JP6745523B2 - 補体系を検査する方法及びそのためのキット - Google Patents
補体系を検査する方法及びそのためのキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6745523B2 JP6745523B2 JP2016159453A JP2016159453A JP6745523B2 JP 6745523 B2 JP6745523 B2 JP 6745523B2 JP 2016159453 A JP2016159453 A JP 2016159453A JP 2016159453 A JP2016159453 A JP 2016159453A JP 6745523 B2 JP6745523 B2 JP 6745523B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- complement
- protein
- functional equivalent
- complement activation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using kinetic measurement, i.e. time rate of progress of an antigen-antibody interaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び/又は補体活性化後期反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法。
(2)検出工程においてさらに補体活性化前期反応を検出する、(1)に記載の方法。
(3)反応工程が、哺乳動物細胞上に存在するスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)哺乳動物細胞がヒト細胞である、(3)に記載の方法。
(5)哺乳動物細胞がヒト胎児腎由来細胞である、(3)又は(4)に記載の方法。
(6)反応工程が、支持体に固定されたスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、(1)又は(2)に記載の方法。
(7)スカベンジャー受容体の機能的等価物が、スカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含むペプチド断片である、(6)に記載の方法。
(8)スカベンジャー受容体がCL−P1、SR−AI又はLOX−1である、(1)から(7)のいずれかに記載の方法。
(9)ペントラキシンファミリーに属するタンパク質がC反応性タンパク質、血清アミロイドP成分又はペントラキシン3である、(1)から(8)のいずれかに記載の方法。
(10)補体活性化増幅反応の検出がプロパージン及び/又はB因子若しくはその分解物の検出により行われる、(1)から(9)のいずれかに記載の方法。
(11)補体活性化後期反応の検出がC5b−9の検出により行われる、(1)から(10)のいずれかに記載の方法。
(12)補体活性化前期反応の検出がC3分解物の検出により行われる、(2)から(11)のいずれかに記載の方法。
(13)スカベンジャー受容体又はその機能的等価物を発現するヒト細胞、及びペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物を含む、補体系を検査するためのキット。
(14)スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料と、被験物質とをインビトロで共存させる被験物質反応工程、
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料とをインビトロで共存させる対照反応工程、
各反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び/又は補体活性化後期反応を検出する検出工程、並びに
被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び/若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び/若しくは補体活性化後期反応より大きい場合に被験物質は補体系の活性化能を有すると判定し、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び/若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び/若しくは補体活性化後期反応より小さい場合に被験物質は補体系の抑制能を有すると判定する判定工程
を含む、被験物質の補体系の活性化能又は抑制能を試験する方法。
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び/又は補体活性化後期反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法に関する。
0
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はCFBが検出される、
C5b−9が検出される、及び
C3b又はC3dが検出される;
↓
血液試料には、補体活性化後期反応の補体制御因子(CFH、C4BP又はCFI)の欠損若しくは機能低下、又は増幅反応の活性化因子(C3、CFB)の異常亢進の可能性ありと判断する。この場合、補体制御因子を添加した反応工程、又は増幅反応の活性化因子に対する中和抗体を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行うことで、異常の原因を特定することができる。
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はCFBが検出される、
C5b−9が検出されない、及び
C3b又はC3dが検出される;
さらに、補体制御因子を人為的に除去した血液試料を用いた本発明の方法を追加的に行った結果、
C5b−9が検出される;
↓
血液試料に含まれる補体系タンパク質はいずれも正常であり、かつ正常に制御されていると判断する。
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はCFBが検出される、
C5b−9が検出されない、及び
C3b又はC3dが検出されないか、又はわずかにしか検出されない;
さらに、補体活性化前期反応に関与する補体タンパク質(C1q、C2、C4)を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
C3b又はC3dが検出される、又は検出される量が増加する;
↓
血液試料は、添加した補体活性化前期反応に関与する補体タンパク質について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はCFBが検出されない、
C5b−9が検出されない、及び
C3b又はC3dが検出されないか、又はわずかにしか検出されない;
さらに、補体活性化増幅反応の活性化因子を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
C3b又はC3dが検出される、又は検出される量が増加する;
↓
血液試料は、添加した補体活性化増幅反応の活性化因子について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はCFBが検出されない;
C5b−9が検出されない
C3b又はC3dが検出されないか、又はわずかにしか検出されない;
さらに、補体活性化増幅反応の活性化因子を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
C3b又はC3dが検出される、及び
C5b−9は検出されない
さらに、補体制御因子を人為的に除去した血液試料を用いた本発明の方法を追加的に行った結果、
C5b−9が検出される。
↓
血液試料は、補体活性化後期反応は正常だが、添加された補体活性化増幅反応の活性化因子について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
細胞
機能的LDL受容体を欠損したCHO/ldlA7細胞はM.Krieger博士(MIT)から分与された。ヒト胎児腎(HEK293)細胞はATCCから購入した。
使用した試薬と購入元は以下の通りである:ネイティブのCRP、C1q欠損血清及び抗ウサギIgG HRP(Merck Millipore);組換えヒトペントラキシン2(SAP)、組換えヒトペントラキシン3(PTX3)、可溶性補体受容体1(sCR1、組換えヒトCD35)、ビオチン化抗マウスペントラキシン2(ヒトペントラキシン2と交差反応する)、ビオチン化抗ヒトPTX3(R&D Systems);精製ネイティブC1q、精製ヒトCFH、精製ヒトプロパージン、精製ヒトCFB、精製ヒトCFI、ウサギ抗ヒトC5b−9抗体、ヤギ抗ヒトCFH抗体、ヤギ抗ヒトCFB抗体、ヤギ抗ヒトプロパージン抗体、プロパージン欠損血清、CFB欠損血清、CFI欠損血清及びCFH欠損血清(Complement Technology);マウス抗ヒトC4BP抗体、精製ヒトC4BP及びMicroVue SC5b−9 plus EIA キット(Quidel);HAM’s F−12、Dulbecco’s minimum essential medium(DMEM)−high glucose、ウシ胎仔血清(FBS)及びヒト補体血清(Sigma−Aldrich);抗mycモノクローナル抗体、Alexa Fluor 555抗体ラベリングキット、EZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−ビオチン及びAlexa Fluorコンジュゲート抗体(Invitrogen);ウサギ抗ヒトC3d抗体(Dako)。
文献(S.Jang et al.,J.Biol.Chem.,2009,284,3956−3965)に記載の方法に従って、ヒト完全長CL−P1をコードするcDNAをpcDNA3.1/myc−HisA発現ベクターにクローニングした。ヒトLOX−1及びSR−A1についても、同様にpcDNA3.1/myc−HisA発現ベクターにクローニングした。CHO/ldlA7細胞は5%熱不活化FBSを含むHAM’s F−12培地で、HEK293細胞は10% FBSを含むDMEM−high glucose培地で、37℃、5% CO2下で培養した。CHO/ldlA7細胞をポリ−L−リジンでコーティングしたガラス製ディッシュ(Iwaki、Japan)上に、HEK293細胞をコラーゲンでコーティングしたガラス製ディッシュ(Iwaki、Japan)上に播種し、24時間後にLipofectamine LTX トランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いて上記ベクターを各細胞に導入した。トランスフェクションの6時間後に培地を交換し、24時間後に細胞を以下のアッセイにおいて用いた。
N末端にインスリンリーダーペプチド及びFLAGタグを付加したヒトCL−P1の細胞外ドメイン(CL−P1アミノ酸配列の59〜742番目)をコードするcDNAをpcDNA3.1ベクターにサブクローニングした。このプラスミドをExpiFectamine 293 トランスフェクション試薬を用いてExpi 293−F細胞(Invitrogen)にトランスフェクトした。7日間の細胞培養後、培養上清を回収し、抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)を用いて可溶性の組換えヒトCL−P1細胞外ドメインを精製した。
CL−P1を発現させたCHO/ldlA7細胞を、10μg/ml Alexa 555−CRP、SAP又はPTX3を含む氷冷HAM’s F12培地/10mM HEPES中で、4℃で1時間インキュベートした。細胞を4% リン酸緩衝ホルマリン(Wako Pure Chemical industries)を使用して室温で30分間固定し、洗浄して、抗myc抗体、又は抗myc抗体とビオチン化抗マウスペントラキシン2抗体(ヒトペントラキシン2と交差反応する)若しくはビオチン化抗PTX3抗体との組み合わせと共に、室温で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞をAlexa 488−抗マウスIgG抗体、又はAlexa 488−抗マウスIgG抗体とストレプトアビジンAlexa 555コンジュゲートとの組み合わせと共に、室温で30分間インキュベートした。細胞核はHoechst 33342(Invitrogen)で対比染色した。蛍光顕微鏡(BZ−9000、Keyence)を用いて×40で画像を取得した。各画像から、BZ−HICプログラム(Keyence)を用いてシグナル強度を算出した。
96ウェルイムノプレートの各ウェルにコーティングバッファーで希釈したCL−P1細胞外ドメイン(5μg/ml)又は熱不活化BSA(5μg/ml)を100μlずつ加え、4℃で一晩インキュベートすることにより固定した。PBSで3回洗浄した後、2% BSA PBS溶液を使用して37℃で1時間プレートをブロッキングした。洗浄後、1% ヒト補体血清又は各種補体欠損血清若しくはaHUS患者血清と共に、20μg/ml(全血清)のCRP、SAP又はPTX3を添加した又は添加しない0.1%ゼラチンを含有するベロナールバッファー(0.82mM MgCl2、145.45mM NaCl及び0.25mM CaCl2、3.11mMバルビツール、1.8mMバルビツール酸ナトリウム)を各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。次いで洗浄後の各ウェルに1% BSA、0.05% Tween 20を含有するPBSで希釈した3.5μg/mlウサギ抗ヒトC3d抗体又はウサギポリクローナル抗ヒトC5b−9抗体を加えてインキュベートし、その後に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)−コンジュゲート抗ウサギIgG抗体(1:5000)を加えてインキュベートした後、SureBlue TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質と反応させてペルオキシダーゼ活性を上記と同様に測定することにより、補体活性化により生成したC3d及びC5b−9の量を測定した。
CL−P1発現HEK293細胞を、10%ヒト補体血清又は各種補体欠損血清若しくはaHUS患者血清を含むDMEM−高グルコース培地中で、20μg/ml(全血清)のCRP、SAP又はPTX3の存在下又は非存在下で、37℃で1時間インキュベートした。細胞を4%リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗ヒトC3d抗体(3.5μg/ml)又はウサギポリクローナル抗ヒトC5b−9抗体をAlexa Fluor 594抗ウサギIgG抗体と組み合わせた免疫染色を行って、補体活性化によって生成したC3d及びC5b−9を検出した。蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングし、シグナル強度をBZ−HICプログラムにより算出し、その平均値である平均蛍光強度(MFI)を各補体タンパク質の定量値とした。
統計解析は、JMP統計ソフトウェアパッケージ(バージョン7、SAS)に包まれる対応のない両側Student’s t検定を用いて行った。なお、実施例において、データは平均値±標準誤差で表す。特に記載がないかぎり、グラフ中のアスタリスクは有意差(p<0.0001)を、nsは有意差がないことを表す。
1−1.ELISA系を用いた評価
CL−P1細胞外ドメインとPTXs(CRP、SAP及びPTX3)との結合をELISAを用いて評価した。結果を図2A〜Cに示す。CRP、SAP及びPTX3は、CL−P1細胞外ドメインと特異的かつ用量依存的に結合し、それぞれの熱変性はCL−P1細胞外ドメインとの結合能を失わせた。
CL−P1とPTXsとの結合を、CHO/ldlA7細胞を用いて評価した。図3に示すように、CL−P1発現細胞においてはCRP、SAP及びPTX3はCL−P1と共局在したが、pcDNA3.1コントロールベクターを発現させた細胞においてはCRP、SAP、PTX3のいずれも検出されなかったことから、CRP、SAP及びPTX3は細胞表面のCL−P1と結合することが示された。また、それぞれの蛍光画像から平均蛍光強度を算出し、CL−P1発現量に対するCRP、SAP又はPTX3の結合量の比較を行った。CL−P1へのCRPの結合量は、SAP及びPTX3の結合量と比べて低レベルであった(図4)。
2−1.ELISA系を用いた補体活性化前期反応の評価
CL−P1細胞外ドメインとPTXsとの結合による補体活性化前期反応の誘導を、ELISAを用いて評価した。図5に示すように、ヒト補体血清の存在下で、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおいてCRPの添加に応じたC3d沈着量の増加が認められた。また、C1q欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおけるC3d沈着量はCRP、SAP又はPTX3の添加によって増加したが、C1qを補充したC1q欠損血清を用いると、このC3d沈着量の増加はさらに増強された(図6)。以上から、CRP、SAP及びPTX3はCL−P1の細胞外ドメインと結合し、C1qを介して補体活性化前期反応を活性化させてC3dの沈着を誘導することが示された。
CL−P1とPTXs結合による補体活性化前期反応の誘導を、CL−P1発現HEK293細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞においてCRPの添加に応じたC3d沈着量の増加が認められた(図7〜図9)。このときC3dはCL−P1(図7)及びC1q(図9)と共局在しており、これらはいずれも細胞表面全体にわたって存在が確認された。C1qを含まないC1q欠損血清を用いた場合、CRP、SAP及びPTX3添加によるC3d沈着は起こらず、C1qを欠損血清に補充することでC3d沈着は回復した(図10)。以上から、CRP、SAP及びPTX3はHEK293細胞表面上のCL−P1と結合し、C1qを介して補体活性化前期反応を活性化させて細胞表面へのC3dの沈着を誘導することが示された。
3−1.ELISA系を用いたCFBを介した補体活性化増幅反応の評価
CL−P1細胞外ドメインとPTXs結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ELISAを用いて評価した。CFB欠損血清を用いた場合と比べて、CFBを補充したCFB欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおいてCRP、SAP及びPTX3の添加に応じたC3d沈着量のさらなる増加が認められた(図11)。以上から、CRP、SAP及びPTX3はCL−P1の細胞外ドメインと結合し、CFBを介して補体活性化増幅反応を活性化させてC3dの沈着を誘導することが示された。
CL−P1とPTXs結合による補体活性化増幅反応の誘導を、CL−P1発現HEK293細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞においてCRP、SAP又はPTX3の添加に応じたCFBのリクルートが観察された(図12)。CFB欠損血清を用いた場合と比べて、CFBを補充したCFB欠損血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞においてCRP、SAP又はPTX3の添加に応じたC3d沈着量のさらなる増加が認められた(図13)。以上から、CRP、SAP及びPTX3はHEK293細胞表面上のCL−P1と結合し、CFBを介して補体活性化増幅反応を活性化させて細胞表面へのC3dの沈着を誘導することが示された。
CL−P1細胞外ドメインとPTXs結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ELISAを用いて評価した。プロパージン欠損血清を用いた場合と比べて、プロパージンを補充したプロパージン欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおけるC3d沈着量はCRP又はPTX3の添加によってさらに増加した一方、SAP添加はC3d沈着量に影響しなかった(図14)。以上から、CRP及びPTX3はCL−P1細胞外ドメインと結合し、プロパージンを介して補体活性化増幅反応を活性化させてC3dの沈着を誘導することが示された。
CL−P1とPTXs結合による補体活性化増幅反応の誘導を、CL−P1発現HEK293細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞においてCRP又はPTX3の添加に応じたプロパージンのリクルートが観察されたが、SAP添加ではこの現象は観察されなかった(図15)。プロパージン欠損血清を用いた場合と比べて、プロパージンを補充したプロパージン欠損血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞におけるC3d沈着量はCRP又はPTX3の添加によってさらに増加した一方、SAP添加はC3d沈着量に影響しなかった(図16)。以上から、CRP及びPTX3はHEK293細胞表面上のCL−P1と結合し、プロパージンを介して補体活性化増幅反応を活性化させて細胞表面へのC3dの沈着を誘導することが示された。
4−1.補体制御因子のリクルート
CL−P1発現HEK293細胞系において、ヒト補体血清を用いた場合、CRP、SAP又はPTX3の存在下及び非存在下のいずれにおいてもC5b−9沈着は認められなかった(図17A)。CRP又はPTX3の存在下では補体制御因子であるCFHが、SAPの存在下ではC4BPがCL−P1と共局在していたことから(図17B及び図17C)、これらの補体制御因子のリクルートがTCCの形成を阻害していることが推測された。
ELISA系を用いて、補体制御因子の欠損血清存在下でのCL−P1細胞外ドメインとPTXsとの結合による補体活性化後期反応の誘導を評価した。CFH欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおけるC5b−9沈着量はCRP又はPTX3の添加によって増加した一方、SAP添加はC5b−9沈着量に影響しなかった(図18)。C4BP欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおけるC5b−9沈着量はSAPの添加によって増加した一方、CRP又はPTX3の添加はC5b−9沈着量に影響しなかった(図19)。CFI欠損血清を用いた場合、CL−P1細胞外ドメインを固定したウェルにおけるC5b−9沈着量はCRP、SAP又はPTX3の添加によって増加した(図20)。さらに、CFH、C4BP、CFIを対応する欠損血清に補充すると、いずれの場合もC5b−9沈着量の増加が抑制された。反応上清中の可溶性C5b−9(SC5b−9)含有量も、C5b−9沈着量と同様に、CFH欠損による増加及びCFH補充による増加抑制が認められた(データは示さず)。以上から、CRP、SAP及びPTX3はCL−P1細胞外ドメインと結合することで補体活性化後期反応を活性化させてTCC形成を誘導することができるが、CRP及びPTX3はCFH存在下で、SAPはC4BP存在下で、並びにCRP、SAP及びPTX3はいずれもCFI存在下で、TCC形成能を阻害されることが示された。
CL−P1発現HEK293細胞を用いて、補体制御因子の欠損血清存在下でのCL−P1とPTXsとの結合による補体活性化後期反応の誘導を評価した。CFH欠損血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞におけるC5b−9沈着量はCRP又はPTX3の添加によって増加した一方、SAP添加はC5b−9沈着量に影響しなかった(図21)。C4BP欠損血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞におけるC5b−9沈着量はSAPの添加によって増加した一方、CRP又はPTX3の添加はC5b−9沈着量に影響しなかった(図22)。CFI欠損血清を用いた場合、CL−P1発現HEK293細胞におけるC5b−9沈着量はCRP、SAP又はPTX3の添加によって増加した(図23)。さらに、CFH、C4BP、CFIを対応する欠損血清に補充すると、いずれの場合もC5b−9沈着量の増加が抑制された。以上から、CRP、SAP及びPTX3はHEK293細胞表面上のCL−P1と結合することで補体活性化後期反応を活性化させてTCC形成を誘導することができるが、CRP及びPTX3はCFH存在下で、SAPはC4BP存在下で、並びにCRP、SAP及びPTX3はいずれもCFI存在下で、TCC形成能を阻害されることが示された。
CL−P1発現HEK293細胞を用いて、aHUS患者血清における補体活性化後期反応を評価した。aHUS患者血清の存在下でCL−P1発現HEK293細胞におけるC5b−9沈着量はCRP又はPTX3の添加によって増加し、aHUS患者血清へのCFHの補充によりC5b−9沈着量の増加は抑制された(図24)。C5b−9沈着量と同様、反応上清中のSC5b−9含有量もCRP又はPTX3の添加により増加し、その増加はCFH補充により抑制された(図25)。以上から、このaHUS患者血清においては、CFHが正常に機能しない結果、CL−P1とPTXsとの結合による補体後期反応の活性化が抑制されず、TCC形成が亢進していることが明らかとなった。
sCR1は、補体活性化後期反応を阻害することが知られている。そこでsCR1を阻害物質として上記ELISA系及びHEK293細胞系に加えることで、補体活性化後期反応の阻害を再現できるか評価した。ELISA系においてヒト補体血清、aHUS患者血清、CFH欠損血清、C4BP欠損血清を用いてC5b−9沈着量を測定した結果を図27〜図29に示す。aHUS患者血清添加時のCRP又はPTX3存在下でのC5b−9沈着量の増加は、CFH添加と同様、sCR1添加によっても抑制された(図27)。CFH欠損血清添加時のCRP又はPTX3存在下でのC5b−9沈着量の増加、及びC4BP欠損血清添加時のSAP存在下でのC5b−9沈着量の増加もまた、sCR1添加によって抑制された(図28、図29)。HEK293細胞系において各種欠損血清又はaHUS患者血清を用いた場合も、sCR1添加によってC5b−9沈着量の増加は抑制された(図30〜図32)。以上から、上記ELISA系及びHEK293細胞系のいずれにおいても、sCR1により補体活性化後期反応の阻害が起こることが確認された。
Claims (13)
- スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者からの血液試料とをインビトロで共存させる反応工程、及び
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法であって、
スカベンジャー受容体が、ヒトのCL−P1(Collectin Placenta 1)、SR−AI(scavenger receptor−AI)又はLOX−1(lectin−like oxidized LDL receptor−1)であり、
ペントラキシンファミリーに属するタンパク質が、ヒトのCRP(C反応性タンパク質)、SAP(血清アミロイドP成分)又はPTX3(ペントラキシン3)であり、
ただし、検査においてプロパージンの機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
H因子の機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
C4結合タンパク質の機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はSAPであり、
被験者からの血液試料が、被験者から採取した血液、血清若しくは血漿、又は特定の補体タンパク質をこれらから欠損させた若しくはこれらに補充した試料であり、
検出工程において検出される補体活性化反応が、補体活性化の増幅反応又は後期反応の少なくともいずれか一方である、前記方法。 - 検出工程において検出される補体活性化反応が、補体活性化古典経路の前期反応、補体活性化の増幅反応及び補体活性化の後期反応である、請求項1に記載の方法。
- 反応工程が、ヒト細胞上に存在するスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者からの血液試料とを共存させる工程である、請求項1又は2に記載の方法。
- ヒト細胞がヒト胎児腎由来細胞である、請求項3に記載の方法。
- 反応工程が、支持体に固定されたスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者からの血液試料とを共存させる工程である、請求項1又は2に記載の方法。
- スカベンジャー受容体の機能的等価物が、スカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含むペプチド断片である、請求項5に記載の方法。
- 検出工程において、プロパージン及び/又はB因子若しくはその分解物が測定される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 検出工程において、C5b−9及び/又はSC5b−9が測定される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 検出工程において、C3分解物が測定される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- スカベンジャー受容体若しくはその機能的等価物を発現するヒト細胞又は支持体に固定されたスカベンジャー受容体若しくはその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物とを含む、スカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化反応を検出することによって被験者の補体系を検査するためのキットであって、
スカベンジャー受容体が、ヒトのCL−P1、SR−AI又はLOX−1であり、
ペントラキシンファミリーに属するタンパク質が、ヒトのCRP、SAP又はPTX3であり、
ただし、検査においてプロパージンの機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
H因子の機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
C4結合タンパク質の機能を調べる場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はSAPであり、
検査のための試料として、前記被験者から採取した血液、血清若しくは血漿、又は特定の補体タンパク質をこれらから欠損させた若しくはこれらに補充した試料が用いられ、
検出される補体活性化反応が、補体活性化の増幅反応又は後期反応の少なくともいずれか一方である、前記キット。 - プロパージン、B因子及びその分解物、C5b−9並びにSC5b−9よりなる群から選択される補体タンパク質を検出するための少なくとも1種の特異抗体をさらに含む、請求項10に記載のキット。
- C5b−9及びSC5b−9よりなる群から選択される補体タンパク質を検出するための少なくとも1種の特異抗体をさらに含む、請求項10又は11に記載のキット。
- スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料と、被験物質とをインビトロで共存させる被験物質反応工程、
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料とをインビトロで共存させる対照反応工程、
各反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化反応を検出する検出工程、並びに
被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化反応より大きい場合に被験物質は補体系の活性化能を有すると判定し、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化反応より小さい場合に被験物質は補体系の抑制能を有すると判定する判定工程
を含む、被験物質の補体系の活性化能又は抑制能を試験する方法であって、
スカベンジャー受容体が、ヒトのCL−P1、SR−AI又はLOX−1であり、
ペントラキシンファミリーに属するタンパク質が、ヒトのCRP、SAP又はPTX3であり、
ただし被験物質のプロパージンに対する活性化能又は抑制能を試験する場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
被験物質のH因子に対する活性化能又は抑制能を試験する場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はCRP又はPTX3であり、
被験物質のC4結合タンパク質に対する活性化能又は抑制能を試験する場合には、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質はSAPであり、
血液試料が、ヒトから採取した血液、血清若しくは血漿、又は特定の補体タンパク質をこれらから欠損させた若しくはこれらに補充した試料であり、
検出工程において検出される補体活性化反応が、補体活性化の増幅反応又は後期反応の少なくともいずれか一方である、前記方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016159453A JP6745523B2 (ja) | 2016-08-16 | 2016-08-16 | 補体系を検査する方法及びそのためのキット |
US15/672,661 US20180052158A1 (en) | 2016-08-16 | 2017-08-09 | Method and kit for examining complement system |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016159453A JP6745523B2 (ja) | 2016-08-16 | 2016-08-16 | 補体系を検査する方法及びそのためのキット |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018028450A JP2018028450A (ja) | 2018-02-22 |
JP2018028450A5 JP2018028450A5 (ja) | 2019-08-08 |
JP6745523B2 true JP6745523B2 (ja) | 2020-08-26 |
Family
ID=61191553
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016159453A Active JP6745523B2 (ja) | 2016-08-16 | 2016-08-16 | 補体系を検査する方法及びそのためのキット |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180052158A1 (ja) |
JP (1) | JP6745523B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116806312A (zh) * | 2021-01-26 | 2023-09-26 | 积水医疗株式会社 | 免疫学测定方法 |
CN114019154A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-02-08 | 河北博因生物科技有限公司 | 基于流式细胞术用于补体检测的试剂盒及制备方法和应用 |
-
2016
- 2016-08-16 JP JP2016159453A patent/JP6745523B2/ja active Active
-
2017
- 2017-08-09 US US15/672,661 patent/US20180052158A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2018028450A (ja) | 2018-02-22 |
US20180052158A1 (en) | 2018-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gutmann et al. | SARS-CoV-2 RNAemia and proteomic trajectories inform prognostication in COVID-19 patients admitted to intensive care | |
Ohkawa et al. | Autoantibodies to epilepsy-related LGI1 in limbic encephalitis neutralize LGI1-ADAM22 interaction and reduce synaptic AMPA receptors | |
Blanc et al. | Overall neutralization of complement factor H by autoantibodies in the acute phase of the autoimmune form of atypical hemolytic uremic syndrome | |
Csincsi et al. | FHR-1 binds to C-reactive protein and enhances rather than inhibits complement activation | |
Chiang et al. | Disease-associated GPR56 mutations cause bilateral frontoparietal polymicrogyria via multiple mechanisms | |
Bonnefoy et al. | Biallelic mutations in LRRC56, encoding a protein associated with intraflagellar transport, cause mucociliary clearance and laterality defects | |
Scavello et al. | Modulation of soluble receptor for advanced glycation end-products (RAGE) isoforms and their ligands in healthy aging | |
Pouw et al. | Complement factor H-related protein 3 serum levels are low compared to factor H and mainly determined by gene copy number variation in CFHR3 | |
US20090042826A1 (en) | Use of the AXL receptor for diagnosis and treatment of renal disease | |
JP2010525362A (ja) | 免疫調節剤のスクリーニング方法 | |
Hair et al. | Human astrovirus coat protein binds C1q and MBL and inhibits the classical and lectin pathways of complement activation | |
WO2010135717A2 (en) | Complement assays and uses thereof | |
Allan et al. | Proteome and functional decline as platelets age in the circulation | |
Ismail et al. | G protein α12 (Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis | |
Pouw et al. | Complement factor H-related protein 4A is the dominant circulating splice variant of CFHR4 | |
JP6745523B2 (ja) | 補体系を検査する方法及びそのためのキット | |
Lee et al. | Prominin‐1‐Radixin axis controls hepatic gluconeogenesis by regulating PKA activity | |
Lopez‐Ramirez et al. | Inhibition of the HEG1–KRIT1 interaction increases KLF4 and KLF2 expression in endothelial cells | |
Zhu et al. | Nonsynonymous single nucleotide polymorphisms of NHE3 differentially decrease NHE3 transporter activity | |
EP3417291B1 (en) | Anti-cxc chemokine receptor antibodies and c-x-c chemokines for the diagnosis of autoimmune disease and graft-versus-host disease | |
WO2007055340A1 (ja) | Ptx3高感度測定法 | |
Salle et al. | Antibodies against the N-terminal domain of annexin A2 in antiphospholipid syndrome | |
Bezuidenhout et al. | The atypical fibrin fibre network in rheumatoid arthritis and its relation to autoimmunity, inflammation and thrombosis | |
JP6169101B2 (ja) | 炎症性疾患の予防及び/又は治療において有用な化合物を同定するスクリーニング法 | |
WO2021058553A1 (en) | Methods for the diagnosis of atherosclerosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20160826 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170321 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190611 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190611 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20190611 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190611 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200306 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200317 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200514 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200714 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200729 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6745523 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |