱為BSA-PBST）100 μL，於室溫阻斷1小時。將其作為ELISA用盤。
（2-4-2）三明治ELISA法
自上述ELISA用盤之各孔中去除BSA-PBST後，將融合瘤培養上清液添加至各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，將50 μL之藉由BSA-PBST稀釋至50 ng/mL之補體C3d分注至各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，使用藉由BSA-PBST稀釋至0.8 μg/mL之生物素標記化套組（Dojindo Molecular Technologies公司製造），將50 μL之經生物素標記之抗補體C3d多株抗體（LifeSpan BioSciences公司製造）分注至各孔中，於室溫靜置1小時。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，將50 μL之藉由BSA-PBST稀釋至0.2 μg/mL之HRP標記卵白素分注至上述各孔中，於室溫靜置30分鐘。以PBST 400 μL對上述各孔進行3次洗淨後，添加包含0.2%鄰苯二胺及0.02%過氧化氫之檸檬酸緩衝液（pH5.0）50 μL，於室溫放置10分鐘後，添加1.5 N硫酸50 μL，使酵素反應停止，測定波長492 nm之吸光度。測定之結果，將吸光度較高之孔選作抗補體C3d抗體產生融合瘤所存在之孔（陽性孔）。再者，作為陽性對照，以1 μg/mL之濃度使用市售之來自小鼠之抗C3d單株抗體（Hycult Biotech公司製造）代替融合瘤培養上清液。
（2-5）選殖
使用（2-4）中所選之抗補體C3d抗體產生株融合瘤，進行融合瘤之單選殖化及單株抗體之純化。選殖化係藉由通常方法（極限稀釋法）進行，藉由與上述三明治ELISA法同樣之方法篩選陽性孔，最終獲得5種單株抗體產生融合瘤。將該融合瘤S3520X（X＝1～5）所產生之單株抗體分別稱為S3520X抗體。
[實施例V：LTIA法中之非特異性反應抑制：sIL-2R之測定]
以下表示使用添加了參考例1中所製作之本案發明之抗C3d單株抗體之LTIA法之試劑，進行試樣中之sIL-2R濃度測定之試驗。試樣使用與實施例IV同樣之試樣。
[實施例5]（利用LTIA法之測定：添加抗C3d單株抗體）
向比較例5所示之第1試劑中，以分別成為100 μg/mL之方式添加參考例1中所製作之5種抗C3d單株抗體，除此以外以與比較例5同樣之方法進行測定。所添加之選殖No.如下所示。實施例5-1：選殖No.S35201、實施例5-2：選殖No.S35202、實施例5-3：選殖No.S35203、實施例5-4選殖No.S35204、實施例5-5：選殖No.S35205。將測定結果示於表5中。
[表5]
| 試樣之sIL-2R測定值（U/mL） | |||||||||
| 檢體序號 | sIL-2R測定值（U/mL） | ||||||||
| 比較例10 CLEIA法 | 比較例11 LTIA法 | 比較例12 LTIA法 | 實施例5-1 LTIA法 | 實施例5-2 LTIA法 | 實施例5-3 LTIA法 | 實施例5-4 LTIA法 | 實施例5-5 LTIA法 | ||
| - | 無添加劑 | HBR-1 添加100 μg/mL | 抗C3d單株抗體 添加100 μg/mL | ||||||
| 選殖No. S35201 | 選殖No. S35202 | 選殖No. S35203 | 選殖No. 335204 | 選殖No. S35205 | |||||
| 對照檢體 | 12 | 1400 | 1378 | 1421 | 1375 | 1359 | 1368 | 1383 | 1382 |
| 24 | 450 | 513 | 528 | 487 | 487 | 460 | 489 | 466 | |
| 25 | 718 | 756 | 782 | 722 | 753 | 726 | 761 | 751 | |
| 背離檢體 | 16 | 346 | 1419 | 1216 | 377 | 366 | 339 | 368 | 350 |
| 17 | 171 | 474 | 349 | 268 | 307 | 277 | 287 | 262 |
（結果及探討）
根據比較例10～12、實施例5-1～5-5之結果，探討本案發明之效果。
（1）驗證對照檢體（檢體序號12、24、25）之測定結果。
比較例10、11之測定結果如實施例IV之探討中所述。又，添加了本案發明之抗C3d單株抗體之LTIA法之測定值（實施例5-1～5-5）亦與比較例10、11大致相同。因此可知抗C3d單株抗體之添加不影響未呈現出非特異性反應之檢體之測定值。
（2）驗證背離檢體（檢體序號16、17）之測定結果。
比較例10、11、12之測定結果如實施例IV之探討所述。另一方面，添加了100 μg/mL之本案發明之抗C3d單株抗體選殖No.S35201之LTIA法之測定值（實施例5-1）成為377 U/mL，顯示出接近比較例10之趨勢。同樣地，添加了100 μg/mL之本案發明之抗C3d單株抗體、選殖No.S35202～S35205之LTIA法之測定值（實施例5-2～5-5）之測定值成為339～368 U/mL，顯示出接近比較例10之趨勢。進而，於檢體17中亦獲得同樣之結果。本案發明之抗C3d單株抗體表現出抑制非特異性反應之效果。
根據以上，本案發明之抗C3d抗體抑制源自試樣之非特異性反應之效果可藉由多株抗體、單株抗體中之任一者獲得。於免疫學測定方法中，實施準確之測定是極為重要的，藉由本發明，可對即便利用了市售之非特異性反應抑制劑仍無法抑制之非特異性反應進行抑制，這具有重要意義。
[產業上之可利用性]
根據本發明，藉由於抗C3抗體存在下進行免疫反應，即便於試樣中包含非特異性因子之情形時，仍可實現準確之免疫測定方法。
無
[圖1]係比較例2（未添加非特異性反應抑制劑之LTIA法）之測定值對於比較例1（CLEIA法）之測定值之相關性。
[圖2]係比較例3（添加HBR-1作為非特異性反應抑制劑之LTIA法）之測定值對於比較例1（CLEIA法）之測定值之相關性。
[圖3]係實施例1（添加本案發明之抗C3d多株抗體作為非特異性反應抑制劑之LTIA法）之測定值對於比較例1（CLEIA法）之測定值之相關性。
[圖4]係表示補體蛋白C3之構造與活化及分解之示意圖（引自補體學入門：從基礎至臨床、測定方法，北村肇，學際企劃（2010.11），p27之圖10）。
Claims (20)
- 一種免疫學測定方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。
- 如請求項1之免疫學測定方法，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
- 如請求項1或2之免疫學測定方法，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集測定方法。
- 如請求項3之免疫學測定方法，其包括： 使試樣中之測定對象物質與抗C3抗體於溶液中接觸之步驟； 向上述溶液中添加乳膠粒子之步驟，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴；及 對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測之步驟。
- 如請求項1至4中任一項之免疫學測定方法，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
- 一種非特異性反應抑制方法，其係對試樣中之測定對象物質進行免疫學測定之方法中之非特異性反應抑制方法，其特徵在於：於抗C3抗體存在下進行免疫反應。
- 如請求項6之非特異性反應抑制方法，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
- 如請求項6或7之非特異性反應抑制方法，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集測定方法。
- 如請求項8之非特異性反應抑制方法，其包括： 使試樣中之測定對象物質與抗C3抗體於溶液中接觸之步驟； 向上述溶液中添加乳膠粒子之步驟，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴；及 對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測之步驟。
- 如請求項6至9中任一項之免疫學測定方法，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
- 一種免疫學測定用試劑，其包含抗C3抗體。
- 如請求項11之免疫學測定用試劑，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
- 如請求項12之免疫學測定用試劑，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集法。
- 如請求項11至13中任一項之免疫學測定用試劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
- 一種免疫學測定用試劑套組，其包含抗C3抗體。
- 如請求項14之免疫學測定用試劑套組，其中，免疫學測定方法係基於均質法或異質法之方法。
- 如請求項16之免疫學測定用試劑套組，其中，基於均質法之方法為乳膠免疫凝集法，且上述免疫學測定用試劑套組包含以下成分： （1）包含抗C3抗體之第1試劑 （2）包含乳膠粒子之第2試劑，該乳膠粒子載持有與測定對象物質特異性結合之同伴。
- 如請求項15至17中任一項之免疫學測定用試劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
- 一種免疫學測定方法中之非特異性反應抑制劑，其包含抗C3抗體作為有效成分。
- 如請求項19之免疫學測定方法中之非特異性反應抑制劑，其中，抗C3抗體係選自由抗iC3b抗體、抗C3dg抗體、抗C3d抗體及抗C3b抗體所組成之群中之一種以上。
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